MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE. ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre

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1 MINISTERE DE LA JEUNESSE, DE L'EDUCATION NATIONALE ET DE LA RECHERCHE ECOLE PRATIQUE DES HAUTES ETUDES Sciences de la Vie et de la Terre MEMOIRE présenté par Melle CHAPAT Ludivine pour l'obtention du diplôme de l'ecole Pratique des Hautes Etudes MÉCANISMES DE LA TOLÉRANCE ORALE : IMPLICATION DES CELLULES T CD4+CD25+ RÉGULATRICES soutenu le 27 Juin 2003 devant le jury suivant : Pr Jean-Marie Exbrayat - Président du jury Pr Geneviève CORDIER Rapporteur Dr Dominique KAISERLIAN Examinateur Dr Raphaëlle BOURDET-SICARD Examinateur Laboratoire EPHE : Directeur d étude : Pr G. CORDIER (Genevieve.Cordier@univ-lyon1.fr) Laboratoire Interactions cellulaires, Rétrovirus et Cancer (Directeur Pr G. CORDIER) UMR 754 INRA- ENVL - UCBL 50, Avenue Tony Garnier Lyon cedex 07 Laboratoire de stage :` Directeur de stage : Dr D. Kaiserlian (kaiserlian@cervi-lyon.inserm.fr) Unité INSERM 404 Immunité et Vaccination (Directeur Dr. T.F. Wild) 21 Avenue Tony Garnier Lyon cedex 07 Résumé La tolérance orale est un mécanisme immunologique physiologique qui prévient la survenue de réactions inflammatoires locales ou systémiques qui peuvent êtres provoqués par la pénétration, à travers l épithélium intestinal, d antigènes alimentaires ou environnementaux. Dans le but d étudier les mécanismes responsables de l établissement de la tolérance orale, nous avons utilisé un modèle murin d hypersensibilité retardée de contact (HSRC) aux haptènes (DNFB), dans lequel l administration orale de l haptène, avant la sensibilisation cutanée avec le DNFB, inhibe le développement de la réaction d HSRC, réponse médiée par les lymphocytes T CD8+. Nos travaux ont permis de mettre en évidence un rôle critique des cellules T CD4+CD25+ EPHE Banque de Monographies SVT 1

2 régulatrices dans l établissement de la tolérance orale au DNFB. Nous avons tout d'abord montré que le déficit de tolérance chez des souris déficientes en chaîne invariante (Ii / ) pouvait être totalement corrigé par transfert adoptif de lymphocytes T CD4+ avant le gavage par l'haptène. L'implication des cellules régulatrices T CD4+CD25+ a été démontré par les résultats suivants : (1) seul le transfert adoptif de T CD4+CD25+ chez des receveuses Ii / avant le gavage permet de prévenir la réaction inflammatoire et le recrutement cutané des lymphocytes T CD8+ effecteurs en bloquant l'activation/expansion des T CD8+, (2) la déplétion in vivo des cellules T CD4+CD25+ diminue la tolérance orale, (3) les cellules T CD4+CD25+ inhibent in vitro la prolifération et la production d'ifn-g par les cellules T CD8+ spécifiques d'haptène. Nous avons ensuite montré que le mécanisme d action des cellules T CD4+ régulatrices impliquées dans la tolérance orale au DNFB est indépendant de la production d interleukine-10 par ces cellules mais nécessite la présence de cellules présentatrices de l antigène exprimant les molécules de classe II du CMH. Ces études montrent que les cellules T CD4+CD25+ innées sont impliquées dans la suppression de réponses T CD8+ et de réactions inflammatoires spécifiques d haptène induite par tolérisation orale. Par ailleurs, nous avons montré que l administration orale prolongée de Lactobacillus casei est capable d inhiber la réaction d HSRC au DNFB en inhibant la réponse T CD8+ spécifique d haptène dans les organes lymphoïdes secondaires. Cet effet inhibiteur des bactéries lactiques dépend de la présence de cellules T CD4+ régulatrices. Des résultats préliminaires montrent que les souris traitées par Lactobacillus casei présentent une proportion accrue de cellules T CD4+CD25+CD62L+ régulatrices, augmentation qui pourrait expliquer l inhibition de l HSRC au DNFB. Ces résultats suggèrent que Lactobacillus casei pourrait être un des composants de la microflore intestinale impliqué dans les phénomènes de tolérance orale par sa capacité à induire et/ou activer des cellules T CD4+CD25+ régulatrices. SOMMAIRE Liste des abréviations utilisées 3 Buts du projet 5 DONNEES BIBLIOGRAPHIQUES 7 1 ère partie : Le système immunitaire intestinal 7 A.La muqueuse intestinale 7 A.1 L épithélium intestinal 7 A.2 Le chorion 8 B. Système lymphoïde associé à l'intestin et induction de la réponse immunitaire intestinale 8 B.1 Plaques de Peyer et ganglions 8 B.2 Réponse immunitaire intestinale : tolérance versus immunité protectrice 10 2 ème partie : La tolérance orale 11 A. Généralités 11 B. Les mécanismes de la tolérance orale 13 B.1 Anergie clonale 13 B.2 Délétion clonale 14 B.3 Suppression active 15 + EPHE Banque de Monographies SVT 2

3 B.3.1 Cellules T CD8 15 B.3.2 Cellules Tgd 15 B.3.3 Cellules T CD ème partie : Les cellules T CD4 + régulatrices 17 A. Les cellules Th2 17 B. Les cellules Th3 18 C. Les cellules T CD4 + régulatrices Tr1 19 D. Les cellules T CD4 + CD25 + régulatrices 19 D.1. Propriétés immunosuppressives 20 D.2. Mécanismes d'action 21 E. Mécanismes d'activation et d'expansion des cellules T CD4 + régulatrices 22 E.1 Rôle des cellules dendritiques "tolérogènes" 22 E.2 Rôle de la microflore intestinale 23 F. Régulation des réponses T CD8 + par les cellules T CD4 + régulatrices 24 4 ème partie : L'hypersensibilité retardée de contact aux haptènes 26 A. Physiopathologie de l'hypersensibilité de contact 26 A. 1. La phase de sensibilisation 26 A.1.1 Capture et apprêtement de l'haptène par les cellules dendritiques 27 A.1.2 Activation et migration des CD vers les ganglions lymphatiques 27 A.1.3 Activation et émigration des lymphocytes spécifiques d'haptène 27 A.2. La phase de révélation : déclenchement de la réaction inflammatoire 28 A.3 Régulation de l'hsrc : résolution de l'inflammation 29 B. Tolérance orale dans le modèle d'hsrc au DNFB 29 Liste des abréviations utilisées Ab / : BM-DC : BSA : CD : CL : CMH : CPAg : DNBS : DNCB : DNFB : EAE : FAE : Flt-3L : GALT : (souris Ab / ) souris déficientes en molécules de classe II du CMH Cellules dendritiques dérivées de la moëlle osseuse (Bone Marrow-derived Dendritic cells) Albumine de sérum de bœuf (Bovin Serum Albumin) Cellule dendritique Cellule de Langerhans Complexe majeur d histocompatibilité Cellule présentatrice de l antigène 2,4-Dinitrobenzenesulfonate 2,4-Dinitrochlorobenzène 2,4-Dinitrofluorobenzène Encéphalite autoimmune expérimentale Epithélium recouvrant les plaques de Peyer (Follicle Associated Epithelium) (Fleet-3 L), Ligand de Fleet-3, facteur de différenciation et d'expansion des cellules dendritiques Tissus lymphoïde associé à l intestin (Gut-Associated Lymphoid Tissue) EPHE Banque de Monographies SVT 3

4 GM-CSF : GRM : HSRC : IFN : Ig : IL : KLH : LIE : LP : LPS : M : MBP : MLN : OVA : PP : RAG / : SCID : SED : SVF : TcR : TGF : Th : TNF : UAE : GranulocyteMonocyte-Colony Stimulating Factor Globules rouges de mouton Hypersensibilité retardée de contact Interféron Immunoglobuline Interleukine Protéine extraite de crabe (Keyhole Lympet Hemocyanin) Lymphocytes intraépithéliaux Lamina propria Lipopolysaccharide Cellule M (Microfold) de l épithélium du dôme des plaques de Peyer Protéine basique de la myéline (Myelin Basic Protein) Ganglions mésentériques (Mesenteric Lymph Node) Ovalbumine Plaque de Peyer (souris RAG / ) souris déficiente en protéine RAG nécessaire à la recombinaison des gènes (souris SCID) souris présentant une déficience immunitaire sévère (Severe Combined Immune Deficiency) Dôme sous-épithélial des plaques de Peyer Sérum de veau fœtal Récepteur de l antigène des cellules T Facteur de croissance Transformant (Transforming Growth Factor) Lymphocyte T auxilliaire (T helper) Facteur de nécrose tumorale (Tumor Necrosis Factor) Uvéorétinite autoimmune expérimentale 1 ère partie : Le système immunitaire intestinal La muqueuse intestinale est l une des interfaces principales entre l organisme et le milieu extérieur. Elle est exposée de façon chronique à des stimuli antigéniques d origine alimentaire, environnementale ou provenant de la microflore bactérienne intestinale résidente. La très grande surface d'épithélium permet une absorption efficace des nutriments. Elle représente aussi un site d entrée des microorganismes pathogènes. A.La muqueuse intestinale A.1 L épithélium intestinal La muqueuse de l intestin grêle est formée de villosités recouvertes d un épithélium monostratifié absorbant composé de cellules épithéliales polarisées (les entérocytes), entre lesquels sont intercalés de EPHE Banque de Monographies SVT 4

5 nombreux lymphocytes T intra-épithéliaux (LIE) majoritairement CD8 +. Elle est en contact permanent avec une flore bactérienne saprophyte abondante que constitue la microflore intestinale résidente. L épithélium intestinal villositaire constitue la première barrière physique s opposant à la pénétration d agents pathogènes présents dans la lumière intestinale, mais assure, grâce à des aminopeptidases de la bordure en brosse des entérocytes, la phase terminale de la dégradation de peptides en acides aminés capables d'être absorbés. Si la majorité des peptides issus de la dégradation luminale est ainsi absorbée sous forme d acides aminés élémentaires, certaines protéines qui ont échappé à la dégradation dans l'estomac ou l'intestin peuvent transcytoser via les entérocytes et atteindre la membrane basolatérale entérocytaire sous une forme native. L épithélium recouvrant les plaques de Peyer (PP) ou épithélium associé au follicule ("follicleassiocated epithelium" ou FAE) est composé de 5 à 10% de cellules épithéliales spécialisées dans la phagocytose : les cellules M. Ces cellules, dont la membrane est dépourvue de bordure en brosse, représentent une voie d'entrée privilégiée pour les antigènes particulaires et les macromolécules. Ces antigènes pourraient ainsi avoir un accès direct à des cellules présentatrices de l'antigène (CPAg) présentes dans la poche intra-épithéliale des cellules M au niveau du dôme subépithélial des PP (SED). A.2 Le chorion Le chorion ou lamina propria (LP), tissu muqueux recouvert par l épithélium villositaire, représente un compartiment lymphoïde diffus comprenant différents types cellulaires. La LP contient des lymphocytes T, majoritairement CD4 + exprimant un TcRab et présentant un phénotype de cellules activées/mémoires (CD45RO + ) et de nombreux plasmocytes à IgA. Elle comprend aussi des cellules présentatrices de l antigène (CPAg) (cellules dendritiques et macrophages) et de nombreuses cellules de l'immunité innée (polynucléaires neutrophiles et éosinophiles). La LP comporte des cellules dendritiques (CD) classe II + (Maric et al, 1996) capables d'émettre des prolongements cytoplasmiques pour capturer des agents pathogènes présents dans la lumière intestinale (Rescigno et al, 2001). B. Système lymphoïde associé à l'intestin ou GALT et induction de la réponse immunitaire intestinale Le système immunitaire lymphoïde associé à la muqueuse intestinale ou GALT (Gut Associated Lymphoïd Tissue) participe au maintien de l homéostasie intestinale. Il est impliqué d'une part dans l'induction d'une réponse immunitaire anti-infectieuse protectrice contre les microorganismes pathogènes (caractérisée par la production d IgA sécrétoires et de lymphocytes T cytotoxiques) et d autre part, par l'induction d'une tolérance locale et systémique vis-à-vis d'antigènes alimentaires ou des bactéries de la flore commensale intestinale. B.1 Plaques de Peyer et ganglions mésentériques : deux sites inducteurs de la réponse immunitaire intestinale EPHE Banque de Monographies SVT 5

6 Le GALT regroupe plus de cellules que le reste du système immunitaire. Les plaques de Peyer et les ganglions mésentériques (MLN) constituent les sites d induction de la réponse immunitaire intestinale. Les PP, qui sont des agrégats de follicules lymphoïdes répartis dans la LP tout au long de l intestin grêle, présentent une structure semblable à celle des ganglions lymphatiques périphériques. Elles sont formées de follicules lymphoïdes composés essentiellement de lymphocytes B vierges porteurs d IgM, séparés par des zones interfolliculaires riches en lymphocytes T et en cellules dendritiques matures. Ce tissu lymphoïde est séparé du FAE par une zone riche en cellules dendritiques appelée dôme sous-épithélial (SED). Contrairement aux autres organes lymphoïdes, les PP sont dépourvues de canaux lymphatiques afférents, mais sont drainées vers les MLN par des canaux éfférents. Des antigènes particulaires ou des macromolécules peuvent traverser la barrière intestinale, via les cellules M du FAE et être alors pris en charge par les CPAg présentes dans la SED, en particulier les CD qui semblent jouer un rôle important à la fois dans l induction de la réponse immunitaire intestinale et dans le maintien de la tolérance. Les CD vont ensuite migrer dans les zones T de la PP où elles vont interagir avec des lymphocytes naïfs. Les cellules B et T ainsi activées dans la PP vont soit, se différencier localement ou rejoindre les MLN via les canaux lymphatiques afférents où elles vont se différencier avant de rejoindre la circulation sanguine et de se disséminer dans les ganglions périphériques et dans la muqueuse intestinale (Figure 2). Des antigènes capables de transcytoser par l'épithélium villositaire peuvent être, soit pris en charge par les CD de la LP pour être présenté aux lymphocytes T CD4 + naïfs dans la LP ou dans les MLN après migration des CD (Liu & McPherson, 1993, McPherson et al, 1995), ou être présentés directement par une population particulière d entérocytes exprimant les molécules de classe II du CMH qui pourraient présenter l'antigène aux cellules T CD4 + naïves de la LP (Kaiserlian et al, 1989, Vidal et al, 1993). La flore intestinale commensale est indispensable à l établissement du GALT et en particulier à la formation des PP. Grâce à des travaux réalisés sur des souris dépourvues de cette flore (souris axéniques), il a été montré qu elle intervient sur le développement des cellules immunitaires du GALT, telles que les plasmocytes à IgA (Moreau et al, 1982) ou les LIE (Bandeira et al, 1990) et donc sur l induction des réponses immunitaires intestinales (revue par Cebra, 1999). B.2 Réponse immunitaire intestinale : tolérance versus immunité protectrice Le système immunitaire intestinal est caractérisé par sa prédisposition à induire une tolérance vis-àvis d antigènes non pathogènes absorbés par voie orale, tout en conservant la possibilité de développer une réponse immunitaire efficace contre des antigènes portés par des agents pathogènes. Le microenvironnement intestinal est caractérisé, à l'état basal, par la présence de cytokines à fonction immunosuppressive comme l IL-10 et le TGF-b, produites en particulier par les cellules épithéliales ou les cellules dendritiques intestinales. L'IL-10 et le TGF-b ainsi que la prostaglandine E 2 (PGE 2 ) produite par les macrophages et les cellules mésenchymateuses constituent un microenvironnement favorable à la différenciation des cellules T CD4 + à fonction suppressive (Figure 3) impliquées dans l'inhibition de pathologies auto-immunes et inflammatoires (Harizi et al, 2002, Iwasaki & Kelsall, 1999 et EPHE Banque de Monographies SVT 6

7 2001). Les cellules T CD4 + des PP exercent une fonction auxiliaire sur la différenciation des cellules B productrices d'iga (Hörnquist et al, 1995) via la production d'il-10 et de TGF-b, cytokines nécessaires à la commutation isotypique des cellules B à IgM en cellules B à IgA de surface. Les cellules T CD4 + productrices d'il-10, particulièrement enrichies dans les PP, seraient donc susceptibles de jouer un rôle clé à la fois dans la réponse humorale IgA et dans les processus de tolérance vis-à-vis d'antigènes absorbés oralement. Le GALT possède également la capacité de développer une réponse immune protectrice contre des microorganismes pathogènes. Les signaux inflammatoires locaux générés par le pathogène via les Toll-like récepteurs (TLR) exprimés à la surface des macrophages et des cellules épithéliales ou mésenchymateuses entraînent la maturation de CD productrices d IL-12 (Williamson et al, 1999, Viney et al, 1998). Ces CD vont favoriser la différenciation de cellules T CD4 + productrices d IFN-g (de type Th1) et l initiation d une immunité protectrice et d autre part, de cellules T CD4 + de type Th3 (TGF-b) favorisant le développement de la réponse B à IgA (Mowat et al, 2003). 2 ème partie : La tolérance orale A. Généralités On appelle tolérance périphérique induite par voie orale, ou tolérance orale, le phénomène d induction et de maintien dans le temps de la suppression des réponses immunitaires systémiques, humorales et cellulaires, spécifiques de l antigène administré par voie orale. La tolérance orale est absolument nécessaire pour éviter la survenue d hypersensibilités retardées contre les protéines d origine végétale ou animale, contre les molécules chimiques (haptènes tels que colorants ou stabilisants) qui constituent le régime alimentaire de l individu sain mais aussi vis-à-vis de la flore intestinale commensale. L intolérance aux protéines du lait de vache chez le nourrisson ou au gluten chez l adulte, respectivement responsable d allergies digestives et de la maladie cœliaque, constitue une preuve indirecte de l importance physiologique de cette tolérance dans le maintien de l intégrité tissulaire intestinale. Dakin avait, en 1829, mis en évidence ce phénomène en observant que des Indiens d Amérique de sud arrivaient à se protéger contre l'eczéma provoqué lors d'un contact cutané avec une espèce d'ortie en ingérant des feuilles de cette même espèce. Mais ce n'est qu'en 1911 que Wells et Osborne qualifièrent ce phénomène de tolérance orale, en démontrant expérimentalement que chez l'animal l'absorption orale de l'antigène induit une suppression de la réponse immunitaire systémique. La nature immunologique de ce mécanisme fut établie quelques années plus tard par Chase (1946) qui démontra que l'administration orale de l'haptène dinitrochlorobenzène (DNCB) chez le cochon d'inde inhibait l'hypersensibilité retardée de contact générée par une sensibilisation ultérieure avec le même haptène. La suppression de réponses immunitaires systémiques induite par l'administration orale d'antigènes a été confirmée dans de nombreux modèles expérimentaux murins utilisant des globules rouges hétérologues, des bactéries et virus inactivés, et des protéines solubles (OVA ou KLH) ou des haptènes sensibilisants (DNCB, DNFB et oxazolone). La possibilité de supprimer des réponses systémiques par administration orale de l'antigène a été confirmée chez l'homme. Ainsi, il a pu être montré que chez des volontaires sains, l'administration orale de KLH inhibait la réaction d'hypersensibilité retardée induite par une immunisation EPHE Banque de Monographies SVT 7

8 ultérieure avec ce même antigène (Husby et al, 1994). L'étude de ces mécanismes a retrouvé récemment un regain d'intérêt car il a pu êtremontré que, chez l'animal, ce phénomène permet de réduire ou d'inhiber le développement de signes cliniques de maladies auto-immunes expérimentales (encéphalite auto-immune expérimentale EAE, arthrite au collagène, diabète insulino-dépendant) et de retarder le rejet de greffe de rétine. (Strobel & Mowat, 1998). Plusieurs études, chez la souris, ont montré que durant les 7 à 10 premiers jours de vie, l'administration orale d'ova est incapable d'induire une suppression des réponses systémiques (Strobel et Ferguson, 1984). Parallèlement chez l'homme, on note un taux particulièrement élevé d'hypersensibilités alimentaires chez le nouveau-né (3 à 4% des bébés développeraient des allergies aux protéines de lait). Cette particularité attribuée aux jeunes enfants, de même qu'aux souriceaux, pourrait s'expliquer en partie par l'immaturité physiologique (intestin plus perméable) et immunologique du GALT mais aussi par l'absence d'une flore intestinale résidente. Il a pu être montré que le LPS relargué par les bactéries Gram négatif joue un rôlemajeur dans l'induction mais aussi dans le maintien dans le temps de la tolérance orale. Ainsi la tolérance orale aux globules rouges de mouton (GRM) (estimée par l'inhibition de la production de IgG, IgM et IgA sériques), ne peut être induite chez des souris axéniques mais est restaurée par l'administration orale de LPS de Escherichia coli (Wannenmuehler et al. 1982). De même, la colonisation de souris axéniques avec des bactéries Gram négatif (Bacteroides ou E. coli) permet de rétablir une tolérance orale à l'ova identique à celle observée chez des souris conventionnelles (Gaboriau-Routhiau et al, non publiés). En corollaire, les souris C3H/HeJ, qui présentent une incapacité génétique à répondre au LPS, sont réfractaires à la tolérance orale aux GRM (Michalek et al, 1982) et développent une tolérance orale à l'ova qui reste limitée dans le temps (Moreau et al, 1988). Il a été ainsi proposé que le LPS n'interviendrait pas dans l'induction de la tolérance orale vis-à-vis de protéines solubles mais plutôt dans son maintien dans le temps (Moreau et al, 1996). Enfin, des travaux de Sudo et collaborateurs ont mis en évidence le rôle des bactéries Gram positif dans le processus de tolérance orale et ce en démontrant que, chez des souris axéniques, la reconstitution néonatale de la flore par Bifidobacterium infantis suffit à rétablir la tolérance orale à l'ova (inhibition réponse IgE anti-ova) (Sudo et al, 1997). La microflore bactérienne intestinale semble donc jouer un rôle crucial dans l'induction et le maintien de la tolérance orale. B. Les mécanismes de la tolérance orale Pendant longtemps deux mécanismes hypothétiques ont prévalu pour expliquer la tolérance orale. Alors que pour certains ce phénomène reposait sur un mécanisme de régulation par des cellules suppressives (Mowat, et al, 1985) d autres proposaient des mécanismes de délétion et/ou d anergie (Whitacre et al, 1991). L issue de ce dilemme fut en partie résolue dans le modèle de tolérance orale à la MBP, dans lequel il a été montré que les mécanismes mis en jeu dépendaient en grande partie de la dose et de la fréquence d'administration orale de l'antigène (Friedman & Weiner, 1994). B.1 Anergie clonale EPHE Banque de Monographies SVT 8

9 L induction d une anergie des lymphocytes T par tolérisation orale à forte dose d antigène a été, dans un premier temps, évoquée dans le modèle d inhibition de l EAE par administration orale répétée de 5mg de MBP (Whitacre et al, 1991). Ainsi, des populations lymphocytaires de rate, PP ou de MLN prélevées chez des souris gavées par MBP ou rendues tolérantes au MBP (n ayant pas répondu à une immunisation ultérieure par MBP) sont incapables de proliférer et de produire de l IL-2 ou de l IFN-g en réponse à une restimulation in vitro par la MBP et ne peuvent supprimer la réponse proliférative des cellules ganglionnaires de souris immunisées avec MBP. De plus, in vivo, le transfert adoptif de ces mêmes populations cellulaires à des souris naïves est d une part incapable d induire d EAE contrairement aux cellules de souris immunisées avec la MBP et est, d autre part, incapable d inhiber les signes cliniques de l EAE induite deux jours après le transfert chez les receveuses naïves. Ces observations permettent d exclure l intervention de cellules suppressives dans ce modèle. Ainsi, l administration orale de la MBP entraînerait une anergie des populations lymphocytaires effectrices de l EAE. Des études ultérieures, réalisées dans le modèle de tolérance orale à l OVA, ont confirmé que de fortes doses d antigène administrées par voie orale induisent une anergie des lymphocytes T (Melamed et al, 1993 et 1994). En effet, l administration intragastrique d une seule dose de 20mg d OVA inhibe le développement de l hypersensibilité retardée à l OVA, la production d IgG2a anti-ova, ainsi que la production in vitro d IFN-g et d IL-2 par les cellules de rate en réponse à une restimulation par l OVA. Le pré-traitement par de l IL-2 des cellules de rate issues de souris tolérisées est capable de restaurer in vitro la réponse proliférative et la production d IFN-g lors d une restimulation. De plus, le transfert adoptif de splénocytes de souris tolérisées prétraités par l IL-2 chez des souris naïves irradiées puis immunisées par l OVA rétablit la production d IgG2a, qui est absente lors de transfert sans pré-traitement par l IL-2. B.2 Délétion clonale La mise en évidence d une délétion clonale de cellules T dans les organes lymphoïdes suite à l administration orale de l antigène a été réalisée à l aide de souris transgéniques exprimant un TcR spécifique de l antigène d intérêt. Ainsi, chez des souris transgéniques pour un TcR spécifique d un peptide classe II d OVA (TcR + OVA), après 5 gavages par des doses d OVA de 5 ou 500mg, on observe dans les PP une diminution très importante du nombre de cellules T spécifiques, associée à la présence in situ de cellules en apoptose (Chen et al, 1995). En revanche, le gavage de 0,5mg d OVA induit une augmentation progressive au cours des gavages du nombre de cellules T spécifiques dans les PP (Chen et al, 1995). Dans ce même modèle, l administration orale d une seule dose de 100mg d OVA induit une expansion rapide mais limitée des cellules T spécifiques dans les ganglions périphériques, suivie d une diminution importante de la fréquence de ces cellules en 14 jours (Van Houten et al, 1996). Par ailleurs, il a été montré que chez des souris au TcR transgénique pour le cytochrome, une administration orale unique de cytochrome c s'accompagne six heures plus tard d'une activation des cellules T spécifiques dans la rate, les PP et les MLN, objectivant une présentation systémique de cet antigène. De plus, cette étude révèle une délétion partielle des cellules T spécifiques induite par gavages répétés par le cytochrome c (Gütgemann et al, 1998). Ainsi la tolérance orale induite par l'administration orale de forte doses d'antigène semble être essentiellement due à une délétion locale et/ou systémique des cellules T effectrices spécifiques de l'antigène. EPHE Banque de Monographies SVT 9

10 B.3 Suppression active Contrairement à la tolérance orale induite par de fortes doses d antigène qui semble induire une délétion et/ou une anergie de cellules T effectrices, les protocoles de tolérisation par voie orale utilisant de faibles doses répétées d antigène semblent faire intervenir une suppression active des cellules effectrices par l induction de lymphocytes T régulateurs. B.3.1 Cellules T CD8 + Le rôle régulateur des cellules T CD8 + in vivo a pu être mis en évidence dans le modèle de l EAE, par transfert adoptif de la tolérance par des cellules T CD8 + issues de souris gavées par la MBP (Chen et al, 1995). Par ailleurs, des cellules T CD8 + isolées de souris tolérisées sont capables d'inhiber in vitro la prolifération et la production d'anticorps spécifiques de la MBP (Lider et al, 1989). En revanche, des souris déplétées en cellules T CD8 + par injection d anticorps anti-cd8 présentent une tolérance orale normale dans ce même modèle d'eae (Chen et al, 1995) ou dans le modèle de tolérance à l OVA (Garside et al, 1995). Ceci suggére que la contribution des cellules T CD8 + dans l'établissement de la tolérance orale reste encore à clarifier. B.3.2 Cellules T gd Dans le modèle d uvéorétinite autoimmune expérimentale (UEA) induite par immunisation avec l antigène-s (Ag-S), le transfert de cellules Tgd + issues de rats gavés avec l Ag-S, est capable de supprimer de façon spécifique l UEA induite ultérieurement chez les rats receveurs et a permis de mettre en évidence le rôle potentiel des cellules Tgd + dans la tolérance orale (Wildner et al, 1996). De plus, l impossibilité d induire une tolérance orale à l OVA chez des souris déficientes en chaîne d du TcR et l inhibition de cette tolérance orale par la déplétion des cellules T TcRgd + ont permis de confirmer ces précédents résultats (Ke et al, 1997). Le fait que les lymphocytes T CD8 + intra-épithéliaux (LIE) de l'intestin comportent 50% de cellules exprimant le TcRgd suggère que les LIE pourraient contribuer à la tolérance orale. En outre, des études récentes chez l'homme montrent que les cellules épithéliales intestinales induisent in vitro la prolifération de cellules T CD8 + à fonction régulatrice (Allez et al, 2003). Cependant, le rôle des LIE dans la tolérance orale n'a pas été formellement démontré. B.3.3 Cellules T CD4 + L absence de tolérance orale chez des souris déplétées en cellules T CD4 + (Garside et al, 1995, Desvignes et al, 1996) et l inhibition de l EAE induite par le transfert adoptif de cellules T CD4 + issues de souris tolérisées par MBP (Chen et al, 1995), mettent en évidence le rôle primordial des cellules T CD4 + dans l établissement de la tolérance orale. Depuis, de nombreuses études ont permis de mettre en évidence différentes sous-populations de cellules T CD4 + régulatrices, qui seront détaillées dans le chapitre suivant. EPHE Banque de Monographies SVT 10

11 3 ème partie : Les cellules T CD4 + régulatrices Différentes populations de cellules T CD4 + aux propriétés immunorégulatrices ont été mises en évidence. Ce chapitre s attachera à décrire ces différentes populations, et en particulier, la sous-population T CD4 + CD25 + qui apparaît comme une population clé dans la prévention des phénomènes auto-immuns et dans le contrôle de réponses immunitaires. A. Les cellules Th2 L'activation des cellules T CD4 + peut conduire à différentes sous-populations T CD4 + effectrices, dont les cellules T CD4 + de type Th1 ou de type Th2, définies par leur profil de cytokines et pouvant mutuellement se réguler. Ainsi les lymphocytes Th1, producteurs de cytokines pro-inflammatoires (IL-2, IFN-g) sont impliqués dans l'immunité à médiation cellulaire et diminuent, via IFNg, l'expansion des lymphocytes Th2 et/ou leur production de cytokines (IL-4, IL-5, IL-6, IL-10 et IL-13) favorisant la réponse humorale. L'IL-4 et l'il-10 produites par les Th2 sont, en retour, capables d'inhiber la réponse immunitaire à médiation cellulaire et l'expansion des lymphocytes de type Th1. L'orientation des réponses immunitaires est donc sous le contrôle d'un équilibre entre les voies Th1 et Th2 et un déséquilibre vers l une de ces deux voies est donc susceptible d'affecter le développement de la réponse immunitaire protectrice. Si la déviation immune vers Th2 est responsable du développement d'un processus pathogène irréversible dans le cas de l'infection parasitaire par Leishmania major chez les souris Balb/c (Launois et al, 1995 et 1997), elle représente, à l'inverse, un mécanisme de régulation bénéfique pour l'évolution de maladies médiées par des effecteurs Th1. Ceci a été décrit, chez l'animal, dans différents modèles de maladies auto immunes (diabète insulino-dépendant, EAE, UAE), modèles dans lesquels la déviation de la réponse Th1 vers une réponse Th2, par l'injection d'il4 par exemple, prévient ou diminue significativement l'apparition des signes cliniques (Cameron et al, 1997, Racke et al, 1994). De même, l'étude de la production de cytokines après administration orale de faibles doses d'antigène a montré une augmentation des cytokines de type Th2 (IL-4, IL-5, IL-10), associée à une diminution des cytokines de type Th1 (IL-2 et IFN-g) (Xu-amano et al, 1992, Khoury et al, 1992, Chen et al, 1994). Ceci suggère que, comme dans les mécanismes de tolérance périphérique, l'induction de tolérance par voie orale dans des réponses médiées par les cellules Th1 pourrait être dû à l activation des cellules Th2 ou la polarisation de la réponse vers un profil Th2. B. Les cellules Th3 Des études réalisées dans le modèle de l'eae ont mis en évidence le rôle central des cellules T régulatrices productrices de TGF-b induites par gavage avec la MBP (Khoury et al, 1992, Chen et al, 1994). Des cellules T CD4 +, clonées à partir de ganglions mésentériques de souris après administration orale de MBP, sont capables d'inhiber via la sécrétion de TGF-b, les signes cliniques de L'EAE induite par EPHE Banque de Monographies SVT 11

12 immunisation ultérieure avec la MBP (Chen et al, 1996). Ces cellules sont capables, de plus, d'inhiber in vitro la prolifération et la production de cytokines des cellules Th1 spécifiques de MBP. Par ailleurs des études cliniques réalisées chez des patients atteints de sclérose en plaque ont montré que l'administration orale de MBP permet le développement de cellules T spécifiques productrices de TGF-b et tend à améliorer les signes cliniques de la maladie (Fukaura et al, 1996). Il a donc été ensuite proposé que les cellules T régulatrices impliquées dans la tolérance orale seraient une sous-population de lymphocytes T CD4 +, dénommées Th3, dont le profil de production de cytokines est distinct des cellules Th2 et est caractérisé par la sécrétion de quantités élevées de TGF-b. Si les mécanismes permettant l'induction, au niveau du GALT, des cellules CD4 + régulatrices de type Th3 n'ont pu être établis, leur différenciation in vitro est favorisée par l'il-10, l'il-4 et le TGF-b, (Seder et al, 1998). De plus, dans le modèle de l'eae, l'injection d'il-4 potentialise la tolérance orale induite par administration orale de MBP en favorisant le développement de cellules Th3 productrices de TGF-b (Inobe et al, 1998). Cependant, le fait que l'on puisse induire une tolérance orale par administration de faibles doses d'ova chez des souris déficientes en IL-4 ou en TGF-b1 (Garside et al, 1995, Barone et al, 1998) suggère que le TGF-b n'est pas le seul facteur soluble responsable de l'induction de la tolérance orale. D'autres cytokines comme l'il-10 semblent en effet nécessaires à l'induction de la tolérance orale (D. Kaiserlian, communication personnelle). Par ailleurs, les cellules productrices d'il-10 exercent un effet inhibiteur sur le développement de la réponse inflammatoire spécifique d'antigène (Groux et al, 1997). C. Les cellules T CD4 + régulatrices Tr1 L'équipe de H. Groux a montré que des cellules T CD4 + à fonction régulatrice peuvent être générées chez l'homme et la souris par stimulation répétée in vitro en présence de l'antigène (OVA), de CPAg et d'il-10 (Groux et al, 1997). Les clones obtenus ont été dénommés Tr1 à cause de leur phénotype (distinct des cellules Th1, Th2 ou Th3) et caractérisées par leur production de quantités élevées d'il-10, d'il-5, d'un faible taux de TGF-b, mais non d'il-2 ou d'ifn-g. La fonction suppressive des cellules Tr1 vis-à-vis de réponses Th1 et Th2 a été mise en évidence in vivo et in vitro. Ainsi, le transfert de clones Tr1 est capable d'inhiber le développement de la colite expérimentale induite chez la souris SCID par injection de cellules CD4 + CD45RB high. Cet effet inhibiteur est obtenu après transfert d'un faible nombre de cellules Tr1 ( ) et nécessite le gavage des souris receveuses avec l'ova, ce qui suggère que les Tr1 doivent être activées par leur TcR pour pouvoir exercer leurs propriétés régulatrices (Groux et al, 1997). Les clones Tr1 sont aussi capables d'inhiber in vivo le développement de pathologies médiées par les cellules Th2, puisqu'elles suppriment, via la production d'il- 10, la réponse IgE sérique et la prolifération de cellules CD4 + effectrices dans un modèle d'hypersensibilité immédiate à l'ova (Cottrez et al, 2000). In vitro, les cellules Tr1 exercent leur effet inhibiteur sur la réponse de cellules T naïves en réponse à des cellules allogéniques via la sécrétion d'il-10 mais aussi de TGF-b (Groux et al, 1997). L'effet immunosuppresseur des Tr1, activés par l'antigène qui a permis leur différenciation, s'exerce de façon non-spécifique d'antigène ("bystander suppression"). Ceci semble être dû au relarguage par ces cellules de cytokines immunosuppressives (IL-10 et TGF-b) qui peuvent agir directement sur les APC ou EPHE Banque de Monographies SVT 12

13 les cellules T présentes à proximité des Tr1 ayant ou non la même spécificité antigénique. Cependant, in vitro, des expériences de transwell suggèrent que l'effet suppresseur des Tr1 est maximal quand ces cellules sont en contact direct avec leur cible. (Roncarolo et al, 2001). D. Les cellules T CD4 + CD25 + régulatrices : Les cellules CD4 + CD25 + sont présentes constitutivement chez la souris, le rat et l'homme et représentent 5 à 10% des lymphocytes T CD4 + périphériques. Elles sont présentes dans les organes lymphoïdes secondaires très tôt au cours de l'ontogénie et sont produites continuellement dans le thymus. Cette sous-population de T CD4 + exprime constitutivement la chaîne a du récepteur à l'interleukine 2 (CD25) ainsi que la molécule CTLA-4 et présente un phénotype de cellules activées/mémoires (CD45RB low ). Elles représentent 30% environ des cellules T CD4 + CD45RB low. Ces cellules produisent très peu ou pas d'il-2, mais sont par ailleurs capables de produire après activation des quantités élevées de cytokines immunosuppressives comme l'il-10 ou le TFG-b. D.1. Propriétés immunosuppressives Chez des souris athymiques, le transfert de lymphocyte T déplétées en cellules régulatrices T CD4 + CD25 + conduit à l'apparition de multiples manifestations auto-immunes (Asano et al, 1996, Sakaguchi et al, 1995). Le rôle de cette population T CD4 + CD25 + dans le maintien de la tolérance périphérique a été confirmé par différentes études chez des souris thymectomisées 3 jours après la naissance. Ainsi, chez ces souris, le transfert de cellules T CD4 + CD25 + permet d'inhiber le développement de cellules effectrices à l'origine des manifestations auto-immunes mais aussi de prévenir la pathologie induite par le transfert de cellules auto-réactives clonées (Suri-payer et al, 1998). Par la suite, de nombreuses études ont démontré que les cellules T CD4 + CD25 + pourraient jouer un rôle majeur dans le contrôle de pathologies auto immunes (diabète auto-immun, EAE, thyroïdite), de maladies inflammatoires chroniques du tube digestif (IBD) (revue par Shevach, 2002) et du rejet d'allogreffes (Karim et al, 2002). Par ailleurs, les cellules T CD4 + CD25 + semblent également être responsables de l'inhibition de la réponse anti-tumorale, suggérant que ces cellules contrôlent la différenciation et/ou l'expansion de cellules T effectrices spécifiques de tumeur (Shimizu et al, 1999). Les cellules T CD4 + CD25 + semblent capables d inhiber les réponses immunitaires de type Th1 et Th2 in vivo et in vitro (Xu et al, 2003). Ainsi, les cellules T CD4 + CD25 + inhibent la différenciation in vitro de cellules T CD4 + CD25 - en cellules Th1 ou en cellules Th2. De plus, in vivo, les cellules T CD4 + CD25 + préviennent le développement de l infection à Leishmania major induite chez des souris SCID reconstituées en cellules T, mais inhibent aussi la colite qui apparaît spontanément chez ces souris lors de leur reconstitution par des cellules T CD4 + CD25 -. Ces résultats soulignent en outre le rôle des cellules T CD4 + CD25 + dans le contrôle de l'immunité anti-infectieuse. EPHE Banque de Monographies SVT 13

14 In vitro, les cellules T CD4 + CD25 + sont capables d'inhiber la prolifération des cellules T CD4 + CD25 - en réponse à une stimulation polyclonale par anti-cd3 en présence de CPAg. Cette suppression nécessite l'activation des T CD4 + CD25 + via leur TcR (Thornton et al, 1998). De plus, les cellules T CD4 + CD25 + se caractérisent in vitro par une faible capacité proliférative à une stimulation via leur TcR. Cette anergie peut être en partie levée lorsque la stimulation via leur TcR est combinée avec l'il- 2 ou à un signal via CD28, et abroge leur effet immunosuppresseur sur les CD4 + CD25 - (Takahashi et al, 1998). Cependant, l'il-2 peut induire in vitro l'expansion des cellules T CD4 + CD25 + humaines tout en conservant leur incapacité de proliférer en réponse à l'anti-cd3 et en maintenant donc leur capacité immunosuppressive (Levings et al, 2001). D.2. Mécanismes d'action Dans les systèmes de co-culture in vitro décrits précédemment, l'effet suppresseur des T CD4 + CD25 + est dû essentiellement à un effet direct sur les lymphocytes T effecteurs et peut être observé en absence de CPAg (Thornton et al, 2000). Cependant, Cederbom et collaborateurs ont observé que les T CD4 + CD25 + pourraient avoir un effet direct sur les CPAg, en diminuant l'expression des molécules de costimulation (CD80 et CD86) sur les cellules dendritiques (Cederbom et al, 2000). Après activation, les cellules T CD4 + CD25 + sont capables de produire des cytokines à activité immunosuppressives comme l'il-10, TGF-b et Il-4 (Thornton et al, 1998, Nakamura et al, 2001). L'inhibition de la colite dans le modèle de souris SCID par les cellules T CD4 + CD25 + semble impliquer l'il-10 (Asseman et al, 1999) ainsi que le TGF-b (Powrie et al, 1996) mais semble aussi mettre en jeu la molécule CTLA-4 (Read et al, 2000). Le rôle exclusif de cytokines n'est pas confirmé dans tous les modèles et le mécanisme de suppression par les cellules T CD4 + CD25 + semble être dépendant de contacts cellulaires entre les cellules T CD4 + CD25 + et les cellules cibles (Thornton et al, 1998, Takahashi et al, 1998). La molécule CTLA-4, exprimée constitutivement sur les cellules T CD4 + CD25 + pourrait jouer un rôle clé dans la fonction suppressive de ces cellules (Takahashi et al, 2000, Salomon et al, 2000). En effet, l'anticorps anti-ctla-4 inhibe l'activité suppressive in vitro des cellules T CD4 + CD25 + et leur effet protecteur in vivo dans la colite expérimentale induite par le transfert de cellules T CD4 + CD45RB high chez des souris SCID (Takahashi et al, 2000, Read et al, 2000). Cependant, le rôle de CTLA-4 reste encore discuté car d'autres auteurs n'ont pas noté d'effet des anticorps anti-ctla-4 sur la suppression in vitro (Levings et al, 2001) et les cellules T CD4 + CD25 + issues de souris déficientes en CTLA-4 conservent une activité suppressive bien que plus faible que celle des cellules T CD4 + CD25 + issues de souris normales (Takahashi et al, 2000). Néanmoins, Nakamura et collaborateurs ont montré que l'expression de TGF-b membranaire est induite sur les cellules T CD4 + CD25 + activées et que leur effet suppresseur est inhibé par des anticorps anti-tgf-b ou par l'addition de récepteurs solubles du TGF-b (Nakamura et al, 2001). Ces données indiquent que le mécanisme de suppression des cellules T CD4 + CD25 + s exercerait par des interactions cellule régulatrice-cellule cible et que le TGF-b être pourrait une des molécules membranaires impliquées dans ce mécanisme. EPHE Banque de Monographies SVT 14

15 Enfin, de même que pour les cellules Tr1, l'effet immunosuppresseur des cellules T CD4 + CD25 + n'est pas spécifique d'antigène et une fois activées par un antigène donné, ces cellules peuvent supprimer la réponse proliférative de lymphocytes T CD4 + CD25 - de spécificité antigénique différente, voire d'haplotype différent (Thornton et al, 2000). E. Mécanismes d'activation et d'expansion des cellules T CD4 + régulatrices E.1 Rôle des cellules dendritiques "tolérogènes" Il a été montré que les CD jouent un rôle clé dans la génération de cellules T CD4 + régulatrices (Tr1). L'état de maturation des CD semble être important, mais reste encore obscur. Ainsi, il a été initialement démontré que la stimulation répétée in vitro de lymphocytes T CD4 + par des CD immatures conduit à l'émergence de cellules Tr1 régulatrices (Jonuleit et al, 2000). En revanche, des études in vivo ont montré que la tolérance induite par l'administration intranasale de l'antigène est dépendante de l'induction de Tr1 par des CD matures pulmonaires productrices d'il-10 (Akbari et al, 2001). Le mécanisme d'induction des cellules T régulatrices pourrait donc impliquer une sous-population tolérogène de CD et/ou un conditionnement fonctionnel de la CD par le micro-environnement au site de pénétration de l'antigène (Weiner et al, 2001). L'administration orale de l'antigène chez des souris transgèniques pour un TcR spécifique de ce même antigène induit une augmentation de la quantité d'il-10 et d'il-4 dans le dôme des PP ainsi que du TGF-b dans les zones T (Gonnella et al, 1998). De plus, des travaux récents à l'aide de souris TcR transgéniques ont montré que l'administration orale de l'antigène favorise l'expansion et l'activation de cellules T CD4 + CD25 + à fonction suppressive (Thorstenson et al, 2001, Zhang et al, 2001). Enfin, le traitement par le Flt3-L (ligand de Flt-3), facteur de différenciation et d'expansion des CD, favorise le développement de la tolérance orale (Viney et al, 1998). Ces données permettent de postuler que les CD intestinales pourraient jouer un rôle dans l'induction de cellules T CD4 + régulatrices au cours de la tolérance orale. E.2 Rôle de la microflore intestinale Les données actuelles suggèrent que les bactéries de la microflore intestinale pourraient avoir un rôle primordial dans l'émergence et/ou l'activation des cellules T CD4 + régulatrices impliquées dans la tolérance orale. En effet, des bactéries Gram +, comme les Lactobacillus qui sont présentes constitutivement dans la flore intestinale, ont la capacité d orienter in vitro la maturation et la production de cytokines de cellules dendritiques vers un profil donné et ce en fonction de la souche bactérienne utilisée (Christensen et al, 2002). Ainsi, L. reuteri, induit la production d IL-10 (mais pas d IL-12) ainsi qu une expression faible de CD86 et des molécules du CMH de classe II par les CD, alors quel.casei, induit une importante production d IL-12 et de TNF-a associée à une forte expression des molécules de surface (Christensen et al, 2002). Ceci suggère que via une effet sur les CD, les bactéries de la flore intestinale pourraient participer à l orientation de la réponse T (Th1, Th2 ou Th3) au niveau intestinal. Il a été montré que Lactobacillus EPHE Banque de Monographies SVT 15

16 paracasei favoriserait la différenciation de cellules T CD4 + en une population productrice d IL-10 et TGF-b et présentant une faible capacité proliférative, pouvant donc être assimilée, de part son profil cytokinique et son état potentiellement anergique, à une population T CD4 + régulatrice (Von der Weid et al, 2001). Plus récemment, il a été démontré que les cellules T CD4 + CD25 + régulatrices issues de différents organes lymphoïdes expriment à leur surface des Toll-like récepteurs (TLR-4, -5, -7 et 8) et que l engagement du TLR-4 par le lypopolysaccharide (LPS), son principal ligand, entraîne l activation des cellules CD4 + CD25 + et favorise la survie de ces cellules ainsi que leur prolifération (Caramalho et al, 2003, Sakaguchi et al, 2003). Le traitement des cellules T CD4 + CD25 + par du LPS augmente leur capacité inhibitrice in vitro et ce, même en absence de CPAg, suggérant que le LPS agit directement sur le TLR-4 de la cellule régulatrice (Caramalho et al, 2003, Sakaguchi et al, 2003). Ces observations laissent penser que les bactéries saprophytes de l'intestin pourraient favoriser les mécanismes de tolérance en agissant, soit directement sur la survie des cellules T CD4 + régulatrices ou, soit indirectement sur le conditionnement des CD tolérogènes. F. Régulation des réponses T CD8 + par les cellules T CD4 + régulatrices Les lymphocytes T CD8 + sont responsables de nombreux processus auto immuns, anti-infectieux, inflammatoires et anti-tumoraux. Ainsi, l étude de la régulation de telles réponses par les cellules T CD4 + CD25 + apparaît comme primordiale et pourrait être exploitée dans le traitement de différentes pathologies. De récentes études montrent que les cellules T CD4 + CD25 + sont capables d inhiber l activation/expansion de cellules T CD8 + en réponse à des stimuli polyclonaux (Piccirillo et al, 2001, Kursar et al, 2002), ainsi que dans des modèles in vivo de rejet d'allogreffes (Van Maurik et al, 2002). Piccirilllo et collaborateurs ont montré que les cellules T CD4 + CD25 + issues de souris normales sont capables d inhiber la prolifération de cellules T CD8 + de souris TcR transgèniques en réponse à une stimulation polyclonale, par un anticorps anti-cd3 en présence de CPAg, ou bien en réponse à l'antigène (Piccirillo et al, 2001). Par ailleurs, ces auteurs montrent que les cellules T CD4 + CD25 + sont capables d'inhiber la prolifération des cellules T CD8 + spécifiques activées par un tétramère contenant le peptide d'intérêt. Ce qui indique un mécanisme de suppression par interaction directe entre la cellule cible CD8 + et la cellule T CD4 + régulatrice plutôt que par la modulation de signaux délivrés par les CPAg aux lymphocytes T CD8 +. De façon intéressante, les cellules T CD4 + CD25 +, peuvent contrôler l intensité de la réponse T CD8 + mémoire (Murakami et al, 2002, Kursar et al, 2002). Ainsi, dans un modèle d infection à Listeria monocytogenes, caractérisée par le développement d une forte réponse T CD8 + protectrice, la déplétion en cellules T CD4 + ou en T CD4 + CD25 + entraîne, si elle intervient lors de la réponse primaire, une diminution de la population T CD8 + spécifique du pathogène, mais se traduit par une expansion importante de cette même population lorsque la déplétion intervient pendant la réponse secondaire (Kursar et al, 2002). De plus, le transfert, chez des souris immunodéficientes (SCID), de cellules T déplétées en T CD4 + issues EPHE Banque de Monographies SVT 16

17 de souris ayant été immunisées par L. monocytogenes va permettre le développement de la population T CD8 + spécifique lors d une seconde immunisation par le pathogène, alors que le co-transfert de cellules T CD4 + CD25 + inhibe totalement le développement de ces cellules T CD8 + (Kursar et al, 2002). L étude des mécanismes d inhibition des réponses médiées par les cellules T CD8 + par les cellules T CD4 + régulatrices pourrait être facilitée par l utilisation de modèles où le développement de la réponse T CD8 + pourrait se faire indépendamment de toute population T CD4 +. C est pourquoi, l utilisation d un modèle murin d hypersensibilité retardée aux haptènes (2,4-Dinitrofluorobenzène DNFB) développé dans l'équipe a permis de mettre en évidence le rôle in vivo de cellules T CD4 + régulatrices dans le contrôle de réponses inflammatoires médiées par des cellules T CD8 + cytotoxiques et de préciser leur implication dans la tolérance induite par voie orale (Bour et al, 1995, Desvignes et al, 1996, Desvignes et al, 2000). 4 ème partie : L'hypersensibilité retardée de contact aux haptènes L hypersensibilité de contact (HSRC) est une réaction d hypersensibilité retardée de type IV induite par l application épicutanée d'haptène sensibilisant. Elle se déroule en deux phases : une phase afférente ganglionnaire qui débute après sensibilisation cutanée avec l'haptène (5 jours) et une phase efférente cutanée qui est provoquée par un nouveau contact cutané avec l'haptène à un site distant. L'inflammation débute 12 heures après la révélation cutanée, atteint son intensité maximale en 24 à 48 heures, puis se résout progressivement en 7 jours environ. A. Physiopathologie de l'hypersensibilité de contact A. 1. La phase de sensibilisation La phase de sensibilisation, appelée aussi phase afférente, correspond au premier contact de l haptène avec la peau. L'haptène va être pris en charge par les cellules de Langerhans (CL) de l'épiderme et par les cellules dendritiques dermiques puis transporté jusqu'aux ganglions lymphatiques drainant le site de sensibilisation (Sreilein et al, 1989, Tse et al, 1990). En outre, l'haptène libre peut diffuser dans le sang et être présenté par les cellules interdigitantes des zones T des ganglions (Pior et al, 1999). A.1.1 Capture et apprêtement de l'haptène par les cellules dendritiques De part leur faible poids moléculaire et leur caractère le plus souvent lipophile, les haptènes, peuvent diffuser rapidement à l'intérieur de l'épiderme et du derme, sous la forme d'haptène libre. Ils vont pouvoir EPHE Banque de Monographies SVT 17

18 ainsi interagir directement avec les CD et se complexer avec le peptide présent dans la niche formée par les molécules de Classe I ou II du CMH ou avec des résidus peptidiques de ces mêmes molécules. De plus, si l'haptène est liposoluble, comme c'est le cas pour le DNFB, il peut diffuser passivement à travers la membrane cellulaire pour se lier à des protéines cytoplasmiques et suivre la voie classique de présentation sur le CMH de classe I. Certains haptènes, comme le DNFB utilisé dans cette étude, peuvent se lier de façon covalente à des acides aminés présents sur les protéines solubles extracellulaires et sur les protéines membranaires. Ainsi, en fonction de la nature de la protéine à laquelle il se lie, l'haptène peut être internalisé par différentes voies susceptibles de conduire à une présentation d'un peptide haptènisé par les molécules de classe I ou de classe II du CMH. Enfin, la phagocytose de cellules apoptotiques ayant fixé des haptènes pourrait également conduire à une présentation par la voie classe I. A.1.2 Activation et migration des CD vers les ganglions lymphatiques La prise en charge de l'haptène par les CD induit tout d'abord l'activation et la maturation progressive de ces cellules, qui se traduit par un changement dans l'expression de certains marqueurs intra et extracellulaires, comme notamment une augmentation de l'expression des molécules de classe II du CMH ainsi que des molécules de co-stimulation (CD40, CD80 et CD86) ou de maturation (CD83), leur permettant ainsi d'acquérir progressivement le phénotype et les fonctions de CPAg capables de stimuler les lymphocytes T naïfs. Parallèlement à leur maturation, l'haptène va induire la migration des CD de la peau jusqu'au ganglion lymphatique drainant, via la lymphe afférente. A.1.3 Activation et émigration des lymphocytes spécifiques d'haptène Les CD entrent en contact avec les lymphocytes T au niveau de la zone para corticale (zone T) de ganglions lymphatiques. Contrairement aux antigènes protéiques classiques, un même haptène peut induire l'activation de lymphocytes T CD4 + classe II restreints et de lymphocytes T CD8 + classe I restreints, puisqu'il peut être présenté à la fois par les molécules du CMH de classe I et de classe II des CD (Krasteva et al, 1998). Ainsi deux populations lymphocytaires sont activées lors de l'hsrc au DNFB : les lymphocytes T CD8 + effecteurs et les lymphocytes T CD4 + régulateurs. (Gocinski et al, 1990, Xu et al, 1996, Bour et al, 1995). Les lymphocytes T CD8 + et CD4 + ainsi activés, vont ensuite quitter le ganglion lymphatique via les canaux efférents, rejoindre le canal thoracique puis la circulation sanguine. Lors d une nouvelle application de l haptène, ces cellules pourront ainsi migrer vers les tissus et en particulier la peau A.2. La phase de révélation : déclenchement de la réaction inflammatoire La phase de révélation, ou phase efférente, constitue l expression clinique de l HSRC. Elle est induite par un second contact avec l haptène à un site distant du site de sensibilisation, et entraîne en quelques heures une réponse inflammatoire matérialisée par un œdème au site du second contact cutané. La réponse maximale est obtenue en heures chez la souris, et diminue ensuite pour disparaître en quelques jours en l absence de tout nouveau contact avec l haptène. Si les cellules effectrices de l'inflammation sont clairement identifiées dans les modèles murins d'hsrc, une controverse existe chez l'homme. En effet, pendant longtemps, l étude des réactions allergiques chez l homme ont conduit à désigner les lymphocytes T CD4 + comme les effecteurs des EPHE Banque de Monographies SVT 18

19 réactions d hypersensibilité (Silvennoinen et al, 1992), cependant des études ultérieures chez des patients allergiques au nickel ont montré que la majorité des clones T spécifiques du nickel isolés du sang périphériques étaient des lymphocytes T CD8 + (Bour et al, 1994). Dans le modèle murin d'hsrc au DNFB, une dichotomie fonctionnelle a été clairement établie entre les lymphocytes T CD4 + et CD8 +. L'utilisation d'anticorps déplétants dirigés contre les molécules de classe I du CMH a démontré un rôle des lymphocytes T CD8 + dans l'induction de la réaction d'hsrc au DNFB (Gocinski et al, 1990). Cette observation a été confirmée au moyen de souris déficientes en molécules de classe I ou de classe II du CMH (constitutivement déplétées respectivement en cellules T CD8 + ou T CD4 + ), les premières ne développant pas d'hsrc et les secondes ayant une réponse inflammatoire exacerbée et prolongée dans le temps (Bour et al, 1995). Dans le modèle d'hsrc au DNFB, les lymphocytes T CD8 + ont donc un rôle effecteur et les lymphocytes T CD4 + un rôle régulateur, tant dans l'intensité de la réaction que dans sa résolution. Lors de la phase de révélation d'une HSRC au DNFB, les cellules T CD8 + sont rapidement recrutées au site cutané, avant les lymphocytes T CD4 +, et exercent leur activité pro-inflammatoire par leur fonction cytotoxique, (Kehren et al, 1999), ceci indépendamment d'un effet auxiliaire des lymphocytes T CD4 + (Xu et al, 1997). Cette activité cytotoxique requiert la voie FAS/FAS ligand ou perforine (Kehren et al, 1999) et est dirigée contre les kératinocytes présentant l'haptène (Akiba et al, 2002). A.3 Régulation de l'hsrc : résolution de l'inflammation La lésion cutanée, observée lors de l'hsrc au DNFB, va persister de 3 à 5 jours puis va s'amender spontanément alors que l'haptène est encore présent dans l'épiderme. Ceci suggére l existence de mécanismes actifs de régulation de la réaction inflammatoire. Dans les modèles murins d'hsrc, le rôle régulateur des lymphocytes T CD4 + apparaît capital car leur absence aboutit à un eczéma de contact d'intensité accrue et qui devient chronique (Bour et al, 1995). Cette population exercerait son action au niveau des ganglions lymphatiques en inhibant l'activation des lymphocytes T CD8 + effecteurs et au niveau cutané par inhibition de l'activité cytotoxique de ces cellules T CD8 + (Bour et al, 1995, Xu et al, 1996). Cette population T CD4 + régulatrice produit de l'il-10 et de l'il-4 (Xu et al, 1996). En revanche, l implication de ces deux cytokines dans la régulation de l HSRC n a pu être démontré. En effet, la réaction d'hsrc n'est pas modifiée chez les souris déficientes en IL-4 (Berg et al, 1995). Et alors que dans notre modèle, cette réaction n est pas augmentée chez les souris déficientes en IL-10 (D. Kaiserlian, communication personnelle), d autres auteurs ont montré que le traitement de souris normales par un anticorps anti-il-10 neutralisant empêche la résolution de l HSRC (Ferguson et al, 1994) et que les souris déficientes en IL-10 présentent une réaction d HSRC exacerbée comparativement à des souris normales (Berg et al, 1995). B. Tolérance orale dans le modèle d'hsrc au DNFB EPHE Banque de Monographies SVT 19

20 Les travaux antérieurs réalisés dans l'équipe ont montré que l'administration orale de DNFB chez la souris, sept jours avant la sensibilisation, permet d'inhiber totalement la réaction d'hsrc induite par sensibilisation cutanée ultérieure avec le même haptène (Desvignes et al, 1996). Contrairement à la souris normale, les souris déficientes en molécules de classe II du CMH (Ab / ), ou déficientes en chaîne invariante (Ii / ), présentant respectivement un déficit complet ou partiel en cellules T CD4 + -classe II restreintes ainsi que les souris normales traitées par un anticorps anti-cd4 déplétant ne développent pas de tolérance orale au DNFB. De plus, il a été observé qu'en absence de cellules T CD4 + l'administration orale de DNFB (sans sensibilisation cutanée) induit une HSRC spécifique du DNFB lors d une seconde application de cet haptène (Desvignes et al, 1996). Ceci démontre que les cellules T CD4 + restreintes aux molécules de classe II du CMH sont impliquées dans l'inhibition de l'hsrc induite par le gavage avec le DNFB (préalablement à la sensibilisation cutanée), et empêchent l'induction d'une réponse à l'immunisation orale de l'haptène chez la souris normale. L induction de la tolérance orale dans ce modèle est due à l inhibition du développement dans les organes lymphoïdes secondaires de cellules T CD8 + spécifiques du DNFB (effectrices de l HSRC). En effet, les cellules T CD8 + de souris tolérisées sont incapables de répondre à une stimulation par des cellules syngèniques chargées par l haptène et ce en termes de prolifération, de production d IFN-g et d activité cytolytique spécifiques du DNFB (Desvignes et al, 2000). De plus, les expériences de transfert adoptif chez des souris immunodéficientes RAG / ont confirmé que les cellules T CD8 + de souris tolérisées sont incapables de transférer une HSRC au DNFB (contrairement aux T CD8 + de souris sensibilisées) (Desvignes et al, 2000). L'ensemble de ces données permettent de proposer que l administration orale de l haptène pourrait induire l'activation d une population de cellules T CD4 + régulatrices (restreintes aux molécules de classe II du CMH). Cette population inhiberait donc l'activation et/ou l'expansion des cellules T CD8 + spécifiques d'haptène dans les ganglions drainant le site de sensibilisation cutanée et aussi dans les MLN, suite à l'administration orale de l'haptène. Le mécanisme d inhibition de la réponse effectrice T CD8 + par les cellules T CD4 + régulatrices au cours de la tolérance orale ainsi que les différentes sous-populations T CD4 + susceptibles d'être impliquées dans la tolérance orale ne sont pas connus. Le but du projet auquel j'ai participé était de définir la contribution des cellules T CD4 + CD25 + dans la tolérance orale. REFERENCES BIBLIOGRAPHIQUES Akbari, O., DeKruyff, R. H. and Umetsu, D. T., Pulmonary dendritic cells producing IL-10 mediate tolerance induced by respiratory exposure to antigen. Nat Immunol : Akiba, H., Kehren, J., Ducluzeau, M. T., Krasteva, M., Horand, F., Kaiserlian, D., Kaneko, F. and Nicolas, J. F., Skin inflammation during contact hypersensitivity is mediated by early recruitment of CD8 + T cytotoxic 1 cells inducing keratinocyte apoptosis. J Immunol : EPHE Banque de Monographies SVT 20