Les expériences françaises en analyse de «l exome» CFTR Laboratoire de Géné:que Moléculaire Inserm U827 MONTPELLIER Anne Bergougnoux Caroline Raynal
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1 Les expériences françaises en analyse de «l exome» CFTR Laboratoire de Géné:que Moléculaire Inserm U827 MONTPELLIER Anne Bergougnoux Caroline Raynal I. CFTR MASTR TM v2 Dx performance evalua:on study (Mul$plicom) Next Genera:on Sequencing : GS Junior System (Roche) Valida$on CEIVD Evalua$on interne II.
2 I. CFTR MASTR TM v2 Dx performance evalua:on study (Mul$plicom) Next Genera:on Sequencing : GS Junior System (Roche) 3 Runs : 18 échan$llons du laboratoire S1 à S18 tous déjà analysés en Séquençage Sanger / DGGE pour SNV en QMPSF/MLPA pour CNV 3 échan$llons fournis par Mul$plicom PS1 à PS3 (commun aux 3 centres d évalua:on) Nombre d échan:llons variable Run 1 et 2 : 10 échan:llons Run 3 : 5 échan:llons Valida$on CEIVD 2 lots différents de CFTR MASTR (Run 1 (Run 2 et 3)) Librairie Séquençage
3 I. CFTR MASTR TM v2 Dx performance evalua:on study (Mul$plicom) Next Genera:on Sequencing : GS Junior System (Roche) 3 Runs : 18 échan$llons du laboratoire S1 à S18 tous déjà analysés en Séquençage Sanger / DGGE pour SNV en QMPSF/MLPA pour CNV 3 échan$llons fournis par Mul$plicom PS1 à PS3 (commun aux 3 centres d évalua:on) Nombre d échan:llons variable Run 1 et 2 : 10 échan:llons Run 3 : 5 échan:llons Valida$on CEIVD 2 lots différents de CFTR MASTR (Run 1 (Run 2 et 3)) Librairie Séquençage 2 étapes de vérifica:on de la qualité de la librairie
4 I. CFTR MASTR TM v2 Dx performance evalua:on study (Mul$plicom) Next Genera:on Sequencing : GS Junior System (Roche) Séquençage Technologie 454 (Roche) empcr : Titanium empcr kits of the LibA type Sequencing : GS Junior System : Titanium sequencing kit Durée : empcr : 1 nuit vérifica:on de l enrichissement des billes Séquençage : 24h 520% Phase Prerun (rinçage, changement tubulures) : 30 min Chargement Pico:terplate délicat 1) Données brutes Qualité sa:sfaisante pour chaque critère pour les 3 runs Reproduc:bilité interrun ok
5 I. CFTR MASTR TM v2 Dx performance evalua:on study (Mul$plicom) Next Genera:on Sequencing : GS Junior System (Roche) 1) Données brutes Run browsner (Roche) Valida$on CEIVD >50% >150 Run 1 et 2; >300 Run 3 >40 Run 1 et 2; >81 Run 3
6 I. CFTR MASTR TM v2 Dx performance evalua:on study (Mul$plicom) Next Genera:on Sequencing : GS Junior System (Roche) 2) Détec$on et annota$on des variants AVA solware (Roche) + SeqNext (JSI Medical System) SNV (mut + pol) : tous les SNV ont été iden:fiés par les deux logiciels Mais 1 faux posi:f (c.2052dela) détecté comme hmz au lieu d htz c.[121034tg,121012t] et c.*125t[n] nombre de répé::on impossible à évaluer! CNV : pas de valida:on CEIVD à ce stade Délé:ons correctement iden:fiées 1 pa:ent avec délé:on 2224 dans run 2 (normalement dessiné uniquement pour détec:on SNV : bien détectée et pas de faux posi:f!) Faux posi:fs générés pour 1 échan:llon en fonc:on des échan:llons choisis comme ra:os contrôles (plusieurs échan:llons contrôles nécessaires)
7 I. CFTR MASTR TM v2 Dx performance evalua:on study (Mul$plicom) Next Genera:on Sequencing : GS Junior System (Roche) Conclusions Aspects techniques : Protocole clair Facilité de manipula:on Rapidité : 3 jours Bonne reproduc:bité entre les runs Chargement PicoTiterPlate délicat Homopolymères illisibles (technologie Roche) IVS10 non analysé : c a>g? Applica$on au diagnos$c au laboratoire : Mul:plexage de 10 échan:llons (SNVs) > coût par pa:ent : 213 euros ( ) Mul:plexage de 5 échan:llons (SNVs + CNVs) > coût par pa:ent : 320 euros ( ) Si valida:on CEIVD pour SNV (ok) et CNV (à venir) coût moins élevé (3 éch + 2 contrôles) 466 euros ( ) (Capacité GS Junior Roche) Compa:ble avec notre ac:vité (hors urgence) Perspec:ves Evalua:on de la technologie Mul:plicom sur MiSeq (expérience posi:ve Lille)
8 7 Runs : 6 échan:llons + 1 témoin posi:f (idem échan:llon) + 1 témoin néga:f Evalua:on interne 33 ADN différents : 21 passés une seule fois (10 pass, 11 fail) 8 passés en double 4 passés en triple (1 run sans cluster réac:fs?) tous déjà analysés en Séquençage Sanger / DGGE pour SNV en QMPSF/ MLPA pour CNV Librairie Séquençage
9 Librairie Hybrida:on d un pool d oligonucléo:des sur l ADN Extensionliga:on PCR amplifica:on (+ index + adaptateurs) Normalisa:on de la librairie + Pooling Prépara:on rapide et facile : 1,5 jours Aucune étape de vérifica:on de la qualité de la librairie avant pooling (système verrouillé pour CEIVD) Séquençage MiSeqDx (Illumina) SBS Chemistry (séquençage base par base) Pairedend 150 nucléo:des Chargement MiSeq : très automa:sé Séquençage : 27 heures Analyse du run par le logiciel MiSeq Reporter : 1h environ Rinçage : 20 min
10 1) Données brutes MiSeqReporter (version Dx) Données qualité du run Reads :
11 1) Données brutes Clusters : MiSeqReporter (version Dx) Données qualité du run
12 MiSeqReporter (version Dx) Échan:llon "Fail" ou "Pass" en fonc:on du taux d assigna:on réussi pour chaque posi:on donnée (Fail si Call rate < 99%). Coordonnées non assignées : confiance trop faible (couverture et équilibre)
13 MiSeqReporter (version Dx) Liste de variants nombre < fichier vcf Pas d analyse possible base par base Ex11 Qualité globale suffisante Qscore > 30 sur une séquence donnée Couverture inégale en fonc:on des régions Variant score : score "mul:variables"
14 MiSeqReporter (version Dx) + SeqNext (JSI Medical System) Sur 42 échan:llons : 30 échan:llons "Pass" et 12 échan:llons "Fail" : 71,5% Quan:té d ADN op:male? 5 μl à 50 ng/μl : 250 ng Qualité d ADN op:male? nécessité de faire migrer sur gel DO 260/280 = 2 Certains qui étaient "fail" dans un run sont "pass" dans le run suivant : pooling librairie? Qualité limite par rapport aux échan:llons du run problème de reproduc:bilité?
15 MiSeqReporter (version Dx) + SeqNext (JSI Medical System) 2) Détec$on et annota$on des variants (pour les 30 échan$llons "Pass") Muta:ons exoniques et introniques flanquantes détectées et correctement annotées pour 26/30 c.[121034tg,121012t] et c.*125t[n] : corrects dans > 97% des cas TG11T7 lu parfois comme TG10T9 TG13T5/TG15T7 lu comme TG13T5 hmz SNV (pol) exoniques détectés sauf : c.1408a>g : non détecté ou statut hmz ou htz faux (5/30)
16 MiSeqReporter (version Dx) + SeqNext (JSI Medical System) 2 pour lesquels une des muta$ons causales n est pas répertoriée c.2241_2248delgatactgc (2372del8) p.phe508del Discussion avec Illumina en perspec:ves d une améliora:on du kit 1) Améliora:on du design régions moins couvertes (exemple : exon 11 (30X)) chevauchement des amplicons sur les 2 brins? 2) Améliora:on du logiciel MiSeq Reporter (alignement, détec:on, ) SNV introniques flanquants iden:fiés mais non no:fiés (ex : c c>t)
17 Conclusions Aspects techniques : Protocole clair Facilité de manipula:on Rapidité : 2,5 jours Homopolymères ± lisibles IVS10 non analysé : c a>g (IVS11) IVS6b non analysé : c _ del (IVS7) Applica:on au diagnos:c au laboratoire : Mul:plexage de 6 échan:llons Coût par pa:ent : 1500 euros Compa:ble avec notre ac:vité (hors urgence) Perspec:ves Evalua:on de la technologie sur les CNV (CFTRdele2,3 CFTRdele22,23, autres? ) Merci à Fanny Verneau et JeanPierre Al:eri Merci à Caroline Raynal et Mireille Claustres Merci de votre a~en:on
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