Valérie Paradis CNRS ESA 8067, Paris et Service d Anatomie Pathologique, Hôpital Beaujon, Clichy vaparadis@teaser.fr.

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1 Analyse quantitative de l expression des genes par RT-PCR en temps-réel : application a la compréhension de la fibrogenèse hepatique Valérie Paradis CNRS ESA 8067, Paris et Service d Anatomie Pathologique, Hôpital Beaujon, Clichy vaparadis@teaser.fr Points-Clés L analyse quantitative de l expression des gènes par RT-PCR en temps réel est une méthode alternative aux techniques de puces à ADN pour l étude du transcriptome. C est une méthode sensible, précise et reproductible qui permet l analyse ciblée d un nombre de gènes préalablement sélectionnés. Elle permet d identifier de nouveaux gènes impliqués en pathologie et d établir des index moléculaires représentatifs de profils spécifiques lésionnels. Introduction L étude globale de l expression des gènes ou «transcriptome» permet de déterminer la «signature» d une cellule ou d un groupe de cellules dans un état physiologique ou pathologique donné, à un moment donné. Ces méthodes ont permis de définir des profils d expression spécifiques associés à différents processus physiopathologiques et même de redéfinir certains cadres anatomo-cliniques (1-3). L analyse du transcriptome fait principalement appel aux puces à ADN (ou microarrays) capables de mesurer et de visualiser rapidement des différences d expression entre les gènes et ceci à l échelle d un génome complet (4-5). Si le principe de cette technologie est simple, sa mise en œuvre et son utilisation en sont plus complexes. La quantification de l expression des gènes par «RT-PCR en temps réel» est une alternative aux techniques de microarray qui présentent des avantages en terme de sensibilité (moindre quantité d ARN nécessaire, quantification de transcrits peu exprimés), précision (quantification du nombre de copies dès la phase exponentielle de l amplification) et reproductibilité (meilleure standardisation des différentes étapes de la technique) (6). Cours fondamental AFEF - L hépatologue face aux gènes : apport des nouveaux outils 23

2 La RT-PCR en temps réel couple une RT-PCR classique à une méthode de quantification fluorescente (7). La cinétique de quantification est basée sur la détection «en temps réel» du signal fluorescent dont l intensité est proportionnelle à la quantité de produit PCR généré au cours de l amplification. La quantification du signal repose sur le concept de «threshold cycle» (Ct) où le Ct correspond au plus petit nombre de cycles pour lequel l intensité du signal fluorescent est supérieure au bruit de fond (8). L interprétation des résultats est plus simple qu avec les biopuces qui requièrent des systèmes d acquisition et de traitement d image, des logiciels de calcul et de traitement de données performants. Par rapport aux puces à ADN qui peuvent contenir des milliers de gènes par support, la RT-PCR est une méthode plus ciblée, s adressant à un nombre limité de gènes préalablement sélectionnés. Ainsi, l intérêt de cette technologie répond plus à une volonté d évaluation précise de la valeur diagnostique et/ou pronostique de marqueurs moléculaires impliqués dans un contexte donné. La sélection des gènes d intérêt a été effectuée en fonction de la problématique étudiée et les amorces et sondes ont été dessinées à partir de l analyse des bases de données de la littérature (SAGE, transcriptome, ). Dans cette sélection, plusieurs gènes de référence servant de gènes contrôle de la qualité et de la quantité des ARN étudiés sont systématiquement inclus. Ciblés sur des gènes choisis, les résultats sont plus aisément exploitables que ceux obtenus par les techniques de puces à ADN. Cours fondamental AFEF - L hépatologue face aux gènes : apport des nouveaux outils 24

3 Ne requérant que peu de matériel, elle peut cependant permettre de quantifier dans un même échantillon un grand nombre de gènes. Dans notre laboratoire, nous avons quantifié plus de 200 gènes à partir d un même échantillon tissulaire. Par cette approche, nous avons étudié l expression de ces gènes en pathologie hépatique illustrant les différentes applications de cette technique. Analyse quantitative de l expression des gènes au cours de la fibrose hépatique Dans la littérature, quelques études ont utilisé les puces à ADN ou la technique SAGE pour examiner l expression différentielle de gènes intra-hépatiques dans les hépatopathies chroniques. Celles-ci ont confirmé l augmentation de l expression d un certain nombre de gènes impliqués dans le processus de fibrogenèse, tels que des gènes codant des molécules de la matrice extracellulaire, des cytokines, et ont également mis en évidence des profils d expression spécifiques de l étiologie de l hépatopathie (VHB, VHC, cirrhose auto-immune, cirrhose biliaire) (9-11). Dans notre travail, nous avons comparé le niveau d expression de 206 gènes impliqués dans différentes voies métaboliques dans une série de cirrhoses d origine virale C ou alcoolique à des prélèvements de foie normal. Les résultats montrent que l expression de 39 gènes variait de façon significative dans la cirrhose (i.e. 2 fois versus foie normal). Trois d entre eux présentaient une forte surexpression (> 10) dont SCG10, un marqueur connu jusqu ici pour être exprimé par les cellules neuronales. Nous avons montré in vitro que SCG10 était exprimé par les cellules stellaires et que son expression était induite était au cours de leur activation tant à l échelle ARN et protéique. Cette étude montre que la RT-PCR permet d identifier l implication de nouveaux gènes dans des pathologies particulières. Analyse quantitative de l expression des gènes dans les nodules hépatocytaires cirrhotiques : Microdissection couplée à la RT-PCR en temps réel La cirrhose est un tissu hétérogène constitué de matrice extracellulaire et de nodules hépatocytaires dont certains sont régénératifs ou polyclonaux et d autres monoclonaux donc néoplasiques; seuls ces derniers ont un potentiel malin (12). Le but de ce travail était de caractériser les marqueurs moléculaires associés à l expansion clonale des nodules c est à dire au stade le plus précoce de la cancérogenèse. Afin d étudier les modifications d expression génique relatives au compartiment parenchymateux indépendamment des modifications liées à la matrice Cours fondamental AFEF - L hépatologue face aux gènes : apport des nouveaux outils 25

4 extracellulaire, une étape préalable de microdissection des micromodules a été effectuée. L analyse du profil d expression de 31 gènes préalablement sélectionnés montrait une différence d expression significative entre les nodules cirrhotiques et le foie normal pour 9 gènes (8 surexprimés). En comparant le niveau d expression de ces gènes en fonction de la clonalité des nodules microdisséqués, nous avons constaté que la diminution de l expression d un gène (Lymphatic vessel endothelial hyaluronan receptor, LYVE1) était particulièrement associée à l acquisition du caractère monoclonal des micronodules hépatocytaires ; son expression étant effondrée dans les CHC. Il s agirait donc d une des modifications d expression génique initiale de la cancérogenèse hépatique. Analyse quantitative de l expression des gènes dans les carcinomes hépatocellulaires La technologie des puces à ADN a montré son intérêt dans l étude de la carcinogenèse hépatique en soulignant la grande variabilité du profil d expression génique liée à l origine de l hépatopathie mais également à l hétérogénéïté intra-tumorale (13-15). Pour le pathologiste, le diagnostic de carcinome hépatocellulaire (CHC) est parfois difficile, en particulier dans les formes très bien différenciées ou lorsque le matériel fourni pour l analyse est peu abondant. Nous avons utilisé l approche de quantification des gènes par RT-PCR en temps réel dans les CHC afin d identifier les gènes les plus spécifiques et dont l expression est susceptible d apporter une aide au diagnostic de CHC. Parmi les 206 gènes quantifiés, nous avons retenu 40 gènes dont l expression était significativement différente dans les CHC versus les prélèvements de cirrhose et de foie normal. La performance diagnostique de chaque gène pour le diagnostic de CHC a été déterminée. Un index moléculaire de CHC combinant les 13 gènes les plus performants dans ce diagnostic a été construit. Cet index a été secondairement validé dans une étude prospective incluant des CHC, des cirrhoses et des foies normaux. Trente-neuf des 40 échantillons testés ont été correctement classés par leur profil moléculaire selon l index, en aveugle du diagnostic histopathologique. Cette étude montre que l analyse quantitative, même restreinte, du transcriptome permet de définir un profil spécifique de CHC qui pourrait aider à caractériser les lésions de diagnostic histopathologique difficile, comme les macronodules hépatocytaires. Analyse quantitative de l expression des gènes dans les macronodules hépatocytaires La surveillance des patients cirrhotiques a montré que l émergence du CHC était précédée dans certains cas par l apparition, au sein du foie cirrhotique, de macronodules de Cours fondamental AFEF - L hépatologue face aux gènes : apport des nouveaux outils 26

5 régénération. Malgré un consensus sur les critères et les classifications anatomo-pathologiques de ces lésions, leur potentiel évolutif ne peut être établi dans la plupart des cas sur les seuls critères cliniques, biologiques et morphologiques. L objectif de cette étude était de classer les macronodules en fonction de leur profil moléculaire en utilisant l index établi pour les CHC et comparer ces résultats à la classification histopathologique. Pour cela, les 13 gènes de l index moléculaire défini précédemment ont été quantifiés dans une série de macronodules représentatifs des différents stades histologiques. Par cette approche, 3 groupes de macronodules ont pu être définis (index <2, 2< index <5, index >5). La corrélation avec les données histopathologiques est en cours d analyse. Analyse quantitative de l expression des gènes dans les tumeurs bénignes hépatiques Les hyperplasies nodulaires focales (HNF) sont des lésions hépatiques dont la pathogénie reste discutée, même si l hypothèse d une anomalie vasculaire artérielle primitive est la plus probable. Afin de préciser la pathogénie de ces tumeurs, nous avons quantifié l expression de 200 gènes sélectionnés dans une série de HNF. Les gènes dont l expression variait significativement (3 fois) entre HNF et foie normal ont été selectionnés et leur performance a été évaluée par la mesure des aires sous la courbe (AUC) des courbes ROC. Les résultats montrent que l expression de 7 gènes était significativement différente dans les HNF. Les plus discriminatifs étaient l angiopoiétine 1 (Ang1) et l angiopoiétine 2 (Ang2). Alors que l expression d Ang1 était significativement augmentée dans les HNF, celle d Ang2 était diminuée. Ces résultats ont été confirmés à l échelle protéique par Western Blot et immunohistochimie. La fonction physiologique de ces gènes permet de proposer une hypothèse physiopathologique dans la genèse des HNF. Cette étude, mettant en évidence une dysregulation de 2 molécules impliquées dans la vasculogenèse (Ang1 et 2) parmi plus de 200 gènes testés, montre qu une approche quantitative ciblée du transcriptome peut apporter une aide dans l exploration de la pathogénie d une lésion. En conclusion, la technique de RT-PCR «temps réel» est une alternative intéressante aux techniques de microarray. La faible quantité de matériel biologique nécessaire et l automatisation de cette technique permettent la quantification simultanée d un grand nombre de gènes. Nos travaux montrent, qu utilisée en première intention, la RT-PCR en «temps réel» s est montrée à la fois utile pour le diagnostic mais aussi pour la découverte de nouveaux gènes impliqués de la physiopathogénie des lésions hépatiques. Cours fondamental AFEF - L hépatologue face aux gènes : apport des nouveaux outils 27

6 Références 1. De Risi J, Penland L, Brown PO et al. Use of a cdna microarray to analyse gene expression patterns in human cancer. Nat Genet. 1996, 14: Chen JJ, Wu R, Yang PC, Huang JY, Sher YP, Han MH, Kao WC, Lee PJ, Chiu TF, Chang F, Chu YW, Wu CW, et al. Profiling expression patterns and isolating differentially expressed genes by cdna microarray system with colorimetry detection. Genomics. 1998, 51: Alizadeh AA, Eisen MB, Davis RE et al. Distinct types of diffuse large B-cell lymphoma identified by gene expression profiling. Nature 2000; 403: Schena M, Schalon D, Davis RW et al. Quantitative monitoring of gene expression patterns with a cdna microarray. Science 1995; 270: DeRisi JL, Iyer V, Brown PO. Exploring the metabolic and genetic control of gene expression on a genomic scale. Science 1997; 278: Holland PM, Abrason RD, Watson R, et al. Detection of specific polymerase chain reaction product by utilizing the 5-3 exonuclease activity of Thermus aquaticus DNA polymerase. Proc Natl Acad Sci USA 1991; 88: Higuchi R, Fockler C, Dollinger G, et al. Kinetic PCR analysis: real-time monitoring of DNA amplification reactions. Biotechnology 1993; 11: Gibson UEM, Heid CA, Williams PM. A novel method for real-time RT-PCR. Genome Res 1996; 6: Yamashita T, Kaneko S, Hashimoto S-I, et al. Serial analysis of gene expression in chronic hepatitis C and hepatocellular carcinoma. Biochem Biophys Res Com 2001; 282: Shackel NA, McGuinness PH, Abbott CA, et al. Insights into the pathobiology of hepatitis C virus-associated cirrhosis. Am J Pathol 2002; 160: Honda M, Kaneko S, Kawai H, et al. Differential gene expression between chronic hepatitis B and C hepatic lesion. Gastroenterology 2001; 120: Paradis V, Dargère D, Bonvoust F, et al. Clonal analysis of micronodules in virus C-induced liver cirrhosis using laser capture microdissection (LCM) and Humara Assay. Lab. Invest ; 80 : Shirota Y, Kaneko S, Honda M, et al. Identification of differentially expressed genes in hepatocellular carcinoma with cdna microarrays. Hepatology 2001; 33: Cours fondamental AFEF - L hépatologue face aux gènes : apport des nouveaux outils 28

7 14; Okabe H, Satoh S, Kato T, et al. Genome-wide analysis of gene expression in human hepatocellular carcinomas using cdna microarray: identification of genes involved in viral carcinogenesis and tumor progression. Cancer Res 2001; 61: Delpuech O, Trabut JB, Carnot F, et al. Identification, using cdna macroarray analysis, of distinct gene expression profiles associated with pathological and virological features of hepatocellular carcinoma. Oncogene 2002; 21: Cours fondamental AFEF - L hépatologue face aux gènes : apport des nouveaux outils 29