Ecole Centrale Paris Année ère année. Cours «Biologie». Vendredi 28 mai 2010
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- Simon Bernier
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1 Ecole Centrale Paris Année ère année. Cours «Biologie». Vendredi 28 mai 2010 Contrôle des Connaissances. 2 ème session) (Durée : 1h30, tous documents autorisés, ordinateur interdit) Important : il est demandé aux élèves d apporter un soin particulier à leur copie : l orthographe et la présentation des réponses pourront être prises en compte dans la note finale. Certaines bactéries ont développé avec le temps des stratégies variées pour résister aux antibactériens. C est notamment ce que l on constate avec l émergence de nombreuses souches bactériennes résistantes aux antibiotiques. L une des stratégies de ces bactéries consiste à exprimer à leur membrane plasmique des protéines, appelées transporteurs d efflux multispécifiques, réalisant le transport vers le milieu extracellulaire d une grande variété de molécules «toxiques». Bacillus subtilis est une bactérie non pathogène pour l homme qui est un excellent modèle pour l'étude d autres bactéries qui sont responsables de pathologies diverses (Staphylococcus aureus, Bacillus anthracis ) ou à l'origine d'infections alimentaires (Listeria monocytogenes). La protéine membranaire BmrA de Bacillus subtilis, et ses homologues chez les bactéries pathogènes citées plus haut, font partie de ces transporteurs d efflux qui confèrent la résistance à certains antibactériens. La mise au point et le développement de nouveaux antibactériens, potentiellement non transportés par ces protéines, passent tout d abord par la compréhension de la fonction et de la structure de ces protéines. 1. Donnez la différence majeure qui existe entre une cellule eucaryote et une cellule procaryote. La cellule eucaryote possède un noyau individualisé, délimité par l enveloppe nucléaire, dans lequel on trouve le matériel génétique de la cellule. En revanche, chez les procaryotes, ce matériel génétique est présent sous la forme d un unique chromosome, directement dans le cytosol. Il n y a pas de compartimentation. 2. Donnez le nom scientifique (genre et espèce) d un organisme procaryote couramment utilisé au laboratoire comme hôte d expression. Donnez également le nom scientifique (genre et espèce) d un organisme eucaryote unicellulaire couramment utilisé au laboratoire ou dans l industrie. Les réponses faisant référence aux organismes déjà cités dans l énoncé ne seront pas prises en compte. Escherichia coli (procaryote), Saccharomyces cerevisiae (eucaryote). On souhaite tout d abord procéder à l amplification du gène codant BmrA dans le génome de B. subtilis, dont le séquençage complet a été réalisé en 1997 et est disponible dans les bases de données de biologie. A partir de ces données, on définit un couple d oligonucléotides permettant d initier la réaction de PCR pour amplifier le gène de BmrA. 3. Rappelez le principe et les principales étapes de l amplification d un fragment d ADN par PCR. Faites un schéma si vous l estimez nécessaire. Quel est le nom donné aux deux oligonucléotides définis plus haut? Quel est leur rôle dans la PCR? Quel est le rôle et la particularité de la Taq polymérase? Schéma dans le cours. Etapes de 1/4
2 dénaturation, d hybridation des amorces et de polymérisation (ou élongation). Les amorces permettent le début de la polymérisation par l ADN polymérase et «encadrent» la région à amplifier. La Taq polymérase est une ADN polymérase thermophile et résistant aux températures élevées utilises lors des cycles de la PCR. 4. A quoi correspond la température de fusion T m? Faites-en une estimation pour l oligonucléotide suivant : 5 -ATCGGGCTAGCTAATTAGTA-3 (on pourra utiliser la formule empirique suivante : T m ( C) = 4 (GC) + 2 (AT) ). Ecrivez la séquence de l oligonucléotide complémentaire en en précisant les extrémités. La température de fusion est la température à laquelle 50 % des liaisons hydrogène des paires complémentaires de deux brins d ADN complémentaires sont établies. AT = 12 et GC = 8 donc T m = 56 C. L oligonucléotide complémentaire est : 3 - TAGCCCGATCGATTAATCAT-5. Afin d isoler la protéine BmrA pour étudier sa structure et sa fonction, on choisit de produire cette protéine sous la forme d une protéine recombinante dans l organisme procaryote indiqué en réponse à la question 2). Pour cela, on réalise tout d abord le clonage du gène codant BmrA dans le vecteur d expression dont la carte est donnée ci-contre. 5. Définir précisément la nature et le rôle des quatre parties du vecteur indiquées par les flèches dans la figure ci-dessus. Citer un «gène de résistance» fréquemment utilisé en biologie moléculaire. Site multiple de clonage : région d ADN contenant un grand nombre de sites de restriction propices au clonage du gène d intérêt. Promoteur : séquence permettant l activation de la transcription du gène placé en aval, contenant notamment les sites de fixation du complexe ARN polymérase. Ori : origine de réplication permettant la fixation de l ADN polymérase de E. coli et la réplication autonome du vecteur in vivo. Gène de résistance : gène induisant la résistance à un agent de sélection placé dans le milieu de culture comme un antibiotique. Le gène peut par exemple coder une enzyme dégradant l antibiotique en question : Amp R code pour une protéine qui dégrade l ampicilline. 6. A partir des informations figurant dans les deux portions de cartes de restriction cidessous (vecteur d expression «vide» et ADN amplifié), indiquez le nom de l enzyme (des enzymes) de restriction qui peut (peuvent) être utilisé(es) pour cloner le gène de BmrA. Justifiez votre réponse en précisant le rôle précis de cette (ces) enzyme(s) dans le processus de clonage du gène BmrA. Le site EcoRI est le seul qui permet le clonage du gène BmrA : ouverture du vecteur dans MCS par l enzyme EcoRI et présence de sites EcoRI de part et d autre de la séquence codant BmrA. 2/4
3 7. Combien de plasmides recombinants différents peut-on obtenir après recombinaison du vecteur initial et du fragment d ADNc préparé après action de l enzyme (des enzymes) de restriction définie(s) à la question 6)? Le cas échéant, indiquez le plasmide permettant l expression correcte du gène BmrA. Deux suivant les orientations relatives du fragment contenant le gène BmrA et du plasmide lors de la recombinaison. Seul le plasmide recombinant contenant le gène BmrA orienté 5 3 en aval du promoteur permettra l expression de BmrA. 8. Qu est ce qu une ADN ligase? Quel est son rôle en biotechnologie? Enzyme catalysant la formation de la liaison phosphodiester entre la fonction 3 -OH du désoxyribose d un nucléotide avec le 5 -phosphate du nucléotide consécutif dans un brin d ADN (elle catalyse la ligation entre deux nucléotides successifs dans un brin d ADN et permet la construction d ADN recombinant). 9. Donner le nom et le principe d une technique de biotechnologie utilisée pour faire «entrer» un plasmide dans une bactérie. Transformation bactérienne : soit chimique en utilisant un choc thermique et le phosphate de Ca 2+ (précipitation des ADN), soit électroporation. Après application de la technique indiquée à la question 9) pour le (les) plasmide(s) recombinant(s) de la question 7), on récupère de nombreux clones bactériens sur un milieu de culture permettant la sélection des bactéries compétentes. Neuf de ces clones sont choisis, à partir desquels on extrait les ADN plasmidiques. On utilise l enzyme de restriction SacI pour vérifier les ADN plasmidiques purifiés. Le produit de l action de SacI sur les 9 ADN plasmidiques est analysé par électrophorèse sur gel d agarose. Les 9 profils d électrophorèse sont indiqués ci-dessous, avec celui d un mélange de marqueurs de poids moléculaires (PM). 10. Sachant que la longueur du vecteur d expression «vide» est l 1 = 5 kb et que la séquence clonée de BmrA a une longueur l 2 = 1,8 kb, donnez (a) le nombre de fragments de restriction attendus après action de SacI sur l ADN plasmidique des bactéries compétentes et (b) une estimation de la longueur de chacun d eux. 2 fragments. Longueur totale de l ADN recombinant : 5 + 1,8 = 6,8 kb. Recombinaison avec orientation correcte : 0,5 kb et 6,3 kb. Recombinaison avec orientation opposée : 1,3 kb et 5,5 kb. 3/4
4 11. Pourquoi les fragments d ADN migrentils vers l anode du dispositif d électrophorèse? Les groupes phosphate apportent de nombreuses charges négatives à l ADN qui est une molécule fortement chargée négativement. 12. Que pouvez-vous dire du clone n 7? Quelle peut en être la raison? Découpé en trois fragments par SacI : mutation introduite lors des étapes de PCR/clonage ou recombinaison multiple ayant conduit à l apparition d un autre site SacI. 13. A partir des résultats de l électrophorèse, quel clone suggérez-vous de choisir pour produire la protéine BmrA par surexpression? Les clones 1, 2, 4 et 9 sont OK. PM = Poids Moléculaire Le clone sélectionné est mis en culture dans les conditions propices à l expression de la protéine recombinante. Afin de vérifier l expression, on lyse les bactéries et on dépose les extraits brut de protéine sur un gel d électrophorèse SDS-PAGE. 14. Rappeler le principe de l électrophorèse SDS-PAGE. Afin d illustrer votre définition, vous ferez un schéma et indiquerez les légendes suivantes : anode, cathode, sens de migration, gel, puits, marqueur de poids moléculaire. Vous pouvez bien entendu ajouter d autres légendes si vous le jugez nécessaire. Schéma correct avec les légendes proposées et les mots Sodium Dodécyle Sulfate (détergent), charge globale négative, masse moléculaire, dénaturation. 15. La protéine BmrA a une longueur de 589 acides aminés. En comparant les profils d électrophorèse de fractions protéiques obtenus pour le clone choisi à la question 13) et pour une bactérie ne possédant pas le plasmide, on constate, dans le premier, la présence d une bande intense à environ 70 kda. Est-ce le résultat attendu? Justifiez. 589*110 Da = Da (masse réelle calculée : Da). Etant donné la précision de la technique, on peut dire que tout va bien. On envisage de purifier la protéine exprimée en utilisant deux techniques chromatographiques successives : une chromatographie échangeuse d ions suivie d une chromatographie d exclusion stérique ou tamis moléculaire (filtration sur gel). 16. Le phi de la protéine est égal à 4,3. Sachant que la plupart des protéines bactériennes ont un 6,5 < phi < 8,0, vous choisissez de travailler avec une résine échangeuse d anions avec le ph initial, ph = 5,5. Justifiez ce choix. Vous pourrez éventuellement faire un schéma pour appuyer votre démonstration. Etant donné les phi, à ph = 5,5, la plupart des protéines de la bactérie seront plutôt chargées positivement alors que BmrA sera négative. BmrA sera retenue sur la colonne alors que les autres protéines seront éluées au ph initial. 17. Rappelez le principe de la chromatographie d exclusion stérique (filtration sur gel). Les protéines sont séparées en fonction de leur taille (volume dans l espace plus 4/4
5 exactement). Les petites protéines interagissent avec les aspérités de la phase stationnaire de ce type de colonne alors que les plus volumineuses en sont exclues. On obtient donc un profil d élution avec les plus grandes masses en début d élution et les plus petites à la fin. 18. A l issue de cette seconde étape de purification, on observe un pic majoritaire correspondant à une masse de 130 +/- 4 kda. Pouvez-vous proposer une explication pouvant justifier la différence de masse avec le résultat au 15)? La masse observée ici est double de celle calculée à la question 15. BmrA est donc éluée sous forme d un dimère. 19. Quel est le nom de la représentation suivante de la protéine BmrA, décrite dans la base de données Protein Data Bank? Indiquez le nom du résidu situé à l extrémité N-terminale. Pouviez-vous prévoir ce résultat? Pourquoi? Indiquez l état d ionisation de cette extrémité à ph = phi. C est la structure primaire encore appelée séquence polypeptidique. Il s agit de la méthionine (Met) qui est toujours à l extrémité N- terminale des protéines bactériennes car elle est codée par le codon START ATG. A ph = phi, l extrémité est NH /4
6 1 MPTKKQKSKS KLKPFFALVR RTNPSYGKLA FALALSVVTT LVSLLIPLLT KQLVDGFSMS 61 NLSGTQIGLI ALVFFVQAGL SAYATYALNY NGQKIISGLR ELLWKKLIKL PVSYFDTNAS 121 GETVSRVTND TMVVKELITT HISGFITGII SVIGSLTILF IMNWKLTLLV LVVVPLAALI 181 LVPIGRKMFS ISRETQDETA RFTGLLNQIL PEIRLVKASN AEDVEYGRGK MGISSLFKLG 241 VREAKVQSLV GPLISLVLMA ALVAVIGYGG MQVSSGELTA GALVAFILYL FQIIMPMGQI 301 TTFFTQLQKS IGATERMIEI LAEEEEDTVT GKQIENAHLP IQLDRVSFGY KPDQLILKEV 361 SAVIEAGKVT AIVGPSGGGK TTLFKLLERF YSPTAGTIRL GDEPVDTYSL ESWREHIGYV 421 SQESPLMSGT IRENICYGLE RDVTDAEIEK AAEMAYALNF IKELPNQFDT EVGERGIMLS 481 GGQRQRIAIA RALLRNPSIL MLDEATSSLD SQSEKSVQQA LEVLMEGRTT IVIAHRLSTV 541 VDADQLLFVE KGEITGRGTH HELMASHGLY RDFAEQQLKM NADLENKAG 20. Donnez les structures secondaires susceptibles d être rencontrées dans la protéine BmrA. Illustrez-les à l aide d un schéma dans lequel vous indiquerez soigneusement les liaisons chimiques importantes pour ces structures. Cours : Hélices-α, brins et feuillets-β, tours et coudes, toutes structures stabilisées uniquement par des liaisons hydrogènes entre les motifs peptidiques C=O et N-H. 21. A quel niveau de structure correspond le résultat obtenu à la question 18)? Structure quaternaire. La protéine ainsi purifiée peut être utilisée pour les études structurales. En parallèle, on souhaite tester le rôle éventuel de BmrA dans la résistance des bactéries à une collection de molécules chimiques développées comme antibactériens. 22. Sachant qu il existe des souches de bactéries dépourvues de BmrA ou d homologues de BmrA, proposez un protocole qui permettrait à un laboratoire pharmaceutique désirant développer ces antibactériens de réaliser un tel crible (3-5 lignes). On peut transformer l une de ces souches bactériennes qui ne comportent pas BmrA avec le plasmide construit et comparer la croissance de ces bactéries transformées avec celle de bactéries ne possédant pas la protéine du tout. Les bactéries seront testées dans/sur des milieux contenant les molécules à tester et leur croissance comparée à celle observée sur un milieu sans ces molécules. 6/4
CHAPITRE 3 LA SYNTHESE DES PROTEINES
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