Modèle Cellulaire pour les Cancers de l Oropharynx VPH Induits

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1 Congrès de l AORLQ - Octobre 2012 Modèle Cellulaire pour les Cancers de l Oropharynx VPH Induits Monika Knapik MD Guillaume Cardin M.Sc Francis Rodier Ph.D Apostolos Christopoulos MD, FRCSC Division d ORL & CCF Université de Montréal Centre Hospitalier de l Université de Montréal

2 Introduction Cancers de la tête et du cou Facteurs de risque : Tabac & Alcool 80% Cancers de la tête et du cou Virus du Papillome humain (VPH/HPV) 25-30% Cancers de la tête et du cou HPV + 50% Cancers de oropharynx HPV+ Amygdales et base de langue Sous-types HPV16 & HPV18

3 Introduction Malgré les progrès thérapeutiques au cours des 20 dernières années, le taux de survie à cinq ans pour tous les cancers ORL ne s est que légèrement amélioré La compréhension de la biologie moléculaire du cancer et l'identification des gènes impliqués sont des éléments clés afin de permettre le développement de nouvelles thérapies ciblées

4 Objectifs Caractériser un modèle de culture cellulaire pour les cancers de l oropharynx HPV+ 1. Dériver des lignées isogéniques à partir de Kératinocytes primaires (HEKn) Cellules épithéliales de l oropharynx (HNOE) 2. Valider la carcinogenèse de notre modèle in vitro 1. Valider la carcinogenèse de notre modèle in vivo

5 Mécanismes moléculaires E6 E7 p53 Perte des points de contrôles du cycle cellulaire prb Prolifération aberrante Apoptose p53 E6 Immortalisation Instabilité génomique Transformation

6 Stratégie htert Immortalization E6 & E7 Oncogènes viraux RAS Oncogène transformant E6 E7 p53 Perte des points de contrôles prb Prolifération aberrante Apoptose p53 E6 Immortalisation htert Instabilité génomique Transformation RAS

7 Méthodologie et Résultats Système Gateway de Lentivirus Infection successive par transduction Kératinocytes Normaux Kératinocytes Transformés htert E6 E7 RAS Hygro Néo Blast Puro htert htert-e6 htert-e6-e7 htert-e6-e7-ras

8 Validation de l expression des transgènes PCR quantitatif reverse transcriptase en temps réel Immunofluorescence Western Blot

9 Florescence normalisée Florescence normalisée Florescence normalisée qrt-pcr E6 et E7 HEKn htert-e6-e7 CaSki (contrôle positif VPH-16) BJ (contrôle négatif VPH-16) Contrôle sans ADN VPH-16 E6 HEKn htert-e6-e7 CaSki (contrôle positif VPH-16) BJ (contrôle négatif VPH-16) Contrôle sans ADN VPH-16 E7 HEKn htert-e6-e7 CaSki (contrôle positif VPH-16) BJ (contrôle négatif VPH-16) Contrôle sans ADN TBP (contrôle du niveau de protéine)

10 Contrôle htert-e6-e7 PGK-RAS Expression de RAS Anticorps anti-ras RAS Bleu (ADN) Vert (RAS) Blue (ADN) Vert(RAS) β-actine htert-e6-e7 htert-e6-e7-pgk-ras

11 Doublement populationnel Courbes de croissance des kératinocytes HEKn Sénescence dépendante p53 & prb HEKn Jours en culture

12 Doublement populationnel Courbes de croissance des kératinocytes HEKn Sénescence Dépendante du raccourcissement des télomères & prb E6 20 HEKn 10 0 E Jours en culture

13 Doublement populationnel Courbes de croissance des kératinocytes HEKn Immortalisation htert-e6 20 HEKn 10 htert E Jours en culture

14 Population Doubling Courbes de croissance des kératinocytes HEKn htert-e htert-e6-e htert E6 E7 HEKn Days in culture

15 Population Doubling Courbes de croissance des kératinocytes HEKn htert-e htert-e6-e7- Ras htert E6 E7 RAS HEKn Jours en culture

16 Étude d Invasion en Matrigel 1% 1% 10% 24 heures 10% 1% 10% 24 heures htert-e6-e7-ras

17 Carcinogenèse in vivo Contrôle Kératinocytes primaires htert htert-e6 htert E6 E7 htert-e6-e7 htert-e6-e7-ras RAS Cellules Transformées Introduction chez des souris nues immunodéficientes

18 Carcinogenèse in vivo

19 Carcinogenèse in vivo

20 volume (mm3) Injections des populations cellulaires transformées K-hTERT-E6-E7-Ras K-hTERT-E6-E7-Ras jours

21 volume (mm3) Carcinogenèse in vivo SCID Hek RAS sans fibroblaste sans matrigel SCID Hela sans fibroblaste sans matrigel jours

22 Mécanismes moléculaires p53 E6 E7 Perte des points de contrôles prb Prolifération aberrante Apoptose p53 E6 Immortalisation htert Instabilité génomique X Transformation RAS

23 Conclusion Nous avons réussi à immortaliser nos cellules Nous avons réussi à exprimer les transgènes (htert, E6, E7,RAS) Nous avons dérivé des lignées cellulaires épithéliales de l oropharynx Nous avons réussi à valider la carcinogenèse in vitro par des études d invasion en matrigel E6 seul ne suffit pas pour immortaliser les cellules En présence de E6 et E7, il y a un 3 e mécanisme suppresseur de tumeur qui médie la SI-Ras

24 Merci Guillaume Cardin Nawel Mechtouf Kim Leclerc Dr Francis Rodier Dr Apostolos Christopoulos Bourse Sciences Biomédicales Bourse CRCHUM ICM- René Malo

25 Normal Keratinocytes (htert+) htert E6 & E7 Transformed Keratinocytes RAS 1 Genetic modifications E6/E7, RAS 2 Compound libraries RNAi-mediated loss of function 3 Irradiation 4 Detection of DNA repair Measurements of viability / proliferative potential RIP

26 Cell lines +Ras +E6 & E7 HCK1T Time? Time? 1. Serum adaptation is necessary for cells to tolerate RAS 2. Prolonged culture allow for the accumulation of unknown mutations + htert + Serum Time? PD HCK1 (defined cell culture media) time

27 Oropharyngeal cell lines Epithelium harvesting Culture 5 Attempts 3 Cell lines HNOE42 HNOE45 HNOE46 HNOE42-E6 HNOE42-hTERT-E6 HNOE42-hTERT-E6-E7 HNOE45-E6 HNOE45-hTERT-E6 HNOE46-E6 HNOE46-hTERT-E6

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