ÉPIDÉMIOLOGIE ET DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DES CANDIDOSES MUQUEUSES ET CUTANÉO-PHANÉRIENNES

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1 ÉPIDÉMIOLOGIE ET DIAGNOSTIC BIOLOGIQUE DES CANDIDOSES MUQUEUSES ET CUTANÉO-PHANÉRIENNES Objectifs pédagogiques - Savoir que les levuroses des muqueuses, de la peau et des phanères en Europe sont dues essentiellement à des Levures du genre Candida (candidoses). - Connaître l'épidémiologie et la pathogénie des candidoses muqueuses, cutanées et phanériennes, notamment les espèces le plus fréquemment impliquées en pathologie humaine et les facteurs favorisant leur développement. - Savoir reconnaître, dans un contexte évocateur, les mycoses suivantes : candidoses des plis, onyxis candidosiques, candidoses oropharyngées, candidoses génitales. - Savoir ne pas hésiter à prescrire un examen mycologique pour affirmer l'origine candidosique d une lésion muqueuse, cutanée ou phanérienne et ainsi adapter le traitement. - Connaître les modalités des différentes techniques mises en œuvre dans le cadre du diagnostic biologique des candidoses des muqueuses, de la peau et des phanères (prélèvement, examen direct, cultures) et les délais de réponse. Savoir prescrire les examens de laboratoire appropriés et être capable d'en interpréter les résultats. - Dans le cadre du diagnostic biologique des candidoses muqueuses et cutanéo-phanériennes, reconnaître la prééminence de la mise en évidence, par l examen direct, du Champignon à l état «parasitaire». - Dans le cadre du diagnostic biologique des candidoses muqueuses et cutanéo-phanériennes, connaître les modalités d isolement et d identification des Champignons par culture mycologique. Plan de cours I - INTRODUCTION...2 I.1 - Levures du genre Candida et candidoses... 2 I.2 - Candidoses muqueuses et cutanéo-phanériennes... 3 I Candidoses buccales et digestives... 3 I Candidoses génitales... 3 I Candidoses cutanées et unguéales... 3 II - PRÉLÉVEMENTS...4 III - EXAMEN DIRECT...5 III.1 - Examen direct «à frais»... 5 III.2 - Examen direct après coloration... 5 IV - CULTURES...5 IV.1 - Isolement... 6 IV.2 - Identification... 6

2 I - INTRODUCTION Pour le clinicien, les buts du diagnostic biologique des candidoses muqueuses et cutanéophanériennes sont : - confirmer la mycose, ou, au contraire, sur la base d une réponse négative, réorienter le diagnostic ; - identifier la (ou les) Levure(s) incriminée(s) et adapter au mieux la thérapeutique ; - comprendre la pathogénie de la mycose et amoindrir (voire supprimer) les facteurs favorisant son développement. Dans ce cadre, la démarche mise en oeuvre par le laboratoire est influencée par : - la symptomatologie clinique ; - les facteurs épidémiologiques inhérents au patient ; - le «terrain» immunitaire sous-jacent. D une manière générale, le diagnostic biologique d'une mycose muqueuse ou cutanéophanérienne repose sur : - la mise en évidence du (ou des) Champignon(s) à l'état parasitaire par examen direct du produit biologique prélevé ; - l isolement et l identification de ce(s) Champignon(s) par cultures. L'évaluation de la sensibilité in vitro du Champignon à divers antifongiques («antifongigramme») est exceptionnellement justifiée et n a que très peu d intérêt en pratique courante. Ni la recherche d anticorps spécifiques, ni celle d'antigènes fongiques circulants ne sont justifiées dans le cadre du diagnostic des mycoses muqueuses et cutanéo-phanériennes. La biologie moléculaire (détection de Champignons dans le matériel biologique, identification spécifique ) reste encore actuellement du domaine de la recherche. L ordonnance prescrivant l examen mycologique d'une candidose muqueuse ou cutanéophanérienne sera donc rédigée ainsi : «Examen mycologique d une lésion de : prélèvement, examen direct et cultures (isolement et identification)». I.1 - Levures du genre Candida et candidoses Les Levures du genre Candida sont des Champignons saprobiontes, présents dans le Monde entier et dans tous les milieux (ubiquistes). Plus d'une centaine d'espèces a été décrite, chacune pouvant théoriquement être impliquée en pathologie humaine en cas de rupture de l'équilibre naturel entre Levure et défenses de l'organisme (pathogénicité par opportunité). L'espèce encore actuellement le plus souvent identifiée (70 à 80 %), Candida albicans, vit en endosaprobionte dans le tube digestif des Mammifères, et principalement dans l intestin grêle de l'homme. Sa prolifération (dont la cause première est à rechercher) peut être à l'origine d'une colonisation de proche en proche jusqu'à la bouche et à l'anus, d'atteintes cutanées et unguéales, d'infestations endogènes par passage à travers la muqueuse digestive (cf. candidoses profondes), mais également de contamination du milieu extérieur. La multiplication récente des terrains favorisant les candidoses se traduit par le maintien d'espèces classiquement reconnues en pathologie humaine (Ex : C. tropicalis, C. lusitaniae) et par l'émergence d'espèces saprobiontiques habituelles, soit des muqueuses et sélectionnées par les imidazolés auxquels elles sont peu sensibles (Ex : C. krusei, C. glabrata), soit de la peau, des fruits, légumes et céréales, ou des produits laitiers (Ex : C. guilliermondi, C. parapsilosis, C. kefyr). Les candidoses sont donc favorisées par des facteurs locaux et/ ou généraux. Les principaux déséquilibres cutanés et muqueux facilitant la prolifération locale des Candida sont : l'humidité et la macération (Ex : grands plis des obèses, port de bottes et de vêtements trop serrés), les microtraumatismes, micro plaies et irritations locales (Ex. : appareils dentaires), l'hyperacidité (buccale, vaginale), les contacts répétés avec les sucres,... Les facteurs généraux favorisant les candidoses sont ceux classiquement impliqués dans le déterminisme des mycoses (cf. Pathogénie des mycoses). Ainsi, les cancers et les hémopathies, la maladie de Hodgkin, la tuberculose, les polytraumatismes, les interventions chirurgicales lourdes, l'héroïnomanie, les endocrinopathies (en particulier le diabète), l'antibiothérapie au long cours, les traitements immunodépresseurs (corticoïdes, immunosuppresseurs prescrits lors des greffes d'organes et de moelle osseuse) et le SIDA, tiennent une place particulière dans la genèse des candidoses.

3 I.2 - Candidoses muqueuses et cutanéo-phanériennes I Candidoses buccales et digestives * Les stomatites aiguës candidosiques regroupent : - la stomatite pseudo-membraneuse, ou muguet buccal : enduit blanchâtre en plaques, recouvrant une muqueuse jugale érythémateuse, voire hémorragique; atteinte concomitante fréquente de la langue (glossite) et du palais (ouranite); - la stomatite érythémateuse, souvent après antibiothérapie : pas d'enduit blanchâtre, mais érythème intense, sensation de brûlure, glossite érythémateuse, lisse et vernissée, ouranite; - la stomatite des dentiers, ou "candidose des prothèses" : érythème intense, limité à la zone prothétique. * Les Candida peuvent coloniser et pérenniser certaines lésions de stomatites chroniques, sans pour cela devoir toujours être considérés comme responsables de la pathologie : leucoplasie buccale, glossite losangique médiane, langue noire villeuse,... * La chéilite candidosique se traduit par un gonflement des lèvres, recouvertes de squames sèches et de croûtelles. La chéilite angulaire, ou perlèche candidosique, est un intertrigo des commissures labiales : fissures érythémato-squameuses. * La colonisation de la muqueuse digestive par les Candida détermine divers tableaux cliniques : oesophagite (en particulier chez le sidéen; avec ensemencement broncho-pulmonaire), gastrite (notamment au cours des traitements antibiotiques), gastro-entérite (du nourrisson), cholécystite, entéro-colite, rectite (hémorragique), anite. I Candidoses génitales * La vulvo-vaginite candidosique est liée à un déséquilibre de la trophicité et/ou du ph de la muqueuse vaginale. Elle est favorisée en particulier par la grossesse, toutes les affections gynécologiques, la prise d'œstro-progestatifs et le diabète. Elle détermine prurit vulvaire et leucorrhées crémeuses. * La balano-posthite candidosique est une lésion inflammatoire du sillon balano-préputial, recouverte d'un enduit blanchâtre. * La dissémination ascendante de ces candidoses peut être à l'origine d'uréthrite et de prostatite, de cystite et d'annexites, parfois d'uretérite, voire d'atteintes rénales. I Candidoses cutanées et unguéales * Les intertrigos candidosiques sont des lésions des grands plis (axillaires, sous-mammaires, génito-cruraux,...) et des sillons interdigitaux, parfois interdigito-plantaires. La lésion est symétrique par rapport au pli, prurigineuse, érythémateuse et inflammatoire, humide et suintante, avec un dépôt blanchâtre au fond du pli. * L'onyxis candidosique atteint le plus souvent les ongles des mains, mais existe aux pieds. La lésion évolue depuis la partie proximale de l'ongle. La zone péri-unguéale est le siège d'un périonyxis, bourrelet inflammatoire et douloureux. * Les candidoses granulomateuses des sujets très immunodéprimés s'expriment par des granulomes de la face et du cuir chevelu, avec généralisation secondaire.

4 II - PRÉLÉVEMENTS De l'efficacité du geste de prélèvement et de la quantité du matériel biologique prélevé dépend le succès des étapes ultérieures du diagnostic mycologique. Les prélèvements doivent être effectués avant tout traitement antifongique par voie générale ou en application locale. Les précautions d'usage de stérilité visent, entre autres, à éviter la contamination du matériel biologique par les Bactéries, mais également par des Levures ou des Champignons filamenteux présents dans le milieu extérieur ou à l'état saprobiontique chez le patient : conditions optimales d'asepsie, stérilité du matériel de prélèvement et de recueil Le matériel stérile utilisé pour le prélèvement est fonction du type et de la localisation de la lésion et du produit biologique à recueillir : écouvillon humidifié au moyen d un peu de liquide physiologique stérile, curette de Brocq fenêtrée, scalpel mousse (c'est à dire non aiguisé) ou vaccinostyle, pinces à épiler, ciseaux fins, pinces et ciseaux à ongles, bistouri d'harouet (ou Punchbiopsy ), Les produits biologiques prélevés sont : * les mucosités (écouvillonnage de muqueuses) * le suintement des intertrigos (écouvillonnage) * les squames (scalpel mousse, curette de Brocq) * les fragments d'ongles (scalpel mousse, curette de Brocq) * le pus des péri-onyxis (écouvillonnage) * les fragments tissulaires (biopsies, pièces opératoires) Pour en savoir plus Les modalités du prélèvement dépendent de la lésion, de son siège, de son aspect. L'important est de récupérer, en chaque site prélevé, un maximum de matériel pour un examen direct abondant, des cultures efficaces, éventuellement un nouvel examen direct et de nouvelles cultures en cas de «doute». En pratique, suivant les différents types de lésions muqueuses ou cutanéo-phanériennes, il est souhaitable d'obtenir : - un écouvillonnage large de la muqueuse, d une lésion suintante d un pli ou d un péri-onyxis ; - une trentaine de squames (ou plus, si possible) prélevées, au-dessus d'une boîte de Petri, avec un scalpel mousse ou une curette ; - un maximum de fragments d'ongles. Lorsqu'il existe un péri-onyxis, le recueil au scalpel ou à la curette des squames du pourtour de l'ongle facilite l'issue de pus sous le bourrelet sus-unguéal, à prélever à l'écouvillon. Le conditionnement et le transport de ces produits biologiques se font en récipients stériles (tubes, flacons, petites boîtes de Petri, ) bien fermés. L ajout de quelques gouttes de liquide physiologique stérile à l écouvillon est conseillé pour éviter la dessiccation. Les fragments de tissus (biopsies, pièces opératoires) destinés à l'examen mycologique doivent être conditionnés dans du liquide physiologique stérile, sans fixateur, totalement séparés de ceux, fixés, destinés à l'anatomopathologiste. La longue survie à sec et à température ambiante des Champignons dans les squames et fragments d ongles permet leur envoi à distance sans risque de détérioration. Au laboratoire, le produit biologique ainsi prélevé sera partagé en deux parties sensiblement égales pour effectuer en parallèle examen direct et culture.

5 III - EXAMEN DIRECT Il s'agit, bien évidemment, de l'examen direct du matériel prélevé, et non de l'examen microscopique des produits de la culture! Dans le langage courant, cette évidence est pourtant loin d'en être une pour tout le monde... Cet examen direct, technique indispensable pour mettre en évidence le Champignon sous un «état parasitaire», apporte en quelques minutes la preuve formelle de la mycose. A elle seule, en effet, la positivité de l examen direct permet d impliquer un (ou plusieurs) Champignon(s) dans le processus pathologique en révélant, par exemple, la présence de Levures bourgeonnantes, éventuellement accompagnées de mycélium, sur les muqueuses, dans les squames, les fragments d ongles En cas de positivité de l examen direct, le diagnostic de mycose sera bien évidemment maintenu, même si les cultures restent ultérieurement négatives ou sont souillées par d'autres spores «contaminantes» présentes sur ou dans le matériel biologique prélevé. Deux modalités d examen direct peuvent être mises en œuvre : III.1 - Examen direct «à frais» L examen direct «à frais» se pratique directement sur les appositions sur lame d écouvillon (mucosités, suintements, pus, squames très fines, ), sans fixation ni coloration spécifique. Il est facilité par l utilisation d éclaircissants (notamment le lactophénol d'amann). Peuvent ainsi être mises en évidence des levures bourgeonnantes (blastospores) de Candida spp., éventuellement accompagnées de pseudo-mycélium. III.2 - Examen direct après coloration Une des principales colorations utilisées en mycologie, la coloration en rose «fuchsia» foncé selon la technique de Hotchkiss-MacManus (HMM), adaptée de la coloration P.A.S. (acide périodique, réactif de Schiff) des histo-pathologistes, est particulièrement indiquée pour mettre en évidence, entre autres, les Levures (blastospores et filaments) du genre Candida dans les squames et les fragments d ongle : blastospores ovales (3 à 7 µm), à paroi mince, bourgeonnantes, associées ou non à des filaments mycéliens. D'une manière générale, la signification pathologique de leur présence est fonction de leur abondance. Pour en savoir plus En présence d'acide periodique (du latin per : au-delà, et du grec iodês : violet [d où : iode] et non «périodique», du grec peri : autour de, et odos : chemin), les groupements hydroxyle des complexes polysaccharidiques des parois des cellules fongiques sont oxydés en aldéhydes. Agissant comme des réducteurs, les aldéhydes ainsi formés réagissent avec le réactif fuchsine-sulfureux de Schiff. IV - CULTURES Le but des cultures est le développement et l isolement de colonies qui, une fois dénombrées, permettront l'identification de la (ou des) Levure(s) impliquée(s).

6 IV.1 - Isolement L isolement se fait par ensemencements pratiqués de façon stérile, classiquement sur tubes de gélose glucosée (2 %) de Sabouraud, contenant des antibiotiques antibactériens et des vitamines. L'adjonction de cycloheximide (Actidione ) dans une partie des milieux permet d'inhiber la croissance d'éventuels Champignons contaminants (mais, attention! il inhibe également celle de certains Candida impliqués en pathologie humaine, par exemple C. glabrata) et d'utiliser la résistance ou la sensibilité du Champignon à ce produit comme critère d'identification. Les milieux ainsi ensemencés sont conservés au moins une semaine à 27 C (et à 37 C pour les produits biologiques d'origine profonde : biopsies, pièces opératoires). En cas de positivité, le développement en deux à quatre jours (parfois davantage, notamment quand le patient est déjà traité par antifongiques), de colonies blanchâtres, crémeuses, épaisses, luisantes suggèrera une (ou des) Levure(s). Les colonies sont dénombrées, habituellement de façon semi-quantitative (de «rares» à «très nombreuses»). Ces délais de croissance conditionnent, bien entendu, le délai de réponse définitive de la part du Laboratoire. Par ailleurs, la négativité des cultures (souvent du fait d applications antérieures d'antifongiques) n'infirme bien évidemment pas le diagnostic (en particulier quand l'examen direct est positif) et n'a aucune valeur de guérison d une mycose précédemment prouvée tant que l'examen direct reste positif. IV.2 - Identification La phase d'identification des Levures doit, désormais, impérativement tenir compte de l'éventualité de l'association de plusieurs espèces dans un même échantillon biologique. Pour en savoir plus Ces associations sont liées à la fois à l'augmentation constante du nombre de patients atteints de pathologies et/ou soumis à des traitements déterminant la prolifération des Levures, et à la prescription au long cours d'antifongiques favorisant des Levures naturellement peu sensibles à ces molécules (p. ex. Candida glabrata, C. krusei). Classiquement, la détection de ces associations passe par un repiquage sur milieu de Sabouraud contenant du triphényl-2,3,5-tétrazolium, substance que chaque espèce est plus ou moins apte à réduire en fournissant un composé coloré. Les colonies prenant des teintes différentes (du blanc au rouge violacé) doivent être considérées comme autant de souches d espèces différentes, qui seront repiquées et identifiées séparément. Récemment, la détection de ces associations a pu bénéficier de la mise au point de milieux contenant des chromogènes, teintant plus ou moins les colonies de couleurs particulières à certaines souches (sans pour autant permettre leur identification spécifique précise). L'identification de Candida albicans passe par la révélation d'au moins un des deux caractères suivants : formation de chlamydospores caractéristiques, 24 à 48 heures après repiquage en stries profondes (anaérobiose) sur des milieux pauvres en sucres et tensio-actifs (PCB = Pomme de terre - Carotte - Bile; RAT = Rice - Agar -Tween); filamentation en sérum ( = blastèse) à 37 C en quatre heures au maximum. L'identification spécifique des autres espèces de Candida nécessite l'étude de certaines propriétés physiologiques de la Levure, en particulier son aptitude (actuellement évaluée en «galeries» commercialisées) à assimiler divers sucres («auxanogramme») et à les fermenter («zymogramme»). L'identification spécifique par agglutination de particules inertes sensibilisées par des anticorps monoclonaux est en cours d'évaluation. Outre par sa mise en évidence à l état parasitaire par l examen direct, il est important d'évaluer l'implication réelle dans la pathologie d'une Levure isolée d'un échantillon biologique par le

7 nombre de colonies développées en culture et par son isolement à plusieurs reprises dans le même type de matériel biologique. Cette phase d isolement et d identification de la (des) Levure(s) dure au minimum trois jours et peut demander une semaine. * * * L essentiel Candidoses buccales (stomatites aiguës et chroniques, chéilite, perlèche) et digestives, génitales (vulvo-vaginite, balano-posthite), cutanées (intertrigos) et unguéales (onyxis avec péri-onyxis) Modalités de prélèvement adaptées Examen direct «à frais» et/ou après coloration (Hotchkiss-MacManus) : blastospores éventuellement accompagnées de pseudo-mycélium. Pose de manière formelle le diagnostic de candidose, quel que soit le résultat ultérieur des cultures Cultures mycologiques : isolement et dénombrement des colonies, identification de la (ou des) Levure(s), détection d associations de Levures Candida albicans, C. glabrata, C. krusei, C. tropicalis,

8 Copyright : Laboratoire de Parasitologie-Mycologie, Faculté de Médecine de Montpellier-Nîmes.