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1 Caractérisation phénotypique et rôle des lymphocytes T régulateurs intra- hépatiques au cours de l hépatite chronique virale C N Sturm (1,2), MA Thélu (1), X Camous (1), G Dimitrov (1), M Ramzan (1), T Dufeu-Duchesne (1), C Guillermet (2), P Arvers (3), M Pernollet (4), V Leroy (1,5), JP Zarski (1,5), PN. Marche (1), E Jouvin-Marche (1) 1-Institut Albert Bonniot, Centre de recherche INSERM-UJF U823, IAPC, Grenoble 2-Département d Anatomie et de Cytologie Pathologiques, Pôle de Biologie, CHU de Grenoble 3-Centre de recherche de Service de Santé des Armées, La Tronche 4-Etablissement Français du Sang de Grenoble, La Tronche 5-Clinique Universitaire d Hépato-Gastro-Entérologie, Pôle Digidune, CHU de Grenoble

2 Rappels L infection virale C évolue vers la chronicité dans > 70% des cas Réponse immunitaire cellulaire anti-virale : rôle majeur dans l évolution de la maladie Réponse CD8 intra-hépatique forte : clairance du virus et guérison Réponse faible ou inefficace : persistance virale et progression de la maladie Mécanismes de dysfonctionnement Émergence de mutations virales Altération de la présentation antigénique Déplétion ou défaut de maturation lymphocytaire T Rôle «suppressif» des cellules T régulatrices sur la réponse cellulaire

3 Rappels Lymphocytes T régulateurs : «T suppresseurs» Tolérance immune : inhibent la réponse aux Ag du soi et agents infectieux T reg circulants plus nombreux chez VHC + que chez les sujets sains Population thymique «natural CD4T reg» la mieux connue et des populations périphériques «induced T reg» moins connues Freinent la prolifération TCD4 et TCD8, la réponse Th1, la cytotoxicité Mécanismes spécifiques ou non de l Ag viral, réversibles Rôle ambigu dans le VHC : limitent les dommages tissulaires mais favorisent la persistance du virus Majorité des études dans le VHC in vitro, sur T reg périphériques Reflet de l infiltrat Treg intra-hépatique in vivo?

4 Buts de l étude Mieux caractériser les T reg intra-hépatiques Leur fréquence dans le foie (% sang) Leur phénotype CD4+ et/ou CD8+ Leur localisation dans le foie (% aux lésions nécrotico-inflammatoires) Etudier leur rôle dans la persistance virale et dans la progression de la maladie Leur environnement (autres cellules T, cytokines) Leur évolution au cours de l aggravation de l activité et de la fibrose En s appuyant sur leur caractérisation phénotypique la mieux validée Expression CD25 (IL2-R), facteur de transcription FoxP3

5 Matériel et Méthodes Analyse en Cytométrie de Flux : 6 biopsies fraiches et 8 sérums Gating strategy CD4, CD8 puis CD25, FoxP3 Etude immunohistochimique en double marquage : 20 biopsies AFA, paraffine CD4 (DAB) / FoxP3 (FB) et CD8 (FB) / FoxP3 (DAB) Comptage cellulaire (station Nikon, Lucia) : nbre de cellules par champ x20 Nbre de CD4, CD8, FoxP3 Total, dans fibrose, dans parenchyme, particulièrement NL-NP Analyse par RT-PCR quantitative : 47 biopsies congelées CD4, CD8, FoxP3, IL-10, IFNγ, TGFβ, TNFα Corrélation paramètres biologiques, virologiques et histologiques

6 Fréquence et Phénotype des lymphocytes T régulateurs dans les biopsies de patients VHC+ Quantification des lymphocytes (%) Foie Sang % CD4 + /CD45 17,38 40,06 % CD8 + /CD45 32,52 25,60 %CD4 + CD25 + /CD4 + 5,96 8,42 %CD4 + CD25 + FoxP3 + /CD4 + CD ,49 45,86 %CD4 + CD25 + FoxP3 + /CD45 0,56 1,55 %CD8 + CD25 + FoxP3 + /CD8 + CD25 + Non détecté 0.04 Les cellules intra-hépatiques CD4 + CD25 + FoxP3 + représentaient < 0.6% du pool lymphocytaire total. CD8 CD8 CD4 CD4 Par cytométrie de flux, la présence de lymphocytes FoxP3 intra-hépatiques exprimant CD8 + CD25 + n était pas détectée. CD25 x CD25 FoxP3 FoxP3

7 Double immuno-marquage CD4/FoxP3 en microscopie optique Lymphocytes CD4 + FoxP3 - Lymphocytes CD4 + FoxP3 + Présence de nombreuses cellules CD4 + sans marquage FoxP3 Présence de nombreuses cellules CD4 + FoxP3 +

8 Double immuno-marquage CD8/FoxP3 en microscopie optique Lymphocytes CD8 - FoxP3 + Lymphocytes CD8 + FoxP3 - Présence de nombreuses cellules FoxP3 + sans marquage CD8 Présence de nombreuses cellules CD8 + sans marquage FoxP3

9 Phénotype des lymphocytes FoxP3 intra-hépatiques en microscopie optique La majorité des cellules FoxP3 sont CD4+ Lymphocytes CD4 - FoxP3 + Lymphocytes FoxP3+ CD8+ Présence de très rares cellules FoxP3+CD4- et FoxP3+CD8+ Nombre limité de Treg FoxP3+CD8+

10 Localisation des cellules CD4 + FoxP3 + dans le foie Nécrose Parcellaire Lymphocytes CD4 + FoxP3 + Nécrose Lobulaire Présence de cellules CD4 + FoxP3 + dans la fibrose (dont nodules lymphoïdes) et dans le parenchyme hépatique (dont nécroses parcellaires et lobulaires)

11 Relation entre les cellules FoxP3, CD4 et CD8 au sein du parenchyme hépatique Cellules FoxP3 totales r=0.508 p= r=0.538 p= Cellules CD4 totales Cellules CD8 totales L analyse immunohistochimique montrait que le nombre total de FoxP3 était corrélé au nombre total de CD4 et de CD8 - Après analyse en régression linéaire multivariée, seule persistait la corrélation CD8/FoxP3 (r=0.466, p=0.039) - Retrouvée dans les zones de fibrose (p=0.023) et le parenchyme (p=0.011)

12 Localisation des FoxP3 au sein du parenchyme FoxP3 dans nécrose r=0.695 p< % des cellules FoxP3+ étaient présentes dans les foyers nécrotico-inflammatoires, au contact de cellules CD CD8 dans parenchyme Nécrose Parcellaire Nécrose Lobulaire La corrélation la plus forte était observée entre les CD8 et les FoxP3 au sein des lésions nécrotico-inflammatoires (r=0.695, p<0.001)

13 Expression transcriptionnelle intra-hépatique des marqueurs cellulaires T et des cytokines 0,050 r= p= ,010 r= p=0.022 Transcrits CD8 0,040 0,030 0,020 0,010 0,000 0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0,012 Transcrits FoxP3 0,008 0,006 0,004 0,002 0,000 0,000 0,002 0,004 0,006 0,008 0,010 0,012 Transcrits IL-10 L analyse en composante principale déterminait plusieurs clusters de transcrits avec des corrélations fortes : CD8/FoxP3, CD8/IL10, IL10/TGFβ (r=0.688, p<0.001) et TGFβ/TNFα (r=0.652, p=0.005). L analyse en régression linéaire (uni et multivariée) révélait que CD8, IL-10 et FoxP3 étaient les 3 paramètres les plus corrélés et ceci, très significativement (r=0.810, p<10 6 ). Aucune corrélation entre la charge virale et les marqueurs utilisés.

14 Evolution des cellules CD8 et FoxP3 au cours de la maladie Cellules CD Le nombre de cellules CD8 augmentait constamment au cours de l aggravation de la pathologie Cellules FoxP Activité (Métavir) Fibrose (Métavir) Le nombre de cellules FoxP3 augmentait jusqu au grade A2 et au stade F3 de la pathologie pour décroître ensuite lors des étapes ultimes A3 et F4.

15 Relation entre FoxP3/CD8 intra-hépatiques et la gravité de la maladie 4% Cellules FoxP3 / CD8 3% 2% 1% z=2.324 p= % Activité Fibrose Le rapport FoxP3 /CD8 diminuait aux stades ultimes de la maladie et s effondrait de manière significative lorsque le stade de fibrose est F 3.

16 CONCLUSIONS 1. Les cellules T reg intra-hépatiques FoxP3 sont majoritairement CD Il existe une relation étroite entre FoxP3, CD8 et IL-10 réalisant un équilibre bénéfique à l hôte et au virus, dans les premiers stades de la maladie :. Les T reg FoxP3+CD4+ inhiberaient les CD8 cytotoxiques.. Ils agiraient par contact cellulaire avec les CD8, au sein des nécroses.. Ils agiraient également en produisant les cytokines IL-10 et TGFβ.. Ils limiteraient les lésions tissulaires mais favoriseraient la persistance virale. Tregs Réponse immune VHC 3. Cet équilibre semble rompu aux stades ultimes de la maladie et A2F3 pourrait représenter un tournant de la maladie : La diminution des Treg entraîneraient la perte de contrôle des CD8 et une aggravation des lésions.

17 Remerciements Centre de Recherche INSERM U823/Université Joseph Fourier Grenoble Patrice N Marche Evelyne Jouvin-marche Paula Bonorino Xavier Camous Guéorgui Dimitrov Tania Dufeu-Duchesne Martine Pernollet Muhammad Ramzan Marie-Ange Thelu Etablissement Français du sang La Tronche Martine Pernollet Clinique Universitaire d HépatoGastroEntérologie CHU-Grenoble Jean-Pierre Zarski Vincent Leroy Département d Anatomie et de Cytologie Pathologiques CHU-Grenoble Nathalie Sturm Christiane Guillermet Centre de recherche de Service de Santé des Armées La Tronche Philippe Arvers Cluster n o 10 «Infectiologie»

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