U 830 INSERM GENETIQUE ET BIOLOGIE DES CANCERS. Équipe «Analyse des Réseaux de Transduction (ART)» Chef d équipe : J. Camonis

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1 U 830 INSERM GENETIQUE ET BIOLOGIE DES CANCERS Équipe «Analyse des Réseaux de Transduction (ART)» Chef d équipe : J. Camonis 1- Introduction : le pourquoi, le comment Au début étaient les ténèbres. Dans le chaos de nos connaissances, la protéine Ral, une GTPase similaire au proto-oncogène Ras, n était qu une curiosité moléculaire : apparaissant avec les métazoaires, absente chez les plantes et chez les protistes, elle n était que le témoin de la richesse de l évolution par duplication/mutation à partir de quelques briques moléculaires initiales. Les choses ont changé : les GTPases Ral sont depuis lors considérée comme des acteurs-clefs de l oncogenèse humaine, tant pour le tumorigenèse que pour la formation de métastases. La voie Ral récapitule une grande partie l oncogenèse par Ras, est nécessaire à la survie des cellules tumorales, et à la tumorigenèse et la formation de métastases. Et enfin, chez la Drosophile où Ral est un gène unique, il est essentiel : sa délétion est létale. Identifier le réseau moléculaire et définir les sous-réseaux fonctionnels au travers duquel/desquels Ral agit dans ses nombreuses fonctions, élucider les mécanismes de ses actions pro-oncogéniques et physiologiques sont les missions de notre équipe d «Analyse des Réseaux de Transduction». Notre stratégie se déploie autour de deux modèles expérimentaux. Une approche ex vivo utilise des techniques de biochimie et de biologie cellulaire appliquées à des cellules humaines et murines tantôt «normales», tantôt avancées à des degrés divers dans les processus oncologiques. Une approche in vivo utilise le modèle de la Drosophile et met à profit la puissance des méthodologies génétiques chez cet insecte qui a contribué de façon essentielle à notre connaissance des mécanismes de la signalisation cellulaire. D un point de vue tactique, notre groupe a pour objectifs 1) d identifier les composants et dessiner la géométrie des réseaux véhiculant la transduction dépendante de Ral, 2) de comprendre la fonctionnalité des partenariats protéiques identifiés, en particuliers leur contribution aux processus néoplasiques mais aussi aux autres fonctions dépendantes de Ral, 3) de valider les nœuds de ces réseaux, en particuliers l existence de cibles thérapeutiques éventuelles. D un point de vue méthodologique, apres avoir travaillé à l identification des réseaux d interaction protéine-protéine à l échelle de protéomes (le projet DrosoMan), nous avons développé une approche systématique d inactivation par sirna à large échelle qui trouve ses moyens dans la plate-forme d imagerie automatisée Biophenics. Ces approches massives complètent les approches artisanales dans notre travail quotidien. 2- Le contexte Contrairement aux modèles cellulaires murins, dans les cellules humaines, le pouvoir oncogénique de RasV12 est largement pris en charge par la voie Ral et l'activation constitutive d'un facteur d'échange de Ral (RalGEF) récapitule l oncogenèse liée à RasV12. L'action de cette RalGEF passe par l activation de Ral même si des évènements indépendants de Ral pourraient être aussi nécessaire. Inversement l inactivation de RalGDS a montré que cette protéine est requise pour la formation de tumeurs dépendantes de Ras induites chimiquement. Aussi, Ral a été montré critique pour le pouvoir migratoire des cellules immortalisées et dans le pouvoir métastasant de cellules transformées par l'oncogène RasV12 mais aussi de cellules transformées par Src où Ras est sauvage.

2 2-1 Trafic et cycle cellulaire ou RLIP76/RalBP1, le premier effecteur identifié de Ral. Nous, et d autres, avions identifié RLIP76 (Jullien-Flores et al., JBC, 1995, 270 :22473) comme un effecteur de Ral impliqué dans l endocytose (Jullien-Flores et al., JCS, 2000, 113 :2837). Si en interphase RLIP76 est bien une protéine d endocytose, en mitose (et seulement en mitose) RLIP76 est localisé aux centrosomes une phase du cycle dénuée d endocytose. RLIP76 y est nécessaire à la migration des centrosomes dupliqués aux pôles du fuseau mitotique. Nous avons montré que un complexe RLIP-cyclinB-p34cdc2 (RLIP-CDK1) est formé en mitose. Nous avons testé l hypothèse selon laquelle RLIP76 servirait de plate-forme, qui rapprocherait CDK1 de ses substrats liés à RLIP, et que ces substrats seraient ses partenaires d interphase impliqués dans l endocytose. Or l endocytose s arrête en mitose. Nous avons montré qu en effet RLIP76 jouait ce rôle pour la phosphorylation d Epsin par CDK1. Or Epsin phosphorylée par CDK1 n est plus opérationnelle pour l'endocytose. Ainsi RLIP76 en mitose, tel Hagen dans le Crépuscule des Dieux fondu au cœur de ses ennemis, servirait à neutraliser les protéines d endocytose et éteindre la fonction «endocytose» lors de la mitose. Mais nous ne savons toujours pas la relation entre RLIP76 et le phénotype de «absence de séparation des centrosomes» en l absence de RLIP76. Or ce phénotype est identique à celui observé lorsque CDK1 ne phosphoryle pas la kinésine Eg5. Ceci nous a suggéré que dans sa fonction de plate-forme, RLIP76 jouerait aussi un rôle d interrupteur positif, rapprochant CDK1 de substrats mitotiques à activer, tel Eg5. Il n y a plus qu a démontrer cette hypothèse. Un article relatant ces données est publié dans J. Biol. Chem. (Rossé et al, JBC, 2003, 13:30597). 2-2 Ral et trafic ou le contrôle par Ral du trafic vésiculaire centrifuge Un modèle où Ral contribuerait à l oncogenèse par son interaction avec RLIP76 ne s impose pas avec une limpidité évidente. Nous avons supposé l existence d autres partenaires. Le mutant de Ral G23V, D49N est activé et n interagit pas avec RLIP76. Utilisé en appât dans un crible double-hybride, il nous a permis d identifier Sec5 comme un nouvel effecteur de Ral. Sec5 est une protéine qui participe à un complexe macromoléculaire, l exocyste, défini initialement par des mutants de S. cerevisiae affectés dans la sécrétion (d où le nom «sec»). Certains mutants SEC sont déficients dans la polarité du bourgeonnement. L exocyste chez les mammifères présente aussi une double fonction, dans la sécrétion et dans l établissement et le maintien de l asymétrie des cellules polarisées. Ceci a ouvert un nouveau champ de recherche car: 1) alors que l exocyste existe donc chez les protistes, Ral n apparaît qu avec les métazoaires où il y a donc une prise en charge de certaines fonctions de l exocyste par Ral ; 2) les protéines de l exocyste apparaissent comme les médiateurs de nombreuses fonctions de Ral. Ainsi, nous avons montré que Ral est nécessaire à l exocytose polarisée via son interaction avec l exocyste. i) dans des cellules MDCK via une fonction de stabilisation de complexes intermédiaires de l exocyste, ii) dans des cellules PC12. La situation s est compliquée quand il est apparu que Ral interagit avec Sec5 mais aussi avec une autre sous-unité du complexe de l exocyste, Exo84. Le modèle reste spéculatif qui justifie ces deux interactions pour permettre à Ral de stabiliser l holocomplexe octomerique de l exocyste dans son équilibre avec deux sous-complexes qui le constitue. Ce travail a été rapporté dans Moskalenko et al., Nat. Cell. Biol., 2002, 4 :66 et J. Biol. Chem, 2003, 278 : 51743). 2-3 Ral et Migration ou La signalisation contrainte dans l espace Nos résultats dévoilent la protéine Ral en acteur / régulateur d un trafic vésiculaire de l intérieur vers la périphérie de la cellule en même temps que comme acteur de l endocytose. Cette place au carrefour endocytose/exocytose pourrait donner à Ral un rôle dans la biogenèse et/ou le

3 recyclage de membranes. Si on y ajoute le rôle de Ral dans le ciblage asymétrique des protéines membranaires, la voie Ral pourrait être un verrou critique dans l établissement de contrainte spatiale au trafic et à la signalisation cellulaire. Cette relation «Ral et trafic de membranes» n est pas incohérente avec ce que nous savons du rôle de Ral dans la migration cellulaire, que ce soit in vitro (cellules C2C12 ou T24), in vivo en situation physiologique ("boarder cells" de l'ovaire de drosophile) ou dans la capacité de cellules tumorales à devenir invasives et former des métastases. Nous avons émis l'hypothèse qu une des bases moléculaires de cette contribution de Ral à la migration pourrait être sa participation au métabolisme des membranes dans des systèmes de trafic anisotropique. A la question «quel est l effecteur de Ral responsable de son rôle dans la migration cellulaire», nous avons répondu par une approche par RNAi, en test de réparation de blessure («wound healing») ou en migration en chambre de Boyden. Ainsi nous avons montré que i) RalA et RalB, protéines structurellement quasi identiques, ne sont pas redondantes, et RalA semble dispensable pour la migration alors que RalB est indispensable; ii) parmi les effecteurs de Ral, l exocyste joue un rôle majeur dans la migration où RalB est activé, ce qui conduit à une augmentation de «complexes exocystes octamériques» recrutés au front de migration. Le modèle qui apparaît à la lumière de ces travaux suggère que la génération de membrane sur le front libre des cellules est obtenue par recrutement de vésicules portant des sous-unités de l exocyste et que ce recrutement est dépendant de l activation de RalB Ce travail a été publié dans Rossé et al., Mol. Cell. Biol, 2006, 26 :727. Des partenaires moléculaires de l exocyste ont été identifiés lors de l établissement de l interactome de Ral, et nous avons continué à investiguer leur éventuelle implication dans la migration. Une première connexion relie l exocyste aux apkc via la protéine Kibra. Dans un travail collaboratif, nous avons montré que cette interaction est nécessaire à la migration et entraine une cascade d activation localisée apkc>jnk>paxillin qui est nécessaire a la migration. Ce travail a été publié dans PLOS Biol, Rosse et al, 2009, 7 : e Un autre travail est en cours, où nous montrons qu une RacGAP qui inactive spécifiquement Rac1 est nécessaire a la migration. Ceci éclaire d un jour nouveau le fonctionnement des GTpases Rac : ici l inactivation de Rac1 est montrée nécessaire. Comme son activation est nécessaire aussi, ces résultats montrent que ce sont des cycles d activation / inactivation de Rac1 qui sont critiques pour son fonctionnement lors de la migration. Le manuscrit relatant ces données est en phase finale d assemblage. 2-4 Ral et cytokinese ou comment deux protéines similaires, RalA et RalB, contrôlent des moments différents de la cytocinèse. La cytocinèse mobilise l exocyste, tant chez les plantes que chez S. cerevisiae où il n y a pas de GTPase Ral. Comme, chez les métazoaires, Ral a «détourné» l exocyste pour en faire un de ses effecteurs, nous avons posé la question du contrôle de la cytocinèse par Ral dans les cellules humaines. Des approches génétiques par sirna et mutants de Ral, et une biologie cellulaire en point fixe et en cellules vivantes ont révélé que chaque GTPase contrôle deux moments de la cytocinèse. RalA est nécessaire à la stabilisation du pont à sa naissance ; RalB est nécessaire à l abscission finale. Dans les deux cas, chaque Ral «passe» par l exocyste mais selon des modalités différentes. Enfin, chaque GTPase se fait nécessairement activer par deux RalGEFs différentes. Ces résultats suggèrent que 1) chaque GTPase relaie au moins deux signaux, un par chacun de ses activateurs 2) les signaux relayés par RalA et RalB sont différents. Ce travail a été publié dans Cascone et al., EMBO J., 2008, 27 :2375.

4 Depuis lors, ce travail s est orienté dans deux directions. D une part, une approche «transversale» par sirna ciblant les partenaires de l interactome de Ral a permis de définir les contributions des partenaires à l étape dépendante de RalA et à l étape dépendant de RalB de la cytocinèse offrant ainsi une première segmentation du réseau en sous-réseaux de signalisation. D autre part, nous définissons l anatomie moléculaire du réseau de kinases qui de RalA à JNK est nécessaire à l «étape RalA» de la cytocinèse, et étudions l impact cellulaire et moléculaire de cette voie JNK dépendante de RalA pour la stabilisation du pont nécessaire a la poursuite du processus de division. 2-5 La Drosophile comme approche intégrée de la voie Ral Si l interférence par RNA est une technique robuste qui permet de poser des questions qui auparavant auraient nécessité des approches laborieuses (KO génique), aléatoire (anti-sens) ou qui auraient trouvé des réponses parfois ambiguës (mutants dominants négatifs), l objet biologique étudié reste un ensemble de cellules «identiques». Etudier la signalisation et/ou le trafic (et c est peut-être la même chose) dans un organisme complet permet d envisager les évènements dans leur complexité biochimique, cellulaire, tissulaire : ceci nous a amené à travailler aussi in vivo. Une manière (intelligente mais prudente) de faire de la génétique a consisté à tester des hypothèses quant à des interactions, selon les résultats de cribles double-hybride ou des phénocopiages. Une approche plus risquée et plus puissante ne fait aucun à priori sur l architecture des voies de signalisation et/ou des interactions, et laisse «le modèle nous parler» lors de cribles génétique à la recherche de modificateurs de phénotypes. Une décision stratégique importante dans la vie de mon équipe a consisté à démarrer une activité de génétique en prenant comme organisme de travail la drosophile. 2-5-a Conservation et différences entre Homo sapiens et Drosophila melanogaster. Nous avons validé la drosophile comme système expérimental pour étudier la voie Ral en montrant la conservation des voies en amont (récepteur, Ras/Rap, RalGEF) et en aval de Ral entre les mammifères et la mouche Drosophila melanogaster. La carte des interactions protéine-protéine chez la drosophile montre que tous les éléments de la voie Ral se connectent de façon similaire chez la mouche et chez les mammifères. Paradoxalement les relations qui lient Ras à Ral ne peuvent se modéliser selon un schéma linéaire où la voie Ral est une voie effectrice de la voie Ras comme chez les mammifères. Le modèle pourrait presque se retourner et l activation de la voie Ras entraîne une aggravation des phénotypes observés quand la «signalisation Ral» est diminuée. D autre part, la voie Ral se comporte comme une voie effectrice de la voie Rap une signalisation paradoxale où en cellules mammifères l interaction physique entre Rap et des RalGEF est bien montrée mais sans aucun impact fonctionnel. Cette différence suggère que i) la drosophile a mis en réseau des modules identiques aux modules existant chez les mammifères mais selon une circuiterie différente, ii) les cellules ex vivo nous offrent de superbes artéfacts expérimentaux, iii) notre appréhension est différente entre cellules en culture et un système multicellulaire intégré. En outre, il n y aurait pas de "voie de signalisation" générique, et la transduction du signal ne pourrait être appréhendée qu'au sein de "réseaux" composés de modules élémentaires combinés différemment selon les organes. Ce travail a été publié dans Mirey et al., Mol. Cell. Biol., 2003, 23 : b Ral chez la mouche explique à la contribution de Ral à l oncogenèse Nous avons caractérisé les phénotypes de mutants amorphes et hypomorphes de Ral que nous avons générés. Par des approches génétiques et cellulaires, nous avons montré que Ral contrôle une apoptose dépendante de JNK en diminuant l activité JNK et/ou en augmentant

5 l activité de p38 qui se révèle capable d une fonction anti-apoptotique. Cette fonction antiapoptotique de Ral pourrait justifier sa nécessité dans l oncogenèse dépendante de Ras. Ces travaux ont été publiés dans Balakireva et al., Mol. Cell. Biol., 2006, 23: Par ailleurs, notre «investissement» dans la génétique de la voie Ral chez la Drosophile nous a permis de montrer que la contribution de Ral à une voie NFkB via l exocyste et la kinase TBK1 dans des cellules humaines en cultures était conservée chez la Drosophile, où la voie orthologue à la cascade Ral-exocyste-TBK contribue a l immunité innée. Nous apportions ainsi la première validation in vivo de cette voie mise en évidence in vitro. Ces travaux ont été publiés dans Chien et al., 2006, Cell, 127: c Plus de Drosophile pour plus de compréhension de l oncogenèse. A partir du phénotype de mort cellulaire chez un mutant Ral, nous avons mené un crible génétique a la recherche de modulateurs de ce phénotype. Ce travail assez laborieux a aboutit à identifier plusieurs dizaines de modulateurs. Le travail est en cours où, utilisant biologie cellulaire et génétique, nous explorons les mécanismes moléculaires et cellulaires qui expliquent ces relations génétiques. Nous orientons ce travail dans deux directions : d une part certains genes identifiés dans ce crible ont une claire contribution à la polarité apicobasal et nous en avons entrepris l étude de leur relation avec la voie Ral dans le système des cellules folliculaires de l ovaire de la drosophile. D autres gènes sont des suppresseurs inattendus de l apoptose liée au défaut de signalisation de Ral et nous essayons de démêler cet écheveau génétique. 3- Méthodologie et stratégie pour aujourd hui et demain. Hier Nous avons d abord associé approches moléculaires et cellulaires en lignées mammifères. Puis, nous avons complété notre boîte à outils méthodologiques avec une approche génétique en Drosophile. Ceci fut ensuite complété avec le projet que j ai animé de carte d interaction protéineprotéine à grande échelle (Projet DrosoMan) afin d établir des cartes de réseaux de protéines chez la Drosophile et chez l'homme. Il s agissait ainsi aussi de relever le défi fonctionnel de la génomique : face aux masses d informations fournies par les programmes de séquençage et d analyse des génomes et des transcriptomes, il est important de mettre en place des outils permettant de labourer le terrain fonctionnel par des approches massives. Les résultats de ce programme sont à la base de nombreuses publications, et la carte d interaction chez la Drosophile a été mise en ligne et publiée (Formstecher et al, Genome Res., 2005, 15 : ) Aujourd hui moins que demain : le projet Biophenics. L interactome moléculaire du programme DrosoMan offre des informations inédites et définit un espace des possibles. Il contribue à répondre à des questions de physiologie et physiopathologie cellulaire, en permettant d émettre des hypothèses qui restent à valider. Pour ce faire, le travail des artisans sophistiqués que nous sommes à la base est plus que jamais d actualité : la biologie cellulaire sur cellules ex vivo et en animal reste indispensable, et nous y consacrons beaucoup de ressources. De même, la génétique de la Drosophile est parfois la seule méthode qui permette de valider ou de mettre en évidence des interactions fonctionnelles. Mais à nouveau notre savoir-faire n est pas à la hauteur quantitative des informations fournies par les approches de la génomique et de la protéomique. Un saut technologique important est apparu avec l avènement des sirna en cellules mammifères, et là aussi des approches automatisée peuvent lever des goulets d étranglement.

6 Aussi avons nous mis en route un projet qui utilise 1) une approche systématique et parallèle par sirna dirigés contre tous les partenaires identifiés dans nos réseaux de signalisation en posant un minimum d hypothèses 2) une plate-forme de phénotypage cellulaire par imagerie et analyse automatisées qui, à travers des lectures phénotypiques (endocytose, sécrétion, prolifération, apoptose, activation de diverses voies de signalisation, migration, etc ), définira une carte d identité phénotypique pour chaque gène inactivé par RNAi. Cette plate-forme constitue le centre technique du programme Biophenics porté et mis en place avec le Dr. Franck Perez (UMR144, Curie) et moi-même. Elle est maintenant implantée et fonctionnelle à l Institut Curie. Au-delà de l interactome, une approche massive par biologie cellulaire : d un outil de validation à un projet d inférence. Il est évident que la plate-forme Biophenics a des applications de validation pour de nombreux projets de génomique et de transcriptomique des cancers. Mais outre cette fonction, le projet consiste aussi à créer une base de données où chaque gène inactivé aura une carte d identité phénotypique. Une similarité de cartes d identité entre gènes permettra d émettre l hypothèse d une convergence fonctionnelle et d une appartenance à une même voie ou à une même machine moléculaire. Tout naturellement, le projet initial s est étendu à l ensemble du génome avec 4 sirna ciblant tous les gènes du génome humain validé et prédit.