Dr Céline RENE. Qu est ce une CSH? La CSH. Faculté de Médecine Montpellier-Nîmes. Des cellules multipotentes Free Powerpoint Templates

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1 Greffe de Free CSH Powerpoint Templates Qu est ce une CSH? MASTER 1 IMMUNOPATHOLOGIE 2011 Cellule multi-potente: cellule capable de régénérer plusieurs populations cellulaires d un dun tissu ou organe donné Chez l homme: localisé dans le sang de cordon et la moelle osseuse. Faible % circulant dans le sang périphérique. Lin- CD34+ CD38- C-kit+ CD133+ CSH Page 1 Page 2 La CSH Auto renouvelable Capable de restaurer l hématopoièse Des cellules multipotentes Transport de l oxygène Défenses de l organisme Système immunitaire Hémostase Coagulation Page 3 Page 4

2 Types de greffe de CSH LES SOURCES DE CSH Greffe de CSH autologue - intensification thérapeutique suivie d une réinjection de CSH (limite la durée d aplasie) - Pas de Trt I.S - Risque de contamination du greffon. - Principe ++++ et source (CSP) - Pas d effet GVL - Pas de rejet - Mortalité basse et rechute élevée - Indications: MM, Lymphome Greffe de CSH allogénique - Permet une chimio i agressive - Nécessite un donneur HLA compatible - Remplace la moelle malade et le système immunitaire. - TRT I.S - Principe et source(csp,mo, CB) - Effet G.V.L - Risque de rejet. - Mortalité élevée é et rechute basse - Indications :AM sévère,déficit I sévère Page 5 Page 6 Origine des CSH du greffon Le don de CSP Moelle osseuse : AG, hospitalisation Cellules souches périphériques : pas AG ni hospitalisation mais facteur de croissance G-CSF injecté au donneur Mobilisation des Cellules Souches Hématopoïétiques par injection de facteurs de croissance (G-CSF) pendant 5 jours Prélèvement par aphérèse Sang de cordon : nb fini de cellules, congélation Page 7 Page 8

3 Sang (CSP) versus Moelle Nombre de cellules x 10 Prise plus rapide Incidence GVH aiguë? idem Incidence GVH chronique: augmentée Conséquences pour le donneur Législation: simplifiée Le sang Free placentaire Powerpoint Templates (USP) Historique 1981 : Découverte des CSH dans le sang placentaire 1988 : Première greffe intra familiale 1992 : Création de la 1ère banque de SP (New York Blood Center) 1993 : Première greffe non apparentée 1999 : Création du Réseau Français de Sang Placentaire Page 9 Page 10 Le sang placentaire Cryopréservation du sang placentaire Sous forme de sang total Après miniaturisation Sg de cordon vs donneur sur pied Avantages: -facilité et sécurisation du prélèvement et conservation à long terme permet de l obtenir rapidement - pas inconvénients du au donneur: age, relocalisation, compliance - réduit le risque viral -Cellules T immatures et capacité des CPA diminuée permet une incidence moins importante de GVHD -permet les greffes avec plusieurs mismatch - permet de cibler des minorités ethniques Inconvénients: - un délai de prise de greffe plus long et un taux de non prise plus important si la dose de cellules pas assez importantes. - pas de possibilités d obtenir des leucocytes du donneur dans les cas de rechute. Page 11 Page 12

4 La Greffe de CSH Allogéniques LES INDICATIONS Objectifs : Destruction de la Moelle Osseuse du Receveur. Remplacement par la Moelle Osseuse et le Système Immunitaire du Donneur. Applications : Cancers hématologiques gq (leucémies, lymphomes...) Pathologies hématologiques non-malignes (aplasies, hémoglobinopathies...) Page 13 Page 14 Hémopathies malignes Affections malignes Greffe si rémission complète (RC) -LAL: - enfant: si >1 an en cas de classement en groupe de haut risque si la maladie résiduelle est positive après induction. - Chez adulte -LAM -LMC -Lymphome non hodgkinien si échec de l autogreffe -Maladie de Hodgkin: si echec de l autogreffe -Myélome -myélodysplasie y -LLC tumeurs solides Quelques cas d allogreffe (plus fait) plutot autogreffes La Greffe de CSH Allogénique Processus de guérison de la greffe de CSH : Deux mécanismes Effet myéloablatif et anti-tumoral de la chimio et de la radio-thérapie précédant la greffe. Capacité des cellules l immunes du Greffon à reconnaître et éliminer les cellules cancéreuses. (Effet Graft versus Leukaemia, GvL) Page 15 Page 16

5 Autres indications de greffe Aplasies médullaires Hémoglobinopathies (βthalassémie,drépanocytose) Maladies métaboliques (adrénoleucodystrophie, MPS) DICS ENQUETE HLA Page 17 Page 18 Donneur HLA compatible dans Free la Powerpoint Templates famille: Oui DONNEUR GENO- IDENTIQUE GREFFE FAMILIALE Histocompatibilité HLA Non Indication greffe CSH maintenue Non PAS DE GREFFE Oui Recherche d'un donneur non apparenté : DONNEUR PHENO-IDENTIQUE Prélèvement sanguin dont on isole les lymphocytes circulants Page Page 20

6 Caractéristiques du CMH Très polymorphe: faible probabilité pour que 2 individus non apparentés aient une identité complète. Le plus polymorphe du génome. Se définit au niveau populationnel. Pour un individus donné, pas de variation des molécules CMH, toujours les mêmes. Dus à plusieurs caractéristiques: - Multi-allélisme: de nombreux variants de chaque gènes Le polymorphisme HLA Classe I Classe II Locus N Locus N A 1519 DRB1 873 B 2069 DQB1 144 C 1016 DPB1 145 Autres 117 Autres 191 TOTAL 4721 TOTAL 1353 Page 21 D après Page 22 La fréquence des allèles varie selon les populations Page 23 Page 24

7 Caractéristiques du CMH Caractéristiques du CMH Très polymorphe: faible probabilité pour que 2 individus non apparentés aient une identité complète. Le plus polymorphe du génome. Se définit au niveau populationnel. Pour un individus donné, pas de variation des molécules CMH, toujours les mêmes. Dus à plusieurs caractéristiques: - Multi-allélisme: de nombreux variants de chaque gènes - Polygénie: plusieurs gènes pour des protéines ayant la même fonction Très polymorphe: faible probabilité pour que 2 individus non apparentés aient une identité complète. Le plus polymorphe du génome. Se définit au niveau populationnel. Pour un individus donné, pas de variation des molécules CMH, toujours les mêmes. Dus à plusieurs caractéristiques: - Multi-allélisme: de nombreux variants de chaque gènes - Polygénie: plusieurs gènes pour des protéines ayant la même fonction co-dominance: expression des allèles maternels et paternels Page 25 Page 26 Caractéristiques du CMH Très polymorphe: faible probabilité pour que 2 individus non apparentés aient une identité complète. Le plus polymorphe du génome. Se définit au niveau populationnel. Pour un individus donné, pas de variation des molécules CMH, toujours les mêmes. Dus à plusieurs caractéristiques: - Multi-allélisme: de nombreux variants de chaque gènes - Polygénie: plusieurs gènes pour des protéines ayant la même fonction co-dominance: expression des allèles maternels et paternels Page 27 Augmentation du nombre de molécules de CMH différentes susceptibles de présenter des antigènes Page 28

8 Page 29 Page 30 Page 31 Page 32

9 Technique Free Powerpoint SBT Templates (Sequence Based Typing) - amplification avec primers spécifiques des groupes déterminés en basse résolution - PCR de séquençage avec un primer pour chaque exon Avantage : lève des ambiguités, détection de nouveau allèle Page 33 Page 34 Définition du «matching» HLA A*23:01 Patient Niveau de Matching Typage Allélique Donneur A*23:01 Typage ADN Basse résolution A*23 Typage Sérologique Typage résolution intermédiaire A23 A*23:ANPV (A*23:01/03/05/06/07) Page 35 Page 36

10 Degré de Free compatibilité Powerpoint Templates nécessaire Effet du HLA sur probabilité de survie - Dépend de la maladie - Dépend de la source de CSH considéré Donneur CSH: >9-10/10 (12 ème ) Résolution allélique A, B, C, DR, DQ, (DP) USP: 4-5 ou 6/ 6 ème A, B, en générique DRB1 en Allélique si 2USP au moins 4/6 entre elles > CNT/kg > CD34/kg Page 37 Page 38 Free Syrenad Powerpoint Templates LE REGISTRE France GREFFE DE MOELLE Module du site de l agence de biomédecine Accès uniquement pour personnes autorisées Page 39 Page 40

11 Inscription Free Powerpoint sur Templates patient REGISTRE FRANCE GREFFE DE MOELLE REGISTRE NATIONAL DE Free DONNEURS Powerpoint DE CELLULES TemplatesSOUCHES HÉMATOPOÏÉTIQUES ORGANISATION 32 CENTRES DONNEURS NATIONAUX Liaisons Internet DONNEURS et USP NON APPARENTES FGM SYRENAD PATIENTS NATIONAUX Liaisons Internet 30 CENTRES CENTRES ALLO- GREFFEURS NATIONAUX Page DVMO Nx et 5422 USP Nles Recherche de donneurs français patients internationaux inscrits sur FGM Réseau Européen de communication Internet / EMDIS 58 Registres internationaux > 10 millions de donneurs Recherche de donneurs internationaux 38 Banques de sang placentaire USP patients nationaux Page 42 PROBABILITE D IDENTIFICATION D UN DONNEUR Free COMPATIBLE Powerpoint Templates Greffon compatible en vue d une allogreffe FAMILIAL (1/4 si fratrie) EXTRA FAMILIAL (1/ en moyenne) mais dépend : de la fréquence du typage HLA de l origine géographique des patients de la diversité éthnique des donneurs de CSH inscrits dans les Registres Mondiaux 1 er prélèvement: Typage HLA générique (Sérologie ou Luminex: A, B, DR,DQ) 2 ème : Typage HLA allélique (Bio mol: A, B, C, DRB1,DQB1, (DPB1)) Typage HLA générique é de la fratrie (Sérologie ou Luminex: A, B, DR,DQ) Donneur apparenté compatible non compatible Typage HLA allélique Banque donneurs volontaires Compatible Non compatible Compatible Non compatible Choix greffon Greffon compatible et satisfaisant Non Urgent? Oui Non Banque USP Page 43 Page 44

12 Recrutement des donneurs Critères d inclusion sur le fichier LE DON DE MO Age Inscription de 18 à 50 ans révolus Annulation du fichier à 60 ans révolus, don de CSP jusqu à 50 ans Recrutement préférentiel d hommes < 40 ans, car fichier français mal équilibré Page 45 Aptitudes requises Parfaite santé physique et psychique Ne présenter aucune contre-indication Compréhension de l engagement à long terme, sans certitude de donner Engagement à signaler tout changement d état civil et/ou d adresse Accepter les principes du respect strict de l anonymat (Loi Bioéthique du 29/07/94) Page 46 Protection du donneur Le parcours Free Powerpoint du donneur Templates de CSH Niveau de risque admis : risque minimal Risque lié au recueil de CSP Risque lié à l anesthésie pour le don de moelle Le donneur doit être informé et consentir de façon officielle Consentement: TGI Le donneur peut se dédire et demander son annulation du registre (Loi Bioéthique du 29/07/94) Anonymat respecté = code FRFXX.... Aucune information d ordre personnel n est donnée au centre receveur sans accord du donneur 1 ère étape : Inscription 2 ème étape : Examens complémentaires Précision(s) du typage HLA 3 ème étape : Envoi d échantillons sanguins 4 ème étape : Don de CSH Page 47 Page 48

13 LES ETAPES DE LA GREFFE Page 49 Page 50 La greffe de CSH Déroulement Conditionnement pré-greffe : Chimiothérapie et/ou radiothérapie Myéloablatif ou non Vise à Eradiquer les cellules tumorales Et/ou «faire de la place» pour les CSH du donneur Greffe : Injection dans une veine périphérique (= transfusion) Homing des CSH LE CONDITIONNEMENT Complications potentielles pour le receveur : Risque infectieux, Maladie du greffon contre l hôte (GvH) aiguë ou chronique, Rechute de la maladie initiale, Toxicité du conditionnement. Page 51 Page 52

14 Types de conditionnement Myéloablatif : chimiothérapie +/- radiothérapie - prévention du rejet de greffe par immunosuppression - éradication de la maladie (destruction du clone malin) - vacuité médullaire hématologique Non myéloablatif : mini-allogreffe - principe : effet antitumoral GVL (graft versus leukemia) - avantage : moins toxique Page 53 Manipulations du greffon allogénique à la banque de cellules 1) Désérythrocytation : systématique quand incompatibilité ABO majeure (ex donneur A/ receveur O) 2) Déplasmatisation : systématique quand le plasma du receveur contient des RAI dirigés contre les Ag érythrocytaires du Receveur 3) Concentration : si volume de collecte trop important (but: 10 ml/kg final) 4) Congélation : rarement quand greffe de CSP allogénique 5) Déplétion lymphocytaire T : très rarement utilisés maladies non cancérologiques Réinjection du greffon Par voie IV Page 54 Surveillance des complications précoces (1) LES COMPLICATIONS GVH aigue : AEG, fébricule, signes cutanés-digestifs-hépatiques tif ti Classée en 4 grades Traitement si grade II Avant J14: mortalité de 50% Solumédrol 2 à 5 mg/kg/j IVL Si réfractaire, mortalité de 70 à 80%. Ttt/ Cellcept, Remicade Nutrition parentérale, antalgiques, anti-émétiques, prophylaxie antimicrobienne, anti-diarrhéiques, soins locaux Page 55 Page 56

15 Surveillance des complications précoces (2) Infections Bactériennes «Aplasie»: ATB adaptés à la «carte bactérienne» Virales Favorisées par GVH et ttt immunos prolongé CMV++. FR: sérologies. Prophylaxie/Aciclovir. Infection ou réactivation (PCR sg) + dans 60%. Tropisme: pulmonaire, neuroméningé, hépatique, GI. Curatif: cymevan, foscavir HSV 1-2, VZV, adénovirus, HHV6, EBV Fongiques Candida, Aspergillus Parasitaires Toxoplasma gondii Autres complications Non prise de greffe Absence de PNN>500/mm 3 après J28 voire J45 pour USP Rejet de greffe Taux PNN, +/- autres lignées Etude du chimérisme sur sang total par PCR quantitative (% cellules l autologues vs cellules l du donneur) Exceptionnel si conditionnement myéloablatif (et suffisamment de cellules réinjectées) Page 57 Page 58 A moyen terme Rechute: NFS, myélogramme, chimérisme GVH chronique après J100 Cutanée, digestive, pulmonaire, hépatique, ophtalmologique GVH/GVL Déficit immunitaire cellulaire et humoral (attention aussi à autoimmunité) Infections bactériennes, virales (CMV: 8-15% après J100, Syndrome lymphoprolifératif EBV), fongiques et parasitaires Page 59 Page 60

16 GvHD Complication principale p et limitante de le greffe de CSH. Observée dans 30% des cas greffes familiale génoidentique et plus de 80 % des greffes phéno-identiques Survient dans les 100 jours après la greffe : atteinte cutanée (paume des mains, plante des pieds) tube digestif (diarrhées +++) foie et poumon Risque et grade est d autant plus grave que le situation de compatibilité est défavorable GvL : observations Risque réduit de rechute chez les receveurs de CSH allogéniques par rapport aux transplantations syngéniques aux HSCT allogéniques T-dépletées. L effet GvL est plus important chez les patients atteints de GvH. Effets bénéfiques des DLI chez les receveurs en rechute (20% à 80% de rémission suivant les pathologies). Cellules immunes en cause : => LT CD4 +, LT CD8 +, cellules NK Page 61 Page 62 Free GvH Powerpoint et Templates GvL Les phases de la GvH aigue Page 63 Nat.Rev.Cancer : Page 64

17 1ère phase = effet du conditionnement En réponse à cette agression : production de cytokines, chémokines et induction de molécules d adhérence = signaux délivrés au système immunitaire TNF, IL-1 CMH I et II Décharge de LPS provenant bact gram- Niveau LPS sanguin corrélé avec intensité dommages intestinaux et intensification de la réponse inflammatoire Parham et al. Nature reviews feb 2003 Page 65 Page 66 2ème phase Free Powerpoint activation Templates des LT du donneur T du donneur reconnaissent Ag étrangers présentés par les DC du receveur DC présentes dans les tissus sont activées par TNF, IL-1 et endotoxine (LPS) DC des organes lymphoïdes secondaires et des organes seraient cruciales pour recrutement des LT Activation des LT Les chémokines : les chémokines inflammatoires (MIP 1a, MIP-2, MCP-1, MCP-3 ) sont exprimées par les tissus endommagés = recrutement de cellules effectrices Page 67 Page 68

18 Les cellules Free Powerpoint natural Templates Killers = NK Apparaissent très tôt après la greffe : production d IFN-, TNF- Lymphocytes sans marqueur T ou B Expriment CD16 (Ig Récepteur) CD56 (molécule adhérence) Rôle décisif dans réponse immune innée (production cytokines) Répertoire NK stable pour un individu donné Cellules régulatrices Récepteurs pour CMH I:R KIR Chaque cellule n expriment pas tous les récepteurs Page 69 Page 70 Récepteurs Free Powerpoint des Templates cellules NK Récepteurs KIR Ligands HLA I: - KIR2DL2/3: HLA-Cw avec motif Ser77-Asn 80 (C1,C3,C7 et C8) - KIR2DL1: HLA-CW avec le motif Asn77- Lys80 (C2, C4, C5 et C6) - KIR3DL1:HLA-B de spécificité B4 - KIR3DL2: HLA-A de spécificité A3 et A11 - KIR2DL4: HLA-G Page 71 Page 72

19 Page 73 Page 74 Les cellules Free Powerpoint régulatrices Templates Pas de marqueur de surface spécifique Phénotype CD4+CD25+ Transfert de T reg : limite la GVH et préserve l effet GVL dans des modèles expérimentaux murins (Cohen et al J.Exp.Med. 196:401; Edinger et al Nat. Med. 9:1144) Le transfert de T reg spécifiques favorise la reconstitution immunitaire (Trenado( et al J.Clin.Invest.112:1688) ) RECONSTITUTION IMMUNOLOGIQUE Expansion et transfert de T reg spécifiques d Ag du Receveur : inhibition de la GVH et facilite la reconstitution immunitaire (Trenado et al., J. Immunol. 176:1266) Page 75 Page 76

20 Reconstitution hématologique Entre 2 à 5 semaines: apparition PNN avec risque infections bactériennes et fongiques GR et plaquettes: environ 15jrs après PNN Lymphocytes: T en 1 er, Nombre réduit de cellules T naïves Nombre réduit de CD4 + (inversion CD4/CD8) Faible diversité du répertoire T. Entre 2 à 6 mois Dosages sous-populations + études fonctionnelles DCs => Reconstitution précoce de DCs dérivées du Donneur (synchronisation avec la reconstitution myéloïde). Mph/Monos => Reconstitution dans les semaines qui suivent la greffe. Page 77 Fonction de : - âge, pathologie - type de greffe: Moelle osseuse/sang placentaire/csp Manipulation du greffon (déplétion en T) Greffe apparentée/non apparentée - Evolution clinique (GVHD, infections) - Polymorphismes génétiques (HLA et non HLA) Page 78 Reconstitution - Fonction thymique Greffe de CSH Cellules du donneur -CSHs - Précurseurs T - Cellules T mémoires Maturation Thymique Expansion périphérique Reconstitution du compartiment T - Nouvelles cellules T naïves - Répertoire complet - Réponse aux infections - Cellules T mémoires - Répertoire perturbé -Réponse incomplète aux infections Monitoring de la greffe: chimérisme Page 79 Page 80

21 Principe Marqueurs génétiques R Marq1 R Marq2 R Marq3 R Marq4 R Marq5 R Marq1 D Marq2 D Marq3 D Marq4 D Marq5 D D Marqueur ur Nb de répétition Propriétés Taille des fragments Caractéristiques Principe (PCR) Informativité Marqueur informatif VNTR (Variable Number of Tandem Repeats) Allèles différents D/R Compétition 100% R M.O Sang J0 J30 J60 J90 J120 J150 J180 A1 C hi i m ér i s m e STR (Short Tandem Repeats) SNP (Single Nucleotide Polymorphism) Amelogenine Allèles différents D/R Compétition 100% ACGGTTA ACGTTTA Chr X: 106 pb Chr Y: 112 pb Présence/absence chez D/R 2 allèles chez l Homme 1 allèle chez la femme Pas de compétition Compétition 90% En cas de sexe mismatch Page 81 Page 82 Méthode à un marqueur: choix du marqueur STR -Donneur et receveur ont au moins 1 allèle différent -Les allèles sont séparés d au moins 2 pb -Les allèles du receveur sont plus courts que ceux du donneur -Bonne corrélation entre les quantifications obtenue et une gamme de dilution d ADN du receveur avant greffe dans celui du donneur => droite de quantification Page 83 Page 84

22 IF Etape 1 Marqueur 1 Marqueur 2 Marqueur 3 Droite Etalon IF Etape 1 Marqueur 2 Droite Etalon Etape 2 Prélvts jour (duplicate) Prèlvt préc (duplicate) 80D/20R 85D/15R 90D/10R 95D/5R 99D/1R % cell 80D/20R 85D/15R 90D/10R 95D/5R 99D/1R % cell Page 85 Page 86 Page 87 Page 88

23 Page 89 Page 90 Comparaison des protocoles En pratique : résultat Free Powerpoint rendu en Templates % de cellules du receveur - chimérisme totale : absence de cellules du receveur Protocole Informativité Sensibilité Quantification Praticabilité VNTR Hybridation VNTR PCR VNTR/STR GeneScan SNP / PCR quantitative 100% 2-5% Semi Difficile (radioactivité) 100% 2-5% Semi Facile 100% 0,5-1% Semi Facile 90% 0,01-0,1% absolue Facile - chimérisme mixte : présence à la fois de cellules du receveur et du donneur, peut être stable ou évolutif Importance de la cinétique - absence de chimères : absence de cellules du donneur Page 91 Page 92

24 DLI Rôle des DLI En traitement, lors des rechutes, à distance de l allogreffe: Mécanismes de l effet GVL lors des DLI Clones cytotoxiques capables de supprimer la formation de colonies leucémiques in vitro (Alyea 1998) Probable help CD4 pour le recrutement de LT CD8+ spécifiques d Ag mineurs et réagissant contre les leucémies (Zorn 2002) Réponse aux DLI est corrélée à la présence de CTLs contre les Ag mineurs HA-1 et HA-2 dont l expression est restreinte aux cellules hématopoïétiques (Marijt 2003) rôle des NK (KIR) lors de greffe HLA-I mismatched Page 93 En pratique Cytaphérèses chez le donneur sans G-CSF Congélation des lymphocytes réinjection à doses croissantes (0.5 x106/kg - 1 x106/kg - 5 x106/kg ) Page 94 Immunothérapie adoptive par les Free Powerpoint cellules Templates T Page 95 Nat.Rev.Cancer : Page 96

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