8.7 CAHIER TECHNIQUE. THÈME 8 Gestion des laboratoires. Méthodes de détection des agents pathogènes. alimentaires

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1 CAHIER TECHNIQUE THÈME 8 Gestion des laboratoires Méthodes de détection des agents pathogènes alimentaires

2 Les cahiers techniques sont des outils destinés aux agents des services publics responsables de la restructuration du système de sécurité sanitaire des aliments et à tous les opérateurs qui sont liés à l élaboration de la politique sanitaire ainsi qu à l organisation générale des contrôles officiels (agents qualifiés des services publics, responsables de laboratoires, chefs de service dans les instances officielles, responsables chargés des contrôles officiels, formateurs, agents techniques, chercheurs, experts ou cadres d entreprises). Ils ont pour objectif de rassembler, sous forme synthétique, les principaux éléments relatifs à un sujet déterminé. L ensemble des cahiers techniques se répartissent selon les différentes thématiques qui sont abordées par EDES lors des sessions de formation. Les cahiers techniques ont été conçus et réalisés par la Cellule de Formation du programme EDES en collaboration avec les membres du Consortium. France Vétérinaire International ANSES ANS_10_3250_LogoFr2_CMYK 09/06/ , rue Salomon de Rothschild Suresnes - FRANCE Tél. : +33 (0) / Fax : +33 (0) Web : Ce fichier est un document d exécution créé sur Illustrator version CS2. ÉQUIVALENCES QUADRI DÉGRADÉ CYAN MAGENTA JAUNE NOIR 80% NOIR 60% EDES est un programme de coopération européen géré par le COLEACP. Le COLEACP est un réseau international œuvrant en faveur du développement durable du commerce horticole. Il est financé par l Union européenne et a été mis en œuvre à la demande du Groupe des États ACP (Afrique, Caraïbes et Pacifique). EDES œuvre en faveur d un renforcement de la sécurité sanitaire des aliments en Afrique-Caraïbes-Pacifique. EDES intervient dans toutes les filières à la suite d une demande introduite au niveau national par tout acteur public ou privé concerné par la sécurité sanitaire des aliments. EDES, programme du COLEACP 130, rue du Trône B-1050 Bruxelles Belgique Tél : +32 (0) Fax : +32 (0) La présente publication a été élaborée avec l aide de l Union européenne. Le contenu de la publication est produit par EDES, relève de la seule responsabilité du COLEACP et ne peut aucunement être considéré comme reflétant le point de vue officiel de l Union européenne et des partenaires du COLEACP.

3 THÈME 8 Gestion des laboratoires 7 Méthodes de détection des agents pathogènes alimentaires Contenu 1. Introduction 2 2. Règles générales de détection des micro-organismes dans les denrées alimentaires 9 3. Règles spécifiques pour la détection des agents pathogènes alimentaires dans les denrées alimentaires Aspects pratiques des méthodes de détection des agents pathogènes dans les denrées alimentaires 13

4 1. Introduction 1.1. Préambule Le terme «d agent pathogène» au sens strict du mot est très vaste et peut comprendre tous les contaminants pouvant être présents dans une denrée alimentaire et susceptibles de porter atteinte à la santé du consommateur. La FAO indique dans ces directives pour le renforcement des systèmes nationaux de contrôle alimentaire que : «Les préoccupations concernant les risques d origine alimentaire portent généralement sur les points suivants : les risques microbiologiques ; les résidus de pesticides ; le mauvais usage des additifs alimentaires ; les polluants chimiques, notamment les toxines biologiques ; et la falsification des produits». Dans l usage, le terme «d agent pathogène» est plus couramment utilisé pour les risques microbiologiques et certains virus. C est cette notion qui a été retenue dans le présent cahier. Étant donné la multiplicité des germes pathogènes, des produits alimentaires au sein desquels ils peuvent être recherchés et de la multiplicité des normes nationales, ce cahier technique sur les méthodes de détection des agents pathogènes alimentaires dans les denrées alimentaires ne permettra pas de couvrir toutes les méthodes spécifiques d analyses. Néanmoins il fournira tous les éléments techniques nécessaires pour l organisation d un laboratoire et de son fonctionnement afin qu il puisse travailler dans le respect des bonnes pratiques reconnues au niveau international Définitions Méthode de détection d un agent pathogène alimentaire : opération destinée à déterminer, de façon fiable, si l agent considéré est présent ou non dans un produit alimentaire dans la mesure ou sa présence rendrait le produit «Préjudiciable à la santé» tel que défini dans le Règlement (CE) n 178/2002 de l Union européenne, et si le produit contrôlé est conforme ou non à la réglementation et à ses spécifications ou exigences préétablies. Contaminant (Codex alimentarius) : tout agent biologique ou chimique, toute matière étrangère ou toute autre substance n étant pas ajoutée intentionnellement au produit alimentaire et pouvant compromettre la sécurité ou la salubrité. Denrée alimentaire (ou «aliment») : toute substance ou produit, transformé, partiellement transformé ou non transformé, destiné à être ingéré ou raisonnablement susceptible d être ingéré par l être humain. Ce terme recouvre les boissons, les gommes à mâcher et toute substance y compris l eau, intégrée intentionnellement dans les denrées alimentaires au cours de leur fabrication, de leur préparation ou de leur traitement. Microbiologique : qui se rapporte aux microorganismes. Micro-organisme (ou microbe) : tout organisme vivant visible seulement au microscope. Parmi les microorganismes, on distingue : les virus, les bactéries, les moisissures et les levures (règne végétal) et les protozoaires (règne animal). Pathogène : qui peut causer une affection, une maladie (bactérie pathogène, pouvoir pathogène). T.I.A.C. (Toxi-Infection Alimentaire Collective) : apparition d au moins deux cas groupés similaires d une symptomatologie, en général gastro-intestinale, dont on peut rapporter la cause à une même origine alimentaire. 2

5 1. Introduction 1.3. Généralités sur la détection des agents pathogènes alimentaires Objectif de sécurité des populations Le but général et principal des analyses est de contribuer à la sécurité des populations. Pour cela les analyses vont permettre de s assurer de la conformité sanitaire des produits alimentaires offerts aux consommateurs. Quelques différences peuvent toutefois être faites dans des objectifs spécifiques. Les essais demandés peuvent notamment concerner : la conformité d un produit aux critères microbiologiques réglementaires ; la mise en évidence d un pathogène à la suite d une toxi-infection ou d une maladie alimentaire identifiée (exemples : salmonellose, listériose, etc.) ; une recherche spécifique telle que par exemple : - la recherche d un pathogène pour s assurer de l absence de dangerosité d un produit dont les conditions de production, de conservation ou de distribution sont suspectes ou pour confirmer ou infirmer des informations concernant la dangerosité éventuelle d un aliment (Listeria monocytogènes, Salmonella spp, Bacillus cereus, Clostridium perfringens, etc.) ; - la recherche d indicateurs d une contamination fécale : E. coli, streptocoques fécaux (contamination ancienne). Respect de la règlementation Les règlementations nationales visent souvent à protéger les consommateurs du pays. Des valeurs maximales de contamination doivent être établies en fonction des bonnes pratiques de fabrication du pays. Les analyses de détection ou de quantification des agents pathogènes alimentaires dans les denrées alimentaires seront alors exécutées en tenant compte des types d agents à rechercher et des valeurs règlementaires fixées. Analyse des risques alimentaires L analyse des risques pour la santé est effectuée à deux niveaux : en prévention, l évaluation, la gestion et la communication auprès du public sont prévus dans le Règlement (CE) n 178/2002. Ce processus est conduit de façon indépendante, objective et transparente. Il est fondé sur les preuves scientifiques disponibles. Les analyses de détections des pathogènes rentrent dans les données servant à l analyse des risques. L étendue des recherches sera alors plus grande et déterminée en fonction des germes connus ou possiblement présents dans les denrées. par la mise en évidence d un pathogène à la suite d une toxi-infection ou d une maladie alimentaire identifiée (exemples : salmonellose, listériose, etc.). Dans ce cas, soit les analyses peuvent être ciblées par la description de l état clinique des patients atteints, soit elles sont déterminées en premier lieu par la connaissance des contaminations les plus probables. Marché international La législation s applique à toutes les denrées c est-à-dire à la fois aux denrées du marché national mais aussi aux denrées exportées ou réexportées avant d être mises sur le marché d un pays tiers, sauf si le pays importateur possède une législation spécifique. Les analyses doivent alors prendre en compte les règlementations internationales ou en vigueur dans le pays de destination. 3

6 1. Introduction 1.4. Avoir des analyses représentatives et fiables Le contrôle microbiologique permet d obtenir à un temps «t», grâce à un échantillon alimentaire déterminé ou à un prélèvement dit «de surface», une photographie de la qualité sanitaire du produit (salubrité et sécurité) mais aussi des conditions d hygiène lors de sa fabrication et de sa conservation. Il contribue également à apprécier la pertinence du choix de la durée de vie des produits et constitue un élément dans l évaluation de l efficacité du système de maîtrise de la qualité sanitaire de l entreprise. Le contrôle microbiologique est donc une opération motivée et complémentaire du contrôle de l hygiène. De fait, les résultats des analyses constitueront des outils pour évaluer tout un procédé de transformation ou de fabrication, les règles d hygiène et la conformité des lots de denrées qui pourraient : manquer aux populations et donc créer des situations de pénurie (sous-alimentation, malnutrition) s ils sont déclarés à tort non conformes ; tuer des consommateurs (populations sensibles, TIAC) s ils sont déclarés conformes à tort. Toute la chaine, qui va de l échantillonnage à l analyse, doit permettre de faire des analyses qui soient représentatives des denrées à évaluer mais aussi fiables que possible. L échantillonnage C est la première étape de l analyse. Elle conditionne toute la validité de l interprétation qui peut être faite du résultat quant à la conformité du lot. Pour que l échantillon soit représentatif, les règles de prélèvement doivent permettre de vérifier la validité de l ensemble du lot de denrées. L application, par les exploitants du secteur alimentaire, des principes HACCP ne remplace pas les contrôles officiels effectués par l Autorité compétente. Les prélèvements réalisés dans le cadre de contrôles officiels doivent obligatoirement respecter les textes réglementaires en vigueur dans le pays. Les prélèvements pour validation de lot doivent être faits selon les règles spécifiques qui assurent la représentativité du lot par l échantillon. D autre part, et pour être fiables, les prélèvements doivent être faits dans des conditions telles que l échantillon ne soit pas contaminé par le préleveur ou l environnement. Les actions de prélèvement doivent être réalisées avec soin afin d éviter que leur analyse ne soit refusée par le laboratoire. Les causes les plus fréquentes rendant l analyse impossible par le laboratoire sont : prélèvement incorrect : sachet percé, fermeture du sachet défectueuse, etc. ; prélèvement n arrivant pas à la température ; non-respect de la quantité minimale requise (dans certains cas, l analyse ne portera alors que sur certaines déterminations, notamment les bactéries pathogènes). Le transport des échantillons Les lieux de production ou de commercialisation sont toujours plus ou moins distants du laboratoire. Il convient donc de s assurer que les conditions de transport et en particulier les températures ne sont pas susceptibles de modifier le résultat. Certains échantillons peuvent être conservés par congélation dans l attente de leur transfert au laboratoire. 4

7 1. Introduction Qualité des analyses La fiabilité du résultat doit pouvoir être démontrée. La qualité des analyses est donc primordiale. Elle ne sera reconnue que si les laboratoires sont engagés dans une démarche qualité Bases réglementaires et normatives Plusieurs documents (règlements, normes ) seront utiles au laboratoire pour mettre en place et réaliser des méthodes de détection des agents pathogènes alimentaires dans les denrées alimentaires. Outre les règles propres à la législation nationale, il est possible (voir obligatoire si le produit est exporté vers l UE) de s inspirer de la règlementation européenne. Base réglementaire Le Règlement (CE) n 2073/2005 concerne les critères microbiologiques applicables aux denrées alimentaires. Il reprend les valeurs maximales pour plusieurs produits et plusieurs micro-organismes. Cependant, il doit aussi être tenu compte des réglementations spécifiques à chaque pays en particulier sur les agents pathogènes viraux. Dans le règlement, l Article 5 traite des dispositions particulières concernant les essais et l échantillonnage qui sont reprises ci-dessous : 1. Les méthodes d analyse ainsi que les plans et méthodes d échantillonnage sont définis à l annexe I et sont appliqués comme méthodes de référence. 2. Des échantillons sont prélevés sur les lieux de transformation et sur le matériel utilisé dans la production de denrées alimentaires lorsque ces prélèvements sont nécessaires pour s assurer du respect des critères. Pour ces prélèvements, la norme ISO/DIS est utilisée comme méthode de référence. Les exploitants du secteur alimentaire qui fabriquent des denrées alimentaires prêtes à être consommées susceptibles de présenter un risque pour la santé publique lié à Listeria monocytogenes prélèvent des échantillons sur les lieux de transformation et sur le matériel utilisé en vue de détecter la présence de Listeria monocytogenes dans le cadre de leur plan d échantillonnage. Les exploitants du secteur alimentaire qui fabriquent des préparations en poudre pour nourrissons ou des denrées alimentaires en poudre destinées à des fins médicales spéciales pour nourrissons de moins de six mois, présentant un risque lié à Enterobacter sakazakii, surveillent les lieux de transformation et le matériel utilisé en vue de détecter la présence d entérobactériacés dans le cadre de leur plan d échantillonnage. 3. Le nombre d unités à prélever suivant les plans d échantillonnage définis à l Annexe I peut être réduit si l exploitant du secteur alimentaire est en mesure de démontrer, par une documentation historique, qu il dispose de procédures efficaces fondées sur les principes HACCP. 4. Si les essais visent à évaluer précisément l acceptabilité d un lot de denrées alimentaires ou d un procédé déterminé, il faut respecter au minimum les plans d échantillonnage définis à l Annexe I. 5. Les exploitants du secteur alimentaire peuvent utiliser d autres procédures d échantillonnage et d essai lorsqu ils sont en mesure de démontrer, à la satisfaction de l Autorité compétente, que ces procédures fournissent des garanties au moins équivalentes. Ces procédures peuvent prévoir le recours à d autres sites d échantillonnage et à des analyses de tendances. Des essais fondés sur d autres micro-organismes et limites microbiologiques connexes ainsi que des essais fondés sur des analyses non microbiologiques ne sont autorisés que pour les critères d hygiène des procédés. Le recours à d autres méthodes d analyse est autorisé lorsque les méthodes sont validées par rapport à la méthode de référence définie à l annexe I et, s il s agit de méthodes commercialisées, certifiées par une tierce partie, conformément au protocole défini dans la norme EN/ISO ou à d autres protocoles analogues reconnus au niveau international. 5

8 1. Introduction Si l exploitant du secteur alimentaire souhaite utiliser d autres méthodes d analyse que les méthodes validées et certifiées décrites à l Alinéa 3, ces méthodes doivent être validées conformément aux protocoles reconnus au niveau international, et leur utilisation doit être autorisée par l Autorité compétente. Les critères de sécurité définissent l acceptabilité d un produit ou d un lot de denrées alimentaires. Ils sont applicables aux produits mis sur le marché jusqu à la fin de leur durée de vie. Les critères d hygiène des procédés indiquent l acceptabilité du fonctionnement du procédé de production. Un tel critère n est pas applicable aux produits mis sur le marché. Il fixe une valeur indicative de contamination dont le dépassement exige des mesures correctives destinées à maintenir l hygiène du procédé, conformément à la législation sur les denrées alimentaires, mais ne permet pas de conclure sur la conformité on non d un produit. Base normative Pour les critères de fonctionnement du laboratoire, deux normes internationales font références. L accréditation des laboratoires par un organisme indépendant national ou international est la garantie d une reconnaissance des résultats dans l ensemble des pays. L accréditation est prononcée sur les critères de la norme ISO qui décrit les exigences générales concernant la compétence des laboratoires d étalonnages et d essais. Cependant en ce qui concerne la microbiologie, l utilisation de la norme ISO 7218 concernant les exigences générales et recommandations en microbiologie des aliments est aussi obligatoire et sert de base à l organisation d un laboratoire de microbiologie. La norme ISO Cette norme internationale établit les exigences générales de compétence pour effectuer des essais (couramment appelés «analyses») et/ou des étalonnages y compris l échantillonnage. Elle couvre les analyses effectuées au moyen de méthodes normalisées, de méthodes non normalisées et de méthodes élaborées par les laboratoires. Elle est applicable à toutes les organisations qui procèdent à des analyses, quels que soient leurs effectifs et l étendue du domaine de leurs activités. Elle est destinée à être utilisée par les laboratoires qui élaborent leur système de management pour la qualité et les activités administratives et techniques. Cette norme est internationale et elle garantit la qualité des résultats du laboratoire dans tous les pays. Elle reste un excellent outil pour l organisation du laboratoire. Si le paragraphe 4 traite du système de management par la qualité, le paragraphe 5 traite des aspects techniques tels que : la compétence du personnel ; les installations et conditions ambiantes ; les méthodes d essai et d étalonnage et validation des méthodes ; l estimation de l incertitude de mesure ; la maîtrise des données ; l équipement ; la traçabilité du mesurage ; les étalons de référence et matériaux de référence ; l échantillonnage ; la manutention des objets d essai et d étalonnage ; assurer la qualité des résultats d essai et d étalonnage ; rapport sur les résultats ; avis et interprétations. 6

9 1. Introduction La norme ISO 7218 Cette norme internationale spécifie des exigences générales et des recommandations/options visant trois utilisations principales : l application des normes élaborées par l ISO TC 34/SC 9 ou l ISO TC 34/SC 5 pour la détection ou le dénombrement des micro-organismes, nommées ci-après «normes spécifiques» ; la bonne pratique de laboratoire pour les laboratoires de microbiologie alimentaire ; les recommandations relatives à l agrément des laboratoires de microbiologie alimentaire (la norme internationale décrit les exigences techniques conformes à l ISO/CEI 17025:2005 relative à l accréditation d un laboratoire de microbiologie par les organismes nationaux). Les exigences de la norme ISO 7218 prennent le pas sur les exigences correspondantes des normes spécifiques existantes. Des instructions supplémentaires concernant les examens de biologie moléculaire sont spécifiées dans l ISO La norme couvre l examen pour les bactéries, les levures et les moisissures et peut être utilisée, si elle est complétée par des recommandations spécifiques, sur les prions, les parasites et les virus. Elle s applique à la microbiologie des aliments, des aliments pour animaux, à l environnement de production d aliments et à l environnement de production primaire. Son objet est d aider à garantir la validité des examens microbiologiques des aliments, à s assurer que les méthodes générales utilisées pour effectuer ces examens sont les mêmes dans tous les laboratoires, à participer ainsi à l obtention de résultats homogènes dans les différents laboratoires et à contribuer à la sécurité du personnel de laboratoire, en prévenant les risques d infection. Normes spécifiques de recherche et analyse des agents pathogènes Les deux normes précédentes sont des normes générales d organisation du laboratoire et du système qualité. Elles ne contiennent aucune information technique pour l analyse d un micro-organisme particulier. Le laboratoire doit utiliser les normes spécifiques pour les recherches. Il existe à l heure actuelle un ou plusieurs documents pour chaque micro-organisme. Il existe deux grands types d analyses qui sont les analyses «classiques» de microbiologie en faisant pousser les germes sur milieu sélectifs et les analyses par «Polymerase Chain reaction» ou PCR pour les virus. Le tableau ci-dessous reprend pour chaque agent pathogène quelques normes spécifiques possibles de notre connaissance. D autres textes de références peuvent exister suivant les pays ou continents. 7

10 1. Introduction Agent Pathogènes Normes possibles Bacillus cereus NF EN ISO 7932, juillet 2005 NF EN ISO 21871, juillet 2006 Clostridium botulinum DIN 10102, juin 1988 NF EN ISO 7937, février 2005 Clostridium perfringens ISO 7937:2004, août 2004 eau ISO/DIS 14189, mars 2012 Escherichia coli NF ISO 7251 Escherichia coli O157:H7 NF EN ISO Listeria monocytogenes NF EN ISO NF EN ISO , février 1997 Salmonella Eau NF ISO NF EN ISO 6579 Shigella NF EN ISO 21567, mars 2005 Staphylococcus aureus NF EN ISO , octobre 1999 Vibrio cholerae NF EN ISO , octobre 1999 Yersinia enterocolitica NF EN ISO 10273, décembre 2003 Virus entériques NF EN ISO , octobre

11 2. Règles générales de détection des microorganismes dans les denrées alimentaires Les micro-organismes pathogènes sont avant tout des micro-organismes. Toutes les règles générales d analyses de micro-organismes décrites ci-après sont applicables Les locaux La conception du laboratoire doit être conforme aux exigences en matière de sécurité qui dépendent du type de micro-organisme. À cet effet, les micro-organismes sont répartis en quatre catégories de risque : Catégorie de risque 1 (aucun risque ou risque très faible pour l individu et la collectivité) Catégorie de risque 2 (risque modéré pour l individu et faible pour la collectivité) Catégorie de risque 3 (risque élevé pour l individu et faible pour la collectivité) Catégorie de risque 4 (risque élevé pour l individu et la collectivité) Il est nécessaire de se référer aux réglementations nationales définissant en particulier la catégorie de risque des micro-organismes présents dans le pays concerné. L objectif est de s assurer que l environnement dans lequel les examens microbiologiques sont effectués n affecte pas la fiabilité des analyses. Il convient donc d agencer les locaux de façon à éviter les risques de contamination croisée. Pour atteindre cet objectif, il faut : a) appliquer le principe de la «marche en avant» ; b) séparer les activités dans le temps ou l espace ; c) éviter les conditions extrêmes telles que l excès de température, de poussière, d humidité, de vapeur, de bruit, de vibration, etc. La surface doit être : suffisante pour maintenir les zones de travail propres et en ordre ; adaptée au volume des analyses réalisées et à l organisation générale interne du laboratoire ; conforme aux réglementations nationales, le cas échéant L hygiène du personnel Dans le domaine de l hygiène du personnel, les précautions suivantes doivent être prises pour éviter la contamination des échantillons et des milieux de culture, et pour éviter des risques d infection du personnel : porter des vêtements de laboratoire correctement fermés, propres et en bon état, réalisés dans un tissu limitant les risques d inflammabilité. Ces vêtements ne doivent pas être portés hors des locaux d essai et éventuellement des vestiaires ; porter des protections pour les cheveux et la barbe, si nécessaire pour l intégrité de l échantillon ; garder des ongles propres et courts de préférence ; se laver soigneusement les mains à l eau tiède, distribuée de préférence par un robinet à commande non manuelle avant et après les examens microbiologiques et immédiatement après chaque passage aux toilettes. Utiliser un savon liquide ou solide, éventuellement un désinfectant, délivré de préférence par un distributeur maintenu en bon état de propreté. Pour se sécher les mains, utiliser des serviettes en papier ou en tissu à usage unique. Ces précautions sont valables tant pour les employés du laboratoire que pour les visiteurs ; 9

12 2. Règles générales de détection des micro-organismes dans les denrées alimentaires lors des manipulations des échantillons, des cultures ou des milieux contaminés, et pendant les ensemencements, éviter de parler, de tousser, etc. ; les personnes présentant des infections de la peau ou des maladies doivent prendre des précautions particulières si les micro-organismes de ces infections ou maladies sont susceptibles de contaminer les échantillons et risquent de fausser les résultats ; ne pas manger ni boire dans le laboratoire et ne pas placer d aliments destinés à la consommation personnelle dans les réfrigérateurs et les congélateurs du laboratoire ; le pipetage à la bouche est à proscrire Le travail en conditions stériles et fertiles Les conditions d ambiances doivent permettre : de ne pas dégrader les échantillons ou les milieux pour assurer la fertilité de l ensemble ; de ne pas contaminer les échantillons ou les milieux en particulier les contaminations par le contrôle des entrées d air ou par les appareils de climatisation. Une attention particulière doit être portée, notamment pour les climats chauds, sur les salles d étuves d incubation pour lesquelles la température de la pièce doit être significativement inférieure aux températures d incubation afin de permettre un bon contrôle des températures d incubation. 10

13 3. Règles spécifiques pour la détection des agents pathogènes alimentaires dans les denrées alimentaires Il faut prendre conscience que l analyse de produits alimentaires éventuellement déjà présents sur le marché et qui semblent ne pas constituer de menace particulière va conduire, lors de l incubation, à la production d un grand nombre de germes pathogènes ou non. Ces produits alimentaires non dangereux au départ vont donc devenir des sources de contamination s ils ne sont pas traités de manière adéquate avant leur élimination Protection de l opérateur Hormis le fait que l échantillon doit être protégé de toute contamination, il est important de se rappeler que les germes pathogènes recherchés le sont parce qu ils sont dangereux pour l homme. Il faudra donc prévoir une pièce réservée pour les analyses de pathogènes et dans cette pièce, l opérateur devra travailler sous hotte à flux laminaire. Photo 1 : Hotte à flux laminaire pour les analyses de pathogènes Photo 2 : Hotte à flux laminaire pour les analyses de pathogènes dans une salle spécifique réservée pour la manipulation des agents pathogènes 11

14 3. Règles spécifiques pour la détection des agents pathogènes alimentaires dans les denrées alimentaires 3.2. Protection de l environnement Comme il a déjà été mentionné, l analyse des agents pathogènes conduit à la multiplication des germes. Ces derniers peuvent être rejetés dans l environnement soit par voie aérienne, soit par les voies d élimination des déchets. Il conviendra donc, en fonction de la réglementation du pays, de respecter les rejets d air du laboratoire vers l extérieur pour le contrôle des contaminations aériennes. Il faudra ensuite assurer une décontamination de tous les déchets par un système adéquat afin de ne pas propager de contaminations accidentelles lors du traitement des déchets. Les systèmes à chaleur sèche ne sont pas recommandés et l autoclavage reste le moyen le plus sûr de destruction des germes. Photo 3 : Autoclave vertical pour la décontamination des déchets du laboratoire 12

15 4. Aspects pratiques des méthodes de détection des agents pathogènes dans les denrées alimentaires 4.1. Aménagement des locaux Il doit tout d abord exister une séparation stricte entre les parties administratives et les parties techniques. Pour les parties techniques, les locaux doivent être aménagés de façon à respecter le principe de la «marche en avant» et à séparer les activités dans le temps ou l espace. Il faudra donc retrouver dans l ordre : (i) Pour l analyse des bactéries, levures et moisissures : une salle de réception au niveau de laquelle les échantillons seront apportés par les demandeurs d analyses (contrôleurs, ou acteurs de la chaine agroalimentaire). Cette salle mène directement au stockage des échantillons ou contient un congélateur et un réfrigérateur pour le stockage temporaire des échantillons. C est la seule salle où les personnes extérieures peuvent accéder ; une salle de préparation des milieux. Les milieux sont préparés et stérilisés si nécessaire dans cette salle qui est une salle propre. Les milieux sont ensuite soit stockés dans des réfrigérateurs soit remis directement dans les salles correspondantes (préparation solution mère ou ensemencement) ; une salle de préparation des solutions mères, c est-à-dire de mise en solution des échantillons dans un milieu nutritif. Dans cette salle les échantillons sont ouverts stérilement à proximité de la flamme d un bec bunsen et mis en solution dans le milieu. Cette opération peut se faire à l aide d un appareil automatique (dilumat) qui délivre, après pesée de la prise d essai, la quantité de milieu nécessaire pour obtenir la dilution programmée ; Photo 4 : Poste de mise en solution avec bec bunsen et dilumat Les prélèvements pour les eaux sont faits par filtration d un volume d eau donné sur des filtres stériles qui sont mis à incuber. Le système de filtration est montré dans la photo ci-dessous. Photo 5 : Système de filtration pour les analyses d eau avec les supports de filtre à côté d un bec bunsen et la pompe pour la filtration 13

16 4. Aspects pratiques des méthodes de détection des agents pathogènes dans les denrées alimentaires une salle d ensemencement au sein de laquelle sont faites les dilutions éventuelles puis l étalement sur boite de pétri ou dans des milieux d enrichissement ; une salle d incubation dans laquelle sont regroupées toutes les étuves permettant les incubations aux différentes températures ; une salle de lecture et d enregistrement des résultats ; une salle pour l analyse des micro-organismes pathogènes qui contient une hôte à flux laminaire ; une laverie pour le lavage et la stérilisation du matériel. Photo 6 : Laverie pour le nettoyage du matériel avant stérilisation On note la présence des bacs identifiés en jaune pour l élimination des déchets. (ii) Pour les analyses PCR : une salle d extraction de l ADN ; une salle de préparation du MIX de réactifs de polymérisation (totalement exempte d ADN) ; une salle de PCR qui contient les thermocycleurs. (iii) Dans les deux cas L enchainement de ces salles doit être le plus possible dans l ordre cité avec des communications entre pièce au moyen d ouverture de type passe-plat pour limiter les mouvements du personnel. Photo 7 : Exemple de communication entre 2 salles (ici salle de mise en suspension et salle d ensemencement) 4.2. Modes opératoires d analyse Choix de la méthode Comme nous l avons déjà indiqué, pour faciliter la reconnaissance des résultats et pour faciliter la mise en place, il est préférable de choisir des méthodes normalisées ou officielles. La plupart des agents pathogènes ont déjà été étudiés et il existe des protocoles déjà publiés. 14

17 4. Aspects pratiques des méthodes de détection des agents pathogènes dans les denrées alimentaires Mise en place La mise en place des méthodes choisies va débuter par la vérification du fait que le laboratoire dispose du matériel, ainsi que de réactifs et consommables cités dans le texte de référence. En effet, pour les analyses microbiologiques (classiques ou par PCR) la sélectivité est telle que les milieux sont extrêmement importants. Il sera bon ensuite de tester le protocole en entier sur une matrice pour s assurer que l ensemble est fonctionnel. Validation Lorsque le mode opératoire est fonctionnel au sein du laboratoire, il est nécessaire de valider le protocole pour s assurer que la méthode répond bien aux besoins c est-à-dire qu elle est sélective (elle ne met en évidence que les germes recherchés), qu elle est sensible (elle permet de détecter les germes au niveau des valeurs réglementaires) et qu elle est répétable (plusieurs analyses du même échantillon donneront le même résultat). Pour cela, il faut réaliser l analyse d échantillons dont la teneur en germes est connue et déterminer les valeurs de répétabilité que l on pourra comparer aux valeurs données dans le texte de référence. Il faudra aussi participer à des essais d intercomparaison avec d autres laboratoires. Les prélèvements Comme nous l avons vu, le prélèvement est très important. Deux cas se présentent en général : soit le laboratoire prend en charge le prélèvement, soit le prélèvement est assuré par une tierce partie (contrôleurs, clients, etc.). Dans le premier cas, le technicien préleveur du laboratoire possède en général les compétences en microbiologie pour ne pas contaminer l échantillon. Dans le deuxième cas, il sera bon de s assurer des compétences du préleveur avant de donner une interprétation des résultats. Dans tous les cas, le laboratoire doit définir le nombre d échantillons qu il doit recevoir pour l interprétation. En effet plusieurs possibilités sont offertes : le prélèvement d un échantillon d une unité, c est en général le cas pour des contrôles de procédés où la multiplicité des contrôles durant la phase de production augmente la sécurité finale du produit. Les demandeurs sont en général des industriels qui font leurs propres contrôles (auto-contrôles prévus dans la réglementation) ; le prélèvement de trois ou cinq unités d un même produit, c est-à-dire, généralement, unités de vente consommateur, ou conditionnements commerciaux, correspondant à une même fabrication ou un même numéro de lot. Dans ce cas l interprétation sur la conformité du lot obtenu sera donnée en fonction du nombre de résultats positifs sur les 3 ou 5 unités qui devront dans ce cas être analysées séparément. Dans tous les cas, le nombre de prélèvements est déterminé soit par l Autorité administrative, soit par le laboratoire, en fonction de la nature du contrôle réalisé. 15

18 4. Aspects pratiques des méthodes de détection des agents pathogènes dans les denrées alimentaires Précautions et renseignements indispensables à prendre lors du prélèvement : Les précautions d usage pour maintenir l échantillon dans son état microbiologique doivent être respectées lors de l opération de prélèvement. En particulier, chaque unité est conditionnée dans un sachet à prélèvement stérile, y compris les échantillons en emballage commercial. Certaines informations sont indispensables au laboratoire pour l analyse ou le rapport d essai : une description précise du produit, indispensable pour l identification des critères analytiques pertinents, par exemple : produit cru, cuit, frit ; produit surgelé ou frais, congelé au service ; fromages au lait cru, pasteurisé ou thermisé ; catégorie de produit quand la dénomination est fantaisiste ; composition d un plat complexe ; produit déballé ou non ; produit conditionné ; produit conditionné sous vide ; etc. ; la température au moment du prélèvement. Le transport du prélèvement au laboratoire Le transport des échantillons est une étape importante qui conditionne la réalisation des analyses par le laboratoire. Cette opération doit être organisée, préparée et effectuée avec soin. En effet, de mauvaises conditions de transport peuvent conduire au rejet des échantillons par le laboratoire, notamment lorsque les conditions de température des échantillons ne sont pas respectées. La réception au laboratoire Lors de l arrivée au laboratoire, le personnel doit vérifier l intégrité des contenants des échantillons pour détecter d éventuelles contaminations survenues après le prélèvement. Il prend la température et s assure qu elle est toujours conforme à celle prévue. Les échantillons sont ensuite conservés dans des conditions qui permettent de garantir la non-détérioration ou la non-prolifération des germes Les analyses des bactéries, levures et moisissures Le principe de base de ces analyses est de déposer une solution issue du mélange de la denrée avec un milieu nutritif non sélectif (préparation de la solution mère) sur des milieux qui ne permettront la croissance que des germes recherchés (ensemencement). Les boites de pétri ainsi préparées sont incubées dans des étuves (incubation) pendant un temps défini afin d être observées pour détecter la présence de colonies issues de la prolifération d une bactérie présente dans la solution de départ. Pour certains germes pathogènes (salmonelle par exemple) la valeur réglementaire est son absence dans 25 g de denrée. Dans ce cas l analyse se déroule en réalisant seulement un enrichissement dans un milieu liquide dans des conditions telles qu un seul germe puisse être détecté. La préparation des milieux Les milieux peuvent se présenter soit sous forme de prêt à l emploi directement utilisable par le technicien, soit sous forme de poudre qui devra être diluée dans de l eau puis stérilisée avant l emploi. Dans les deux cas le laboratoire doit s assurer que les conditions de transport, de préparation ou de stockage n ont pas affecté la stérilité ou la fertilité des milieux avant leur utilisation. 16

19 4. Aspects pratiques des méthodes de détection des agents pathogènes dans les denrées alimentaires L ensemencement L ensemencement consiste à déposer un volume donné de la suspension mère sur des boites de pétri ou dans des tubes pour l enrichissement. À ce stade, les solutions ou les échantillons ne sont que peu ou pas contaminés et ne présentent pas de risque pour les opérateurs. Cette opération peut donc être faite dans la sphère de stérilité à proximité d une flamme. Photo 8 : Paillasse d ensemencement où l on peut voir les tubes et boites de pétri prête à être utilisées, sur la gauche un bec bunsen et sur le chariot un système de filtration pour les recherches de germes dans les eaux. Incubation Les boites de pétri et les tubes sont mis à incuber dans des étuves dont les températures sont contrôlées. Photo 9 : Salle d étuve où chaque étuve est à une température donnée. On note la présence de la climatisation pour maintenir la température à un niveau bas pour que la régulation des étuves fonctionne. La température de chaque étuve est surveillée en continue pour s assurer qu il n y a pas de rupture durant la durée de l incubation. 17

20 4. Aspects pratiques des méthodes de détection des agents pathogènes dans les denrées alimentaires La lecture La lecture va consister à compter le nombre de colonies sur les boites, comme sur les exemples donnés dans la photo ci-dessous. Photo 10 : Exemple de boite de pétri après incubation À l heure actuelle, cette lecture est réalisée après incubation à un poste situé en général à proximité d un ordinateur permettant la saisie directe des résultats. Cependant l inscription sur une feuille manuscrite de suivi d échantillon reste tout à fait adaptée. Photo 11 : Exemple de poste de lecture. La luminosité est bonne et l ordinateur permet la saisie directe des résultats. Ici le lecteur de code barre permet le suivi informatique en direct des informations concernant un échantillon La détection des virus par la technique PCR Cette technique de biologie moléculaire est maintenant couramment utilisée pour détecter spécifiquement les traces d ADN de virus pathogènes dans les aliments. Elle est aussi de plus en plus utilisées comme technique d identification de bactéries pathogènes car elle est très spécifique et beaucoup plus rapide. Certains laboratoires peuvent fournir un résultat sur la détection de E. Coli O157 H7 en 24 heures. Extraction de l ADN La première étape est l extraction d ADN qui doit se faire dans une salle propre car une contamination par des traces d ADN d un autre échantillon ou d un opérateur perturbera l analyse. Cette extraction est basée sur des kits d extraction prêts à l emploi disponibles dans le commerce. Elle consiste à détruire les cellules pour libérer l ADN qui est ensuite purifié sur de petites colonnes souvent à base de silice. À l issue de cette étape l ADN purifié est récupéré en solution dans un micro tube. Préparation du mix Le mix est le mélange de réactifs nécessaire au fonctionnement de la polymérase qui re-synthétisera de l ADN à partir de l ADN des virus ou des bactéries. Pour être sélectif du virus et du germe recherché, il faut une petite séquence de l ADN connu qui sert d amorce à la polymérase. La salle de préparation doit être totalement exempte d ADN puisque la moindre trace d ADN sera ensuite amplifiée et pourra perturber le déroulement normal de l analyse. 18

21 4. Aspects pratiques des méthodes de détection des agents pathogènes dans les denrées alimentaires Amplification Cette opération est automatisée et est réalisée dans des thermocycleurs qui vont reproduire plusieurs cycles de températures pour arriver à multiplier le nombre de brins de l ADN recherché. La détection peut se faire soit par migration sur des gels de polyacrylamide soit directement en temps réel avec un appareil tel que celui présenté sur la photo 12 ci-dessous : Photo 12 : Thermocycleur en temps réel (à droite) accompagné de son système informatique de pilotage et de collection des résultats 4.5. Élimination des déchets L ensemble des déchets est susceptible d être une source de contamination. Il est donc nécessaire de prévoir : la stérilisation afin de détruire tous les germes, dont les germes pathogènes produits lors de l incubation ; l élimination par une voie qui ne passe pas par les salles d analyses (respect de la marche en avant). La norme ISO 7218 prévoit deux autoclaves dans le laboratoire : un pour la stérilisation du matériel et des milieux avant analyse ; l autre pour la stérilisation des déchets Rendu des résultats Le rapport d essai Le rapport d essai doit permettre au demandeur de l analyse d avoir toutes les informations nécessaires pour l interprétation des résultats. Pour cela il doit comporter au moins les indications suivantes (repris dans la norme ISO 17025) : a) un titre (par exemple «Rapport d essai» ou «Certificat d étalonnage») ; b) le nom et l adresse du laboratoire, ainsi que le lieu où les analyses ont été effectuées, s il diffère de l adresse du laboratoire ; c) l indication unique du rapport d essai (tel que le numéro de série) et, sur chaque page, une indication permettant d assurer que la page est reconnue comme faisant partie du rapport d essai ou du certificat d étalonnage, avec une indication claire de la fin du rapport d essai ; d) le nom et l adresse du client ; e) l identification de la méthode employée ; f) la description, la condition et l identification non ambiguës de l objet soumis à l essai ou à l étalonnage ; g) la date de réception de chaque objet soumis à l analyse, car cela permet de connaitre les délais entre prélèvement et analyses ce qui est essentiel pour la validité et l application des résultats. Il en va de même pour la date d exécution de chaque analyse ; 19

22 4. Aspects pratiques des méthodes de détection des agents pathogènes dans les denrées alimentaires h) une référence au plan et aux procédures d échantillonnage utilisés par le laboratoire ou d autres organismes, si ces informations sont connues, car elles sont pertinentes pour la validité ou l application des résultats ; i) les résultats de l analyse, avec les unités de mesure ; j) le (les) nom(s), fonction(s) et signature(s), ou une identification équivalente, de la (des) personne(s) autorisant l édition du rapport d essai ; k) s il y a lieu, une déclaration selon laquelle les résultats ne se rapportent qu aux objets soumis à l essai. Il convient que les exemplaires sur papier des rapports d essai et des certificats d étalonnage comportent également le numéro de la page et le nombre total de pages. Enfin il est recommandé aux laboratoires d insérer un avertissement spécifiant que le rapport d essai ou le certificat d étalonnage ne doit pas être reproduit, sinon en entier, sans l autorisation écrite du laboratoire. Les conclusions du rapport d analyse Lorsque le laboratoire apporte une conclusion qui figure sur le rapport d essai, il doit s assurer : que les critères choisis pour l interprétation sont pertinents en fonction de la classification du produit et de son usage prévu et selon qu il existe ou non des critères microbiologiques réglementaires ; que l échantillon est représentatif du lot et que les conditions de prélèvement n ont pas modifié les caractéristiques de l échantillon ; dans le cas contraire, la mention comme quoi le rapport ne concerne que l échantillon soumis à l analyse est capitale ; le laboratoire doit mentionner l origine des documents et leur version datée car en l absence de telles informations, c est la version en vigueur qui s applique et donc peut remettre en cause la conclusion. Crédits photo : Laboratoire bioqual : ZA de Pic - Rue Henri Fabre PAMIERS 20

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24 Thèmes des cahiers techniques EDES est financé par l Union européenne Imprimé sur du papier certifié FSC, à l aide d encres écologiques sans solvant. Date de publication : Mars 2013 Design : 1 Système de sécurité sanitaire 2 Réglementation et normes 3 Évaluation des risques 4 Méthodes de formation 5 Communication sur les risques 6 Systèmes d autocontrôle 7 Traçabilité et étiquetage 8 Gestion des laboratoires 9 Procédures 10 Sous-produits animaux 11 Enregistrement des produits 12 Contrôles officiels

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