Plan du cours 29/03/2013. Schéma général transduction signal. Introduction Le cancer est une pathologie cellulaire

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1 UE09s Méthodes d étude et analyse du génome Applications des techniques du génie génétique à la thérapie des maladies acquises Exemples en cancérologie Thérapie ciblée Théranostique Plan du cours Introduction Cancérogenèse moléculaire Notion de thérapie ciblée Exemples de techniques en vue de détecter une anomalie moléculaire FISHamplification d un gène, surexpression du récepteur membranaire HER2 (cancer du sein) PCR et séquençage Sanger ou détection par extension d amorces mutation ponctuelle activatrice du gène KRAS, activation d une voie de transduction du signal de division mitotique (cancer colorectal) PACES Dr Nicolas SEVENET Schéma général transduction signal Introduction Le cancer est une pathologie cellulaire Tratstuzumab Cancer du sein R Cetuximab Cancer colorectal M = Messager R = récepteur C = cytoplasme N = noyau /Rubriques/Output/Communicati ons_intercellulaires3.php# Caractéristiques générales de la cellule cancéreuse Prolifération cellulaire non contrôlée Indépendance vis-à-vis des signaux de contrôle du cycle cellulaire Perte de l inhibition de contact Suppression de l exigence d un support solide Expansion clonale Hypothèse de Peter Nowell(1976) : toutes les cellules tumorales constituant la tumeur dérivent d une cellule unique dotée d une altération génétique favorisant la prolifération MAIS la cellule normale ne devient tumorale (= transformation cellulaire) qu après accumulation d anomalies génétiques Colonisation de tissus étrangers (métastases) Capacité d envahissement et de croissance au sein de tissus étrangers = le tissu stromal adjacent se modifie Introduction le cancer est une pathologie génétique Au niveau génétique L accumulation d anomalies génétiques est favorisée par une instabilité chromosomique globale ( altération de la ségrégation des chromosomes) instabilité génétique, complexité génomique : Augmentation du taux de mutation Mutations des gènes de contrôle du cycle cellulaire ou de la croissance cellulaire Balance entre prolifération et différenciation Modifications morphologiques Perte de l adhérence et morphologie arrondie Perte des câbles d actine Réorganisation du cytosquelette Diapo 6 cours JB Corcuff différenciation cellulaire UE2 S1 Gènes impliqués en cancérologie Définition Gènes dont l altérationva favoriser la prolifération tumorale Oncogènes Gènes dont l activation va accélérer la prolifération cellulaire Exemples Récepteurs membranaires Protéines de la transduction du signal (signalisation cellulaire, transmission d une information apportée par la fixation d un ligand à son récepteur membranaire, jusqu au noyau division de la cellule = signal mitogénique= de mitose) (diapos 22 & 25 cours Pr Cambar UE2 S1) Facteurs de transcription activant les gènes favorisant la division cellulaire Gènes suppresseurs de tumeur Gènes dont l inactivation va casser les mécanismes de contrôle du cycle cellulaire Autres Gènes codant des protéines impliquées dans la détection et la réparation des dommages de l ADN voir cours sur la réparation de l ADN, système Mismatch Repair 1

2 Introduction - thérapie ciblée Introduction - thérapie ciblée Biomarqueur L altération génétique entraîne la synthèse d une protéine Qui constitue un avantage sélectif pour la cellule tumorale avantage sélectif Qui peut être «utilisée» afin de suivre l évolution de la maladie marqueur d évolution, marqueur pronostic Qui peut être ciblée par un médicament destiné à ralentir ou supprimer le développement de la tumeur cible thérapeutique, marqueur prédictif Exemples de thérapies ciblées Amplification du récepteur membranaire anticorps monoclonal anti- = Trastuzumab, Herceptin Activation de la voie EGFR/Ras anticorps monoclonal anti-egfr inhibant cette voie si protéine RAS n est pas mutée = Cetuximab, Erbitux CANCER DU SEIN THÉRAPIE CIBLÉE ANTI-HER2 HERCEPTIN Voie de transduction du signal débutant par le récepteur membranaire Baselga J, Swain SM (2009) Novel anticancer targets: revisiting ERBB2 and discovering ERBB3. Nature Rev Cancer 9, Activation d une voie de signalisation cellulaire Détermination de la surexpression tumorale de HER2 Dimérisationdu récepteur HER2 phosphorylation des tyrosine situées sur la partie intracytoplasmique du récepteur Interaction avec la PI3kinase et activation de la voie PTEN La surexpression tumorale de est observée dans Les cancers du sein En phase précoce (observée au diagnostic) Métastatiques (observée lors de l évolution tumorale) Certains cancers de l estomac Elle est associée à une prolifération cellulaire augmentée, une agressivité tumorale (accroissement de la masse tumorale) 2

3 Détermination de la surexpression tumorale de HER2 Détermination de la surexpression tumorale de HER2 On parle de surexpression tumorale lorsqu en immuno-histochimie anti-, on observe un marquage des cellules tumorales Modéré et homogène : IHC 2+ homogène Fort : IHC 3+ Principe Immuno- HistoChimie(IHC) Coloration HES des tissus IHC Diapos 32 à 35 du cours de P Dubus en histologie Surexpression tumorale de Elle est un facteur pronostique et prédictif de thérapie ciblée Immuno-histochimie anti-her2 sur tumeur du sein FISH IHC 0 Absence de marquage anti- ( négatif) le récepteur membranaire n est pas exprimé à la surface des cellules tumorales IHC 1+ Faible marquage anti- Différence de marquage entre cellules normales et cellules tumorales le récepteur membranaire est peu exprimé à la surface des cellules tumorales Iconographies et schémas disponibles sur le site laboratoire Roche Iconographies et schémas disponibles sur le site laboratoire Roche Immuno-histochimie anti-her2 sur tumeur du sein Carcinomes canalaires infiltrants FISH HER2 PRÉDICTIF Indication thérapeutique de trastuzumab(herceptin ) IHC 2+ Marquage anti- circonférentiel de la cellule tumorale modéré le récepteur membranaire est exprimé à la surface des cellules tumorales IHC 3+ Marquage membranaire anti- intense et complet sur plus de 10% des cellules tumorales ( positif) le récepteur membranaire est fortement exprimé à la surface des cellules tumorales Iconographies et schémas disponibles sur le site laboratoire Roche Recherche d amplification du locus HER2 par FISH POUR TOUT cancer du sein (CARCINOME MAMMAIRE INFILTRANT ) 2+ EN IHC anti-her2 Diapositives réalisées avec l aide de Frédéric Chibon 3

4 FISH Fluorescent In Situ Hybridization Principe Principe Décrit dans le cours d Edith Chevret(UE1, diapos 39 à 45) Hybridation moléculaire Dépistage de la trisomie 21 (3 chromosomes 21) Détection d une translocation réciproque entre deux chromosomes (t(9;22), chromosome Philadelphie) Détection d une amplification Un gène est dupliqué de très nombreuses fois les unes à la suite des autres sur le même chromosome amplifié HSR, homogenousstaining Region= région colorée de façon homogène Fragments d ADN locus spécifiques HYBRIDATION Prélèvement étudié: Etalement chromosomique Noyaux interphasiques Coupes... Diapositives réalisées avec l aide de Frédéric Chibon Chr 17 Chr 17 Cen17 Cen17 Cen17 Cen17 pies%20par%20noyau%20fish&source=web&cd=5&ved=0cesqfjae&url=http%3 A%2F%2Fwww.e- cancer.fr%2fcomponent%2fdocman%2fdoc_download%2f4298- caracterisations-des-tumeurs-de-la- vessie&ei=a9t0t8mne4nf0qwrmjwudq&usg=afqjcneoaqdiy- XK045MW1ucGzlYircwHQ Ratio = /Cen17= 1 Ratio = /Cen17= 1,5 Pas d amplification Diapositives et schémas des Dr Beuzeboc, Dr Couturier, Institut Curie, Paris Diapositives et schémas des Dr Beuzeboc, Dr Couturier, Institut Curie, Paris 4

5 Carcinomes canalaires infiltrants FISH HER2 Carcinome Canalaire Infiltrant- Grade III - IHC 20% 2+ Diapositives et schémas des Dr Beuzeboc, Dr Couturier, Institut Curie, Paris Nombre moyende copies par noyau: HER2 =2.65 CEN-17 = 1.82 HER2/CEN-17 ratio : 1.45 NON AMPLIFIE Diapositives réalisées avec l aide de Frédéric Chibon Carcinomes canalaires infiltrants FISH HER2 Carcinome Canalaire Infiltrant-Grade III - IHC 60% 2+ L Herceptin en situation métastatique Essai pivot (pivotal study) M+ 1ère ligne IHC 2+ or 3+ A/E (60 / 75) C (600) ou Paclitaxel (175 mg/m²) CT (AC/EC ou Pacli) + Herceptin Slamon, DJ. N Engl J Med 2001; 344 : Nombre moyende copies par noyau: HER2 10 CEN-17 2 HER2/CEN-17 ratio : > 5 AMPLIFIE Objectif principal : Une diminution de 50 % du délai médian avant progression Diapositives réalisées avec l aide de Frédéric Chibon Un marqueur frontière dans le cancer colorectal : le gène KRAS CANCER COLORECTAL THÉRAPIE CIBLÉE ANTI-EGFR ERBITUX Siena, S et al (2009) Biomarkerspredictingclinicaloutcomeof epidermalgrowthfactor receptor-targetedtherapyin metastaticcolorectal cancer. JNCI 101,

6 Voie de transduction du signal EGFR-KRAS Immunohistochimie anti-egfr Algarset al (2011) EGFR gene copy number assessment from areas with highest EGFR expression predicts response to anti- EGFR therapy in colorectal cancer BJC 105, NormannoN et al (2009) Implications for KRAS status and EgFR-targeted therapies in metastatic crc Nat. Rev. Clin. Oncol. 6, Marquage anti-egfr intense avec deux clones différents Cetuximab Erbitux Mécanisme d action du cetuximab Anticorps monoclonal humanisé anti-egfr (Her1) Inhibe la prolifération des cellules tumorales Surexprimant le récepteur EGFR Avec une voie de signalisation fonctionnelle (gène KRASnon muté, «wild-type») ATTENTION: Si la voie est activée (mutation activatrice oncogène KRAS), il n y a plus d indication à inhiber EGFR Indications Cancer colorectal métastatique en association avec les chimiothérapies classiques Cancer des voies aéro-digestives supérieures en association avec des chimiothérapies classiques (à base de sels de platine) Ligand Activation de EGFR Cascade de transduction du signal Gènes activés Blocage de EGFR Cascade de transduction du signal Gènes non activés Apoptose Angiogenèse Métastase Prolifération dédifférenciation Autre représentation du mécanisme d action du cetuximab Cetuximab- Erbitux - Anti-EGFR KRAS cancer colorectal métastatique Cetuximab NormannoN et al (2009) Implications for KRAS status and EgFR-targeted therapies in metastatic crc Nat. Rev. Clin. Oncol. 6, Patients avec mutation KRAS Patients avec KRAS NORMAL Le cetuximabn inhibe la prolifération cellulaire (et donc entraîne une survie prolongée chez les patients) uniquement lorsque la voie EGFR-KRAS est intègre ( KRAS non muté, normal) 6

7 Mutations KRAS les plus fréquentes Chr 12; exon 2; Codons 12 et 13 Les mutations KRAS les plus fréquentes GGT GGC Détermination du statut KRAS recherche des mutations ponctuelles activatrices de l oncogène KRAS 2 méthodes principalement PCR-séquençage direct PCR en temps réel : méthode par extension de primer Délimiter la zone tumorale à explorer La détermination du statut KRAS par séquençage direct 140 pb Exon 2 KRAS Primer forward(sens) Primer reverse (antisens) KRAS; Exon 2; p.gly12val, GGT>GTT La détermination du statut KRAS semi-automatisée Méthode par extension d amorce puis électrophorèse capillaire (sur un séquenceur) Principe dateien/infos_nr188.pdf 7

8 Shifted Termination Assay(STA) Life technologies Protocole du STA pour détermination KRAS Principe Après la PCR, durant la réaction d élongation d oligonucléotide(primer extension), des oligonucléotidesparticuliers vont permettre, sous conditions réactionnelles, l allongement de la séquence ou pas. Les produits alors formés sont détectables après migration électrophorétique en capillaires Résultats KRAS codon 12 KRAS codon 13 Exemples de résultats pour le codon 12 de KRAS Exemples de résultats pour le codon 13 de KRAS 8

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