8.3.3 Réactifs. La polymérase catalyse la synthèse de brins complémentaires d ADN.

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1 8.3.3 Réactifs 1. AD polymérase: La polymérase catalyse la synthèse de brins complémentaires d AD. Des polymérases qui sont résistantes à la chaleur sont utilisées, telles que la Taq polymérase (Thermus aquaticus), la Tth polymérase, la Pwo polymérase et la Pfu polymérase. L enzyme doit être capable de synthétiser des longues séquences d AD (i.e. bonne activité de polymérisation). De plus, les polymérases de type Pwo et Pfu exhibent une activité exonucléase 5-3 ; des mauvais nucléotides sont reconnus, enlevés et remplacés par les bons nucléotides. L activité exonucléase 5-3 augmente la fidélité de réplication de l AD Amorces: Des amorces sont des courts oligonucléotides, dont les séquences de nucléotides sont complémentaires aux bouts des régions ciblés de l AD à amplifier. Deux amorces distincts sont utilisés pour l ACP: un amorce qui synthétise de gauche à droite et un autre qui synthétise de droite à gauche. Chaque amorce se lie à un brin de l AD original. amorces 306

2 - P - La synthèse d AD procède toujours dans la direction 5 à 3. Le 1 er nucléotide à être incorporé réagit avec l -3 libre de l amorce. Le bout 5 de l amorce est bloqué. La paire d amorces doit être choisie spécifiquement pour 5' l échantillon d AD. C 2 A La longueur des amorces est 3' généralement entre 10 et 30 nucléotides et leur séquence doit P 5' être complémentaire pour une C 2 T section unique de l AD matrice. - 3' Idéalement, chaque amorce contient un nombre équivalent de P 5' nucléotides. C 2 G Pour éviter la formation de - 3' dimères entre les amorces, il ne doit pas y avoir de complémentarité 5' intra- ou intermoléculaire entre les P C 2 C amorces. - 3' La température de dénaturation des amorces doit être similaire, ainsi qu être située entre 55 C et 80 C Désoxynucléotides triphosphates: Le mélange réactionnel doit contenir un excès des 4 désoxynucléotides triphosphates (datp, dctp, dgtp et dttp) puisqu ils sont consommés durant l ACP. - P - P - P Base - dtp C 2 Cytosine Adénine Thymine Guanine La concentration de chaque désoxynucléotide doit être égale. 308

3 4. Tampon: Le p et la force ionique du tampon est choisi selon la polymérase utilisée. La force ionique a une influence importante sur la spécificité de l ACP. Une solution tampon typique possède une force ionique d environ 50 mm, un p de 8.3 et contient du Tris-Cl et du KCl ou du acl. La solution tampon contient aussi du MgCl 2 à une concentration entre 0.5 et 5 mm. Les ions Mg 2+ forment un complexe soluble avec l AD et la polymérase. Le rôle des ions Mg 2+ est d amener la polymérase à proximité de l AD et de balancer les charges négatives sur les molécules d AD. De plus, les ions Mg 2+ stimule l activité de la polymérase. La [Mg 2+ ] est liée à la spécificité et au rendement de la réaction d amplification. À des concentrations faibles de Mg 2+, l activité enzymatique de la polymérase est diminuée. Un excès de Mg 2+ résulte en une dénaturation incomplète de l AD puisque la forme double brins de l AD est stabilisée par ces ions. De plus, une [Mg 2+ ] élevée augmente la liaison des amorces aux mauvais sites, résultant en une perte de spécificité L ACP en temps réel n peut suivre le progrès de la réaction d amplification en chaîne par polymérase en utilisant un marqueur fluorescent pour quantifier les produits formés durant chaque cycle. L augmentation des produits de la réaction peut être quantifier en mesurant l augmentation de l intensité de fluorescence. Un graphique de l intensité de fluorescence en fonction du nombre de cycles d amplification donne une idée plus précise de la cinétique qu une mesure de l accumulation des produits après un nombre fixe de cycles. Deux différents types d essaies peuvent être utilisés pour l ACP en temps réel: essaie par liaison d un colorant et essaie basé sur des sondes. 310

4 8.4.1 Essaie par liaison d un colorant Dans un tel essaie, on utilise un colorant qui fluoresce après liaison à l AD à double brins. Puisque de plus en plus de molécules d AD à double brins sont produites après chaque cycle d ACP, l intensité de fluorescence augmente. Les colorants se lient soit entre les bases appariées ou au sillon mineur de la double hélice d AD. (D après A. Manz,. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) Essaie basé sur des sondes Cette méthode est basée sur la dégradation d une sonde cible par l activité exonucléase 5-3 de la polymérase. La sonde est un court oligonucléotide dont la séquence est complémentaire à une région de l AD cible se trouvant entre les deux amorces. Un fluorophore est attaché au bout 5 de la sonde et l extincteur est lié au bout 3. La proximité de l extincteur réduit la fluorescence du fluorophore. La sonde est ajoutée au mélange réactionnel et se lie à l AD dénaturé. Sa fluorescence est éteinte. Durant l élongation des amorces, le fluorophore est enlevé de la sonde due à l activité exonucléase de la polymérase. Le fluorophore libéré fluoresce dans le mélange réactionnel. L intensité de fluorescence est directement proportionnel au nombre de cycles d amplification (i.e. nombre de molécules amplifiées). (D après A. Manz,. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 312

5 8.5 Transcription inverse de l AR 5' 3' ARm 72 C 5' 3' amorce 42 C 5' 3' 3' 5' transcriptase inverse 5' 3' 5' 5' 3' ARm 3' 5' AD 94 C ACP de l'ad Séquençage des acides nucléiques Puisque la séquence des nucléotides dans une molécule d AD ou d ARm détermine sa fonction, le séquençage des acides nucléiques est une tâche bioanalytique importante. Le développement de méthodes rapides et automatisées pour le séquençage des acides nucléiques a attiré beaucoup d intérêt dans les dix dernières années, surtout dans le contexte du projet du génome humain. Méthodes de séquençage: microréseaux d AD (pour des oligonucléotides courts) - méthode de Maxam-Gilbert - méthode de Sanger 314

6 8.6.1 L usage d enzymes de restriction L AD extrait des cellules ou des tissus est souvent trop long pour être directement séquencé. L AD doit avant être coupé en plus petits fragments de jusqu à 800 paires de bases. Les endonucléases de restriction sont employées. Ces enzymes reconnaissent une séquence spécifique de 4 à 8 bases dans une molécule d AD à double brins et coupent les deux brins à un point spécifique prêt du site de reconnaissance. Une digestion (ou plusieurs digestions séquentielles) avec des enzymes de restriction produit une série de fragments qui peuvent être dénaturés et séparés par électrophorèse sur gel. Après séparation, les fragments d AD à simple brin peuvent être séquencés Méthode de Maxam-Gilbert Le séquençage des fragments d AD à simple brin débute avec le marquage radioactif du bout 5 avec du phosphore- 32 (voir figure de droite). Les fragments d AD sont ensuite traités avec un réactif chimique qui coupe l AD à un site spécifique. La réaction chimique est effectuée dans des conditions de rendement faible pour que chaque molécule d AD est coupé seulement une fois à un site donné. Les fragments obtenus sont séparés selon leur taille par SDS-PAGE. La position des fragments sur le gel est détecté par autoradiographie. 5 3 Pour un séquençage complet, un échantillon d AD est généralement séparé en quatre parties et chaque partie est traitée avec un réactif différent. (D après A. Manz,. Pamme & D. Iossifidis, 316 Bioanalytical Chemistry, 2004)

7 1. Coupure de la guanine (G): Traitement avec le diméthyl sulfate (DMS) et la pipéridine Guanine (D après A. Manz,. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) Coupure de la guanine (G) et de l adénine (A): L adénine est aussi méthylée par le DMS à la position 3. Le traitement avec la pipéridine donne aussi lieu à la coupure de la base d adénine. 4 Adénine La vitesse de coupure de l adénine est un cinquième de celle de la guanine Par contre, si de l acide (i.e. acide formique) est ajouté au mélange réactionnel au lieu du DMS, la guanine et l adénine sont hydrolysées à des vitesses comparables. Les positions des adénines dans une chaîne sont établies en comparant les positions des guanines et des guanines + adénines. 318

8 3. Coupure de la cytosine (C) et de la thymine (T): Le traitement des fragments d AD avec de l hydrazine et de la pipéridine libère des cytosines et des thymines. 2 3 C Cytosine Thymine (D après A. Manz,. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) Coupure de la cytosine (C): Si la réaction avec l hydrazine est effectué dans une solution de 1.5 M acl, l AD est coupé seulement avant une cytosine. Une comparaison des positions des cytosines + thymines et des cytosines permet de situer les thymines. Les conditions des quatre réactions sont ajustées pour que les bases sont relâchés en moyenne à une position aléatoire par molécule d AD. La base située à l extrémité 5 ne peut pas être identifié puisque le nucléotide est détruit durant la réaction. De plus, la 2 è base est souvent impossible à résoudre par électrophorèse sur gel. Les 1 ère et 2 è bases doivent être identifiées par séquençage du brin complémentaire. 320

9 Exemple de séquençage d un fragment d AD par la méthode de Maxam-Gilbert 5 Électrophorèse sur gel 3 (D après A. Manz,. Pamme & D. Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) Méthode de Sanger (méthode didéoxy ou méthode de terminaison de chaîne) La méthode de Sanger est basée sur la synthèse d un brin complémentaire de l AD en utilisant les oligonucléotides à séquencés comme matrices (tel que pour l ACP). Contrairement à l ACP, la synthèse du brin complémentaire est effectuée en présence d un nucléotide de terminaison de chaîne. L échantillon d AD à simple brin est divisé en 4 portions. Chaque portion est incubé avec de l AD polymérase, les quatre désoxyribonucléotides triphosphates (datp, dgtp, dctp, dttp) et une amorce appropriée. Le brin complémentaire synthétisé est marqué en incorporant du 32P, soit dans l amorce ou dans un des désoxyribonucléotides triphosphates. Dans chacun des 4 mélanges réactionnels, est ajouté un 2,3 -didéoxynucléotide triphosphate (ddtp) en petite quantité. - P P P Base ' ddtp 322

10 Dès que un ddtp est incorporé dans la chaîne croissante, la réaction se termine puisqu il n y aura pas de 3 - libre pour l incorporation d un autre nucléotide. L incorporation d un ddtp résulte dans une série de chaînes tronquées, chacune terminée par un analogue didéoxy dans la position de la base correspondante. Les produits de chacune des 4 réactions sont séparés selon leur taille par électrophorèse su gel dans des voies parallèles. La séquence du brin complémentaire d AD est déterminée par autoradiographie. Cette séquence est ensuite utilisée pour identifier la séquence de l AD original. 323 Exemple de séquençage d un fragment d AD par la méthode de Sanger Électrophorèse sur gel (D après D.J. olme,. Peck, Analytical Biochemistry, 3è éd., 1998) 324

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