Dosage du THC urinaire et de ses métabolites : indicateur de reconsommation

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1 O COOH OH Centre Universitaire Romand de Médecine Légale Unité de Toxicologie et de Chimie Forensiques Site de Lausanne Travail de diplôme Mars 2014 Dosage du THC urinaire et de ses métabolites : indicateur de reconsommation Travail réalisé au Centre Universitaire Romand de Médecine Légale (CURML) Unité de Toxicologie et Chimie Forensiques (UTCF) Par Vincent SCHOUWEY, 53 ème TAB ESSanté Lausanne Sous la supervision de Vincent VARLET et Catherine MEYLAN

2 Sommaire «Nous sommes des millions, pour ta légalisation, ce que nous voulons : le droit à l auto production, de la cave au balcon et en toute saison! De la weed, de la beuh, de la ganja! L état nous prend pour des cons prenons-les pour ce qu ils sont : des empêcheurs de fumer en rond! Nous sommes des millions, et nous voulons quoi? La légalisation! De la weed, de la beuh et de la ganja!» Black Bomb A Mary Il s agit là du genre de propos qu il est fréquent d entendre au sujet du cannabis, bien qu en Suisse, la conduite sous son influence est illégale et punissable. La sanction pouvant aller d une simple amende à un retrait de permis à durée indéterminée. Lorsque qu un conducteur est se voit retirer son permis, l Unité de Médecine et Psychologie du Trafic (UMPT) est mandatée pour l évaluation des habitudes de consommation de l usager contrevenant. Ainsi, le consommateur doit s abstenir de consommer du cannabis pendant une période de 3 semaines. Lors de ces 3 semaines, un prélèvement urinaire va être effectué chaque lundi afin d en doser la concentration en THCCOOH. A l heure actuelle, les cas sont interprétés en fonction de leur concentration en THCCOOH, qui est le métabolite du THC en plus grande concentration dans l urine. Pour se faire, ce métabolite doit être hydrolysé, extrait, dérivé, puis analysé par GCMS. Ce travail aura pour but, dans un premier temps, de définir quelle est la meilleure méthode pour déglucuronider le THC et ses métabolites, l hydrolyse enzymatique, chimique ou combinée (chimique + enzymatique). Lorsque celle-ci aura été sélectionnée nous allons la mettre en pratique sur des cas réels. Afin de mettre en évidence une reconsommation les de la période d abstinence. Pour finir, nous comparerons 2 molécules anomères de THCCOOH-gluconique, afin d observer une variation au niveau des résultats avec les trois hydrolyses. Travail de diplôme Mars

3 Abstract «Nous sommes des millions, pour ta légalisation, ce que nous voulons : le droit à l auto production, de la cave au balcon et en toute saison! De la weed, de la beuh, de la ganja! L état nous prend pour des cons prenons-les pour ce qu ils sont : des empêcheurs de fumer en rond! Nous sommes des millions, et nous voulons quoi? La légalisation! De la weed, de la beuh et de la ganja!» Black Bomb A Mary This quote is frequently heard about cannabis. In Switzerland, driving under its influence is illegal and punishable. Sanction can be a simple fine but also withdrawal of a driver s license of indeterminate duration. When a driver gets his driver s license revoked, the Traffic Medicine and Psychology Unit (UMPT) is mandated to evaluate his consummation habits. So, the consumer mustn t smoke cannabis for a period of 3 weeks. During these 3 weeks, his urine will be collected each Monday to measure the THCCOOH concentration. Nowadays, cases are interpreted in terms of concentration of THCCOOH, which is the THC metabolite in bigger concentration in urine. This metabolite must be hydrolysed, extracted, derivate, then analysed by GCMS. The first objective of this work is, to define which method to deglucuronidate the THC and its metabolites is the best, enzymatic hydrolyse, chemical or combined (chemical + enzymatic). When it will have been selected, we will practice on real cases. In conclusion, we will compare 2 THCCOOH-glucuronide anomere molecules, to observe a variation between the three hydrolyses results. Travail de diplôme Mars

4 Table des matières Sommaire... 2 Abstract Introduction Le cannabis Historique Les cannabinoïdes D une plante textile à la drogue Pharmacocinétique L absorption Distribution Métabolisme Elimination Pharmacodynamique Les effets du cannabis sur l organisme Conduite sous influence du cannabis Loi Suisse Contrôles d abstinence au cannabis Buts Méthode L hydrolyse, l extraction et dérivatisation Principe de dosage par GCMS Matériel Matériel biologique GC-MS Standards et solutions Calibreurs et contrôles Choix du protocole Hydrolyse enzymatique Hydrolyse chimique Hydrolyse combinée enzymatique et chimique Travail de diplôme Mars

5 5.4. Résultat Discussion Mise en pratique du protocole Interprétation des résultats Interprétation des patients Discussion Test d une nouvelle ampoule glucuronique Pratique Résultats Hydrolyse enzymatique Hydrolyse chimique Hydrolyse combinée Discussion Conclusion Conclusion personnelle Bibliographie Annexes Lexique Travail de diplôme Mars

6 1. Introduction Ce travail a été réalisé au laboratoire de Toxicologie et de Chimie Forensiques du Centre Universitaire Romand de Médecine Légale. Ce laboratoire travaille en collaboration avec la police, le Service des Automobiles et de la Navigation vaudois (SAN), ainsi que d autres centres de médecine légale (Tessin et Valais). Différentes analyses y sont effectuées comme le dosage de l alcool dans le sang pour les contrôles routiers ainsi que les accidents de la route, la recherche de différents xénobiotiques en cas de décès, en passant par les dépistages et dosages des stupéfiants pour les usagers de la route ayant pris le volant sous leur influence, les cas d agression sexuelle, de bagarre et de tentative de meurtre. Pour les personnes, conduisant sous l emprise de stupéfiant, ayant été interpellées par la police lors d un contrôle routier ou d un accident, un dépistage et un dosage vont être effectués afin de déterminer la présence ou non de substances psychotropes ayant pu influencer leur conduite. Une des mesures dictées par le SAN impose la vérification de l abstinence du conducteur contrevenant aux différentes classes de stupéfiants et ce, sur trois semaines minimum (test dit des trois lundis). Les urines collectées lors des 3 lundi servent à mettre en évidence, sur 3 semaines consécutives, une non-accoutumance du conducteur au cannabis. Lors de ces analyses, le tétrahydrocannabinol (THC) et ses métabolites sont mis en évidence par un test immunologique. Si, lors de ce test, les 3 urines sont négatives, l expertise de l UMPT sera favorable à la restitution du permis. En revanche si l une de ces urines possède une concentration en carboxytétrahydrocannabinol (THCCOOH) supérieure au seuil minimal de détection (50 ng/ml), celle-ci sera considérée comme positive, dans ce cas l expertise de l UMPT sera défavorable. L unité de médecine et psychologie du trafic (UMPT) L unité de médecine et psychologie du trafic est chargée d évaluer l aptitude à la conduite de personnes souffrant de problèmes de santé (maladie dégénérative ou problème psychologique) ou de dépendances à la drogue, aux médicaments et/ou à l alcool. Un des buts de l UMPT est de vérifier, pour chaque individu (sur demande du Service des Automobiles et de la Navigation) son aptitude à la conduite. Dans le cadre d une suspicion de dépendance (alcool, drogues et/ou médicaments), des échantillons seront prélevés afin d être analysés au laboratoire de toxicologie et chimie forensique du Centre Universitaire Romand de Médecine Légale Le cannabis Le cannabis est une plante originaire d Asie. Autrefois utilisé pour ses propriétés textiles et dans certains rituels religieux, le cannabis (Cannabis Sativa) a su, au fil des siècles conquérir le monde entier. [1] Travail de diplôme Mars

7 Historique L histoire du cannabis débute en Extrême et Moyen-Orient. A cette, époque le chanvre était cultivé pour ses fibres qui entrèrent dans la fabrication d habits, de cordages et de papiers. Sa résine, quant à elle, était utilisée pour soigner les douleurs et les troubles du sommeil. C est au 19 ème siècle que le cannabis fait son entrée en Europe notamment grâce à certains médecins anglais de retour d Inde, mais également par à Napoléon et ses hommes. Ils avaient trouvé dans le cannabis des vertus thérapeutiques et c est ainsi que sa culture débuta en Europe. De nos jours le cannabis a su se trouver une nouvelle utilité au sein des Hommes, qui ne l utilisent plus pour la fabrication d habits ou de cordes mais plutôt pour ses effets psychotropes, dus au THC qu il contient (Δ-9-tétrahydrocannabinol). [1] Les cannabinoïdes Les cannabinoïdes sont les diverses substances chimiques qui composent le cannabis. De nos jours, nous comptabilisons environ une soixantaine de cannabinoïdes identifiés, sans compter les cannabinoïdes de synthèse. L Homme a longtemps ignoré la composition du cannabis, il faudra attendre le 20 ème siècle pour que les premiers cannabinoïdes soient mis en évidence. Il faudra tout de même attendre 1964 avant que l un des cannabinoïdes les plus importants et responsable des effets psychotropes sur les consommateurs, le Δ- 9-tétrahydrocannabinol (THC), soit mis en évidence. Après transformation, celui-ci donne 2 métabolites le 11-OH-THC (11-OH-Δ9-tétrahydrocannabinol) ayant des effets psychotropes et le THC-COOH (11-nor-9- carboxy-thc) qui ne possède pas d effets psychotropes. [2][3] C est l acide cannabigérolique qui est le précurseur des différents cannabinoïdes présents dans une plante. En effet, suite à diverses biotransformations de l acide cannabigérolique, la plante va synthétiser différents cannabinoïdes comme, par exemple, l acide tétrahydrocannabinolique qui, par la suite, donnera naissance au THC. Le cannabidiol (CBD) est également un des cannabinoïdes présent dans le cannabis. Celui-ci ne possède pas d effet psychoactif sur le consommateur, mais révèle des effets anti-inflammatoires, analgésiques et la capacité de diminuer l anxiété. Travail de diplôme Mars

8 D une plante textile à la drogue Comme mentionné ci-dessus, le cannabis était utilisé pour ses fibres. Ce n est qu en 1961, avec la réédition de la convention unique sur les stupéfiants, qui citait déjà l opium et la cocaïne, que le cannabis et ses dérivés furent considérés comme une drogue. La convention unique sur les stupéfiants regroupe diverses substances connues pour leurs effets psychotropes. Le but de celle-ci est de limiter la production, la vente ainsi que la possession et la consommation de drogue, sauf dans un cadre médical. La Suisse fait partie de cette convention. Elle la signa en 1970 et le règlement fut mis en vigueur dans le pays la même année. [3] 1.2. Pharmacocinétique Le cannabis est le plus fréquemment consommé sous forme de cigarette de cannabis (consommation par inhalation), mais il peut également être consommé par voie orale (sous forme d huile) en étant ajouté à différentes boissons ou aliments. Le cannabis peut être consommé par inhalation sous 2 formes : la marijuana correspondant aux fleurs (femelles non fertilisées) séchées de la plante et le haschich fabriqué à partir de la résine de cannabis ou le pollen. Différents modes d administration ont fait l objet de recherche ou sont en cours. En raison de sa grande lipophilie, il est difficile d en préparer une solution aqueuse pour réaliser une injection. Parmi ces méthodes figurent : des gouttes pour les yeux (solution huileuse). Les recherches concernant ce mode d administration a mis en évidence une biodisponibilité de 6-40%. D autres essais ont été effectués par voie dermale. Celle-ci utilise un isomère du Δ 9 -THC, le Δ 8 -THC qui est plus stable. Cette méthode a permis de démontrer la capacité du THC à pénétrer la peau lorsque celui-ci est mélangée au propylène glycol. [4] L absorption Lors de l inhalation de la fumée d une cigarette de cannabis, le THC présent dans celle-ci va être transporté du joint au sang grâce au système respiratoire. Après inhalation, lorsque la fumée se trouve dans les poumons, le THC va pouvoir passer dans le sang grâce aux échanges gazeux comme pour l oxygène et le dioxyde de carbone. Il peut être détecté dans le sang entre 3 et 10 min après la première inhalation. Par la suite la concentration sanguine en THC va fortement diminuer, en raison de la forte lipophilie de celui-ci. Travail de diplôme Mars

9 Lors de l inhalation, divers paramètres vont influencer la concentration en THC dans le plasma. Ainsi la biodisponibilité de celui-ci varie en fonction de la durée de l inhalation (temps durant lequel la fumée se trouve dans les poumons) et de la profondeur de l inhalation (plus la fumée se rapproche des alvéoles plus la quantité en THC va augmenter). Lors de l administration par voie orale, le cannabis est mélangé à la préparation sous forme d huile ou de beurre. Après ingestion le THC présent dans l estomac va être dégradé. Mais en raison du faible ph de l acide gastrique le Δ 9 -THC se transforme en une molécule isomère le Δ 8 -THC. Par la suite le THC va être lentement absorbé par l intestin puis va être métabolisé par le foie comme lors de l inhalation. [4] [6] Distribution Le THC inhalé va rapidement pénétrer dans le système vasculaire via les alvéoles pulmonaires. Une fois celui-ci dans le sang, il va vite se lier aux protéines plasmatiques qui vont lui permettre de se diffuser dans tout l organisme (foie, cœur, poumons..). Ce phénomène explique la rapide décroissance de la concentration en THC dans le sang. En effet le THC étant une molécule très lipophile, celle-ci va pouvoir rapidement quitter la circulation sanguine pour atteindre les organes comme le cerveau ainsi que les tissus graisseux, grâce à sa forte lipophilie. Le THC emmagasiné par ceux-ci va être libéré dans tout l organisme au fil du temps. C est pourquoi la demi-vie de celui-ci varie en fonction du sexe ainsi que du poids de chaque individu. [5] [6] Métabolisme Le THC est métabolisé dans le foie grâce à la succession d une hydroxylation (ajout d un groupe fonctionnel hydroxy (-OH)) et d une carboxylation (ajout d un groupe fonctionnel carboxyle (-COOH)). D autres organes sont également capables de métaboliser le THC comme, par exemple, le cœur et les poumons, mais ceux-ci le font en moins grande quantité que le foie. Lors de sa métabolisation c est le carbone 11 ((R-CH3) R correspondant à la molécule de THC) du THC (Δ-9-tétrahydrocannabinol) qui va être hydrolysé en R-CH 2 OH. C est ainsi que nous obtenons le 11-OH- THC métabolite psychoactif. Par la suite celui-ci va subir un carboxylation et ainsi nous obtenons le 11- nor-carboxy-thc (R-COOH), métabolite non psychoactif. Ensuite, le THC-COOH sera glucuronidé, lors de cette étape un acide osidique (acide glucuronique) va venir se lier au groupement carboxyle du THCCOOH. Cet étape a pour but de rendre le composé plus soluble en milieux aqueux afin d en faciliter l excrétion par les reins. [4] [5] Travail de diplôme Mars

10 Fig. 2 : Métabolisation du THC en THCCOOH Elimination Le THC est totalement éliminé de l organisme après quelques semaines sous forme de métabolites acides. La durée d élimination du THC et de ses métabolites est cependant variable en fonction de la consommation (régulière ou occasionnelle). L élimination du THC demande beaucoup de temps, car en raison de sa grande affinité pour les tissus graisseux, celui-ci va s y stocker et être lentement libéré dans l organisme. C est pourquoi, il est possible de retrouver du THCCOOH dans l urine même après une ou deux semaines d abstinence. Le THC est éliminé par l urine, mais la plus grande concentration se retrouve dans les selles contrairement au THCCOOH qui se retrouve principalement dans l urine mais aussi dans le sang. La demi-vie du THC et de ses métabolites est estimée entre 1 et 3 jours. [5] 1.3. Pharmacodynamique A l heure actuelle, la pharmacodynamique du cannabis cible, deux récepteurs: les récepteurs CB1 et CB2. Le CB1 est le siège des effets psychoactifs du cannabis. En effet, lors de la consommation de marijuana, le THC va principalement être actif sur ce récepteur. Le CB1 se trouve principalement à la surface des neurones du système nerveux central et périphérique. Il est également présent sur d autres organes comme la rate ou encore le cœur, mais en quantité moins importante. En raison de sa forte localisation au niveau du système nerveux, le CB1, lors de la fixation du THC sur celui-ci, est principalement responsable des effets sur le système locomoteur et sur la mémoire. Le CB2, quant à lui, se situe au niveau des leucocytes et de la rate. Son action se porte principalement sur le système immunitaire. De ce fait, il fait l objet de recherches à but thérapeutique sur les effets analgésiques, anti-inflammatoires et antinéoplasiques, que celui-ci génère lorsqu il est en présence de cannabinoïdes. Le but de ces recherches est de synthétiser des cannabinoïdes ayant une plus grande affinité pour le CB2 que pour le CB1. [5] Travail de diplôme Mars

11 1.4. Les effets du cannabis sur l organisme En plus du fait de posséder des effets psychotropes, le cannabis exerce une multitude d effets secondaires sur notre organisme. Ces effets sont variables d un individu à l autre et peuvent être influencés par l état physique et psychique de celui-ci lors de la consommation. Ces effets peuvent également varier en fonction du mode de consommation ainsi que de la quantité de THC ingérée. Notons que les effets les plus couramment rencontrés sont, une rougeur oculaire ainsi qu une sécheresse buccale. Mais d autres effets peuvent être observés, comme ceux présent dans la liste (non exhaustive) ci-dessous : Système nerveux : relaxation musculaire, effet analgésique et perte de mémoire à court terme. Performances psychomotrices : ralentissement des réflexes, diminution de la capacité de coordination. Perception et état psychique : euphorie, augmentation de la perception sensorielle, anxiété. Bien entendu, il existe encore un grand nombre d effets produits par le cannabis sur notre organisme, mais tous ces effets générés lors de la consommation de cannabis varient d un consommateur à l autre Conduite sous influence du cannabis La consommation de cannabis a pour effet de provoquer des endormissements, ainsi qu une baisse des réflexes. C est pourquoi, elle n est pas compatible avec la conduite d un véhicule, ou l utilisation d une machine de chantier, par exemple. Les risques encourus lors de la conduite sous l emprise du cannabis sont valables pour le conducteur, mais également pour les autres usagers de la route. C est pourquoi des lois ont pour but de limiter et de sanctionner sévèrement les personnes ayant pris le volant sous l emprise du cannabis ou d autres psychotropes. [2] Travail de diplôme Mars

12 Loi Suisse En Suisse, la conduite sous l emprise de stupéfiants est strictement interdite. Chaque conducteur, qui s avère positif au cannabis (valable pour les autres substances psychotropes), est passible d une sanction allant d une simple amende à une peine privative de liberté. A cette première sanction vient s ajouter un retrait de permis pour une durée minimale d un mois. En référence aux articles 31 alinéa 2 de la loi sur la circulation routière (en vigueur depuis le 1 er fervrier 1991) : «Toute personne qui n'a pas les capacités physiques et psychiques nécessaires pour conduire un véhicule parce qu'elle est sous l'influence de l'alcool, de stupéfiants, de médicaments ou pour d'autres raisons, est réputée incapable de conduire pendant cette période et doit s'en abstenir.» [6] Contrôles d abstinence au cannabis Lors d un contrôle routier ou d un accident, il est possible pour les agents de police présents d effectuer des tests préliminaires, visant à mettre en évidence une éventuelle consommation d alcool, de stupéfiant ou de médicament, sur les conducteurs pour lesquels il y aurait quelques soupçons. Lorsqu un conducteur a été contrôlé positif au cannabis, celui-ci est jugé comme étant inapte à la conduite automobile, et va devoir se soumettre à une expertise dans le but de récupérer son permis de conduire. Le but de cette expertise est de démontrer que le conducteur en question n est pas dépendant du cannabis et qu il est apte à conduire sans être sous son influence. Cette expertise se déroule sur trois semaines consécutives. Le conducteur en question doit se soumettre à un prélèvement d urine hebdomadaire. Ces prélèvements vont, par la suite, être analysés afin de mettre en évidence la présence ou l absence de cannabinoïdes dans celle-ci. Si au bout des trois semaines, les trois urines sont négatives, le conducteur en question pourra alors récupérer son permis. Dans le cas contraire, même si un seul des prélèvements est positif, le conducteur sera obligé de renouveler ces prélèvements. Travail de diplôme Mars

13 2. Buts Ce travail va être divisé en 3 axes principaux. Dans un premier temps, il va s agir de comparer 3 méthodes différentes, au niveau de l hydrolyse, pour le dosage du THC urinaire et de ses métabolites. Le but est de déterminer quelle méthode offre le meilleur rendement. Lorsque celle-ci aura été évaluée, nous pourrons passer au point suivant qui vise à mettre en pratique la nouvelle méthode définie au début du travail. Pour se faire, nous allons analyser environ 200 échantillons et confronter les résultats de THCCOOH obtenus entre l ancienne et la nouvelle méthode. Pour terminer, nous allons tester une nouvelle ampoule de THCCOOH glucuronide, conçue par Lipomed, afin de comparer leur molécule de THCCOOH glucuronide avec celle de Cerilliant. Nous allons effectuer cette comparaison afin de voir s il y a une variation entre les résultats obtenus avec ces molécules car elles ne possèdent pas la même structure. Il s agit de deux molécules dite anomères, ce qui signifie que la position de leurs acide glucuronique n est pas la même. 3. Méthode Pour la réalisation de ce travail, un GCMS (Gas Chromatography Mass Spectrometry) a été utilisé. Il s agit, d un chromatographe en phase gazeuse équipé d une colonne capillaire couplé à un spectromètre de masse. Mais avant de pouvoir analyser les échantillons, ceux-ci doivent passer par trois phases de traitement : l hydrolyse, l extraction et la dérivation L hydrolyse, l extraction et dérivatisation Avant que les différents échantillons puissent être analysés par GCMS, ceux-ci doivent passer par trois étapes primordiales : l hydrolyse, l extraction et la dérivatisation. Les substances d intérêts, le THC et ses métabolites, présentes dans un échantillon biologique, comme par exemple l urine dans le cadre de ce travail, doivent dans un premier temps être déglucuronidées puis, par la suite, elles pourront être extraites et dérivées. L hydrolyse/déconjugaison Dans le cadre du dosage du THC urinaire et de ses différents métabolites, une hydrolyse est nécessaire. En effet, ces substances se présentent dans l urine sous forme glucuronidée, c est-à-dire qu un acide glucuronique s est lié à nos molécules d intérêt. Le but de l hydrolyse est donc de détacher cet acide des molécules, afin de rendre l extraction de celles-ci possible. Pour se faire, il est possible d utiliser des Travail de diplôme Mars

14 enzymes, comme la β-glucuronidase extraite d Escherichia coli (E. coli) ou des solutions chimiques, comme l hydroxyde de potassium (KOH). L extraction Une fois le THC et ses métabolites hydrolysés, ceux-ci peuvent donc être extraits. Dans le cadre de ce travail, une extraction liquide/liquide sera utilisée. Lors de ce type d extraction, le but est de transférer les molécules d intérêts d une phase liquide aqueuse, ici l urine, à un solvant organique, dans ce cas le chlorobutane. Lorsque ces deux phases entrent en contact, les substances présentes dans l urine, ayant une grande affinité pour le solvant vont être transférées de l un à l autre lors de l agitation. Une fois l agitation terminée nos échantillons vont être centrifugés. Le chlorobutane étant moins dense que l eau, celui-ci se retrouvera en phase supérieure. Il sera donc plus facile à prélever et pourra être évaporé par la suite. La dérivatisation Une fois le solvant des échantillons évaporé, ceux-ci vont pouvoir être dérivés. Le but de cette étape est de rendre plus volatile et plus stable toutes les substances présentes dans nos échantillons afin de faciliter leur évaporation lors de leur injection sur le GCMS. La dérivatisation a également pour but de modifier la masse molaire des molécules, afin d en augmenter leurs spécificités et ainsi d en facilier l identification. Pour dériver nos échantillons, nous allons utiliser du N-Methyl-N-trimethylsilyltrifluoroacetamide (MSTFA). Le MSTFA est un réactif de dérivatisation dont des groupements vont se fixer sur un ou plusieurs groupes fonctionnels (alcool, amine, amide, acide aminé et acide carboxylique) Principe de dosage par GCMS La chromatographie gazeuse (GC) s effectue, après traitement de l échantillon. Une fois cette étape effectuée, celui-ci peut être injecté dans l appareil. La température très élevée du liner permet un passage rapide de la phase liquide à la phase gazeuse. Lorsque l échantillon est sous forme gazeuse, il peut être introduit dans la colonne grâce à de l hélium, gaz vecteur, qui permet à l échantillon de cheminer le long de la colonne. Lorsque l échantillon se trouve dans la colonne, il entre en contact avec la phase stationnaire de celle-ci. En fonction de leur affinité pour la phase stationnaire, les différentes molécules présentes dans l échantillon vont migrer plus ou moins rapidement (plus l affinité est grande, plus la migration sera longue). C est ainsi que l on obtient le temps de rétention (temps pour lequel une molécule migre au travers de la colonne). Travail de diplôme Mars

15 Lorsque l échantillon sort de la colonne, celui-ci se retrouve dans la partie de l automate dédiée à la spectrométrie de masse (MS). Cette méthode a pour but de détecter les différents ions caractéristiques de chaque molécule présente dans l échantillon. Fig.3 : Exemple de chromatogramme en GCMS Lors de leur arrivée dans la source, les différentes molécules vont être ionisées par celle-ci. Pour se faire, les molécules sous forme gazeuse entrant dans la source vont rencontrer des électrons générés par le filament. Ces électrons vont permettre de fragmenter les molécules en différents ions, qui vont par la suite pouvoir être détectés par le quadrupole. Lors de la fragmentation, une même molécule sera toujours fragmentée de la même façon tant que les conditions restent les mêmes, ce qui rend l identification possible. Une fois les molécules ionisées, les ions sont filtrés et accélérés puis celles rentrent dans le quadrupole. Le quadrupole est composé de 4 barres parallèles et opposées à travers lesquelles un courant électrique oscillant en radio fréquence est appliqué. Les ions traversant le quadrupole en suivant un axe linéaire au centre des 4 barres vont être influencés par les différentes tensions exercées. Pour qu un ion soit détecté, celui-ci doit traverser le quadrupole sans entrer en collision avec les barres. Chaque ion possède une stabilité spécifique dans ce champ électrique, lui permettant de traverser le quadrupole et de terminer sa course sur le détecteur. Lorsque les ions entrent en contact avec le détecteur, ceux-ci vont être déviés dans le collecteur. Les chocs successifs contre les parois du collecteur générés par les ions vont être amplifiés puis enregistrés sous forme de signaux électriques, qui par la suite vont être transformés en spectre de masse grâce à un ordinateur. [8] Travail de diplôme Mars

16 Fig4. Spectre de masse du THCCOOH-TMS 4. Matériel 4.1. Matériel biologique Pour la réalisation de ce travail, nous avons eu besoin d urine positive aux cannabinoïdes. C est pourquoi nous avons choisi les urines des personnes ayant dû se soumettre à des prélèvements d urine effectuées sur trois semaines consécutives entre 2012 et Nous avons également eu besoin d urine négative, utile pour la préparation des droites de calibration et des contrôles de qualité interne. Cette urine sera également utilisée pour la fabrication d urine positive au THCCOOH à 50ng/ml Travail de diplôme Mars

17 4.2. GC-MS Le GC-MS utilisé pour ce travail est composé de la façon suivante : module de Chromatographie gazeuse Agilent 6890 N et module de spectrométrie de masse Agillent La partie GC est équipée d une colonne capillaire de 30 mètre de long pour un diamètre de 0,25mm. La phase stationnaire interne (DB-XLB) 0,250 µm d épaisseur. L hélium est utilisé comme gaz vecteur à une pression constante de 16,01 psi. Le volume d échantillon injecté (MSTFA : ACN (1 :1 ; v/v)) est de 2 µl. L injecteur ainsi que le liner sont à une température de 260 C. Au départ de la méthode la température de la colonne est de 150 C. Puis celle-ci va progressivement jusqu à 280 C à une vitesse de 25 C/min. la durée de la méthode pour obtenir une séparation complète des cannabinoïdes recherchés est de 12,2 minutes. La source (dans la partie MS) est maintenue à une température de 230 C, tandis que le quadrupole est à 150 C. Pour chaque cannabinoïde, nous avons sélectionné deux ions d identification ainsi que leur correspondant deutéré (SI) : THC m/z 303, 386 ; THC-D3 m/z 306, 389 ; 11-OH THC m/z 371, 459 ; 11- OH-THC-D3 m/z 374, 462 ; THCCOOH m/z 371, 488 ; THCCOOH-D9 m/z 380, 497. (Annexe 1) 4.3. Standards et solutions THC, THC-D3 et 11-OH-THC-D3 sont fourni par Lipomed. 11-OH-THC, THCCOOH et THCCOOH-D9 ont été acheté chez Cerilliant (Texas, Amérique). Les deux ampoules de THCCOOH-glucuronide proviennent de chez Lipomed (Arlesheim, Suisse) et Cerilliant (différence au niveau de la structure des molécules entre les deux fabricants). La β- Glucuronidase (E. coli) est fournie par Roche Diagnostic (Rotkreuz, Suisse). N-Methyl-N-trimethylsilyl-trifluoroacetamide (MSTFA) provient de Macherey-Nagel Gmbh (Düren, Allemagne). La solution de KOH 11,8N est préparée à partir d une poudre achetée chez Merck (Darmstadt, Allemagne). L acide acétique glacial, 1-chlorobutane, et l acétonitrile proviennent de chez Sigma Aldrich (Saint-Louis, Amérique). Standard interne Le standard interne (SI) utilisé lors de ce travail a été préparé à l aide des ampoules de molécules deutérées (THC-D3, 11-OH-THC-D3 et THCCOOH-D9). Une molécule deutérée est une substance à laquelle un ou plusieurs atomes d hydrogène ont été remplacés par un ou plusieurs atomes de deuterium, dont la masse est double de celle de l hydrogène. Grâce à cette modification, le temps de rétention des molécules deutérées est légèrement inférieur ou supérieur à celui des molécules recherchées, mais surtout son spectre de masse est différent. Le standard interne sert de contrôle pour les différentes étapes du traitement des échantillons. En cas d absence du standard interne, il est possible de suspecter un problème lors de l extraction et de la dérivation. Travail de diplôme Mars

18 Le standard interne sera également utile lors du dosage, du fait que la concentration de celui-ci est connue. Il a donc, par la suite, été possible de mettre en rapport les valeurs obtenues pour nos échantillons avec celle du standard interne. Ainsi, il nous est possible de connaître la concentration en THCCOOH, par exemple, contenue dans nos échantillons. Fig. 4 : ions spécifiques du THCCOOH-TMS (371 et 488) avec les ions du SI correspondant (380 et 497) 4.4. Calibreurs et contrôles 7 différents points de calibrations ont été créés aux concentrations suivantes : 5 ; 10 ; 25 (2X); 75; 200 et 500 ng/ml pour le THCCOOH et 0,5 ; 1 ; 1,5 (2X) ; 2 ; 3 et 5 ng/ml pour le THC et le 11-OH-THC préparés à partir de solutions stock à 1µg/ml dans du méthanol. 1 ml d urine négative y est ajouté afin de traiter les points de calibration de la même manière que les échantillons. Pour les contrôles de qualité interne (CQI), le contrôle urinaire liquid chek de Biorad ([150ng/ml THCCOOH]) a été utilisé. De plus 3 autres CQI ont été créés manuellement dans de l urine négative aux concentrations suivantes : CQI A 2ng/ml de THC et 30 ng/ml de THCCOOH, CQI B 4ng/ THC et 100 ng/ml de THCCOOH et le CQI C 2ng/ml de THC-glucuronide et 60 ng/ml de THCCOOH. (Annexe 2) 5. Choix du protocole Dans un premier temps, trois méthodes d hydrolyse du THC et de ses métabolites vont être comparées afin d en déduire les performances de chacune. Le but de ce test va être de déterminer quelle méthode offre le meilleur rendement, celle qui offre les meilleurs résultats dans un minimum de temps et, générant un minimum de frais. Pour ce faire, 10 échantillons urinaires positifs au THCCOOH ont été sélectionnés. Parmi ces échantillons, 5 ont une concentration inférieure à 100 ng/ml et les 5 autres une concentration supérieure à 100 ng/ml. Chaque Travail de diplôme Mars

19 échantillon sera analysé par les 3 méthodes et les résultats obtenus seront comparés entre les 3 méthodes. Les méthodes qui vont être utilisées sont divisées en 3 parties. Dans un premier temps le THC et ses métabolites doivent être hydrolysés. Dans la première méthode, une hydrolyse enzymatique a été choisie, grâce à l utilisation d une enzyme d Escherichia coli, la β-glucuronidase. Dans la seconde méthode, l hydrolyse se fera à l aide d hydroxyde de potassium. Il s agira donc d une l hydrolyse chimique et pour finir nous combinerons les deux hydrolyses. Lorsque l échantillon a été hydrolysé celui-ci doit être extrait. Pour ce faire, du chlorobutane sera utilisé. Celui-ci va permettre d extraire le THC et ses métabolites de l urine. Après agitation et centrifugation, le chlorobutane ayant une densité inférieure à celle de l urine, va se retrouver en phase supérieure et pourra être prélevé facilement. Pour finir, une fois la phase supérieure prélevée et évaporée à l aide d azote, les métabolites extraits au préalable, vont pouvoir être dérivés au MSTFA et injectés sur GCMS Hydrolyse enzymatique Une fois les tubes prêts avec le standard interne et les différents points des droites de calibration, 1 ml d échantillon urinaire (UMPT), de contrôles internes, et également de l urine négative pour les droites vont être ajoutés. A la suite de cela, 1 ml de tampon phosphate 0,1M à ph 6,0 sera ajouté, dans le but d optimiser l activité hydrolytique de l enzyme (β-glucuronidase), dont 50 μl sera ajouté. L ajout d un tampon à ph 6,0 est nécessaire car la β-glucuronidase atteint un maximum de son potentiel enzymatique à ce ph. Après une incubation over-night à 37 C, les échantillons sont prêts pour l extraction. Pour se faire, le milieu va être acidifié en ajoutant 450 μl d acide acétique glacial, puis 4 ml de chlorobutane seront ajoutés afin de créer 2 phases liquides et d extraire les substances d intérêt. Après agitation et centrifugation, le surnageant sera prélevé et évaporé. Une fois l évaporation effectuée, les échantillons peuvent être dérivés au MSTFA et analysés par GCMS. (Annexe 3) 5.2. Hydrolyse chimique Dans le cadre de l hydrolyse chimique, la β-glucuronidase est remplacée par une solution d hydroxyde de potassium. Lorsque tous les tubes sont prêts et l ajout 1 ml d échantillon étant fait, 125 μl de KOH 11,8N seront ajouté, puis les échantillons seront incuber pendant 15 minutes à une température de 60 afin de catalysé la réaction. L hydrolyse étant achevée, il est possible de passer à l extraction liquide/liquide qui se passe dans les mêmes conditions que dans le cadre de l hydrolyse enzymatique. Une fois l extraction terminée, la phase supérieure peut être prélevée et évaporée, puis les échantillons peuvent être dérivés au MSTFA. (Annexe 4) Travail de diplôme Mars

20 5.3. Hydrolyse combinée enzymatique et chimique Pour finir l hydrolyse en tandem enzymatique et chimique. Celle-ci débutera avec l hydrolyse enzymatique. Une fois les tubes prêts avec 1 ml d échantillon, 50 μl de β-glucuronidase seront ajoutés et, les échantillons pourront être incubés en over-night à 37 C. Les échantillons sont repris avec le protocole de l hydrolyse chimique au niveau de l ajout des 450 μl de la solution d hydroxyde de potassium 11,8N. L extraction et la dérivation se passent dans les mêmes conditions que pour l hydrolyse enzymatique. (Annexe 5) 5.4. Résultat Au total 3 essais ont été réalisés avec chaque hydrolyse. Les droites de calibrations ont donc été comparées entre elle après chaque essai. Lors de ces essais, les droites de calibration obtenues avec chaque méthode pour le THCCOOH a été exploitable. Aucune d entre elles ne possédaient un coefficient de corrélation inférieur à 0,98. Concernant le THC c est l hydrolyse chimique qui, lors des 3 essais a démontré des droites de calibration exploitables. En ce qui concerne le dosage de THCCOOH effectué sur les échantillons en provenance de l UMPT, c est une fois de plus l hydrolyse chimique qui aura démontré les meilleures équivalences entre les anciens dosages et ceux effectués avec l hydrolyse chimique. (Annexe 6) Bien que l hydrolyse combinée offre également des droites exploitables, celle-ci ne sera pas utilisée pour la suite du travail en raison des discordances trop importantes entre les anciens dosages de THCCOOH et les nouveaux. Concernant les droites de calibration de l hydrolyse enzymatique celle-ci ne sont pas exploitables Discussion Le but de cette étape était de choisir la méthode d hydrolyse la plus rentable. Après réflexion sur les résultats obtenus lors des 3 essais, il a été décidé de choisir la méthode chimique pour la suite du travail. Les raisons qui ont influencé ce choix sont multiples. Notons que ces essais ont été effectués avec du THC non glucuronide, qui n est, de ce fait, pas influencé par l hydrolyse. Nous avons donc choisi de prendre la méthode qui donnait les résultats les plus cohérents, pour les contrôles et nos 10 échantillons tests utilisés lors des 3 essais. De plus, le but de base était de trouver la méthode la plus rentable en fonction de la qualité des résultats obtenus, du temps de réalisation de l analyse ainsi que du coût généré par celle-ci. La méthode chimique nous a apporté des résultats plus que satisfaisants par rapport à l autre méthode et, de plus, cette méthode nécessite une hydrolyse de 15 minutes contre une hydrolyse en overnight pour les 2 autres méthodes. De plus, l hydrolyse chimique utilise une solution de KOH qui est nettement moins couteuse qu une enzyme. Travail de diplôme Mars

21 6. Mise en pratique du protocole Lors de cette partie, le protocole d hydrolyse chimique est mis en pratique sur des échantillons urinaires. Pour ce faire, environ 219 échantillons d urine en provenance de l UMPT ont été sélectionnés. Chaque urine a été prélevée dans le cadre du test des 3 urines hebdomadaires. Le but de cette mise en pratique va être de mettre en évidence une éventuelle consommation de cannabis entre les trois prélèvements, période durant laquelle le patient dit s abstenir de toute consommation, grâce à la mise en évidence de faibles concentrations de THC. Les échantillons urinaires vont par trois, chaque regroupement de trois échantillons correspond à un patient (excepté pour 13 cas ou nous n avons que deux urines successives). Pour chaque échantillon, les anciennes valeurs de THCCOOH dosées par GCMS ont été recueillies, ainsi que les valeurs de créatinine dosées par réaction de spectrophotométrie. Pour commencer, les nouveaux résultats ont été comparés avec les anciens. Lors de cette comparaison, 42 échantillons ont été retirés, car ceux-ci ne possédaient aucun résultat pour le THCCOOH ou des résultats non concordant avec les précédents. Concernant les discordances entre les résultats, il est possible que le THCCOOH a été dégradé, dû à la dégradation de l urine durant la conservation. [5] Afin d interpréter les résultats, le modèle II selon Huestis sera utilisé comme référence de base. Ce modèle met en rapport la concentration en THCCOOH après correction avec le paramètre de créatinine, de la deuxième urine avec celle de la première urine, ainsi qu entre la troisième et la deuxième urine. Avant d établir le rapport entre les différentes concentrations en THCCOOH, celui-ci doit être corrigé grâce à la valeur de créatinine de même pour les concentrations de THC ([THCCOOH ng/ml] ([THC ng/ml]) / [créatinine mg/ml]). Une nouvelle consommation de cannabis est confirmé dès que U+1/ U > 0,5 et pour une concentration en THCCOOH supérieure ou égale à 14 ng/ml. Afin de faciliter l interprétation des résultats, ceux-ci seront introduits sous forme de tableau à double-entrées. Le noircissement d une case se rapportera au rapport entre les concentrations en THCCOOH tandis que les cases rouges correspondent au THC. La superposition de ces 2 donnera une case rouge et noir. (Annexe 7) Travail de diplôme Mars

22 6.1. Interprétation des résultats Pour interpréter les résultats, un tableau à double-entrées va être utilisé. Sur ce tableau l entrée de gauche correspondra au rapport de la concentration de THCCCOH présente dans l urine 2 (U2) sur la concentration de THCCOOH dans l urine 1 (U1), de même lors du rapport entre la concentration de THCCCOH de l urine 3 (U3) sur la concentration de THCCOOH de l urine2 (U2). Si celui-ci est supérieure à 0,5 c est la case qui sera noircie. Si ce rapport est inférieur à 0,5 c est la case qui sera noircie. Même principe est appliqué pour l entrée supérieure. Là, il s agit de représenter la concentration en THC présente dans U2 ou U3. S il y a présence de THC, c est la case qui sera coloriée en rouge et dans le cas contraire la case sera coloriée de la même couleur. Différents cas de figures peuvent cependant être mis en évidence. Voici les 4 cas de figures qu il est possible de rencontrer avec ce tableau. L abstinence Si U2/U1 (U3/U2) < 0,5 Si (U3) est non détectée Travail de diplôme Mars

23 Consommation SI U2/U1 (U3/U2) > 0,5 Si (U3) > 0,4 ng/ml Consommation récente : juste avant U2 ou U3 SI U2/U1 (U3/U2) < 0,5 Si (U3) > 0,4 ng/ml Consommation non récente : juste après U1 ou U2 SI U2/U1 (U3/U2) > 0,5 Si (U3) est non détectée Interprétation des patients L interprétation des cas va se faire de la manière suivante : Dans un premier temps nous allons prendre tous les patients pour lesquels nous n avons pas les 3 urines, puis les cas où le rapport entre les concentrations en THCCOOH est inférieur à 0,5 et pour lesquels le THC n a pas été mis en évidence (abstinence). Par la suite nous allons nous intéresser au cas contraire où le rapport entre les Travail de diplôme Mars

24 concentrations en THCCOOH est supérieur à 0,5 et, où le THC a été mis en évidence (consommation avéré par les 2 indicateurs). Puis nous allons nous intéresser au cas où, le THC a pu être mis en évidence et où le rapport entre les concentrations en THCCOOH est inférieur à 0,5 (consommation récente). Pour conclure, nous nous intéresserons au cas où le rapport entre les concentrations en THCCOOH est supérieur à 0,5 et, pour lequel il n y a pas eu de mise en évidence du THC (consommation non récente). Cas non interprétable Lors de la mise en pratique, 19 cas n ont pas pu être interprétés car seules 2 urines sur les 3 étaient interprétables. En effet, lors de l analyse des échantillons, un problème analytique est survenu impliquant la disparition du THCCOOH et de son SI. Dans d autre cas, l absence d échantillons est en cause. Cas inférieur à 14 ng/ml selon Huestis Quatre usagers font partie de cette catégorie. Pour eux, d après le modèle de Huestis, lorsque la concentration en THCCOOH est inférieure à 14 ng/ml, les résultats sont considérés comme négatifs. Cas d abstinence Trois usagers font partie de cette catégorie, il s agit de toutes les personnes pour lesquelles le rapport entre les concentrations en THCCOOH est inférieur à 0,5 et que la concentration en THCCOOH est supérieure à 14 ng/ml pour les 3 urines selon le modèle de Huestis [9]. De plus le THC n a pas été mis en évidence. Cas de consommation Dans cette catégorie, seuls deux patients ont été mis en évidence. Le rapport entre les concentrations en THCCOOH est supérieur à 0,5 dans les 2 cas entre l U2 et l U1. En revanche pour le rapport, entre l urine 3 et l urine 2 le cas 28, est supérieur à 0,5 tandis que le cas 28 est inférieur à 0,5. Pour les 2 cas, une concentration en THC a été mise en évidence dans l U2. Dans ce cas de figure, le test d aptitude est à refaire. Non seulement le rapport entre les concentrations en THCCOOH est supérieur à 0,5 pour au moins une des urines, mais une concentration en THC dans l U2 a été mise en évidence pour les 2 patients. Cas de consommation récente Cette situation regroupe un seul consommateur, pour lequel le rapport entre les concentrations en THCCOOH entre l U3 et l U2 est inférieur à 0,5. En revanche, nous avons pu mettre en évidence une faible concentration en THC dans l U2. Bien que le métabolisme d élimination du THC ne soit pas encore Travail de diplôme Mars

25 clairement établi, sa durée de demi-vie est estimée entre 1 et 3 jours [5]. En raison de cet intervalle temporel, il nous est possible d estimer que le patient a très récemment consommé du cannabis lors de sa période d abstinence, mais de manière peu conséquente. Selon le modèle de Huestis, cet usager n aurait pas consommé de cannabis. Cependant, selon le modèle établi en fonction de la concentration en THC, il est possible de mettre en évidence une nouvelle consommation lors de la période d abstinence. Cas de consommation non récente La grande majorité des résultats se situe dans cette catégorie (25 cas). Pour la plupart des consommateurs, le rapport entre la deuxième et la première urine et/ou entre la troisième et la deuxième urine est supérieur à 0,5 mais le THC reste non détecté. Il y aura donc : U2/U1 et U3/U2 > 0,5 Dans un premier temps, les cas 30 à 43 vont être analysés. Il s agit de tous les cas pour lesquels les rapports entre les concentrations en THCCOOH sont supérieurs à 0,5. Pour les cas 30, 32, 35, 40 et 41, la concentration en THCCOOH entre l U1 et l U2 diminue, mais le rapport entre les 2 concentrations n est pas inférieur à 0,5. D un autre côté, entre l U2 et l U3 la concentration en THCCOOH augmente, se qui met en évidence une nouvelle consommation entre le prélèvement de l U2 et l U3. Concernant les cas 31 et 37, dans ces 2 situations, la concentration entre l U1 et l U2 augmente, par conséquence, il y a eu une nouvelle consommation entre les 2 prélèvements. Par la suite, la concentration entre l U 2 et l U3 diminue, mais le rapport entre ces deux ne donne pas un rapport < 0,5. Pour les cas 33, 42 et 43, les concentrations en THCCOOH entre l U1, l U2 et l U3 ne cessent d augmenter entre les trois prélèvements, cela démontre clairement que ces 3 individus ont continué leur consommation. Dans les cas 34, 36, 38 et 39, la concentration en THCCOOH diminue d une urine à l autre. Cependant, le rapport entre ces concentrations reste supérieur à 0,5. Bien que la concentration en THCCOOH diminue entre les différentes urines, cette diminution n est pas significative d un arrêt de consommation selon Huestis [9]. Travail de diplôme Mars

26 U2/U1 > 0,5 Dans cette situation, nous avons 7 patients pour qui le premier rapport entre les concentrations en THCCOOH entre l U2 et l U1 est supérieur à 0,5. Pour les cas 44, 45,46, 47, et 48, le rapport entre les concentrations en THCCOOH de l U2 et l U1 est supérieur à 0,5. Bien que d une urine à l autre, la concentration en THCCOOH diminue, mais cette diminution n est pas significative d un arrêt de consommation selon Huestis [9]. Pour les cas 48 et 49, le rapport entre les concentrations en THCCOOH entre l U2 et l U1 est également supérieur à 0,5. Et pour cause, dans tous les cas, la concentration en THCCOOH est doublée entre l U1 et l U2. Cette augmentation met en évidence une nouvelle consommation de THCCOOH entre le premier prélèvement et le second. Cependant, la diminution entre le second prélèvement et le troisième démontre un arrêt de la consommation. U3/U2 > 0,5 Dans cette catégorie, nous avons 4 patients. Pour ces 4 personnes, c est lors du dernier prélèvement, en établissant le rapport entre l U3 et l U2, qu une nouvelle consommation a été mise en évidence. Pour le cas 51, le rapport entre la seconde et la première urine est inférieur à 0,5, ce qui est compatible avec un arrêt de la consommation. En revanche, la diminution de la concentration en THCCOOH entre l U2 et l U3 n est pas significative d un arrêt de la consommation. De ce fait, le rapport reste supérieur à 0,5. En ce qui concerne les cas 52 à 54, leur rapport entre l U2 urine et l U1 est inférieur à 0,5. En revanche, pour les 3 cas, il est possible d observer une augmentation de la concentration en THCOOH entre l U2 et l U3. Cette augmentation n est pas compatible avec un arrêt de la consommation. Pour les 4 cas mentionnés ci-dessus, les consommateurs ne semblent pas consommer entre le premier et le second prélèvement selon Huestis [9]. Cependant entre le 2 ème et le 3 ème prélèvement il est clairement possible de mettre en évidence une nouvelle consommation Discussion Lors de la mise en pratique de la méthode, nous avions pour but de mettre en évidence d éventuelles faibles concentrations en THC dans l urine. Après traitement des résultats, nous avons pu mettre en évidence une concentration en THC dans 6 de nos 54 cas de base, donc 3 ne sont pas exploitables en raison de l absence de la concentration en THCCOOH pour une des urines. Après avoir mis en pratique le modèle selon Huestis pour l interprétation des résultats, il est possible de se rendre compte que, dans la plupart des cas, ce modèle fonctionne. En revanche, lors de cet essai, un cas fait exception à la règle. Travail de diplôme Mars