en transplantation rénale - E. Thervet (page 6) Les puces à ADN Résumé Résumé

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1 Protéomique et génomique Coordinateur : E. Thervet, service de transplantation rénale et de soins intensifs, hôpital Necker, Paris & Application des nouveaux outils moléculaires en transplantation rénale - E. Thervet (page 6) " Les puces à ADN - G. Guellaën & Intérêt des microarrays en transplantation - D. Anglicheau (page 18) & Protéomique et transplantation rénale Un exemple d utilisation clinique - E. Thervet (page 28) & Apport de l analyse du métabolome dans le biomarquage des toxiques et des pathologies - C. Junot, H. Benech, E. Ezan (page 36) Les puces à ADN " G. Guellaën* Résumé Résumé Les puces à ADN offrent de nouvelles voies d analyse de l expression et de la structure du génome d'un tissu normal ou pathologique. Parmi elles, les puces "pangénomiques" permettent de mesurer simultanément l expression des gènes humains, établissant ainsi une "signature" du transcriptome spécifique de différents organes ou cellules dans un état défini. Les gènes caractéristiques de cette "signature" peuvent ensuite être regroupés sur une puce dédiée, plus facile à mettre en œuvre en routine, pour le diagnostic d une affection ou le suivi des patients. Ces puces à ADN permettent également d analyser les altérations du génome ainsi que les polymorphismes associés à certaines pathologies. Elles sont donc un outil puissant, mais leur emploi reste délicat. La méthodologie doit être rigoureuse pour garantir la qualité des résultats. L élaboration de protocoles respectant des standards précis (MIAME) et la baisse des coûts devraient accroître leur utilisation en milieu hospitalier dans les prochaines années. Mots-clés : Puces à ADN - Profil d'expression - Transcriptome - Diagnostic. Le développement des puces à ADN, issues du Programme génome humain, ouvre de nouvelles possibilités pour : $ analyser le transcriptome des tissus dans des situations normales et pathologiques, permettant ainsi d améliorer le diagnostic de certaines maladies ; $ rechercher des altérations du génome (insertions, délétions ou duplications) ; $ détecter des polymorphismes. * Unité INSERM 581, hôpital Henri-Mondor, Créteil. Ce document présente principalement l utilisation des puces à ADN pour l étude du transcriptome, les deux autres applications, moins répandues, étant brièvement évoquées dans les deux derniers paragraphes. LE PROGRAMME GÉNOME HUMAIN ET LES PUCES À ADN La séquence complète des 2,85 milliards de nucléotides du génome humain révèle la présence d environ

2 gènes, dont les deux tiers ont une fonction connue (1). Ce nombre, relativement faible par rapport aux gènes attendus initialement, génère néanmoins un transcriptome (ensemble des ARNm exprimés à un instant donné dans un tissu) d une grande complexité. Cela résulte principalement de l existence de plusieurs promoteurs sur certains gènes et/ou d une maturation alternative des ARNm qui concernerait près de 50 % des gènes humains (2). Cette diversité dans l expression des transcrits peut être spécifique d un organe et de son état physiopathologique, ou transitoirement exprimée, mais également résulter de polymorphismes génétiques. Une telle variabilité dans les profils d expression est un atout si nous arrivons à l associer à un tissu dans un état donné. Les puces à ADN, développées dans ce but, sont constituées d un support, de la taille d une lame de microscope ou plus petit, sur lequel est ordonné un nombre de fragments d ADN, allant de par lame jusqu à /cm 2, chaque dépôt étant spécifique d un transcrit. L exploitation de cette puce consiste à hybrider ces séquences d ADN parfaitement répertoriées avec une sonde [1] marquée générée à partir de l organe dont on veut étudier soit l expression des gènes, soit la structure du génome ou ses polymorphismes. ÉTUDE DE L EXPRESSION DES GÈNES d ARNm (puces dédiées) dans un tissu donné suivant une méthodologie schématisée figure 1. Stratégie et déroulement de l expérimentation Au préalable, il est indispensable de programmer cette expérience pour pouvoir comparer les résultats avec ceux d autres groupes et avoir toute la lisibilité requise dans les publications. Pour cela, il est souhaitable de Protocole expérimental à établir suivant les critères MIAME suivre les recommandations (MIAME) ( groups/miame/miame_checklist.html) mises sur pied par la Microarray Gene Expression Data Society, incluant : $ la conception de l expérience ; $ les échantillons utilisés, leur préparation et le marquage des sondes ; $ la procédure d hybridation et ses paramètres ; $la récolte des données et leurs traitements ; $ les puces ADN utilisées. Figure 1. Principe général de l utilisation de puces à ADN pour l analyse de l expression de gènes. Puces "pangénomiques" Puces dédiées Tissu de départ A ARN Sondes Tissu de départ B Amplification Hybridation-Lavage Hybridation-lavage Comparaison de deux lames B A Hybridation compétitive A B Lame(s) hybridée(s) Acquisition - Normalisation - Enlèvement bruit de fond Analyse Elle consiste à donner un instantané sur le niveau d expression de tous les ARNm de gènes choisis (intégralité du transcriptome avec les puces pangénomiques ) ou d une sous-population [1] Pour nous conformer à l usage courant, nous appellerons sonde la molécule marquée, mais, au sens strict du terme, la sonde correspond aux séquences connues (i.e. les puces) et la cible au tissu étudié. Image de synthèse Validation Publications Dépôt dans les bases de données 10

3 Choix et mise en œuvre des puces L utilisation des puces à ADN conduit généralement à deux expériences successives. La première met en œuvre des puces pangénomiques, couvrant l intégralité des gènes humains, afin de générer une signature spécifique du tissu étudié ou d identifier plus spécifiquement les gènes impliqués dans le phénotype étudié. La deuxième expérience utilise des puces dédiées comportant les gènes sélectionnés à partir de la signature d intérêt. " Puces pangénomiques. Il est recommandé d utiliser des puces commerciales comme celles produites par Affymetrix, Agilent ou Amersham, entre autres. Les caractéristiques de trois d entre elles sont résumées dans le tableau I (3). Les puces Affymetrix et Agilent permettent d utiliser des quantités plus faibles d ARN (50 ng) que les puces Amersham (200 ng), mais ces dernières permettent des cinétiques d hybridation en milieu liquide plus sensibles. Les prix sont sensiblement les mêmes pour le traitement d une lame (de l ordre de euros fin 2004). Ces puces peuvent nécessiter un équipement spécifique, pas forcément disponible sur le site ; il peut donc être utile de les sous-traiter. " Puces dédiées. Ces puces comportent un plus petit nombre de gènes sélectionnés à partir des résultats obtenus sur les puces pangénomiques. Il peut être tentant d utiliser les résultats obtenus par d autres groupes, mais, dans ce cas, il faudra se conformer à la méthodologie publiée pour espérer obtenir des résultats interprétables. En effet, une étude a montré des résultats très différents obtenus à partir de puces Amersham, Affymetrix et Agilent hybridées avec une sonde préparée à partir d un même tissu (4). Ce manque d homogénéité peut s expliquer par des choix de séquences d oligonucléotides dans différentes régions d un même transcrit selon les plates-formes. Si l oligonucléotide choisi par un opérateur est dans un exon susceptible de disparaître lors de la maturation alternative d un transcrit, ou correspond à une position qui n est pas lue par la transcriptase inverse lors de la préparation de la sonde (voir plus loin), il n y aura pas de signal sur la lame. En revanche, un autre Tableau I. Quelques caractéristiques des trois principales puces commerciales utilisées en France (d après 3). Amersham (Codelink) Affymetrix Agilent Oligonucléotide 30 mer 25 mer 60 mer (dépôt dans un gel) (synthèse sur lame) (dépôt) Quantité d ARN 0,2 à 2 µg 0,05 à 5 µg 0,05 à 5 µg total nécessaire Marquage Streptavidine - Streptavidine - Cy3-Cy5 fluorophore fluorophore Sensibilité 1: : : Avantages Sensibilité Reproductibilité Sensibilité Cinétique d hybridation Plate-forme mature Reproductibilité en milieu liquide Plate-forme Lisible par différents scanners mature Inconvénients Qualité moyenne Oligonucléotides Cy5 sensible des dépôts courts à la dégradation (11 à 12 oligos par gène) par l ozone et faible sensibilité opérateur obtiendra un résultat positif s il choisit un oligonucléotide dans une région différente. Ces variabilités peuvent également résulter de polymorphismes entre les oligonucléotides fondés sur des séquences de départ différentes ou de sélection de nucléotides à partir de plusieurs gènes d une famille multigénique, mais également de sondes marquées et hybridées différemment suivant les protocoles. " Mise en œuvre des puces. L utilisation des puces à ADN nécessite l accès à une plate-forme disposant de robots pour préparer les milieux réactionnels, d un scanner compatible avec le système de puce utilisé et, enfin, d un support informatique performant. En effet, l analyse des données reste une des étapes les plus délicates pour exploiter correctement ce type d expérience. $ Pour le choix des dépôts sur la puce dédiée, les oligonucléotides longs (45-70 mer) sont les mieux adaptés (5). Cette longueur assure leur spécificité, et un seul oligonucléotide est utilisé par gène. Le choix de la position de l oligonucléotide sur le transcrit est important. Il est nécessaire de : s assurer de la spécificité de l oligonucléotide en comparant sa séquence avec l ensemble des séquences disponibles dans les bases de données ; choisir éventuellement un oligonucléotide à cheval sur deux exons pour limiter l hybridation à de l éventuel ADN génomique contaminant ; éviter des oligonucléotides trop en 5 sur l ARNm (les sondes ADNc synthétisées sont le plus souvent amorcées à partir de la région 3 des ARNm et une synthèse incomplète de la sonde ne recouvrirait pas la région correspondant à l oligonucléotide sélectionné) ; prendre en compte les zones soumises à de la maturation alternative, qui aurait un intérêt majeur si elle s avérait spécifique de l état physiopathologique du tissu étudié. 11

4 $ Lors de la préparation de la puce, il est souhaitable d introduire des dépôts témoins correspondant à des ARNm, si possible d expression constante, comme les gènes de ménage (même s ils ne sont pas parfaits, leur expression pouvant varier dans certaines situations) ou à des dépôts d ADN génomique. Il est également utile de déposer des gènes n existant que dans d autres espèces (plantes) servant de contrôle négatif. Préparation des ARN Il faut obtenir une quantité d ARN suffisante (de 50 µg à 5 µg suivant le type de puce) et un matériel de bonne qualité. Une telle quantité peut être obtenue sur une biopsie, mais si elle est trop faible, l alternative consiste à regrouper plusieurs biopsies ou à amplifier le matériel de départ. Le regroupement de plusieurs biopsies permet de se démarquer de l hétérogénéité des individus et des biopsies, mais cela nécessite plus de prélèvements, ce qui peut être un inconvénient s il faut une cohorte trop importante de patients comparables et ayant subi des traitements identiques. L amplification se présente sous deux formes : soit l amplification du matériel biologique par amplification linéaire ou par PCR, soit l amplification du signal (6). L amplification linéaire est fondée sur la transcription inverse de l ARN total en ADNc, puis, par transcription à partir de cette matrice, à effectuer plusieurs cycles de synthèse d ARNc. C est ainsi que sont préparées les sondes utilisées sur les puces Affymetrix ou Amersham (voir chapitre sur les sondes). La PCR, plus simple, permet un taux d amplification supérieur, mais elle peut introduire un biais plus important dans la représentativité de l expression des gènes que la technique précédente, tous les ARNm ne s amplifiant pas forcément de la même manière. Dans tous les cas, il faudra s assurer que la région amplifiée recouvre celle correspondant aux dépôts effectués sur les puces. L amplification du signal consiste à incorporer dans la sonde des nucléotides marqués qui seront ensuite détectés par un anticorps couplé à une enzyme amplifiant le signal (i.e. peroxydase) ou par d autres types de protéines (i.e. avidine-biotine) (voir ci-dessous). La qualité de l ARN est cruciale pour obtenir une sonde représentative du transcriptome du tissu étudié. Le critère communément admis est un rapport d intensité des bandes ribosomales 28S/18S de 1,8 après électrophorèse sur gel d agarose des ARN, ou sur un appareillage comme le Bioanalyseur 2100 d Agilent. Ce rapport est rarement atteint sur des biopsies humaines, et un rapport de 1,5 pourra être toléré. Préparation des sondes Le marquage dépend des puces préparées et de l appareillage disponible sur le site. Deux stratégies existent : $ l hybridation compétitive de deux sondes fluorescentes marquées au Cy3 et Cy5 sur une même lame ; $ la comparaison de deux lames hybridées chacune avec une sonde différente, marquée avec le même fluorophore. Pour l hybridation compétitive, un ARN préparé à partir d un tissu A est transformé en ADNc en incorporant un fluorochrome vert (Cy3), celui issu d un tissu B est marqué avec un fluorochrome rouge (Cy5). L hybridation de la lame se fait simultanément avec les deux sondes. Un gène surexprimé en A donnera un spot vert, un gène surexprimé en B donnera un spot rouge, un gène exprimé à un niveau comparable dans les deux situations donnera un spot jaune, avec toutes les gammes de couleurs intermédiaires en fonction de la représentativité de chacun des ARNm dans les deux tissus de départ (figure 1). Pour éviter toute distorsion due à des marquages différents entre le Cy3 et le Cy5, il est recommandé d hybrider une autre lame en inversant les marquages Cy3 et Cy5 des sondes utilisées (dye swap). L inconvénient majeur de ce type de sonde est l altération du Cy5 en présence d ozone, mais de nouvelles méthodes de lavage permettent d atténuer cet effet. La comparaison de deux lames consiste à hybrider l une d entre elles avec une sonde obtenue à partir du tissu A, l autre avec une sonde générée à partir du tissu B. Ces deux sondes sont obtenues en marquant de l ARNc à la biotine lors de sa synthèse (voir ci-dessus). Cet ARNbiotine est ensuite révélé par la streptavidine accrochée à un fluorochrome. Cette dernière technique est plus complexe à mettre en œuvre. Les sondes Cy3 et Cy5 sont plus sensibles et permettent d utiliser moins d ARN de départ. Cette méthodologie pourra donc être privilégiée pour les puces dédiées. Traitement du signal et analyse des données Une fois l hybridation, le lavage et la lecture des lames effectués grâce au scanner, il faut traiter le signal et analyser les données. Cela nécessite d une part la normalisation et l enlèvement du bruit de fond, d autre part l analyse des données. Différents logiciels sont disponibles pour ce type de travail, ainsi que plusieurs stratégies (7). Nous ne donnerons que les grands principes. " Normalisation et enlèvement du bruit de fond. Quel que soit le système utilisé, les lames doivent donner un signal d intensité similaire pour pouvoir être comparées entre elles (8), des variations pouvant survenir, dues à une hétérogénéité dans les dépôts, les marquages des sondes, etc. Cette normalisation peut se faire : $ en ajustant au même niveau la moyenne du logarithme du rapport des signaux entre les deux états considérés, 12

5 associée ou non à la normalisation de leurs distributions et de leurs écarts types. Cette méthodologie difficile à décrire en quelques lignes est bien expliquée sur le site ( oncology/microcore/html_resource/ tut_frameset.htm) ; $ par rapport à l expression de gènes de ménage ; $ par rapport aux signaux donnés par de l ADN génomique déposé sur la lame. Des techniques de normalisation spécifiques des hybridations compétitives (Cy5 et Cy3) sont également détaillées sur le site Web précédemment cité. Concernant le bruit de fond, seuls les spots présentant un signal supérieur à un certain seuil, habituellement 80 % au-dessus du bruit de fond, seront pris en compte. Ces opérations éliminent un certain nombre de clones. À titre d exemple, sur les gènes présents sur une puce pangénomiques, il ne reste en général que à gènes dont les profils d expression seront soumis à l analyse. " L analyse. Il existe plusieurs méthodes d analyse, incluant entre autres le regroupement hierarchique (clustering), l analyse en composantes principales ou les systèmes neuronaux (9, 10). Le clustering est la méthode la plus couramment présentée dans les publications. Elle consiste habituellement à générer une image en deux dimensions, avec les échantillons sur une dimension et les gènes sur l autre (figure 2). Plus des échantillons ont des profils comparables, plus ces profils sont proches les uns des autres sur la figure. Il en est de même pour les profils d expression des gènes. Chaque dimension peut être accompagnée de dendrogrammes, dont les longueurs sont inversement proportionnelles à la proximité des profils des échantillons ou des gènes. Il existe deux types de traitement des données pour effectuer ce clustering, soit supervisé, qui consiste à donner des informations sur la nature des échantillons lors du traitement des données, soit non supervisé, tous les échantillons étant traités en aveugle. Cette dernière méthode est la plus souvent utilisée en première approche, l analyse supervisée intervenant ensuite sur des puces dédiées. Validation des données Il est indispensable de valider les résultats obtenus de l analyse de puces à ADN. Deux situations peuvent se présenter suivant ce que l on recherche : $ des signatures permettant le classement d échantillons dans des souspopulations données ; $ des gènes directement impliqués dans la situation physiopathologique étudiée. Rejet aigu Normal Rejet chronique Figure 2. Clustering de profil d expression de gènes rénaux dans des biopsies de patients avec rejets aigus, greffons stables ou rejet chronique. Les gènes (rangées) et les patients (colonnes) sont regroupés sur la base de la similarité des profils identifiés pour l expression des gènes. Les gènes surexprimés ou sous-exprimés par rapport à la moyenne des gènes de tous les échantillons sont représentés en rouge et en vert respectivement. Les gènes exprimés de manière comparable sont représentés en noir. L absence de données est représentée en gris. La longueur des branches des dendrogrammes est inversement proportionnelle à la similarité des profils des échantillons (haut) et des gènes (gauche) [d après 16]. Dans le cadre prospectif d une recherche de signature, une validation croisée sur ses propres échantillons peut être suffisante. Pour cela, la signature issue de tous les échantillons dont on dispose, sauf un, doit permettre de prédire correctement le statut de l échantillon isolé. La valeur de la signature sera ensuite confortée par une validation indépendante. La signature doit alors être en mesure de donner le statut d échantillons qui n ont pas fait partie de l étude initiale. Ce deuxième type de validation est essentiel, comme cela été montré pour l utilisation des puces à ADN dans l étude de l évolution des cancers (11). Concernant la recherche de gènes directement impliqués dans le phénotype observé, la validation par RT-PCR quantitative est très utilisée. Néanmoins, il est souhaitable, lorsque cela est possible, de faire un Northern-Blot. Cette expérience, en plus de la spécificité d hybridation, fournira des infor- 13

6 mations sur la taille du transcrit étudié, confirmant ainsi que le gène analysé, s il est déjà connu, est bien le bon. Il faut garder à l esprit que les informations fournies ne concernent que les ARNm, qui ne sont qu un élément dans le phénotype observé. D autres régulations peuvent intervenir, comme le niveau d expression de la protéine correspondante, sa maturation post-traductionnelle, sa localisation cellulaire et son interaction avec d autres protéines. Accessibilité des résultats L analyse des puces à ADN génère une masse considérable d informations à mettre à la disposition de la communauté scientifique. Un moyen efficace consiste à déposer les résultats de ces expériences dans des bases de données publiques affectées à l utilisation des puces comme GEO ( nlm.nih.gov/projects/geo/) et Arrayexpress ( De nombreuses données sont également accessibles dans des bases privées. Une évaluation globale de l ensemble de ces bases est disponible sur le site de l ENS ( tools/data_management.php). HYBRIDATION GÉNOMIQUE COMPARATIVE Le principe de l hybridation génomique comparative sur puces (HGC-puce) repose sur le même principe que l hybridation génomique comparative sur chromosome métaphasique. La principale différence réside dans les cibles, qui sont représentées sur l HGC-puce par des fragments d ADN génomique clonés, amplifiés et déposés. La couverture intégrale du génome par ces fragments permet de détecter et de positionner des délétions, des insertions, des translocations et des duplications. Pour la préparation de telles puces, il faut partir d une banque d ADN génomique (ADN humain : 3000 Mb) clonée en BAC (capacité environ 0,1 à 0,3 Mb/BAC) ou en cosmides (capacité environ 0,04 Mb/cosmide) et procéder à des amplifications de chaque clone avant le dépôt sur la lame. Trois méthodes d amplification sont actuellement utilisées pour amplifier les clones de départ : la PCR de l ADN des clones coupée et liguée à un adaptateur (ligation-mediated PCR), la PCR amorcée avec des oligonucléotides dégénérés (DOP-PCR) et l amplification d ADN circulaire (rolling circle amplification). Ces techniques sont détaillées dans la revue (12). La comparaison des génomes consiste ensuite à : $ isoler l ADN du patient à étudier et l ADN témoin ; $ marquer chaque ADN avec une sonde fluorescente différente ; $ mélanger ; $ bloquer les séquences d ADN répétées du génome avec des séquences ADN répétées non marquées (i.e. ADN humain de cot 1) ; $ hybrider la puce à ADN ; $ analyser les résultats. La différence majeure entre les puces disponibles est leur résolution sur le génome humain, qui va d un Mbase jusqu à 100 Kb pour les puces les plus résolutives (± clones). À l avenir, on peut prévoir le développement de puces portant des oligonucléotides permettant une résolution de l ordre de la kilobase ; il faudra alors au minimum de dépôts sur la lame. Cette technique a déjà été employée pour détecter, par exemple, des anomalies génétiques dans le cancer (13), et elle aura certainement des développements dans le diagnostic de nombreuses maladies génétiques. Comme pour les travaux d analyse du transcriptome, des puces dédiées peuvent ensuite être préparées pour cibler des régions spécifiques du génome, comme cela a été fait pour la neurofibromatose (14). RECHERCHE DE POLYMORPHISMES La recherche de polymorphisme (SNP) peut également se faire par la technologie des puces à ADN, en utilisant pour les dépôts des oligonucléotides porteurs ou non du polymorphisme recherché. Pour cela, les puces électroniques à ADN sont un outil de choix (15). Cette puce, développée par la société Nanogen, est constituée d une cartouche contenant 99 sites de dépôt associés chacun à une microélectrode susceptible de créer un champ électrique. L activation de ce champ électrique sur un site depôt permet de fixer spécifiquement les oligonucléotides normaux et mutés, puis, lors de l expérience, de sélectionner les ADN que l on souhaite hybrider avec un dépôt donné. Toutes les combinaisons possibles entre sondes et cibles peuvent ainsi être obtenues. Un exemple de résultat est représenté sur la figure 3. Le coût moyen d un SNP par cette technologie est de l ordre de 2 euros. CONCLUSION Les puces à ADN sont un outil puissant qui permet de collecter un ensemble considérable de données sur le génome et son expression en un temps court et à partir de peu de matériel biologique. Cela reste une technologie onéreuse, surtout pour les puces pangénomiques, qui ne peut être mise en œuvre que sur une plate-forme bien équipée par des personnes compétentes, notamment dans le domaine de la bio-informatique. Une très grande rigueur est nécessaire dans l élaboration de ce type d expérience pour générer des résultats utiles pour la communauté et facilement échangeables avec d autres groupes. Malgré ces contraintes, la standardisation de leur utilisation et la baisse des coûts devraient promouvoir leur intro- 14

7 Fluorescence Sonde mutée 1 2 duction dans le milieu hospitalier, fournissant ainsi une aide précieuse pour le diagnostic de certaines affections et le suivi des patients. % R É F É R E N C E S B I B L I O G R A P H I Q U E S 1. Finishing the euchromatic sequence of the human genome. Nature 2004;431: A Sonde sauvage Figure 3. Détection de polymorphismes en position 122 du promoteur du gène du facteur VII, en vert le génotype normal, en rouge le muté. L échantillon 36A permet de normaliser. Il y a dans cette expérience cinq hétérozygotes (1, 3, 4, 6, 13) [d après 15]. 2. Modrek B, Lee CJ. Alternative splicing in the human, mouse and rat genomes is associated with an increased frequency of exon creation and/or loss. Nat Genet 2003:34: Hardiman G. Microarray platforms comparisons and contrasts. Pharmacogenomics 2004;5: Tan PK, Downey TJ, Spitznagel EL et al. Evaluation of gene expression measurements from commercial microarray platforms. Nucleic Acids Res 2003;31: Mansfield ES, Sarwal MM. Arraying the orchestration of allograft pathology. Am J Transplant 2004; 4: Livesey J. Strategies for microarray analysis of limiting amounts of RNA. Brief Funct Genomic Proteomic 2003;2: Napoli C, Lerman LO, Sica V, Lerman A, Tajana G, de Nigris F. Microarray analysis: a novel research tool for cardiovascular scientists and physicians. Heart 2003;89: Benes V, Muckenthaler M. Standardization of protocols in cdna microarray analysis. Trends Biochem Sci 2003;28: Boussioutas A, Haviv I. Current and potential uses for DNA microarrays in transplantation medicine: lessons from other disciplines. Tissue Antigens 2003;62: Kaminski N, Friedman N. Practical approaches to analyzing results of microarray experiments. Am J Respir Cell Mol Biol 2002;27: Ntzani EE, Ioannidis JP. Predictive ability of DNA microarrays for cancer outcomes and correlates: an empirical assessment. Lancet 2003;362: Mantripragada KK, Buckley PG, de Stahl TD, Dumanski JP. Genomic microarrays in the spotlight. Trends Genet 2004;20: Albertson DG, Pinkel D. Genomic microarrays in human genetic disease and cancer. Hum Mol Genet 2003;12,spec.N o 2:R Mantripragada KK, Buckley PG, Jarbo C, Menzel U, Dumanski JP. Development of NF2 gene specific, strictly sequence defined diagnostic microarray for deletion detection. J Mol Med 2003; 81: Santacroce R, Ratti A, Caroli F et al. Analysis of clinically relevant single-nucleotide polymorphisms by use of microelectronic array technology. Clin Chem 2002;48: Chua MS, Mansfield E, Sarwal M.Applications of microarrays to renal transplantation: progress and possibilities. Front Biosci 2003;8:s