ENSEIGNEMENT DE BIOLOGIE CELLULAIRE : BIOLOGIE MOLÉCULAIRE

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1 ENSEIGNEMENT DE BIOLOGIE CELLULAIRE : BIOLOGIE MOLÉCULAIRE UNIVERSITÉ DES ANTILLES-GUYANE PREMIÈRE ANNÉE DES ETUDES DE SANTÉ DR MARYSE ETIENNE-JULAN-OTTO

2 IV- LA CONSERVATION DE L ADN

3 DEUX MÉCANISMES La réplication de l ADN La réparation

4 IV- LA CONSERVATION DE L ADN

5 IV-1 LA RÉPLICATION

6 LA RÉPLICATION DE L ADN Précède la division cellulaire Duplication de l information génétique qui sera transmise en quantités identiques aux cellules filles : contenu informatif identique à la cellule mère 1 molécule d ADN è 2 molécules filles rigoureusement identiques à la molécule de départ

7 LA RÉPLICATION DE L ADN (2) Processus complexe Nombreuses activités enzymatiques Bien connue chez les procaryotes Comparable chez les eucaryotes

8 LA RÉPLICATION DE L ADN (3) : DIFFÉRENTES ÉTAPES Initiation Elongation Réactions de liaison et de terminaison

9 LA RÉPLICATION DE L ADN (4) : DIFFÉRENTES ÉTAPES Initiation 1. Reconnaissance d une origine de réplication par un complexe protéique 2. Séparation des brins parentaux 3. Stabilisation provisoire sous forme simple brin

10 LA RÉPLICATION DE L ADN (4 BIS) : DIFFÉRENTES ÉTAPES Initiation 4. Initiation de la synthèse des brins fils au niveau d une fourche de réplication Assurée par primosome chez E. coli

11 LA RÉPLICATION DE L ADN (5) : DIFFÉRENTES ÉTAPES Elongation Exécutée par le réplisome (autre complexe protéique) Le réplisome se déplace le long de l ADN parental è déroulement è synthèse des brins fils

12 LA RÉPLICATION DE L ADN (6) : DIFFÉRENTES ÉTAPES Réactions de liaison et/ ou de terminaison Mécanismes enzymatiques mal connus Suivies de la séparation de la division cellulaire

13 IV-1 LA REPLICATION 1) LES ENZYMES DE LA RÉPLICATION

14 DEUX TYPES PRINCIPAUX DE CONTRAINTES 1. Contraintes topologiques ADN sous forme super enroulée è nécessité suppression supertours ADN sous forme d une double hélice è nécessité de séparer les deux brins 2. Contraintes liées à l orientation antiparallèle des 2 brins

15 A) LES TOPOISOMÉRASES Diminuent considérablement le taux d enroulement de l ADN 2 types : Topoisomérases de type I Se fixent sur l ADN è coupent 1 seul des brins è déroulement de l ADN è réparation Topoisomérases de type II coupent les 2 brins

16 B) LES ADN POLYMÉRASES Définition : enzymes qui assurent la synthèse d un nouveau brin d ADN à partir d un brin matrice d ADN (ADN polymérase ADN dépendante) Plusieurs ADN polymérases chez les procaryotes et les eucaryotes

17 B) LES ADN POLYMÉRASES (2) Seules certaines sont impliquées dans la réplication : ADN réplicases Les autres : rôles secondaires dans réplication Réparation ADN (remplacement séquences endommagées) Recombinaison,

18 B-1) LES ADN POLYMÉRASES (3) : CARACTÉRISTIQUES COMMUNES Additionnent des nucléotides 1 par 1 à une extrémité 3 -OH libre : le choix du nucléotide à intégrer respecte les règles d appariement avec le brin matrice (A apparié à T et G apparié à C)

19 B-1) LES ADN POLYMÉRASES (4) : CARACTÉRISTIQUES COMMUNES Fidélité de la réplication : correspond au taux d erreurs commises par les ADN polymérases lors de la synthèse d une molécule d ADN 10-8 à (1 erreur par génome pour 1000 cycles de réplication bactérienne ou 10-6 erreur par gène et par génération ) Chaque ADN polymérase a un taux d erreurs caractéristique

20 B-1) LES ADN POLYMÉRASES (5) : CARACTÉRISTIQUES COMMUNES Mécanismes de la fidélité de la réplication : pourquoi ce taux d erreurs est il faible? 1. contrôle d erreur présynthétique : contrôle de la base du nucléotide entrant avant son incorporation dans le brin en cours de synthèse

21 B-1) LES ADN POLYMÉRASES (5 BIS) : CARACTÉRISTIQUES COMMUNES Mécanismes de la fidélité de la réplication (2): 2. Contrôle par correction d épreuve : - Après l incorporation d un nucléotide dans une chaine en cours de synthèse, ce système contrôle la nature de la base. - Les erreurs sont corrigées par l activité 3-5 exonucléolytique qui s exerce dans le sens opposé à la synthèse d ADN. Toutes les ADN polymérases bactériennes possèdent cette activité 3-5 exonucléolytique

22 B-1) LES ADN POLYMÉRASES (6) : CARACTÉRISTIQUES COMMUNES Nécessité d une amorce : Fournit l extrémité 3 OH libre Celle-ci est allongée par addition de nucléotides Différents types d amorce

23 B-1) LES ADN POLYMÉRASES (7) : CARACTÉRISTIQUES COMMUNES Différentes formes d amorce : 1. amorce ARN synthétisée face à la matrice au moment de la réplication ADN cellulaire, certains virus 2. ARN préexistant dans la cellule et qui s apparie avec la matrice rétrovirus

24 B) LES ADN POLYMÉRASES (7BIS) : CARACTÉRISTIQUES COMMUNES Différentes formes d amorce : 3. Extrémité 3 -OH produite dans la molécule d ADN double brin par coupure par une endonucléase (voir plus loin) 4. Intervention d une protéine qui présente directement des nucléotides libres à la polymérase : certains virus

25 B-2) LES ADN POLYMÉRASES DES BACTÉRIES (PROCARYOTES) Trois ADN polymérases chez E. coli. Les ADN polymérases I et II è impliquées essentiellement dans la réparation de l ADN endommagé. L ADN polymérase III, enzyme à multiples sous-unités, est la réplicase

26 B-2) ADN POLYMÉRASE III DE E. COLI activité réplicase (synthèse des brins d ADN fils lors de la réplication) est assurée par la sous-unité α. activité de correction d épreuves 3-5 exonucléolytique par la sous-unité ε. Sous-unités ε et α fonctionnent de façon coordonnée; ce qui permet d augmenter l efficacité de la correction d épreuves

27 B-3) ADN POLYMÉRASES DES EUCARYOTES (1) Multiples Certaines sont dépourvues d activité 3-5 exonucléase

28 B-3) ADN POLYMÉRASES DES EUCARYOTES (2) ADN polymérases α et δ sont des ADN polymérases nucléaires aux fonctions différentes ADN polymérase α ==> initiation de la synthèse des brins d'adn ADN polymérase δ ==> allonge les brins naissants

29 B-3) ADN POLYMÉRASES DES EUCARYOTES (3) ADN polymérases β et ε è processus de réparation vraisemblablement ADN polymérases γ è réplication de l ADN mitochondrial

30 A D N polymérase α/primase δ ε β γ Il existe 5 ADN polymérases chez les mammifères (lettres grecques) Emplacement Fonction d e synthèse Autres fonctions Amorce Synthèse d ADN Nécessité PCNA 3-5 exonucléase Réparation Réparation Réplication 3-5 exonucléase 3-5 exonucléase Inhibiteurs Aphidicoline Aphidicoline Aphidicoline Nucléaire Nucléaire Nucléaire Nucléaire Mitochondrial Didésoxy- TTP Didésoxy- TTP

31 B-4) PROTÉINES ACCESSOIRES DES ADN POLYMÉRASES (EUCARYOTES) (1) Le PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen) Puissant activateur de l ADN polymérase δ. Active aussi l ADN polymérase ε mais non indispensable.

32 * B-4) PROTÉINES ACCESSOIRES DES ADN POLYMÉRASES (EUCARYOTES) (2) Facteur de réplication A (RF-A) Se fixe sur l ADN simple brin. Indispensable à l action des polymérases α et δ. Pourrait être impliquée dans les phénomènes de recombinaison

33 * B-4) PROTÉINES ACCESSOIRES DES ADN POLYMÉRASES (EUCARYOTES) (3) Facteur de réplication C (RF-C) Se fixe sur l ADN au niveau des zones où sont synthétisées les amorces. a une activité ATPasique ADN dépendante stimulée par PCNA et RF-A

34 C) LES HÉLICASES Sépare les brins d ADN Utilise l hydrolyse de l ADN comme source d énergie

35 D) LA PRIMASE ARN polymérase : enzyme qui synthétise un nouveau brin d ARN à partir d un brin matrice d ADN (ARN polymérase ADN dépendante) utilisée uniquement pour la synthèse de courtes séquences d ARN qui sont utilisées comme amorce pour la synthèse d ADN Chez les eucaryotes, la fonction primase est portée par l ADN polymérase α

36 IV-1 LA REPLICATION DE L ADN 2) LE DÉROULEMENT DE LA RÉPLICATION

37 L initiation de la réplication entraîne la cellule dans un cycle de division Eucaryotes : celle-ci a lieu pendant la phase S du cycle cellulaire La réplication débute au niveau d une zone précise appelée origine de réplication

38 A-1. L ORIGINE DE RÉPLICATION PROCARYOTES Cairns (1962) A marqué l ADN en le mettant en présence de nucléotides radioactifs. En se répliquant, l ADN incorpore ces nucléotides. Il est alors possible de suivre les molécules marquées et leur réplication grâce à la radioactivité émise (autoradiographie en microscopie électronique) Cette méthode a montré que la molécule d ADN est circulaire chez les bactéries

39 Cairns (1962) A-1. L ORIGINE DE RÉPLICATION PROCARYOTES 1. La réplication débute en un point fixe et unique du chromosome circulaire bactérien. 2. deux fourches de réplication se forment 3. elles se déplacent en sens inverse l une de l autre sur le chromosome

40 A-1. L ORIGINE DE RÉPLICATION PROCARYOTES (2) Cairns (1962) 4. se rejoignent en un point opposé du site d initiation

41 A-1. L ORIGINE DE RÉPLICATION PROCARYOTES(3) Réplication bidirectionnelle (= il y a 2 fourches de réplication) à partir du point d initiation appelé origine de réplication La fourche de réplication est la zone d ADN au niveau de laquelle la réplication est active (synthèse des brins fils d ADN)

42 Autoradiographie Interprétation

43 A-2. L ORIGINE DE RÉPLICATION EUCARYOTES Marquage ADN puis autoradiographie en microscopie électronique. Origines de réplication multiples car grande quantité d ADN à répliquer 20 à chez l homme

44 Autoradiographies Interprétation

45 Réplication bidirectionnelle (2 fourches de réplication), mode le plus fréquent : bactéries, certains phages, certains virus eucaryotes, les cellules de mammifères Réplication unidirectionnelle (1seule fourche de réplication) : certains bactériophages, ADN mitochondrial de souris.

46 L UNITÉ DE RÉPLICATION OU RÉPLICON Zone d ADN répliquée à partir d une même origine de réplication 1 réplicon unique chez les procaryotes Plusieurs chez les eucaryotes

47 L UNITÉ DE RÉPLICATION : LE RÉPLICON(2) Eucaryotes : Plus petits que chez les procaryotes : réplicon 100 à 200 kb chez l homme. Réplication plus lente : 40 mn chez E. coli 6 heures chez les mammifères

48 B) L ADN DOIT ÊTRE MAINTENU SOUS FORME SIMPLE BRIN Les hélicases séparent les brins d ADN Stabilisation des brins d ADN séparés sous forme simple brin : par la fixation des protéines SSB : «Single Strand Binding»

49 MOLÉCULE D ADN EN COURS DE RÉPLICATION 2 types de régions Régions non répliquées sous forme de double hélice Les régions où la réplication est en cours: la fourche de réplication La fourche de réplication se déplace sur l ADN à partir de son point de départ (origine de réplication)

50 C) SYNTHÈSE DE L AMORCE ARN (PRIMER) L amorce ARN est synthétisée par la primase qui est associée au primosome chez E. coli Le primosome = complexe composé de multiples protéines : - une ARN polymérase ADN dépendante appelée primase ; - 2 autres protéines è activation de la primase è complexe capable de synthétiser l ARN ;

51 C) SYNTHÈSE DE L AMORCE ARN (PRIMER) (2) Primosome (suite) - de protéines i, n, n, n qui assurent la reconnaissance du site où doit être synthétisée l amorce : leur fixation à l ADN donnerait à celui ci une forme particulière qui permet la fixation des protéines dna B et C et de la primase.

52 Les enzymes de la réplication chez les procaryotes Protéine M en kd Gène Fonction Rep 65 rep hélicase 50 Hélicase III 75 hélicase SSB 74 ssb Stabilisation de l ADN double Protéine i 66 dnat brin Protéine n Constitution du Protéine n 76 primosome 70 Protéine n 17 - Protéine dnab 29 dnab 100 Protéine dnac 300 dnac 20 Primase 60 dnag Synthèse ARN primer A D N polymérase III Sous-unité α 140 polc Elongation du brin synthétisé et Sous-unité β 37 dnan contrôle de fidélité Sous-unité γ 52 dnaz Sous-unité δ 32 dnax Sous-unité ε 25 dnaq Sous-unité θ 10 Sous-unité τ 83 A D N 102 pola Maturation du 300 polymérase I Ligase 75 lig brin néoformé Ligation finale 300

53 D) L ÉLONGATION La fourche de réplication se déplace le long du brin matrice qui est progressivement dénaturé par les hélicases et les brins fils sont synthétisés par la réplicase

54 brin néosynthétisé ADN polymérase sur le brin direct Hélice d ADN parental Protéines se fixant sur l ADN simple brin primase hélicase Amorce d ARN fragment d Okazaki ADN polymérase sur le brin retardé (terminant la synthèse d un fragment d Okasaki) brin néosynthétisé

55 D) L ÉLONGATION (2) La fourche de la réplication se déplace dans le sens 5 3 sur un brin et 3 5 sur l autre Les ADN polymérases n incorporent des nucléotides qu à une extrémité 3 OH libre (synthèse dans le sens 5 3 )

56 D) L ÉLONGATION (3) è la synthèse est semi-discontinue

57 D) L ÉLONGATION (4) Sur le brin précoce, synthèse se déroule de façon continue dans le sens 5-3 à mesure que le duplex parental est déroulé. Les protéines SSB sont chassées au fur et à mesure de l utilisation du brin matrice

58 D) L ÉLONGATION (5) sur le brin retardé, : une séquence d ADN simple brin doit être exposé puis un segment est synthétisé dans le sens inverse (par rapport au déplacement de la fourche).

59 D) L ÉLONGATION (6) sur le brin retardé, : -è Une série de ces fragments (fragments d OKASAKI) de 1000 à 2000 pb est synthétisée chacun de 5 vers 3 (synthèse discontinue). Ils sont ensuite reliés les uns aux autres pour donner naissance à un brin retardé intact.

60 D) L ÉLONGATION (7) sur le brin précoce : 1 seul événement d initiation au niveau de l origine sur le brin retardé : série d événements d initiation (1 par fragment d OKAZAKI) initié chacun par un ARN de 10 bases de long

61 ADN néosynthétisé matrice du brin retardé matrice du brin direct

62

63 E) FINITION DU BRIN Destruction des amorces ARN par la RNase H qui détruit les ARN des hybrides ADN-ARN. La lacune engendrée est comblée par l ADN polymérase I La soudure est réalisée par une ligase

64 F) CORRECTION IMMÉDIATE DES ERREURS

65 IV-2 LA REPARATION DE L ADN

66 La réplication : insuffisante pour maintien intégrité de l ADN Insuffisante pour conserver rôle de l ADN dans l évolution. La conservation de l information empêche la dégénérescence rapide.

67 ALTÉRATIONS DE L ADN : 2 CAUSES La non fidélité de la réplication Les agressions subies par l ADN

68 IV-2 LA CONSERVATION DE L ADN 1) LES AGRESSIONS SUBIES PAR L ADN ET LEURS CONSÉQUENCES

69 A) LES AGRESSIONS PHYSIQUES Rayonnements très énergétiques : Rayonnements cosmiques, Radioactivité Rayonnements moins énergétiques : Rayons ultraviolets.

70 A) LES AGRESSIONS PHYSIQUES (2) Les conséquences des rayonnements très énergétiques : Lésions directes modifications de bases, ruptures de brins Conséquences indirectes induisent la production d ions superoxydes O - - chimiquement très réactifs

71 A) LES AGRESSIONS PHYSIQUES (3) Les conséquences des Rayons ultraviolets : principalement des dimérisations de thymines adjacentes (création de liaisons covalentes entre nucléotides adjacents)

72 Les dimères de thymine *Action sur l ADN des rayons ultraviolets (soleil) * Des dimères similaires peuvent se former entre 2 bases pyrimidine voisines dans l ADN (C ou T).

73 B) LES AGRESSIONS CHIMIQUES Par des molécules réactives Par des radicaux libres

74 B) LES AGRESSIONS CHIMIQUES (2) Origine de ces molécules Métabolisme propre de la cellule Ex : ions H+ cellulaires et l agitation thermique peuvent retirer jusqu à bases puriques par jour et par cellule chez l homme.

75 B) LES AGRESSIONS CHIMIQUES (3) Conséquences Lésions directes: Dépurination Modification de bases [désamination, oxydation, ], Création de liaisons covalentes entre les deux brins.

76 Dépurination de l ADN

77 Désamination Désamination

78 Désamination et dépurination : - deux réactions chimiques les plus fréquentes è lésions sévères au niveau de l ADN cellulaire

79 Sites pouvant être modifiés par des lésions oxydatives (flêches rouges), des attaques hydrolytiques (flêches bleues), et des méthylations incontrôlées (flêches vertes)

80 B) LES AGRESSIONS CHIMIQUES (4) Conséquences Lésions indirectes: Drogues intercalantes

81 C) CONSÉQUENCES DES AGRESSIONS Tout évènement qui modifie de manière irréversible la structure de l ADN par rapport à la double hélice régulière est reconnu comme inacceptable.

82 C) CONSÉQUENCES DES AGRESSIONS (2) Le changement peut être : une mutation ponctuelle qui transforme une base en une autre, un changement structural qui ajoute un élément volumineux à l ADN ou relie deux bases l une à l autre.

83 C) CONSÉQUENCES DES AGRESSIONS (3) Le changement d une seule base Affecte séquence mais pas la structure globale de l ADN è mésappariement. N empêchent pas la réplication lorsque les brins sont séparés, ni la transcription. Risque pour les générations futures.

84 C) CONSÉQUENCES DES AGRESSIONS (4) Les modifications structurales Peuvent constituer un obstacle physique à la réplication ou à la transcription : liaisons covalentes entre bases d un même brin d ADN ou entre les bases situées sur des brins opposés.

85 C) CONSÉQUENCES DES AGRESSIONS (5) Les modifications structurales Exemples : - UV è dimérisation de pyrimidines adjacentes - Addition d un groupement volumineux sur une base

86 C) CONSÉQUENCES DES AGRESSIONS (6) Les modifications structurales Autre cas : Coupure simple brin ou retrait d une base empêche un brin de servir de matrice pour la synthèse d ADN ou d ARN.

87 C) CONSÉQUENCES DES AGRESSIONS (7) Quel que soit le changement induit Si maintien du composé d addition endommagé dans l ADN è maintien des problèmes structuraux et/ou induction de mutations jusqu à ce qu il soit enlevé.

88 IV-2 LA REPARATION DE L ADN 2) LES SYSTÈMES DE RÉPARATION

89 A) PRINCIPAUX SYSTÈMES Le principe de la réparation est d éliminer les lésions et de revenir à la séquence d origine Le mode le plus courant est le celui du système de réparation par excision-remplacement Systèmes de compensation La réparation directe Les systèmes de tolérance

90 B) SYSTÈMES DE COMPENSATION Il existe des systèmes qui compensent les conséquences néfastes de l ADN endommagé au cours de la réplication : systèmes de compensation.

91 C) LA RÉPARATION DIRECTE Elle est rare Implique l iinversion ou le simple retrait de la lésion. Processus direct et spécifique de chaque altération.

92 C) LA RÉPARATION DIRECTE (2) Cas de la photoréactivation des dimères de pyrimidines : les liaisons covalentes sont défaites par une enzyme dépendante de la lumière : système très répandu dans la nature. Chez E. coli : gène phr è enzyme photolyase.

93 D) LE SYSTÈME DE RÉPARATION PAR EXCISION 1. Etape de reconnaissance des sites endommagés par des nucléases spéciales (endonucléases) : reconnaît une base endommagée ou un changement dans le parcours spatial de l ADN 2. Excision de la région endommagée de l ADN (exonucléases). 3. Synthése d une séquence de remplacement par d autres enzymes (ADN polymérase, ADN ligase)

94 " Nucléases : enzymes qui attaquent l ADN) Les endonucléases coupent à l intérieur d une chaine continue d ADN * Attaque (coupure) par une endonucléase Les exonucléases retirent des nucléotides d une chaine nucléotidique à partir d une extrémité libre Attaque (coupure) par une exonucléase

95 C) LE SYSTÈME DE RÉPARATION PAR EXCISION (2) Systèmes courants d endonucléases certains reconnaissent des lésions générales dans l ADN, D autres agissent sur des altérations spécifiques des bases : les glycolases reconnaissent les bases endommagées spécifiques, les endonucléases AP reconnaissent les résidus des sites qui ont perdu une ou plusieurs purines

96 C) LE SYSTÈME DE RÉPARATION PAR EXCISION (3) Il y a souvent de multiples systèmes de réparation par excision dans un même type cellulaire, et ils s occupent probablement de la majorité des lésions qu ils rencontrent

97 C) LE SYSTÈME DE RÉPARATION PAR EXCISION (6) CHEZ E. COLI Différents modes de réparation en fonction de la longueur des fragments dadn à réparer, Réparation de très courts fragments : système VSP Réparation de courts fragments : gènes uvr Réparation de longs fragments : gènes uvr

98 D) LA RÉPARATION DES MAUVAIS APPARIEMENTS Résulte d un examen de l ADN qui détecte des bases voisines mal appariées. Les mauvais appariements qui se produisent au cours de la réplication sont corrigés par une distinction entre les brins «neufs» et les brins «anciens» (méthylés) (système dam) et par une correction préférentielle de la séquence des brins néo-synthétisés. Dautres systèmes s occupent des mauvais appariements produits par la conversion de bases telle qu en provoque la désamination.

99 EUCARYOTES Les systèmes de réparation mal élucidés. Ils sont probablement proches de ceux des procaryotes. Certaines maladies humaines héréditaires donnent une indication de l existence et de l importance des systèmes de réparation chez les mammifères : systèmes par excision, système par recombinaison existent vraisemblablement.

100 IV-2 LA REPARATION DE L ADN 3- CAS PARTICULIER DES MÉTHYLATIONS : MODIFICATIONS CONSITUTIVES DE L ADN

101 La méthylation est la modification la plus courante de l ADN. Existe de manière constitutive : elle est physiologique Correspond à un marquage informatif de l ADN. A une signification différente chez les procaryotes et chez les eucaryotes.

102 LA METHYLATION CHEZ LES PROCARYOTES (1) L ADN de E. coli contient une petite quantité de 6- méthyladénosine et de 5-méthylcytosine sous l action de 3 systèmes de méthylation

103 LES MÉTHYLATIONS CHEZ LES PROCARYOTES (2) Infection d une bactérie par un virus Lors de l infection d une bactérie par un virus, celui-ci injecte son ADN dans la bactérie. Pour se défendre, la bactérie détruit l ADN viral grâce à des enzymes capables de cliver l ADN : les endonucléases de restriction Sans protection, l ADN bactérien peut lui aussi, être coupé par ces enzymes

104 LES MÉTHYLATIONS CHEZ LES PROCARYOTES (2) Rôle de la méthylation chez les procaryotes Protection de l ADN de la cellule hôte contre les clivages par les endonucléases de restriction contrairement aux ADN étrangers qui ne possèdent pas les mêmes systèmes de modification et de restriction. But principal : protection de la bactérie vis à vis des invasions, la source d invasion la plus courante étant le bactériophage.

105 LES MÉTHYLATIONS CHEZ LES EUCARYOTES (1) Chez les eucaryotes, la méthylation a pour rôle de distinguer les gènes qui sont dans des conditions fonctionnelles différentes. Voir le chapitre sur la régulation de l expression des gènes

106 V- ORGANISATION DU GÉNOME

107 V-1 LA REPETITION

108 LA RÉPÉTITION Séquences uniques dans le génome : Seul composant de l ADN procaryote Composant principal de l ADN eucaryote Séquences répétées : séquences présentes en plusieurs copies dans le génome: Moyennement répétées Hautement répétées La plupart des gènes de structure : ADN non répété La fréquence des différents types d ADN est spécifique de chaque génome

109 V-2 L ABONDANCE D UN GENE

110 ABONDANCE D UN GÈNE Niveau d expression d un gène = nombre de copies d ARNm correspondant dans les cellules Gène abondant è copies d ARNm Gènes moyennement abondants : 10 3 Rarement exprimés : < 10 copies (majorité des gènes)

111 ABONDANCE D UN GÈNE (2) La majorité des ARNs sont présents dans la plupart des cellules (voire toutes) fonctions nécessaires à tous les types cellulaires : fonction de ménage (housekeeping) ou activité constitutive

112 ABONDANCE D UN GÈNE (3) Par opposition, gènes impliqués dans des fonctions spécialisées nécessaires qu à quelques cellules: Cellules musculaires Globules rouges,..

113 V-3 NOMBRE DE GENES

114 Bactéries : > 2000 gènes Eucaryotes supérieurs: de l ordre de gènes dont qui s expriment Espèce humaine : Séquençage du génome terminé en 2003 (Human genome project) 3,3 milliiards de pb dont 1,5% utilisés pour la synthèse des protéines = ADN codant = gènes actifs codant pour 1 ou plusieurs protéines Reste de l ADN était considéré comme de l ADN poubelle (junk DNA, COMINGS, 1972) : en fait fonction n était pas connue

115 V-4 MORCELLEMENT DU GÉNOME EUCARYOTE

116 De nombreux gènes eucaryotes sont plus longs que leurs ARNm Cette différence provient d interruptions séparant plusieurs parties d une région codante d ADN. Chez les eucaryotes supérieurs, peu de gènes continus

117 Exons : séquences représentées dans l ARN mature Introns : séquences intermédiaires, enlevées lors de la maturation du transcrit primaire. Délétées lors de l épissage de l ARN

118 Exons (300 pb) beaucoup plus petits que les introns (300 pb è pb) : Taille des introns détermine la taille d un gène Les exons sont reliés les uns aux autres dans l ARN dans le même ordre que l ADN Les introns n ont pas de fonctions codantes

119 V-5 ORGANISATION DU MATÉRIEL GÉNÉTIQUE CELLULAIRE

120 MATÉRIEL GÉNÉTIQUE Masse compacte dans un volume limité Différentes activités (réplication, transcription, ) dans ce volume restreint è passage d un état inactif à un état actif

121 MATÉRIEL GÉNÉTIQUE (2) Nécessité d une condensation serrée de l ADN L état condensé résulte de la liaison de l acide nucléique à des protéines basiques (nucléoprotéines).

122 MATÉRIEL GÉNÉTIQUE (3) Bactéries : matériel génétique sous la forme d un nucléoïde

123 MATÉRIEL GÉNÉTIQUE (4) Eucaryotes : masse de chromatine dans les noyaux (interphase). Eucaryotes (mitose) : empaquetage encore plus étroit è chromosomes

124 V-5 Organisation du matériel génétique cellulaire A- CHEZ LES PROCARYOTES

125 LES PROCARYOTES Nucléoïde : Grand nombre de boucles d ADN double brin Chaque boucle est fixée à sa base è domaine structural indépendant Chaque boucle : propre degré d enroulement Environ 100 domaines / génome

126 V- Organisation du génome eucaryote E- ORGANISATION DU MATÉRIEL GÉNÉTIQUE CELLULAIRE 2) CHEZ LES EUCARYOTES

127 V-5 Organisation du matériel génétique cellulaire B- CHEZ LES EUCARYOTES

128 A) HIÉRARCHISATION DU DEGRÉ DE COMPACTION Nucléosome Fibre de 100 Å Fibre de 300 Å : chromatine

129 B) LE NUCLÉOSOME Sous-unité fondamentale de la chromatine Identique chez tous les eucaryotes Plus de 90% du génome est organisé en nucléosome

130 B) LE NUCLÉOSOME (2) Constitué : D une longueur d ADN de 200 pb enroulée autour D un octamère contenant des histones (protéines) 2 copies de H 2 A 2 copies de H 2 B 2 copies de H 3 2 copies de H 4 1 copie de H 1 Histones du noyau = core

131 STRUCTURE DU NUCLÉOSOME Le core (histones) a une structure cylindrique de 110 Å sur 60 Å ADN hauteur= 60 Å H1 110 Å = diamètre

132 C) LA FIBRE DE 100 Å DE DIAMÈTRE Chaîne continue de nucléosomes chapelet 100 Å = diamètre du nucléosome

133 100 Å

134 D) LA FIBRE DE 300 Å DE DIAMÈTRE Provient de l enroulement des fibres de 100 Å H1 nécessaire à cet enroulement (stabilisation) 6 nucléosomes par tour

135 D) LA FIBRE DE 300 Å DE DIAMÈTRE (2) Constituant de base de la chromatine

136 E) LA CHROMATINE Niveau d organisation supérieure de la fibre Due à des protéines non histones

137 E) LA CHROMATINE (2) Sensibilité à l ADNase I (enzyme qui coupe l ADN) Régions hypersensibles à l ADNase I : domaines contenant des gènes actifs Localisation : sites de régulation de la transcription, origine de réplication, autres

138 E) LA CHROMATINE (3) Régions hypersensibles à l ADNase I : régions où nucléosomes exclus par la présence d autres protéines (ARN polymérase, )

139 E) LA CHROMATINE (4) Euchromatine : compaction plus lâche des fibres Hétérochromatine : empaquatage très dense des fibres, forme inactive de la chromatine

140 F) LES CHROMOSOMES Etat de compaction extrême de la chromatine

141 PROJET ENCODE (ENCYCLOPEDIA OF DNA ELEMENT)

142 ADN SITUÉ EN DEHORS DES GÈNES Espèce humaine : Etait considéré comme de l ADN poubelle (1972) En dehors des gènes, reste de l ADN a en fait des fonctions biologiques et est essentiel à la vie Projet ENCODE ou Encyclopedia of DNA elements (international,> 400 chercheurs) : Cartographie systématique des régions transcrites, des régions de liaison aux facteurs de transcription, structure de la chromatine, de modification des histones

143 Rôle majeur dans la régulation de l expression des gènes (publication en 2012 des premiers résultats) vaste table de contrôle avec des millions d'interrupteurs régulant l'activité de nos gènes. Sans ces interrupteurs les gènes ne fonctionneraient pas et des mutations dans ces régions pourraient induire des maladies, 80% du génome (incluant les gènes) a un rôle codage d'arn régulateurs? Résultats plus précis au cours des prochaines années Nature 489, (06 September 2012)

144 V-6 Génome extra chromosomique (extra nucléaire)

145 Responsable de la transmission non mendélienne des caractères Transmission mendélienne contributions égales des deux parents

146 Résulte de la présence dans les mitochondries et les chloroplastes (végétaux) de génomes d ADN transmis indépendamment des gènes nucléaires

147 Code pour l ensemble des ARNs de l organite Code pour seulement certaines protéines nécessaires au fonctionnement de l organite Autres protéines sont codées par le noyau et importées dans l organite

148 Sont transcrits et traduits dans le même compartiment de l organite Transmission exclusivement maternelle

149 V-5 Organisation du génome eucaryote 1) ORGANISATION GÉNÉRALE DE L EXPRESSION DU GÉNOME MITOCHONDRIAL

150 GÉNOME MITOCHONDRIAL ADN circulaire (exceptionnellement linéaire) : ADNmt Plusieurs exemplaires par organite è grand nombre par cellule Séquence spécifique

151 GÉNOME MITOCHONDRIAL (2) Taille très variable Petite taille chez les animaux : séquence connue chez l homme, la souris, la vache è taille de 16,5 kb environ Levure : environ 84 kb Plantes : minimum de 100 kb

152 GÉNOME MITOCHONDRIAL (3) : EXPRESSION La plupart des protéines constituantes sont importées du cytoplasme Petit nombre de protéines synthétisées in situ Appartiennent à des complexes dont certaines sous-unités sont importées du cytoplasme

153 GÉNOME MITOCHONDRIAL (4) : EXPRESSION Produisent tous les ARNs nécessaires à la synthèse de ces protéines : ARN messagers, ribosomaux et de transfert

154 GÉNOME MITOCHONDRIAL (5) : EXPRESSION Synthèse des ARNs par une ARN polymérase codée par le noyau La synthèse des protéines synthèse chez les procaryotes Code génétique un peu différent du code cytoplasmique

155 V-5 Organisation du génome eucaryote 2) L ADN MITOCHONDRIAL DE MAMMIFÈRES

156 Molécule compacte codant pour un nombre restreint de protéines : Pas d introns, Chevauchement de gènes ou pas de séparation entre les gènes Toutes les régions appartiennent à un gène (sont exprimées) sauf l origine de la réplication

157 13 régions codant pour des protéines Les gènes des ARNs de transfert séparent les gènes codant pour les protéines ou pour les ARNr Il existe un seul promoteur pour les gènes s exprimant dans le même sens è 1 transcrit unique

158 Transcrit è clivage Un brin transcrit dans le sens des aiguilles d une montre : brin H (heavy = lourd en densité) Brin L (light) : transcrit dans le sens contraire des aiguilles d une montre Transmission maternelle