En considérant votre dernier projet de recherche, à quelle étape avez-vous en premier pensé aux statistiques?

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1 ENQUÊTE: BIOSTATISTIQUES DANS LA RECHERCHE Le but de notre questionnaire n'était pas de pointer du doigt les lacunes dans la façon qu'ont les chercheurs d'aborder les statistiques ni d'apporter de manière arrogante des explications mathématiques. Nous savons que la rigueur mathématique en statistiques se confronte à la réalité de l'expérimentation en biologie et en médecine. C'est un point que nous ne négligeons pas. En conséquence, les questions de notre enquête n'ont pas toujours de réponses tranchées "vraie ou faux" (parfois elles en ont quand même...). En considérant votre dernier projet de recherche, à quelle étape avez-vous en premier pensé aux statistiques? Lors de l'écriture de l'ébauche du futur projet Quand j'écrivais la version finale de ma demande de financement Quand j'ai commandé mes échantillons, animaux ou recruté les sujets Lors de la collecte des données Lors de l'analyse des données Lors de l'écriture de la publication Quand les reviewers / éditeurs l'ont demandé Jamais Je ne sais pas Il a été mis en avant de manière récurrente dans les directives telles que publiées par l' American Physiological society (J Appl Physiol 97: , 2004) que les statistiques devraient entrer en jeu très tôt dans le design expérimental. Des groupes expérimentaux appropriés et les tailles d'échantillons correctes devraient être déterminées au plus tard quand les échantillons, animaux ou patients sont collectés ou recrutés. La possible distribution normale de la variable d'intérêt, la variance (donc ll'écart type) par exemple devraient être estimées via des expériences préliminaires de manière à préparer les futures analyses de la grande expérience...etc Bien sûr, dans le monde réel, avec des contraintes réelles, les statistiques peuvent passer au second plan lors de l'écriture du projet. Par ailleurs, la planification statistique à des étapes précoces n'est parfois pas possible. Par exemple, il est fréquent qu'une expérience soit planifiée en utilisant des échantillons collectés d'un projet précédent: la taille de l'échantillon peut ainsi ne pas être adaptée aux paramètres (normalité, moyenne, variabilité...) de la nouvelle variable mesurée, mais il serait cher, peu éthique ou même impossible d'obtenir de nouveaux sujets. Néanmoins si cette situation se présente, les chercheurs doivent garder à l'esprit la possible faible puissance statistique de leur étude (i.e. un haut risque de ne pas détecter une différence existante entre deux groupes). A Biotelligences, nous pensons que de telles limites devraient être clairement dévoilées dans le texte des publications. Il ne devrait alors y avoir aucune surprise si un autre laboratoire étudiant le même processus biologique publie une différence statistiquement significative en utilisant de plus grands échantillons... Ils sont simplement plus puissants (statistiquement parlant!). Inutile d'ajouter que penser aux statistiques pour la première fois seulement lorsque les reviewers le demandent devrait être vue comme une très mauvaise option. Très mauvaise! 1

2 Selon vous, à propos de la taille d'échantillon (n) d'une expérience, lesquelles des propositions suivantes sont vraies? Elle peut être ajustée au cours du développement du projet Elle doit être déterminée avant de démarrer les expériences Elle doit être grande pour garder l'écart type de la population échantillonnée faible La taille de l'échantillon se décide principalement en fonction de la technique utilisée pour analyser les échantillons Bon, vous le devinez: c'est la continuité de la question précédente. La taille d'un échantillon devrait être déterminée avant que le projet ne commence. L'addition de nouvelles observations (cellules, animaux, patients...) est souvent décidée car une "tendance" (en général définie comme une p-value approchant sans atteindre 0.05) est observée en analysant la différence entre les groups. Il pourrait sembler logique que de nouvelles observations soient ajoutées. Cependant cela génère une augmentation dramatique de la probabilité d'obtenir une erreur de Type I (i.e. trouver p<seuil et conclure à une différence, alors que cette différence est observée seulement par hasard). Concernant la troisième affirmation, la taille de l'échantillon n'a pas une influence systématique sur l'écart type (SD) de l'échantillon, qui reflète fidèlement l'écart type réel de la population échantillonnée. L'écart type (SD) ne doit pas être confondu avec l'erreur standard à la moyenne (SEM) qui est une propriété de l'échantillon (précision de mesure), elle influencée par la taille de l'échantillon. La dernière affirmation est proche du non-sens. Cependant, nous la considérons tous intuitivement comme vraie (oui "nous" car l'auteur de ce questionnaire est un biologiste). Le choix de la taille de l'échantillon est influencé par la variabilité (écart type), la différence attendue entre les groupes et les risques α et β acceptés (respectivement le risque de conclure à une différence quand il n'y en a pas, et le risque de conclure à une absence de différence quand il y en a une). Mais il n'est pas inhabituel d'entendre dans les laboratoires: "...ok, commandons 10 animaux pour le comportement, c'est suffisant pour le comportement", ou encore "...pour la RT-PCR un échantillon de 5 est suffisant..." Malgré cette apparente sagesse commune empirique, les variances et changements induits ne sont pas les mêmes dans différent tests comportementaux ou entre différents gènes, de ce fait des tailles d'échantillon différentes devraient être utilisées... Mais ici encore, dans le monde réel il n'est pas toujours possible d'obtenir de nouveaux animaux ou de nouveaux cdna... Imaginez la situation où vous comparez les moyennes de deux groupes en utilisant un test t de Student. Pour vous, laquelle/lesquelles des propositions suivantes correspondent à la situation où p=0.05? On peut être sur qu'il existe une différence entre les deux groupes de données Il y a 5% de chances d'avoir tort si on suppose que l'effet observé est biologiquement important Il y a une probabilité de 5% d'observer cette différence entre les groupes alors que les deux moyennes sont en fait identiques Si on accepte l'hypothèse H0, il y a une forte probabilité d'obtenir un faux résultat négatif Le concept de p-value est difficile à manipuler et de nombreuses idées fausses persistent dans la communauté scientifique. Comme souligné dans la littérature (par exemple Cumming G IASE 2010; Fidler F et al. Psychol Sci 2004), les p-values sont hautement variables même lorsque les échantillons sont issus d'une même population, et leur interprétation n'est pas bien maîtrisée par les chercheurs. 2

3 Les analyses des intervalles de confiance à 95% devraient être préférées par rapport aux p-values pour interpréter les différences entre les groupes. Première affirmation: NON! Vous n'avez aucune certitude concernant la différence. La p-value donne une probabilité, jamais une certitude! Deuxième affirmation: NON! La p-value ne vous informe pas sur l'importance biologique (magnitude) de votre effet, elle vous donne une indication sur la probabilité d'avoir une telle différence entre les groupes par chance même dans le cas où les deux moyennes sont en réalité similaires dans les populations échantillonnées. Le calcul de l'intervalle de confiance à 95% de la différence entre les groupes expérimentaux est plus utile pour discuter la magnitude, mais cette conclusion finale sera vôtre... aucun logiciel ou modèle mathématique ne remplacera votre expertise. Troisième affirmation: et bien oui, c'est une des façons de définir la p value. Dernière proposition: H0 (hypothèse nulle que vous, ou votre logiciel, formulez avant de faire le test) postule que les deux moyennes (ou quoique vous comparez) sont identiques... Si vous acceptez H0 quand p=0.05 (ce qui en général arrive quand p>0.05) vous avez en effet de grandes chances t'obtenir un faux résultat négatif. Selon vous, laquelle/lesquelles des propositions suivantes est/sont vraie/s concernant les barres d'erreur montrées sur les graphiques? Elles doivent être montrées car elles montrent la variabilité de l'échantillon L écart type (SD) est plus approprié que l'erreur standard à la moyenne (SEM) pour montrer la variabilité de la population Des erreurs standards à la moyenne (SEM) qui ne se recouvrent pas entre deux groupes indiquent que le test statistique donnera p<0.05 Les barres d'erreur sont plus petites quand le nombre d'observations (n) augmente La question des barres d'erreur est importante et souvent peu prise en compte par les scientifiques en Sciences de la Vie (voir Cumming et al. J Cell Biol, 2007). Les barres d'erreur fournissent au lecteur des informations sur la distribution des variables mesurées, mais elles ne montrent pas toujours la variabilité de l'échantillon. Par exemple, l'erreur standard à la moyenne (SEM) est la barre d'erreur la plus utilisée en biologie (souvent incorrectement), elle n'indique PAS la variabilité de l'échantillon ou de la population: elle montre la variabilité de la moyenne si l'étude était répétée. Inversement, l'écart type (SD) d'un échantillon est une bonne estimation de la variabilité dans la population initiale. Il convient d'être très prudent avec la règle empirique qui dit que "des SEM qui ne se recouvrent pas donnent p<0.05"... L'espacement entre les erreurs standard peut en effet être utilisé pour déterminer la significativité statistique, mais quelques instructions doivent être respectées. Par exemple cette règle est très dépendante de la taille de l'échantillon. Si n=3, alors p<0.05 seulement si l'espace entre les barres d'erreur équivaut à deux bras de la SEM. Si n=10, alors p<0.05 si cet espace équivaut à un bras de la SEM... De fait, aucune règle automatique ne dit que des SEM non-chevauchantes sont suffisantes, en particulier si la taille des groupes est faible (3 à 10) comme fréquemment en biologie. Enfin, l'écart type (SD) de l'échantillon est un exemple de barre d'erreur qui est influencé de manière très marginale par la taille d'échantillon, et l'amplitude (range, qui est l'écart entre les valeurs extrêmes de l'échantillon) est une barre d'erreur qui s'élargit lorsque n augmente. 3

4 Selon vous, quelle/s affirmation/s est/sont vraie/s à propos des barres d'erreur montrées dans les publications? L'erreur standard à la moyenne (SEM) donne des informations sur la variabilité dans l'échantillon L'écart type (SD) n'est pas modifié quand la taille de l'échantillon (n) augmente L'intervalle de confiance à 95% montre l'intervalle dans lequel 95% des valeurs se trouvent L'intervalle de confiance à 95% est un bon indicateur du degré de précision avec lequel la moyenne de la population échantillonnée a été estimée Nous supposons que maintenant vous avez une idée concernant les deux premières propositions. La définition de l'intervalle de confiance à 95% est l'intervalle de valeurs dans lequel on peut être à 95% sur de trouver la moyenne réelle de la population échantillonnée. En conséquence, l'affirmation 3 n'est pas correcte et la proposition 4 correcte. Selon vous, laquelle/lesquelles des affirmations suivantes correspond/ent aux tests nonparamétriques? Ils ne pré-supposent pas que la population échantillonnée suive une distribution gaussienne Ils sont plus sensibles aux valeurs aberrantes (outliers) que les tests paramétriques Ils n'utilisent pas la moyenne et l'écart type (SD) pour calculer la p-value Quand la taille de l'échantillon est faible ils ont la même puissance que les tests paramétriques Les tests non-paramétriques sont basés sur moins de "suppositions" pour calculer une comparaison. Parmi ces "non suppositions", ils ne supposent pas que les données suivent une distribution gaussienne. Les tests non-paramétriques fonctionnent en classant les variables obtenues et se focalisent sur ces classements et non sur les valeurs individuelles des variables. Ils ne regardent pas les paramètres gaussiens habituels (d'où leur nom) des échantillons tels que la moyenne ou l'écart type. Vous noterez ici à quel point il est donc étrange de montrer moyenne, écart type (SD) ou erreur standard (SEM), paramètres gaussiens dans les publications quand un test non-paramétrique est réalisé... Bonne nouvelle: ces tests sont bien moins sensibles aux valeurs extrêmes que les tests paramétriques, car ils n'utilisent pas les valeurs individuelles! Peu importe si la valeur est 1 log ou 3 logs au dessus de la médiane et au dessus des valeurs dans l'autre groupe, elle sera simplement classée "au dessus". Mauvaise nouvelle cependant, ces tests sont moins sensibles, tout simplement! En utilisant moins de suppositions, ils "ignorent" beaucoup d'information et sont de ce fait moins puissant que des tets paramétriques. D'où des p values plus élevées. Imaginez une expérience dans laquelle vous comparez deux groupes expérimentaux (n= 20 dans chaque groupe). La collecte des données se passe bien, mais les résultats montrent une limite de détection pour les valeurs extrêmes <u>dans un groupe seulement</u> (faible sensibilité pour les 5 plus faibles valeurs). Vous ne pouvez pas recommencer une autre expérience. Selon vous, que convient-il de faire? Faire un test t de Student avec les valeurs restantes disponibles Donner des valeurs arbitraires extrêmement faibles aux points manquants et conduire un test nonparamétrique Présenter le graphique sans mentionner ces points "hors limite" 4

5 Présenter le graphique en mentionnant les valeurs manquantes comme des "points aberrants" (outliers) sans les montrer Présenter le graphique avec les points indiqués Les valeurs "hors-gamme" sont très fréquentes dans les tests biologiques tels les ELISA ou les qrt- PCR. L'exclusion complète des valeurs non-détectées génère un fort biais dans les résultats, en particulier si elle n'affecte qu'un groupe. Même si la distribution initiale est gaussienne, un test paramétrique tel qu'un test t de Student n'est pas recommandé du tout! De manière surprenante peut être, une conduite à tenir est d'assigner des valeurs arbitraires aux données hors gamme. Dans la mesure où les tests non-paramétriques classent les observations sans tenir compte des valeurs numériques, la valeur arbitraire donnée n'influencera pas le résultat du test si elle respecte le rang correct de l'observation. Ce dernier point ne pose en l'occurrence pas de problème car une seul groupe montre de telles valeurs, elle se verront assigner a un plus faible rang que celles de l'autre groupe de toutes façons. Notre opinion est que: - Si le graphique montre des valeurs individuelles, les données manquantes devraient être montrées sur le graphique, toutes alignées, et la limite de détection montrée; - Si le graphique ne montre pas de valeurs individuelles (histogramme, boxplots...), le texte devrait donner une description de la procédure de test. Par exemple: "5 values were off limits for the experimental group xxx. Arbitrary low values were attributed to these observations and a nonparametric test (donner le nom du test test...) was performed..." 5

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