CHM3102-A2005 Révision: immunoessais et biocapteurs 08/12/2005
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1 CHM3102-A2005 Révision: immunoessais et biocapteurs 08/12/2005 1
2 5.2 Structure et propriétés des antigènes épitopes antigène anticorps 1- Antigène univalent et uni-déterminé: un seul épitope à la surface, ex. les haptènes. 2- Antigène multivalent et uni-déterminé : à > 1 épitopes du même type 3- Antigène multi-déterminé et univalent: plusieurs épitopes de différents types, mais seulement un de chaque type (ex., des antigènes protéiques). 4- Antigène multi-déterminé et multivalent: plusieurs épitopes de différents types et plus d un épitope de chaque type (ex., cellules entières) 2
3 Les immuno-complexes Interaction liante primaire étudiée avec des haptènes: Complexe soluble Des réactions secondaires anticorps-antigène résultant d antigènes multivalents produisent de l agglutination ou précipitation d un réseau polymérique antigène-anticorps. Un produit visible est formé sur un temps allant de quelques minutes à quelques heures: Complexe insoluble 3
4 Exemple 5.1: test d agglutination pour les anticorps Brucella abortus Chaque tube contient la même quantité de la suspension bactérienne (antigène). du sérum Ag (bactérie) Ab (sérum) Ab-Ag 4
5 2. Réactions avec précipitation 5
6 Quantification d antigène par la méthode d immuno-diffusion radiale L anticorps est uniformément distribué dans le gel. Due à la diffusion de l antigène à travers le gel, des anneaux de précipité sont formés autour des puits contenant des solutions d antigène de différentes concentrations. Le diamètre carré (d 2 ) d un anneau de précipité est α à la [antigène]. Courbe d étalonnage Concentrations d antigène différentes 6
7 Question Identifiez la/les combinaison(s) ci-dessous qui donnerai(en)t un précipité autour d un rapport anticorps:antigène de 1:1. a) Un antigène univalent et multidéterminé (épitopes A, B, C et D) et des anticorps Anti-C b) Un antigène multivalent et unidéterminé (épitope A) et un anticorps Anti-A c) Un antigène univalent et unidéterminé (épitope A) et un anticorps Anti-A d) Un antigène multivalent et multidéterminé (épitopes A, B, C et D) et un anticorps Anti-D 7
8 5.5 Essais immunologiques quantitatifs Classification des essais immunologiques: homogène vs. hétérogène Homogène: aucune séparation nécessaire (ex. turbidité mesurée) Hétérogène: séparation requise (par précipitation ou immobilisation) compétitif vs. non-compétitif et ou anticorps marqué vs. antigène marqué marqueurs: fluorophores, radio-isotopes, enzymes, etc. + réactifs anticorps (Ab) marqueur (L) anticorps marqué (Ab-L) Propriétés idéal: de multiples liaisons covalentes, effet minimales sur l antigène ou l anticorps marqué, permettre de différencier entre l espèce libre et liée, facilement détectable, stable, etc. par type de marqueur utilisé, essai immuno-enzymatique (ELISA) 8
9 5.5.3 Essais compétitifs 1. Échantillon d antigène: Essai hétérogène (immobilisation et rinçage) Une quantité limitée d anticorps (Ab) est immobilisé (insuffisante pour lier toutes les molécules d antigène dans l échantillon). L échantillon: quantité inconnue de l antigène (Ag) L échantillon est mélangé avec une quantité fixe et connue de l antigène marqué (Ag*). (Il faut garder le rapport Ab à Ag* constant). Ag et Ag* sont en compétition pour un nombre limité de sites anticorps, Ab. Rincer pour éliminer tout Ag et Ag* non liées. Mesure fluorescence sur support solide. Ag Ag * Courbe d étalonnage Log [Ag] 9
10 1. Échantillon d antigène: Essais non compétitifs L échantillon, Ag, est incubé avec un excès d anticorps Ab immobilisé; toutes les molécules Ag se lient à l anticorps. Souvent Ab est multidéterminé. Pour détecter la quantité d antigène lié à Ab immobilisé, un 2 e anticorps marqué (Ab 2 *) est ajouté qui se lie à un autre épitope de l antigène - formation d un «complexe sandwich» Ab:Ag: Ab 2 *. Rincer l excès d Ab 2 * et mesurer la fluorescence du support solide. Courbe d étalonnage complexe sandwich log [Ag] 10
11 Méthode immuno-enzymatique: ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay) Ab-E Essai hétérogène sur phase solide Marqueur: les enzymes Ex., Horseradish peroxydase; Phosphatase alcaline; β-galactosidase. Un seul marqueur enzymatique catalyse la production de multiples copies d une espèce détectable (ex.par fluorescence) générant ainsi un grand signal rend possible l analyse quantitative de faibles concentrations d échantillon Désavantage: besoin d ajouter un substrat (donc, une autre étape de réaction) Mode compétitif: antigène marqué (Ag-E) Mode compétitif: antigène marqué (Ag-E) Mode non-compétitif: deux anticorps utilisés: Anticorps primaire (Ab 1 ) qui réagit avec l analyte Ag Anticorps secondaire, Anti-Ab 1, marqué avec une enzyme (Ab-E) 11
12 5.8.1 ELISA - mode compétitif L antigène dans l échantillon (analyte, Ag) et l antigène marqué avec enzyme (Ag-E) sont en compétition pour un nombre limité (et insuffisant) de sites anticorps, Ab, liée sur le support solide. Après incubation, le support est rincé pour enlever les antigènes non-liées et une concentration saturante du substrat enzymatique (S) est ajoutée. La conversion du substrat S en produit P peut être mesurée en mode cinétique. Dans ce cas, la vitesse de conversion du substrat diminue lorsque [Ag libre ] dans l échantillon augmente. Plus souvent, une approche à temps fixe est utilisée. Après un certain temps d incubation avec le substrat, la réaction enzymatique est arrêtée. Une courbe d étalonnage dans laquelle la [produit] diminue lorsque la [Ag libre ] dans l échantillon augmente 12
13 5.8.2 ELISA - mode non compétitif basées sur la formation de «complexes sandwich». Un anticorps primaire (Ab 1 ) immobilisé est présent en excès et lie quantitativement tout l antigène Ag (analyte). Un 2 e anticorps (anti-ab 1 ) avec marqueur enzymatique (Ab 2 -E) réagit avec l antigène lié, formant un complexe sandwich; détecté par une mesure de l activité de l enzyme liée au support. Une courbe de calibration est obtenue dans laquelle la [produit] augmente avec la [Ag] dans l échantillon. Ex., Détection d anticorps au virus de l immunodéficience humaine (VIH) par ÉLISA 13
14 6. Biocapteurs 6.1 Principe d un biocapteur Biocapteur = élément de reconnaissance moléculaire + transducteur analyte signal analyte signal transducteur élément de reconnaissance moléculaire transducteur élément de reconnaissance moléculaire L élément de reconnaissance moléculaire réagit spécifiquement avec le bioanalyte d intérêt. Le transducteur agit en tant que détecteur, convertissant l évènement de reconnaissance moléculaire en un signal facilement mesurable. 14
15 L élément de reconnaissance moléculaire: est immobilisé à/près de la surface du transducteur par physisorption, chimisorption ou par piégeage dans une membrane inerte offre une spécificité et une sensibilité élevées pour l analyte, ainsi qu une réponse rapide ex. enzymes, anticorps, ADN, cellules entières, micro-organismes Le transducteur: est le composant d un biocapteur qui détecte les changements physiques se produisant dans l élément de reconnaissance moléculaire suite à la liaison de l analyte et les convertit en un signal de sortie qui peut être amplifié, affiché et sauvegardé peut convertir le signal provenant d un évènement de reconnaissance moléculaire soit directement ou par le biais d un médiateur chimique (ex. glycomètre) De type électrochimique, optique, acoustique, calorimétrique Principe de fonctionnement d un biocapteur 15
16 Glycomètre - biocapteur ampérométrique Bandelette-test pour le glucose électrode de référence Ag/AgCl zone réactive contacte électrique électrode de travail/enzyme e - Fe(CN) 6 4- FAD C 6 H 12 O 6 glucose électrode glucose oxydase Fe(CN) 6 3- FADH 2 C 6 H 10 O 6 gluconolactone 16
17 L accepteur physiologique (O 2 ) est remplacé par un médiateur synthétique (1,1 -diméthylferrocène ou Fe(CN) 6 3-/4- ) pouvant transporter les électrons du centre rédox de l enzyme à la surface de l électrode. Courbes d étalonnage enregistrées pour le glucose avec le ferrocène comme médiateur Due à l utilisation d un médiateur artificiel, l analyse devient insensible à la fluctuation du taux d oxygène (i.e. N 2 vs. air) L analyse peut aussi être effectuée à des potentiels plus bas (élimination d espèces interférentes). (D après Mikkelsen & Cortòn, Bioanalytical Chemistry, 2004) 17
18 6.3 Microréseau à base d ADN Un microréseau à base d ADN permet l analyse en parallèle de plusieurs gènes sur un seul dispositif. Des dizaines de milliers de réactions peuvent être effectuées simultanément sur une seule puce à ADN. Cette nouvelle technologie exploite l appariement de deux oligonucléotides complémentaires. Avec un microréseau d ADN, il est possible d identifier la séquence d un gène et de détecter des mutations génétiques. (D après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) sonde moléculaire 18
19 Fabrication de macro- ou microréseaux d ADN Une puce à ADN contient un arrangement ordonné d oligonucléotides immobilisés en forme de points sur un support solide miniaturisé (généralement du verre). Chaque point d une puce contient jusqu à ~10 6 oligonucléotides identiques, mais la séquence nucléotidique varie d un point à l autre. 19
20 Dans un microréseau, la taille des points est de 20 à 50 μm (ex. puce à ADN d Affymetrix). puce à ADN d Affymetrix (D après Manz, Pamme & Iossifidis, Bioanalytical Chemistry, 2004) 20
21 Lecteur de microréseauxmicroscope confocal à fluorescence induite par laser λ excitation : Vert (532 nm) Rouge (633 nm) 21
22 Séquençage de l ADN avec un microréseau Un microréseau constititué de 4 4 = 256 points de tetranucléotides. Pour simplicité, seulement une chaîne est illustré par point. Échantillon d oligonucléotide à séquençer: Digérer l oligo d ADN partialement par voie enzymatique pour le couper en plus petits fragments Marquer les fragments avec fluorophore Appliquer l échantillon sur la puce C Un microréseau après réaction avec de l ADN partiellement digéré. L hybridation avec les tetranucléotides du réseau est indiquée en rouge. 22
5.5.5 Exemple d un essai immunologique
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