FACULTE DE MEDECINE DE SFAX. Laboratoire d Histologie

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1 UNIVERSITE DE SFAX ANNEE UNIVERSITAIRE FACULTE DE MEDECINE DE SFAX Laboratoire d Histologie 1 ème ANNEE MEDECINE COURS D EMBRYOLOGIE GENERALE LA FECONDATION Préparé par : Pr. Ag Leila Keskes

2 PLAN DU COURS 1. INTRODUCTION 2. PRINCIPAUX EVENEMENTS PRECEDANT LA FECONDATION 2.1 Insémination et transit des spermatozoïdes dans les voies génitales 2.2 Capacitation 3. PHENOMENES CYTOLOGIQUES DE LA FECONDATION 3.1 Traversée du cumulus oophorus et fixation sur la zone pellucide 3.2 Réaction acrosomique et traversée de la zone pellucide 3.3 Fusion des gamètes et activation de l ovocyte 3.4 Incorporation et transformation du spermatozoïde 3.5 Amphimixie 4. ANOMALIES DE LA FECONDATION 4.1 Fécondation anormale avec gamètes normaux 4.2 Fécondation anormale avec gamètes anormaux 4.3 Absence de fécondation 5. INSEMINATION ARTIFICIELLE ET FECONDATION IN VITRO (FIV) 5.1 INSEMINATION ARTIFICIELLE Insémination intra-vaginale Insémination intra-cervicale Insémination intra-utérine Insémination intra-péritonéale 5.2 FECONDATION IN VITRO ET TRANSFERT EMBRYONNAIRE (FIVETTE) 5.3 TECHNIQUES DE FECONDATION ASSISTEE

3 1. INTRODUCTION La fécondation est l union d un gamète femelle (ovule) et d un gamète mâle (spermatozoïde). Le résultat de cette union est un œuf ou zygote. La formation du zygote marque le début du développement embryonnaire d un nouvel individu. La fécondation se déroule in vivo dans les voies génitales féminines, dans la portion ampullaire de la trompe utérine (figure 1). Figure1 : Lieu de déroulement de la fécondation naturelle La fécondation est précédée de certain événements préliminaires et ses conséquences biologiques sont : * le rétablissement de la diploïdie par la fusion des deux lots haploïdes de chromosomes. * la détermination du sexe du zygote. Lorsque le spermatozoïde est porteur d un chromosome sexuel Y, le génotype du zygote sera du type masculin (44+ XY) ; lorsqu il est porteur d un chromosome sexuel X, le génotype sera féminin (44 + XX).

4 2. PRINCIPAUX EVENEMENTS PRECEDANT LA FECONDATION. 2.1 Insémination et transit des spermatozoïdes dans les voies génitales * L insémination est le dépôt des spermatozoïdes et du liquide séminal dans le vagin lors d un rapport sexuel. Le sperme d un homme fertile a un volume moyen de 3,5 ml et contient au moins 20 millions de spermatozoïdes / ml. Sur les dizaines de millions de spermatozoïdes déposés dans le vagin, seuls quelques centaines de milliers s engagent dans le canal cervical (figure 2). Les autres meurent rapidement à cause du ph acide du vagin, défavorable pour leur survie. Figure 2 : Insémination des spermatozoïdes et migration dans les voies génitales féminines * Dans le canal cervical les spermatozoïdes doivent traverser la première barrière physiologique : la glaire cervicale. Celle-ci est un hydrogel produit par les glandes exocrines muqueuses du col utérin et présente en période péri-ovulatoire les caractères physico-chimiques les plus favorables à l ascension des spermatozoïdes vers l utérus : il est abondant, peu visqueux, à ph alcalin et riche en eau, en électrolytes et en acides aminés. La plupart des spermatozoïdes engagés dans le canal cervical restent emprisonnés dans la glaire et les cryptes glandulaires. Seuls quelques milliers de spermatozoïdes bien mobiles, de structure normale traversent cette barrière et arrivent dans la cavité utérine au bout de quelques dizaines de minutes (figure 2).

5 * A partir de l utérus, les spermatozoïdes remontent rapidement jusqu au tiers externe de la trompe de Fallope, où se déroule normalement la fécondation (figure 1). Ce transit rapide est assuré grâce à la mobilité des spermatozoïdes, aux contractions musculaires de l utérus et des trompes et aux battements ciliaires de l épithélium tubaire. Seuls 300 à 500 spermatozoïdes atteignent le site de la fécondation ; les autres meurent et seront phagocytés par les macrophages. 2.2 Capacitation La capacitation correspond aux modifications cellulaires et moléculaires subies par le spermatozoïde dans les voies génitales femelles qui le préparent à subir la réaction acrosomique (RA) et à traverser la zone pellucide (ZP). Elle s accompagne d une élimination des protéines fixées par des liaisons non covalentes et d une redistribution de certaines protéines membranaires, entraînant la déstabilisation de la membrane plasmique et la création de zones fluides, pauvres en protéines. Ces zones sont les futurs points de fusion entre la membrane plasmique et la membrane acrosomique, lors de la RA. Au cours de la capacitation, le déplacement des spermatozoïdes se transforme en un mouvement non linéaire, caractérisé par un battement flagellaire de forme asymétrique et de forte amplitude. Cette mobilité hyperactivée et faiblement progressive, contribue à la traversée des couches périovocytaires. 3. PHENOMENES CYTOLOGIQUES DE LA FECONDATION 3.1 Traversée du cumulus et fixation sur la zone pellucide Les quelques centaines de spermatozoïdes capacités qui arrivent au niveau du tiers externe de la trompe de Fallope, entrent en contact avec les cellules folliculeuses périovocytaires dissociées par un gel d acide hyaluronique (figure 3). Grâce à une enzyme, l hyaluronidase associée à la membrane externe des spermatozoïdes, la matrice extracellulaire est hydrolysée et les cellules du cumulus oophorus sont dispersées ; les cellules de la corona radiata sont détachées de la ZP.

6 Figure 3 : Spermatozoïdes autour de l ovocyte à féconder Ainsi, plusieurs spermatozoïdes se fixent par des liaisons spécifiques d espèces sur cette dernière (figure 4). L adhésion se produit par interaction entre des glycoprotéines membranaires du spermatozoïde et des glycoprotéines spécifiques de la ZP. Il s agit de la ZP1, ZP2 et ZP3. La ZP3 assure la fixation primaire du spermatozoïde dont l acrosome est encore intact. Après la réaction acrosomique, la ZP2 assure le maintien de cette liaison en ce fixant à la membrane interne de l acrosome. La ZP1 forme des ponts d union entre les filaments glycoprotéiques de la ZP, formés de ZP1 et ZP2. Figure 4 : Fixation du spermatozoïde à la ZP3 et réaction acrosomique 3.2 Réaction acrosomique et traversée de la zone pellucide La réaction acrosomique se produit au contact de la ZP. L adhésion des spermatozoïdes à la ZP déclenche une entrée brutale de Ca++ qui favorise la fusion

7 de la membrane externe de l acrosome à la membrane plasmique du spermatozoïde en déstabilisant les membranes et en activant des phospholipases membranaires. Cela donne lieu à la formation de vésicules membranaires et de fenêstrations (figure 5), et entraîne la libération des enzymes acrosomiales activées par l entrée du Ca++, en particulier la proacrosine activée en acrosine. Cette enzyme permet la traversée de la ZP en la rendant perméable aux spermatozoïdes. Après la RA, le spermatozoïde traverse la ZP, animé d un mouvement qui lui confère une force propulsive importante (fig 21). L hyaluronidase libérée par l acrosome au cours de la RA, facilite la traversée de la ZP en hydrolysant l acide hyaluronique contenu dans les mailles de la ZP dont la texture est modifiée par l acrosine. Acrosome intact Fusion membranaire Acrosome réagi Figure 5 : Réaction acrosomique 3.3 Fusion des gamètes et activation de l ovocyte Parmi les spermatozoïdes fixés, un seul traverse la ZP et entre en contact avec la membrane plasmique de l ovocyte (figure 6). Les deux membranes fusionnent progressivement jusqu à incorporation totale du spermatozoïdes dans l ovocyte. Le début de la fusion provoque une décharge de Ca++ à partir du réticulum endoplasmique lisse (REL) de l ovocyte et induit son activation qui se manifeste par deux événements :

8 Figure 6 : Etapes de la traversée de la ZP et de l entrée du spermatozoïde fécondant dans l ovocyte * la réaction corticale, c est à dire la libération par exocytose du contenu des granules corticaux dans l espace périvitellin. Les enzymes hydrolytiques libérées provoquent l hydrolyse partielle de ZP2 et le durcissement de la ZP la rendant infranchissable par d autres spermatozoïdes, empêchant ainsi la polyspermie. * la reprise de la méiose qui s achève par la production du deuxième globule polaire dans l espace périvitellin et d un pronucléus ou pronoyau femelle haploïde et à chromatine condensée (figure 7). A B Figure 7 : Formation des pronucléï et émission du deuxième globule polaire

9 3.4 Incorporation et transformation du spermatozoïde Parallèlement à la reprise de la méiose, le flagelle du spermatozoïde se détache de la tête puis dégénère et le noyau subit un certain nombre de modifications. Il perd immédiatement son enveloppe nucléaire, la chromatine se décondense progressivement par élimination des protamines et leur remplacement par des histones. Il se forme alors un pronucléus mâle qui s entoure d une nouvelle membrane nucléaire. La chromatine du pronucléus femelle se décondense plus tardivement et pendant quelques heures, les deux pronucléus se distinguent par un état de condensation plus poussé de la chromatine femelle. Au fur et à mesure de leur formation, les deux pronucléus, initialement périphériques, se rapprochent l un de l autre et de la région centrale du zygote (figure 7). Environ dix heures après la pénétration du spermatozoïde, les deux pronucléï sont en place l un à côté de l autre dans la région centrale de l œuf ; chacun d eux est le siège d une réplication de l ADN qui prépare la première division de segmentation. 3.5 Amphimixie et première division de segmentation Immédiatement après l entrée du spermatozoïde et la formation des deux pronucléï, le zygote entre en prophase, au cours de laquelle s individualisent les chromosomes. Un fuseau mitotique se met en place par polymérisation des microtubules à partir du centriole proximal dupliqué du spermatozoïde. Les enveloppes nucléaires disparaissent et les chromosomes viennent se placer autour de la plaque équatoriale métaphasique. La première division de segmentation marque le début du développement embryonnaire (figure 8). Figure 8 : Deux cellules filles issues de la première division de segmentation d un œuf fécondé

10 4. ANOMALIES DE LA FECONDATION Une fécondation anormale est à l origine d un zygote anormal qui est le plus souvent destiné à être avorté très précocement. On distingue plusieurs situations anormales : 4.1 Fécondation anormale avec gamètes normaux : c est le cas lorsque deux ou plusieurs spermatozoïdes pénètrent dans l ovocyte. C est la polyspermie responsable de triploïdie ou de polyploïdie. 4.2 Fécondation anormale avec gamètes anormaux : ce sont surtout les anomalies chromosomiques qui peuvent être mineures ou létales et touchent soit l ovocyte soit le spermatozoïde. Exemples : * L absence d émission du premier ou du deuxième globule polaire aboutissant à la formation d un ovocyte diploïde et d un zygote triploïde. * La pénétration dans un ovocyte haploïde d un spermatozoïde diploïde (diplospermie). Le zygote est alors également triploïde. 4.3 Absence de fécondation : parfois, la fécondation ne peut pas avoir lieu pour des raisons diverses. Exemples : * les anomalies importantes de la gamétogenèse,. * les malformations ou obstructions des voies génitales. * les anomalies de la glaire cervicale. * la présence d anticorps anti-spermatozoïdes * les troubles sexuels, etc INSEMINATION ARTIFICIELLE ET FECONDATION IN VITRO (FIV) Ce sont les techniques médicales de procréation médicalement assistée (PMA) destinées à faciliter la procréation, en court-circuitant les obstacles à la fécondation naturelle par rapport sexuel. Ces techniques nécessitent un traitement du sperme in vitro dans le but d éliminer le liquide séminal et ses facteurs inhibiteurs du pouvoir fécondant des spermatozoïdes et de sélectionner les spermatozoïdes ayant une bonne mobilité. Elles nécessitent également une stimulation et une induction de l ovulation suivies en cas de FIV par une ponction ovocytaire.

11 5.1 INSEMINATION ARTIFICIELLE Il s agit de déposer du sperme à l aide d une seringue ou d un dispositif adapté, dans les voies génitales féminines Insémination intra-vaginale Elle est réservée au cas où l homme présente une impuissance érectile mais, est capable d éjaculer par masturbation Insémination intra-cervicale Elle est indiquée en cas d oligo-asthénospermie ou oligospermie pure. Son but est de protéger les rares spermatozoïdes de l acidité du milieu vaginal Insémination intra-utérine (figure 9) Elle trouve son indication lorsque l éjaculation par rapport sexuel ne permet pas l ascension d un nombre suffisant de spermatozoïdes dans la cavité utérine. Son objectif donc est d éviter au sperme de franchir le mucus cervical, soit parce que ce dernier est perturbé, soit que les spermatozoïdes sont incapables de le traverser (oligo-asthénospermie, auto-immunisation, éjaculation rétrograde). L inconvénient de cette technique est de réaliser un afflux massif et rapide de spermatozoïdes dans les trompes. Cet inconvénient oblige à rechercher une synchronisation de l ovulation. Figure 9 : Insémination intra-utérine (IIU)

12 5.1.4 Insémination intra-péritonéale Les spermatozoïdes sélectionnés sont inséminés dans la cavité péritonéale par injection trans-vaginale. Elle a les mêmes indications que l insémination intrautérine. 5.2 FECONDATION IN VITRO ET TRANSFERT EMBRYONNAIRE (FIVETTE) La première naissance d un bébé humain par FIVETTE est survenue en En 1990, environ enfants sont nés de part le monde. Les indications de la FIVETTE sont nombreuses ; la principale est la stérilité tubaire ; les autres indications sont : - les stérilités inexpliquées - les échecs des autres PMA - les anomalies du sperme - l azoospermie obstructive Les ovocytes obtenus par stimulation de l ovulation sont ponctionnés sous échographie (figure 10). A B Figure 10 : Repérage des follicules ovariens par échographie (A) et ponction ovocytaire (B) Les spermatozoïdes sont préparés comme pour l insémination artificielle. Le nombre de spermatozoïdes mis en contact d un ovocyte est de l ordre de L insémination est réalisée dans des récipients appropriés (figure 11).

13 La culture se déroule à 37 dans l obscurité en présence de 5% de CO2, de 5% d O2 et de 90% de N2. La fécondation est vérifiée 24H après l insémination. Elle est attestée par l existence de deux pronucléï et de deux globules polaires dans l espace péri-vitellin. L embryon de deux à quatre cellules est transféré dans l utérus 48H après la ponction à l aide d un cathéter à travers le canal cervical (figure 11). Le taux de grossesse par cette technique peut atteindre dans les stérilités tubaires pures 25%. Figure 11 : Principales étapes de la fécondation in vitro 5.3 TECHNIQUES DE FECONDATION ASSISTEE Lorsque les caractéristiques et ou les fonctions spermatiques sont trop altérées, la FIVETTE se solde souvent par un échec. Ainsi, les techniques de fécondation assistée, permettent de supprimer ou de franchir une ou plusieurs barrières naturelles protégeant l ovocyte : cumulus oophorus, zone pellucide, membrane plasmique et permettent ainsi de réduire jusqu'à un le nombre de spermatozoïdes nécessaires. Toutefois, ces techniques nécessitent une micromanipulation des gamètes à l aide de micromanipulateurs adaptés sur un microscope inversé et de micropipettes. Celles-ci servent d une part à tenir l œuf par aspiration douce et d autre part à

14 microdisséquer la zone pellucide ou microinjecter les spermatozoïdes dans le cytoplasme ovocytaire. Les principales techniques de fécondation assistées sont : La perforation de la zone pellucide (zona drilling): consiste à perforer ou disséquer partiellement la zone pellucide chimiquement grâce à une solution de tyrode acide, ou mécaniquement à l aide d une ou deux micropipettes de verre. L inconvénient de cette technique est le taux élevé de polyploïdie. Actuellement cette technique est en voie d abandon au profit des techniques de microinjection. La microinjection sous la zone pellucide (SUZI) : consiste à injecter dans l espace périvitellin quelques (5 à 10) spermatozoïdes au contact de la membrane plasmique de l ovocyte. Un seul spermatozoïde ayant subi la réaction acrosomique fusionne avec la membrane plasmique. La microinjection intracytoplasmique (ICSI) : consiste à microinjecter un seul spermatozoïde dans le cytoplasme ovocytaire (figure 12). Cette technique court-circuite l étape de fusion membranaire et permet d obtenir des fécondations même avec des têtes spermatiques uniquement ou des spermatozoïdes épididymaires ou encore des spermatides. Elle est actuellement très largement utilisée et donne des résultats bien supérieurs à ceux obtenus par la technique précédente. Le risque de polyspermie est quasi nul. pipette spermatozoïde ovocyte A Figure 12 : Technique de microinjection (ICSI) B