Le phénotypage érythrocytaire: Validation et difficultés d interprétation

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1 Société Tunisienne de Biologie Clinique Journée de formation Interprétation et validation des tests immunohématologiques Le phénotypage érythrocytaire: Validation et difficultés d interprétation Dr Manel Chaâbane MCA en Hématologie Centre National de Transfusion Sanguine Faculté de Pharmacie de Monastir Tabarka, le 20 octobre 2016è 1

2 Plan Introduction Phénotypage érythrocytaire Phénotypage RH KEL Phénotypage étendu Conclusion 2

3 Introduction 3

4 Introduction Les antigènes érythrocytaires 350 antigènes 35 systèmes 12 collections 11 séries séries 700 4

5 Introduction Règles immunologiques de la transfusion de CGR (En dehors du système ABO) A B Allo-immunisation Donneurs Receveur 5

6 Introduction Quels antigènes doit-on déterminer? Les plus immunogènes Les plus dangereux (transfusion, MHNN) RH: D,C,c,E,e KEL: Kell Phénotypage RH KEL FY: Fya,Fyb JK: Jka,Jkb MNS: S,s Autres Phénotypage étendu 6

7 Introduction Phénotypage érythrocytaire : Identification des antigènes (Ag) exprimés sur la membrane des globules rouges (GR) Examen essentiel à la sécurité transfusionnelle Concerne : receveur de PSL et donneur de sang Donneurs : qualification des concentrés érythrocytaires (CGRs phénotypés) Receveurs : assurer sécurité du transfusé, de la femme enceinte et de son fœtus 7

8 Phénotypage érythrocytaire: Réalisation, validation, difficultés 8

9 Phénotypage érythrocytaire Chez le donneur En dehors du groupage ABO- RHD: Phénotypage RH KEL Phénotypage étendu Objectif : mettre à la disposition du receveur des CGRs phéno- compatibles (RH KEL ou autres ) Chez le receveur En dehors du groupage ABO- RHD: Phénotypage RH KEL Phénotypage étendu Objectif : sécurité transfusionnelle 9

10 Phénotypage érythrocytaire Donneurs de sang Sains Habituellement sans difficultés Phénotypes rares (E et e négatifs, RH nul, k négatif ) Receveurs de PSL Difficultés courantes En rapport avec Passé transfusionnel surtout si transfusion récente Pathologie sous jacente / AHAI, greffe de CSH Plus de précautions 10

11 Phénotypage érythrocytaire RH-KEL 11

12 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Définition Rechercher, à l aide de sérums tests appropriés la présence ou l absence à la surface des GR du sujet testé des Ag: C (RH2 ), E (RH3 ), c (RH4 ),e (RH5 ) Kel ( K1 ) Les Ag les plus immunogènes ( 80% des allo-ac ) Conditions de réalisation: fonction de l automatisation et du système informatique 12

13 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Indications Prévention de l'allo-immunisation anti-érythrocytaire ( RH-K1 ) Receveurs de sexe féminin: de la vie intra-utérine jusqu'à la fin de la période procréatrice, Patients dépendants de transfusions chroniques de GR: porteurs d'hémoglobinopathie, d'érythroblastopénie, d'anémie chronique... Patients en hémato-oncologie, candidats à la greffe de CSH... Prévention des accidents hémolytiques transfusionnels (RH-K1 ) en cas d allo-immunisation préexistante. 13

14 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Situation en Tunisie Respect du phénotype RH-K1 Chez les polytransfusés ( hémoglobinopathes, greffés de CSH, patients souffrant d hémopathie ) Chez les receveurs de sexe féminin jusqu à la ménopause Phénotypage de la quasi-totalité des donneurs de sang Satisfaire toutes les demandes en sang phénotypé 14

15 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Modalités de réalisation Un phénotypage est valide et exploitable pour la transfusion si on possède deux résultats concordants sur 2 prélèvements différents à raison d 1 détermination /prélèvement Situation en Tunisie Donneurs de sang : une seule détermination sur semiautomate Receveurs : deux déterminations sur le même prélèvement 15

16 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Modalités de réalisation Prélèvement Tube NFS ou citrate +++ Tube sec : non conseillé Techniques utilisées : basées sur l hémagglutination Microplaque en phase liquide ( donneurs) TCI et/ou Technique enzymatique ( receveurs ) En tube : En salin ( si difficultés ) 16

17 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Démarche du laboratoire d IH du CNTS Donneurs de sang : une seule détermination par la technique microplaque en phase liquide Receveurs de PSL Deux déterminations Deux techniques Deux lots de réactifs Deux techniciens Confrontation des résultats Saisie informatique 17

18 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Microplaque en phase liquide Sensibilisation préalable des GR par la broméline EG + ES + Phénotype sur la même microplaque Technique rapide, économique ( dilution des anti-sérums ) Microplaque en phase liquide Interprétation rapide, aisée 18

19 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Microplaque Microplaque et gel test Gel test enzyme 19

20 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Validation analytique La validation analytique repose sur: Résultats des CQI conformes : résultats obtenus / attendus Absence d ambigüité réactionnelle avec chaque réactif L absence de double population Un profil réactionnel cohérent (Exemple: les Ag antithétiques) 20

21 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Interprétation Concordance entre les résultats des deux déterminations Discordance avec un ancien résultat Éliminer une erreur d affectation à l enregistrement Réaliser le phénotypage avec une autre technique L absence de 2 Ag antithétiques (Exemple: c et C ; E et e) nécessite le recours à des explorations complémentaires sérologiques et/ou moléculaires 21

22 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Interprétation Absence d ambigüité réactionnelle avec chaque réactif L agglutination pourrait être liée à une sensibilisation in vivo par des Ig Patients souffrant d AHAI, MHNN, incident transfusionnel Tenir compte du résultat du TCD Ne se pose pas avec les réactifs monoclonaux IgM en salin 22

23 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Difficulté 1 Doubles populations 23

24 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Double population (dp) Présence simultanée de GRs positifs et négatifs pour l Ag étudié Présence simultanée de GRs du patient et du donneur ( patient transfusé récemment ) Dégager le phénotype transfusionnel Proposer une conduite transfusionnelle Refaire dans un délai de plus de 45 jours après à la dernière transfusion 24

25 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Double population 1 D C c E e K D C c E e K Conduite transfusionnelle : RH: 1, 2, 3,4, 5 K: -1 ( D+ C- c+ E- e+ K- ) 25

26 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Double population 2 D C c E e K Conduite transfusionnelle : RH: 1, 2, 3,4, 5 K: -1 (D+ C- c+ E- e+ K- ) 26

27 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Difficulté 2 Auto-anticorps 27

28 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Auto-anticoprs Sensibilisation des GR du patient par des auto-anticorps TCD ( AGH ) positif Réaction positive en dehors de toute réaction spécifique ( même en l absence d anti-sérums ) Toutes les techniques : enzymatique ou TCI CAT: en fonction de l optimum thermique de l auto-ac (froid, chaud) 28

29 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Auto-anticoprs D C c E e K D C c E e K 29

30 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Auto-anticoprs froids Résolution Même que pour GS ABO Faire des lavages avec de l eau physiologique préchauffée à 37 C Refaire le phénotypage avec la même technique Valider par un témoin autologue négatif 30

31 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Auto-anticoprs chauds Résolution 1: Changer de technique Technique en tube Anti-sérums monoclonaux de type IgM réagissant en salin Supprimer l enzyme ou l AGH du milieu réactionnel Couteuse : consommatrice de réactifs Se prête à l urgence +++ ( rapide ) 31

32 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Auto-anticoprs chauds Technique en tube 1 goutte GR à 5% dans l eau physiologique + 1 goutte antisérum Centrifugation 2000 rpm 20 sec Lecture o Présence d agglutination o Absence d agglutination 32

33 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Auto-anticoprs chauds D C c E e K D C c E e K TA D C c E e K TA: Témoin auto RH: 1, 2, 3, - 4, 5 K: -1 ( D+ C+ c- E- e+ K- ) 33

34 Phénotypage érythrocytaire RH-K1 Auto-anticoprs chauds Résolution 2: Autres méthodes Elution douce à 45 C Décrocher les auto-ac sans toucher à l intégrité de la membrane érythrocytaire Blocage par AGH Vérifier que le TCD est négatif, refaire le phénotypage par la même technique Techniques lourdes avec un résultat non garanti ( TCD demeure positif ) 34

35 Phénotypage érythrocytaire RH K1 Place des techniques moléculaires Connaissance des bases moléculaires du polymorphisme RHCE et KEL Développement des techniques de génotypage PCR-ASP, PCR en temps réel Déduction du phénotype Sans attente du délai de 45 jours après la dernière transfusion ou la rémission de l AHAI 35

36 Phénotypage érythrocytaire étendu Duffy-Kidd-MNS. 36

37 Phénotypage érythrocytaire étendu Définition Consiste à rechercher, à l aide de sérums tests appropriés la présence ou l absence à la surface des hématies du sujet testé des Ag autres qu ABO, RH D, C, c,e, e et K1 Les plus impliqués en transfusion Système Duffy : FY1 (Fya ) et FY2 (Fyb) Système Kidd : JK1 (Jka ) et JK2 (Jkb ) Système MNS : MNS3 (S) et MNS4 (s ) Autres Ag moins impliqués : Kpa, k, Lua, Lub, P1, Lea, Leb 37

38 Phénotypage érythrocytaire étendu Circonstances de réalisation Validation de l identification d un anticorps chez le receveur: confirmer le caractère allotypique (ex: anti-fya) Aide à l identification d un mélange complexe d anticorps chez le receveur: éliminer certains Ac dont le R est porteur de l Ag correspondant (ex: anti-c+jka+fyb+s) Nécessité de transfuser des CGRs phéno-identiques devant l impossibilité d identifier les allo-anticorps (ex: autoanticorps) 38

39 Phénotypage érythrocytaire étendu Indications Certains polytransfusés à titre préventif ( drépanocytaires ) Donneurs de sang : disposer de CGRs compatibles afin de transfuser les patients allo-immunisés Situation en Tunisie Chez les polytransfusés immunisés : ne transfuser que des CGRs phénotypés (éviter de transfuser des CGRs hétérozygotes ) Phénotypage ciblé des CGRs à la demande 39

40 Phénotypage érythrocytaire étendu Modalités de réalisation Réalisation du phénotypage étendu pour un Ag donné : utilisation de l anti-sérum correspondant Législation française : un phénotypage est valide et exploitable pour la transfusion si on possède deux résultats sur 2 prélèvements différents à raison d 1 détermination par prélèvement Situation en Tunisie : une seule détermination 40

41 Phénotypage érythrocytaire étendu Méthodes Quasi-exclusivement méthode d hémagglutination Tester les GR du patient ou du CGR ( suspension adéquate selon la technique à utiliser ) vis-à-vis du réactif approprié Méthode en fonction du réactif utilisé : monoclonaux IgM, polyclonaux ou monoclonaux IgG Technique enzymatique : non utilisée pour les antigènes Duffy et MNS Validation biologique : témoins négatifs et positifs hétérozygotes

42 Phénotypage érythrocytaire étendu Validation analytique 42

43 Phénotypage érythrocytaire étendu Validation analytique 43

44 Phénotypage érythrocytaire étendu Validation analytique Validation analytique repose sur : Résultats des CQI conformes Absence d ambiguïté réactionnelle avec chaque réactif L absence de double population Un profil réactionnel cohérent ( Exemple des Ag antithétiques) 44

45 Phénotypage érythrocytaire étendu Interprétation Discordance avec un ancien résultat Éliminer une erreur d affectation à l enregistrement Réaliser le phénotypage dans une autre technique L absence de 2 Ag antithétiques nécessite le recours à des explorations complémentaires sérologiques et/ou moléculaires 45

46 Phénotypage érythrocytaire étendu Difficultés GR sensibilisés par auto - Ac ou des allo-ac type IgG ( AHAI, MHNN, Incident transfusionnel ) Réaction positive (TCI/ T. Enzymatique) Même en l absence d anti-sérums spécifiques Déduction du phénotype : Impossible. 46

47 Phénotypage érythrocytaire étendu Difficultés 47

48 Phénotypage érythrocytaire étendu Difficultés Solutions? 48

49 Phénotypage érythrocytaire étendu Elution directe ( douce à la chaleur 45 C ) Décrocher les auto-ac et mettre à nu les Ag érythrocytaires S assurer de la négativation du TCD Refaire phénotypage 49

50 Elution directe Elution 45 C TCD positif TCD négatif 50

51 Phénotypage érythrocytaire étendu Traitement à la chloroquine Utilisé si le TCD est positif type IgG Dissocie les IgG des GR sans endommager l intégrité de la membrane érythrocytaire Incubation prolongée : hémolyse, perte ou affaiblissement de certains Ag Traitement Acide glycine/edta Valider par des Témoins: (+) et (-) ( altération de certains Ag ) 51

52 Phénotypage érythrocytaire étendu Blocage par AGH : Négativer le TCD des GR sensibilisés par des IgG Technique applicable si TCD positif type Ig G (± 2 + ) Utilise anticorps anti IgG ( AGH ) Mécanisme : Blocage des Ac type IgG Valider par la négativation du TCD Technique en salin si antisérums IgM disponibles 52

53 Phénotypage érythrocytaire étendu Techniques simples MAIS longues Pas chères applicables dans tous les Laboratoires Très bons résultats pour TCD positif avec des scores 1 + à 2 + Résolution: S, s, Fy a, Fy b, Jk a et Jk b. 53

54 Phénotypage érythrocytaire étendu Biologie moléculaire Connaissance des bases moléculaires du polymorphisme Développement des techniques de génotypage PCR-ASP, PCR en temps réel Déduction du phénotype 54

55 Conclusion 55

56 Conclusion Phénotypage érythrocytaire : hémagglutination Technicité simple Examen relativement complexe Plus que les Ag RH, Kell, six Ag des systèmes Duffy, kidd et MNS La gamme de réactifs disponibles ne couvre pas tous les Ag et le coût est élevé 56

57 Conclusion Maîtrise des outils immuno-hématologiques. Gérer les difficultés dues à: Antécédents transfusionnels récents ( dp ) Conduite transfusionnelle la plus adéquate Sensibilisation des hématies testées ( TCD positif ): Précautions techniques Génotypage = alternative au phénotypage 57

58 Merci pour votre attention! 58