L'ADN mitochondrial a été découvert en 1962 par Margit MK Nass et Sylvan Nass par microscopie électronique.

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1 L L'ADN mitochondrial a été découvert en 1962 par Margit MK Nass et Sylvan Nass par microscopie électronique. Figure 1 Mitochondries observées au microscope électronique à transmission Plus tard, cet ADN particulier, extrait de cellules animales, sera séquencé par Gillum en L étude de cet ADN particulier révélera un polymorphisme particulier qu utilise la police scientifique depuis les années dans des cas de filiation, dans le cas où le suspect est en fuite en particulier, ou alors lorsque l ADN nucléaire est inexploitable. 1

2 La mitochondrie Description Les mitochondrie (du grec mitos, fil et chondros, grain) sont des organites cellulaires spécialisés présents à l'intérieur des cellules eucaryotes, dont la taille est de l'ordre du micromètre. Leur rôle au sein de la cellule est primordial puisque c est elles qui assurent la production de l énergie utilisable par la cellule. Chaque cellule humaine contient des dizaines voire des milliers de mitochondries de 2 à 10m de long et 0,5 à 1 m de large. Elles se composent de 2 membranes mitochondriales, une externe et une interne, qui délimitent trois milieux : le milieu extra-mitochondrial (cytoplasme de la cellule), l'espace inter-membranaire et la matrice. Figure 2 Organisation de la mitochondrie Chaque mitochondrie comporte 2 à 10 de petites molécules d ADN mitochondrial (16kb) présentes sous une forme circulaire dans la matrice. Origine Une cellule eucaryote primitive aurait intégré une bactérie il y a environ 1,5 à 2 milliards d années, lorsque l atmosphère primitive s est enrichie en dioxygène. Une étude phylogénétique indique que le plus proche parent de cette bactérie primitive connu actuellement est Rickettsia prowazekii, un parasite intracellulaire obligatoire. 2

3 Au cours de l évolution, la majorité des gènes de l endosymbionte originel auraient été perdus ou bien transférés vers le noyau de la cellule eucaryote hôte Cependant un petit nombre de gènes sont restés et ont donné lieu à la présence actuelle de mitochondries dans nos cellules. Le devenir des mitochondries lors de la fécondation Lors de la fécondation, l'ensemble du spermatozoïde pénètre dans l'ovocyte. Pourtant, la plupart des organites apportés par celui-ci, et notamment ses mitochondries, ne sont pas transmis à la descendance. Ainsi, l'adn mitochondrial est un héritage maternel : ainsi des frères et sœurs partageront le même ADN mitochondrial avec leur mère. En effet, chez la plupart des organismes, parmi lesquels les mammifères, l'adn mitochondrial du père ne se transmet pas à la descendance : seules subsistent les mitochondries de la mère, contenues dans l'ovocyte. Figure 3 Transmission de l'adn mitochondrial Les chercheurs ont montré que, quelques minutes après la fécondation, l'ovocyte enclenche un processus d'autophagie : les éléments du spermatozoïde sont séquestrés dans des vésicules puis éliminés par voie de dégradation enzymatique. 3

4 Le polymorphisme de l'adn mitochondrial La séquence de l'adn mitochondrial est entièrement connue et présente deux régions hypervariables HV1 et HV2, d une longueur totale de quelque 700 kb, au niveau de la région de contrôle de la réplication. Figure 4 Description du génome de l'adn mitochondrial Le polymorphisme n'est pas lié ici à des variations de longueur mais à des variations dans la composition en nucléotides (polymorphisme de structure). De ce fait, il existe de nombreuses versions avec des fréquences relativement faibles dans la population. Exemple différence entre deux individus au niveau de leur HV1 : 5'...GTACCTAGCTAGTTTTTTTTTTAG...3' 5'...AAAAGGTACGTAGAGAGAGATCC...3' 4

5 Utilisation par la police scientifique Principe Le polymorphisme de l'adnmt est moins marqué que celui de l'adn nucléaire et l'analyse qui en est faite est donc moins discriminante. En effet, l'adn mitochondrial ne permet pas d'identifier un individu à 100% mais permet d'exclure une hypothèse. On a environ 1 chance sur 2000 que deux personnes non apparentés présentent le même ADNmt. Il présente néanmoins un double intérêt : Préservé par la haute résistance de la mitochondrie et présent à de nombreux exemplaires dans une cellule (de l'ordre de 50 génomes mitochondriaux pour un seul génome nucléaire), il peut être analysé sur des traces anciennes ou fortement dégradées sur lesquelles l'adn nucléaire n'est plus exploitable. La recherche historique en a fait ces dernières années un fréquent usage, notamment pour les ossements de la famille impériale de Russie et pour le coeur présumé de Louis XVII conservé à St Denis. Il peut également permettre d'expertiser des tissus biologiques dépourvus d'adn nucléaire, mais riches en mitochondries, qui sont prélevés sur une scène de crime. C'est notamment le cas des tiges de cheveux. La comparaison des mitotypes (équivalent du génotype de l'adn nucléaire) est réalisée par séquençage des régions HV1 et HV2 de l'adn mitochondrial. Si plus de trois différences sont observées entre les deux ADNmt, on considère que les deux échantillons sont non apparentés. Dans le cas de l'affirmation d'identité, la fréquence du mitotype est déterminée à partir d'une banque de données internationale comportant les séquences de 1657 individus non apparentés. La majorité des séquences déterminées n'existent pas dans cette banque de données. Dans ce cas, l'estimation de la fréquence en cas d'identification est inférieure à 1/1657, soit moins de 0,06 %. Néanmoins, certaines séquences d'adn mitochondrial sont sur-représentées dans la population générale et leur fréquence peut atteindre 2,8 %. Dans ce cas, on considère que cette fréquence élevée ne permet pas une identification fiable et que seule une exclusion est possible. Cette technologie est lourde et onéreuse. Comme il s'agit d'une méthode permettant l'analyse de microprélèvements, elle est très sensible aux contaminations. Plus encore que pour l'adn nucléaire, la séparation des activités et la mise en place de nombreux contrôles (extraction-amplification) revêtent une importance particulière pour la validation des résultats. 5

6 Comme pour l ADN nucléaire, la séquence cible (sites HV1 et HV2) sont amplifiés grâce à la technique de la PCR. (voir article : de la découverte de l ADN nucléaire à son utilisation par la police scientifique). Cette amplification permet d avoir un échantillon d ADNmt suffisant pour permettre une analyse probante. Les différents acteurs du séquençage Des nucléotides (ou plutôt désoxynucléotides) ; Des didésoxynucléotides (nucléotides privés du groupement OH en position 3 ) marqués avec un fluochrome. Leur incorporation dans une chaîne d ADN interrompt définitivement la synthèse de l ADN ; Une amorce ; L ADN polymérase (enzyme synthétisant un brin complémentaire au brin matrice). Technique de séquençage Pour le séquençage, tout se passe initialement dans un tube à essai, en présence des acteurs de la synthèse de l ADN : de l ADN à séquencer, des nucléotides, une amorce et de l ADN polymérase. Chacun de ces acteurs est présent en grande quantité. La réaction de séquençage fait donc intervenir de multiples réactions. 1. L ADN polymérase utilise aléatoirement les nucléotides présents dans le milieu pour l ADN simple brin de la matrice en synthétisant un ADN de séquence complémentaire. 2. Lorsque l ADN polymérase choisit par hasard un didésoxynucléotide (ce qui est rare puisqu'il y en a moins que des nucléotides) et qu elle l incorpore dans la chaîne en synthèse, celle-ci s interrompt prématurément. Puisqu un grand nombre de réactions de synthèse ont lieu dans le tube, il existe statistiquement des chaînes de toutes les tailles qui commencent toutes au même endroit sur l ADN matrice (déterminé par l amorce utilisée), toutes celles qui possèdent la même longueur se terminent donc par le même didésoxynucléotide marqué par un fluorochrome spécifique (exemple : rouge pour A, bleu pour G, vert pour T et jaune pour C). Il est alors possible de séparer les chaînes d ADN obtenues par électrophorèse. Plus les chaînes sont courtes, plus elles migrent loin et tous les fragments d'une même taille migrent à la même distance. On obtient alors une succession de bandes colorées, chacune correspondant au dernier nucléotide incorporé. Il suffit alors de lire la succession des couleurs pour connaître l ordre des nucléotides, c'est-à-dire la séquence de l ADN, étape assurée automatiquement par les détecteurs du séquenceur. 6

7 Figure 5 Résultat d'une électrophorèse suite au séquençage de l'adnmt. Des marqueurs de taille peuvent être utilisés pour comparer. 7

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