Département de Microbiologie Unité de Virologie Hôpital C. Nicolle CHU Rouen

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1 Département de Microbiologie Unité de Virologie Hôpital C. Nicolle CHU Rouen Groupe de Recherche Antimicrobiens et Microorganismes (GRAM) Faculté de Médecine-Pharmacie Université de Rouen Diagnostic virologique de la Grippe Marie Gueudin Laboratoire associé au Centre National de Référence du VIH

2 Caractéristiques du virus de la grippe Famille des orthomyxoviridae genre Influenza virus type A, B ou C Virus à ARN segmenté, se liant au mucus (grec myxa ) par leur hémagglutinine (HA) Virus enveloppé La grippe : un virus très variable Glissement antigénique : mutation modérée des gènes codant pour les protéines de surface immunité conservée : épidémie saisonnière Cassure : - concerne uniquement les virus A - changement radical des protéines de surface perte de l immunité : pandémie

3 Sous type du virus de la grippe A Hémagglutinine Deux antigènes de surface: - Neuraminidase N : permet le relargage du virus, 9 types connus - Hémagglutinine H : responsable de la fixation de la particule virale à Neuraminidase un récepteur situé sur la cellule cible, 17 types différents Les sous-types du virus sont basés sur des différences antigéniques de ces 2 protéines : H1N1, H3N2 H5N1 (Aviaire)

4 Epidémies de grippe en France Année Une évolution constante des virus circulants. Année Influence sur l efficacité - de la vaccination - des outils de diagnostic

5 La grippe de l hiver Selon les données du Réseau des GROG -semaine 45, du lundi 5 novembre au dimanche 11 novembre 2012 : -Les virus grippaux sont présents mais restent discrets sur le territoire métropolitain. Les cas de grippe confirmée restent peu fréquents et sporadiques. Les trois types et sous-types de grippe A(H1N1), A(H3N2) et B circulent conjointement, sans qu on puisse encore dire celui qui sera dominant cet hiver. -Cela reste le bon moment pour vacciner contre la grippe les personnes à risque et ceux qui les prennent en charge. -La circulation du virus respiratoire syncytial(vrs) s intensifie partout en France et l épidémie de bronchiolite du nourrisson démarre, notamment en France Nord.

6 Prélèvement pour diagnostic grippe - introduire l'écouvillon dans une narine, aller le plus loin possible vers le naso-pharynx - frotter vigoureusement le coton de façon à détacher le plus possible de cellules épithéliales - décharger l'écouvillon dans le milieu de transport - avec le même écouvillon, refaire le même geste dans l'autre narine, puis casser l'écouvillon dans le milieu de transport -après identification, transporter à température ambiante Laisser l'écouvillon dans le milieu de transport, ne pas oublier de préciser la localisation de l'écouvillonage %2FNEJMe &aid=NEJMe _attach_1&area=

7 Échantillon contenant l antigène Techniques de diagnostic Principe des tests rapides : recherche des antigènes viraux par immunochromatographie Ac marqués dirigés contre l Ag

8 Échantillon contenant l antigène Par immunochromatographie Ac marqués dirigés contre l Ag Immobilisation des Ac ayant capturés l Ag

9 Échantillon contenant l antigène Par immunochromatographie Ac marqués dirigés contre l Ag Immobilisation des Ac ayant capturés l Ag Ac anti Ac = Ligne contrôle Échantillon Négatif Positif

10 Techniques de diagnostic Recherche des antigènes viraux par immunofluorescence Utilisation d Ac marqués par un composé fluorescent et dirigés contre les Ag viraux

11 Techniques de diagnostic Détection de génomes viraux par amplification génique = PCR Technique d amplification enzymatique qui permet à partir d un fragment d ADN d obtenir un très grand nombre de copies identiques de ce même fragment. Réaction réalisée in vitro et qui ne nécessite que très peu matériel génétique.

12 Protocole de mise en place de la chimio-prophylaxie dans une collectivité de personnes à risque lors d une épidémie de grippe, en période de circulation du virus grippal (Complément à la circulaire N 444 du 17 septembre 2004) Extraits du protocole : Pour un 1 er cas de syndrome grippal (cas 1) => aucun prélèvement n est fait. Si un 2ème cas apparaît dans les 3 jours qui suivent le 1er cas (cas 2) => un test de diagnostic rapide de la grippe est réalisé Si un 3ème cas dans les 3 jours qui suivent le 2ème cas (cas 3) => un test de diagnostic rapide de la grippe est réalisé Outils diagnostiques 2 types d outils de diagnostic : Les tests de diagnostic rapide de grippe par immuno chromatographie sur membrane Le diagnostic du type, à des fins de surveillance épidémiologique des virus circulant, qui nécessite des techniques développées par les CNR de la grippe Texte datant d avant 2009 donc avant le H1N1pdm09 Conduite à tenir devant des infections respiratoires aigues basses dans les collectivités de personnes âgées: en cours d actualisation

13 Performances des tests de diagnostic rapide Influenza type A Rapid tests Sensitivity, % Specificity, % PPV, % NPV, % Directigen EZ Flu A and B 82.1% 100% 100% 89.3% Binax Now Influenza A/B antigen kit 71.0% 100% 100% 84.0% Genedia influenza Ag 76.1% 100% 100% 86.2% Humasis Influenza A/B antigen test 79.1% 100% 100% 88.5% SD Bioline rapid influenza kit 82.1% 100% 100% 89.3% RT-PCR 98.5% 100% 100% 99.0% B Directigen EZ Flu A and B 40.7% 100% 100% 66.2% Binax Now Influenza A/B antigen kit 37.2% 100% 100% 64.9% Genedia influenza Ag 40.7% 100% 100% 66.2% Humasis Influenza A/B antigen test 41.8% 100% 100% 66.7% SD Bioline rapid influenza kit 47.7% 100% 100% 68.9% RT-PCR 97.8% 100% 100% 98.0% Evaluation of five rapid diagnostic kits for influenza A/B virus Chi Hyun Cho et al J Virol Methods Sep 8. pii: S patients (influenza A, n = 67; B, n = 86; negative samples, n = 100) Echantillons collectés entre janvier 2009 et décembre 2011

14 Performances des tests de diagnostic rapide sur des virus H1N1pdm09 Table I. Rapid Antigen Test Comparisons of Total Clinical Samples (N = 167) Using Real- Time and Culture as the Gold Standard Rapidtests Sensitivity(%) Specificity(%) PPV b (%) NPVc(%) BD Directigen EZ Flu A + B M Rapid Detection Flu A + B Binax Now Influenza A&B QuickVue Influenza A + B Remel X/pect A&B Performance of five FDA-approvedrapidantigentests in the detectionof 2009 H1N1 influenza A virusdeenae. Sutter 1,*, et al J Med Virol Nov;84(11): Les tests rapides n ont pas été adaptés aux variants H1N1pdm09

15 Influence de l âge sur la sensibilité des tests rapides Patients Positive Immunofluorescence False Negative Inpatients Children Sensitivity (95% CI) 75% (62 to 86) Positive Test rapide False Negative Sensitivity (95% CI) % (64 to 95) Adults % (30 to 61) Outpatients Children % (62 to 87) Adults % (62 to 86) Pour la grippe : l IF ne fait pas mieux que les tests rapides Chez patients hospitalisés : sensibilité adultes < sensibilité enfants Patients non hospitalisés : enfants moins jeunes que ceux hospitalisés et adultes moins âgés que ceux hospitalisés Effet de l âge sur l excrétion virale à prendre en compte Evaluation of Indirect Fluorescent Antibody Assays Compared to Rapid Influenza Diagnostic Tests for the Detection of Pandemic Influenza A (H1N1) pdm09 Sandra Nutter, 1 PLoSOne. 2012; 7(3)

16 Utilité des tests rapides grippe Une très bonne spécificité, une sensibilité souvent insuffisante. Résultat positif : fiable, présence de virus Résultat négatif : aucune conclusion possible, si symptômes évocateurs, réitérer le test, faire test PCR Les tests rapides grippe sont utiles si: - Pas de possibilité de faire le diagnostic rapidement par PCR - Les limites du test sont connues - Le test est réalisé sur plusieurs prélèvements - L épidémie est avec un sous type bien défini et que le test est adapté

17 PCR grippe Avantages : -Plus sensible que les tests rapides - adaptation rapide des techniques en cas d apparition d un nouveau variant - permet le sous typage pour une suivi épidémiologique Inconvénients : - Fait uniquement dans des laboratoires spécialisés - Cher Réalisée 3 fois/ semaine au laboratoire de virologie de Rouen (fréquence adaptée en fonction de l épidémie)

18 PCR grippe To test or to treat? An analysis of influenza testing and antiviral treatment strategies using economic computer modeling. Lee BY, McGloneSM,NCBI PLoS One Jun 23;5(6):e Findings were quite different for older adults (65+ years old). Routine PCR testing of ILI cases seems cost-effective when the probability of ILI being influenza is at least 10%. This presumes that PCR is available at the time of the clinic visit, results are rapidly available, and, if the test is positive, antiviral medications are initiated within 48 hours, which may not be feasible in many settings.

19 Merci de votre attention!

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