VECTEURS ET BANQUES yann audic_2009

Transcription

1 VECTEURSETBANQUES yannaudic_2009

2 VECTEURSETBANQUES DEFINITIONS VECTEURSetCLONAGE Utilité Principe Différentsvecteurs/différentsusage BANQUES Principe Banquesgénomiques Banquesd'ADNc Normalisation

3 Définitions Unvecteurestuneséquenced'ADNpermettantlapropagation,la sélection,lamodificationd'uneséquenced'adnd'intérêt.enbref l'étudeetlamanipulationd'uneséquenced'adnisolée. Leclonageestl'actiond'isoleretd'insérerdansunvecteurun fragmentd'adnd'intérêtpourlemultiplieràl'identique. L'ADNgénomiqueestlesupportphysiquedel'ensembledes gènesdelacellule l'adncomplémentaire(adnc)estlacopieenadndesarnm.

4 ADNgénomique Transcription pre ARNm AAAAAAA...AAA Epissage ARNm AAAAAAA...AAA ARNm Transcriptaseinverse ADNc INVITRO

5 OLIGOdT AAAAAAAAAAAAA AAAAAAAAAAAAA TTTTTTTTTTTTT ReverseTranscriptase Oligonucleotidealeatoire: unmélanged'oligonucleotides de6nucleotidesdetoutesles séquencespossibles:46=4096 NNNNNN ReverseTranscriptase

6 VECTEURSETBANQUES VECTEURSetCLONAGE Utilité Principe Différentsvecteurs/différentsusage BANQUES Principe Banquesgénomiques Banquesd'ADNc Normalisation

7 Utilité Permetdeconserveruneséquenced'ADN donnée. Permetdelamultiplierpourenaccroîtrela quantité. Permetdelamodifierpouryintroduiredes mutations,déletions. Permetdelaréintroduiredansdescellules.

8 Principes Circulaire UnVecteur Linéaire Procaryote UneCellulehôte Eucaryote ADNgénomique Unfragmentd'ADNd'intérêt. ADNc

9 Différentsvecteurs pourdifférentesutilisations VECTEURS Plasmides Phages BAC YAC HOTE Bactérie Bactérie Bactérie Levure INSERT(Kb) BAC

10 plasmides Lesplasmidessontdesmoléculesd'ADNcirculairesnaturellement présentesdanslesbactériesenplusdeschromosomesbactérien.ilsne contiennentgénéralementpasdegènesindispensablesàlasurviedela cellule.ilsapportentdesgènespouvantprésenterunavantagesdans desconditionsdeculturesparticulières(antibiotique,métauxlourd, hypersalinité,...)oùilsvontapporterunavantagepourlacroissancede lacellulelespossédant.

11 PlasmideType Genederésistancea unantibiotique Sitedeclonage Gènesdesélection Originedereplication (E.Coli) Originederéplication (Phage)

12 MCS Sitespourenzymesderestrictionuniques. Sitepour«primer»deséquencage. PromoteurspourRNApolymerasephagiques (PhagesT7,T3).

13 pg ngd'adn µg mgd'adn

14 BacteriophageLambda

15 BacteriophageM13

16 BacterialArtificialChromosomes BAC 7.4kb para,parbandrepesontdesgenes requispourlastabilitédubac. OriSestuneoriginederéplication CM:gènederésistanceau chloramphenicol

17 BACs Avantages: Grandecapacitéd'insertion Facilitédemanipulation(commeplasmide) Hôtebactérien Copieunique Pas(peu)deréarrangement

18 YAC

19 pg ngd'adn µg mgd'adn

20 VECTEURSETBANQUES VECTEURSetCLONAGE Utilité Principe Différentsvecteurs/différentsusage BANQUES Définition Banquesgénomiques Banquesd'ADNc Normalisation

21 Définition Unebanqued'ADNestunePOPULATIONdevecteurscontenant desfragmentd'adndiversreprésentatifd'untypecellulaire,d'un génome,d'unstadeparticulierdedéveloppement. UneBanqueestcaractériséepar: letypedevecteur lanaturedesinserts(adngenomique,adnc),leur origine lepourcentagedevecteurspossédantuninsert lataillemoyennedesinserts latailledelabanquec.a.dlaquantitédeclones/ mldebanque

22 Constructiond'unebanqued'ADN genomiquedansunbac ADNGénomique fragmenté

23 Constructiond'unebanqued'ADN genomiquedansunbac ADNGénomique fragmenté

24 Banquenonordonnéevsbanque ordonnées Chaquecolonieestrepiquéeindividuellement dansunpuitdelaplaquede384puits.

25 Exempleunebanqued'ADN génomiquehumain Segment Vector RestrictionEnzyme DNASource PlateNumbers PlateCount EmptyWells Non InsertClones RecombinantClones AverageInsertSize GenomicCoverage 1 ptarbac1.3 MboI blood 1to (1.3%) Approx.3097(2.1%) Kbp 6.7X 1,4.105X156103=2,181010bp HG=3,2109bp Couverture=6.7X

26 BanqueADNc PolishingofcDNA ends

27 Clonageboutfranc

28 Clonageaveclinker

29 Clonageaveclinker 46=4096

30 Quefairepouréviterdedigérerles ADNc?

31 Clonagedirectionnel Reversetranscriptase,methyl dctp datp,dgtp,dttp RnaseH,DNApolI,dNTPs EcoRIadaptateurs DigestionXhoI ADNcpermettantclonagedirectionnel

32 MCS EcoRI XhoI

33 LesEST Unebanquepermetd'avoiruneimagedesADNcprésentsdansletissu étudié.pourcela,leséquencagepartieldel'ensembledesclonesdela banquespermetd'obtenirdesestouexpressedsequencetag.c.a.ddes étiquettesdesséquencesexprimées.

34 LesEST Celles cipermettent 1)l'identificationdesARNmexprimés. 2)l'attributiond'uneidentitéàchaqueclone. 2)Uneestimationduniveaud'expressionpar comptagedesestcorrespondantàunarnm donné.

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36 Unebanqued'ADNcvadoncnormalement représentersousformedeclonesl'ensemble desarnmprésentdansletissusinitial. Lareprésentationdechaqueclone représentantenproportionlaquantitéd'arnm danslacellule. CeciposeleproblèmedesARNmraresqui peuventn'êtrereprésentésquepar1cloneou mêmeaucuntandisquedesarnmtrès abondantpeuventreprésenteruneproportion importantedesclonesdelabanque.

37 Criblagedifférentiel Pourdéterminerquelssontlesgènes différentiellementexprimésentre2tissus. Parexemple,tissussainsversustissu cancéreux

38 Criblagedifferentiel Maspin,aSerpinwithTumor SuppressingActivityinHumanMammary EpithelialCells(Science,1994)

39 LANORMALISATIONDES BANQUES BUT:FairequechaqueARNmdelacellule quelquesoitsonnombredecopiedansle tissusétudiéssoientreprésentésennombrede clonesidentiquedanslabanque.

40 BanqueADNsimplebrin Banquepartiellementdouble brin Sélectionvecteuravecdouble brin Lesclonesdontlaconcentration estimportantereformentdu doublebrinceuxdontla concentrationestfaible,non. Sélectionvecteursimplebrin= BanqueNormalisé.

41 PourQuoiFaire? Pourlesorganiseretautomatiserlagestion Pourlesanalysesfonctionnelles(post génomique)

42 PourQuoiFaire? Analysesfonctionnelles: Vecteursd'expression:étudedurôledela protéinexsurteloutelmécanismecellulaire. Neomycin pcmv Wasserman_film

43 Criblagefonctionnel:ouQUIFAITQUOI?

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45 Lecture? VisiterlesiteduNCBI MolecularCloning:ALaboratoryManual (ThirdEdition)