Biofilm de L. pneumophila : analyse globale de l expression des gènes et relation avec le Fer

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1 Biofilm de L. pneumophila : analyse globale de l expression des gènes et relation avec le Fer Thomas Hindré 1, Holger Bruggeman 2, Carmen Buchrieser 2 et Yann Héchard 1 1 Laboratoire de Chimie de l'eau et de l'environnement Equipe Microbiologie Fondamentale et Appliquée, UMR CNRS 6008, Poitiers 2 Unité de Génomique Moléculaire des Pathogènes, Institut Pasteur, Paris

2 Legionella pneumophila Genre Legionella (Fraser et al., 1977; Brenner et al.,1979) - Établi en 1979 suite à une épidémie de pneumonie lors d une réunion de la Légion Américaine - Légionellose : pneumonie sévère, environ 1000 cas/an en France - Bacille Gram négatif, aérobie, flagellé - 48 espèces identifiées (Fields et al., 2002) Espèce Legionella pneumophila (15 sérogroupes) - 98,6% des isolats cliniques du genre Legionella en France (Aurell et al., 2003) - Sérogroupe 1 : 80% des cas de légionellose avérés - Trois génomes connus : L. pneumophila Lens, Paris (Cazalet et al., 2004) et Philadelphia (Chien et al., 2004) Colonisatrice des milieux d'eau douce - environnements naturels (lacs, rivières ) - environnements artificiels (réseaux d eau, spas, climatisation, tours aéroréfrigérantes )

3 Cycle biologique de L. pneumophila D après Molmeret et. al 2004 Forme intracellulaire - dans les protozoaires : amibes libres - dans les macrophages alvéolaires humains : infection par inhalation d aérosols contaminés Forme libre - planctonique : cellules libres - sessile : colonisation des biofilms

4 Les amibes libres - Protozoaires (Acanthamoeba, Hartmanella, Naegleria ) se nourrissant de bactéries, en particulier dans le biofilm, par phagocytose - Certaines bactéries, comme Legionella, résistent à la digestion et se multiplient dans l amibe - Seule niche de multiplication connue de Legionella - Rôle dans la protection contre les traitements - Terrain d entraînement pour les bactéries infectant les macrophages

5 Legionella pneumophila et les biofilms Étude des biofilms naturellement présents dans l'eau : - Micro-colonies en absence de protozoaires (Rogers et al., 1992) croissance extracellulaire au sein des biofilms? - Pas de multiplication en absence de protozoaires (Kuiper et al., 2004) persistance au sein des biofilms Rogers et al., µm Étude de biofilms mono-espèce modèles : (Piao et al., 2006) variation selon les espèces et les souches différences de structure du biofilm : 37 et 42 C = croissance en structure "micellaire " 25 C = croissance en structure "champignon " Piao et al., µm Pas/peu d'étude de l'état physiologique des cellules sessiles Pas d'étude de l'expression génétique des cellules sessiles

6 Objectifs de l étude Caractérisation moléculaire de l adaptation de L. pneumophila dans un biofilm 1- Comparaison de l expression des gènes dans les cellules sessiles par rapport au cellules planctoniques 2- Comparaison de la formation de biofilm par L. pneumophila sauvage et mutantes Projet soutenu par l AFSSET

7 Biofilms modèles Réalisation de biofilms modèles - Mono espèce : L. pneumophila - Support polystyrène : Microplaque 96 puits ou flasque de culture cellulaire - Suivi croissance : coloration au cristal violet et mesure DO 595 nm Loin des conditions «naturelles» mais 1ère étape indispensable pour l étude de l expression des gènes

8 Effet de la température sur la formation de biofilm par L. pneumophila Lens et Paris 20 C 37 C 42 C Croissance DO 595 0,1 Lens Paris 0,1 Lens Paris 0,1 Lens Paris 0,01 0,01 0, Temps (h) Temps (h) Temps (h) Formation de biofilm DO 595 ratio 1,5 1 0,5 1,5 1 0,5 1,5 1 0, Lens Paris Lens Paris Lens Paris Les souches Lens et Paris diffèrent par leur capacité à former des biofilms La formation de biofilm par la souche Lens est favorisée à 20 C

9 Influence de la phase de croissance sur l'adhésion de L. pneumophila Lens et Paris à 20 C 0,7 0,6 Phase exponentielle 0,5 Phase stationnaire 0,4 Phase stationnaire tardive DO 595 0,3 0,2 0,1 0 Lens Paris Figure 2 : Adhésion de L. pneumophila Lens et Paris à 20 C Meilleure adhésion de la souche Lens quelque soit la phase de croissance L'adhésion est favorisée après l'entrée en phase stationnaire de croissance

10 Analyse globale de l expression des gènes Biofilms en flasques de culture Incubation 14 j à 20 C Récolte de 3 échantillons de cellules : cellules de départ «ensemencement» cellules en «suspension» après incubation cellules adhérées, «sessiles» Microarrays (puces à ADN) Préparation des ARN totaux Transcription inverse en ADNc et marquage fluorescent Hybridation sur microarrays : 3823 oligonucléotides (70-mer) représentatifs des génomes de L. pneumophila Lens, Paris et Philadelphia Analyse statistique des résultats d hybridation

11 Gènes spécifiquement régulés au sein du biofilm Ratio sessile versus lpl number Description Inoculation Suspension lpl0660 Similar to hypothetical protein 0,16 0,15 lpl1853 Similar to hypothetical protein 0,23 0,19 lpl2916: atpb Highly similar to H+-transporting ATP synthase chain a 6,31 3,06 lpl0236 Similar to pyoverdine biosynthesis protein PvcA 3,21 4,10 lpl0237 Similar to pyoverdine biosynthesis protein PvcB 3,95 3,71 lpl2271 Similar to alkyl hydroperoxide reductase AhpD 10,74 9,78 lpl2272 Similar to alkyl hydroperoxide reductase AhpC 30,72 23,30 lpl2032 Similar to transposase 4,77 3,64 lpl0482 Unknown 3,87 4,03 lpl1129 Unknown 3,15 6,78 lpl2462 Unknown 3,08 5,44 lpl2719 Unknown 3,59 4,09 lpl2728 Unknown 3,12 4,27 lpl2780 Unknown 3,14 3,45 14 gènes = 0,47% du génome (> ±3), 6 gènes avec une fonction potentielle Alkylhydroperoxide réductase : protection contre les radicaux libres oxygène et/ou azote Pyoverdine : système d acquisition du Fer chez Pseudomonas

12 Pyoverdine et Pseudomonas Pyoverdine - ferrisidérophore - permet l'acquisition du Fe(III) - surexprimée en cas de carence en Fe F e Gènes associés à la synthèse de la pyoverdine Fonction Synthèse du peptide Synthèse du chromophore Modification du peptide Régulation Récepteur Inconnue Gène pvdd, pvdijk pvcabcd pvda, pvdf pvds, fpvi, fpvr fpva pvdr, pvde Influence du fer sur la formation de biofilm par P. aeruginosa (Banin et al., 2005) - Inhibition en milieu totalement dépourvu de fer - Inhibition en milieu trop riche en fer (> 100µM)

13 Locus pvc chez P. aeruginosa et L. pneumophila P. aeruginosa PAO1 L. pneumophila Lens P. aeruginosa : (Stintzi et al., 1996; 1999) - opéron pvcabcd - régulateur transcriptionel ptxr - induction en milieu carencé en fer L. pneumophila : - lpl0236 : pvca like - lpl0237 : pvcb like - lpl0238 : similaire à FAD monooxygenase - lpl0239 : similitude avec transporteurs - lpl0240 : fonction inconnue Les loci pvc diffèrent par leur organisation Les gènes pvcc, pvcd et ptxr sont absents chez L. pneumophila L. pneumophila ne produit pas la pyoverdine mais la légiobactine (Liles et al., 2000) Rôle des gènes pvc chez L. pneumophila?

14 Étude de l expression des gènes pvcab chez L. pneumophila Lens Taux d'induction déterminé par Expression relative Arrays qrt -PCR Pyrophospate de Fer (g/l) Sess. vs Sess. vs Sess. vs. Sess. vs Gene susp. stat. susp. stat lpl2036: pvca lpl2037: pvcb Validation des résultats de microarrays par RT-PCR quantitative Induction de l expression de pvca et pvcb par le pyrophosphate de fer Effet inverse de la production de sidérophore! La disponibilité en fer influence l expression des gènes pvc La concentration en fer pourrait être supérieure dans le biofilm

15 Effet du fer sur la formation de biofilm 1 Croissance 1,5 Formation de biofilm OD 595 0,1 OD 595 ratio 1 0,5 0, ,12 0,25 1,25 g/l Time (min) Iron concentration Pas d'effet du fer sur la croissance planctonique L'excès de pyrophosphate de fer inhibe la formation de biofilm

16 Et maintenant Relation entre pvc et ahp? Stress oxydatif, Fe 3+ peut induire la formation de radicaux hydroxyl à partir de H 2 O 2 Rôle des produits des gènes pvc chez Legionella Analyse de la formation de biofilm modèles : - mutants des gènes pvc et ahp - mutagenèse aléatoire par transposition - action du peroxyde d hydrogène sur la formation de biofilm Réalisation de biofilm complexes (multi espèces, eau naturelle ) pour valider les premiers résultats obtenus : - expression de pvc et ahp dans ces conditions - rôle du fer et du peroxyde d hydrogène sur la présence de Legionella dans ces biofilms

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18 Les biofilms Communauté microbienne sessile (Donlan et al., 2002) : - irréversiblement fixée à un support - incluse dans une matrice extracellulaire sécrétée - possédant un phénotype particulier en terme de vitesse de croissance et d'expression génétique Substrate Stephens et al., 2002 Mode de vie prédominant dans l'environnement: - communautés microbiennes multi-espèces - mode de vie sessile avantageux pour les bactéries du fait de la présence de la matrice (concentration des nutriments, protection contre les aggressions extérieures) - phénotype particulier : moins grande sensibilité aux agents antimicrobiens

19 Profil global d'expression génétique Comparaison sessile versus ensemencement : - 4,48% du génome (> ±3) : - 32 gènes réprimés : fonction inconnue (27) gènes induits : ATP synthase (9), métabolisme (12), réplication + transcription + traduction (48) fonction inconnue (23) Comparaison sessile versus suspension : - 3,15% du génome (> ±3) : - 44 gènes réprimés : métabolisme (6), membrane (5), transport/sécrétion (8) fonction inconnue (17) - 49 gènes induits : métabolisme (5), adaptation + détoxication (5), fonction inconnue (35) Sélection des gènes dont l expression est altérée de façon similaire dans les deux comparaisons