Diagnostic et suivi virologique des hépatites virales B et C. Marie-Laure Chaix Virologie Necker

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1 Diagnostic et suivi virologique des hépatites virales B et C Marie-Laure Chaix Virologie Necker

2 OUTILS DIAGNOSTIQUES VHC Transaminases Recherche des Anticorps! Tests indirects - Anticorps! ELISA! RIBA (Immuno-blots)! Sérotype! Indication! Dépistage Recherche du virus!tests directs - Génome!RT-PCR - TMA!bDNA (ADN branchés)!génotype!test direct - Antigène!Indications!Hépatite aiguë!traitement!populations particulières : hémodialysés, Immunodéprimés Positif : contact avec le virus Positif : infection active contaminant / évolution

3 Profil des différents marqueurs lors d une hépatite C aiguë ou chronique Transaminases (xn) HCV-Ag ARN HCV-Ag ARN EIA Jours Transaminases Hép. Aiguë Transaminases Hép. Chronique

4 Les Marqueurs Sériques Différence Ag/Ac : 42 jours Contamination J-0 J-15 J-14 ARN Ag J-57 ELISA 3 J-70 J- >100 ELISA 2 ELISA Marqueurs directs Marqueurs indirects

5 Tests de Dépistage Mise en évidence des Ac dirigés contre le VHC!format : ELISA ou dérivés!evolution de 3ème génération!bonne sensibilité / spécificité!choix du biologiste : deux techniques différentes Tests dits de confirmation : Immuno-blots Mise en évidence des Ac dirigés contre certains Ag du VHC!format : bandelettes!bonne spécificité mais sensibilité médiocre!permet un suivi du profil (séro- ou déséro - conversion)!coût important Lacunes : "Positivité tardive : fenêtre sérologique "Immuno-dépression "Transfert passif

6 Tests de Biologie Moléculaire Amplification de la cible Amplification du signal Virus, bactérie ou cellule Cible ARN ou ADN TMA Ajouter primers & enzymes PCR Ajouter primers & enzymes bdna Ajouter sondes et ADN branché Copies (ARN) Copies (ADN) 1 sonde de détection par copie 1 sonde de détection par copie amplifiée Plusieurs sondes de détection par cible

7 copies / ml UI / ml 8 M UI/mL 200 M UI /ml Seuil thérapeutique : UI/mL Monitor Roche 600 à UI/mL Versant RNA à 8 M UI/mL Amplicor Roche : 50 UI/mL TMA : 10 UI/mL LCx Abbott 25 à 2,3 M UI/mL Cobas Taqman ROCHE 30 à 200M UI/mL 1 Test Idéal???

8 Indications des tests de biologie moléculaire! Dépistage :! Mise en défaut des tests sérologiques! Fenêtre sérologique (phase aiguë) #! Mise en évidence du génome viral Marqueur direct :! Confirmation de tests sérologiques! Objectivation d une infection active! Indication / suivi thérapeutiques! Quantification du génome viral :! Mise en place d un traitement! Suivi thérapeutique! Caractérisation génétique :! Adaptation thérapeutique (génotype )! Suivi thérapeutique (résistance )! Etude épidémiologique

9 nt C E1 E2 NS2 NS3 Génotypage nt 5' 3' * Séquençage RFLP Hybridation inverse 4a NS4 4b 5a NS5 5b nt Séquençage : référence poly U ou polya! Mise en évidence de séquences génomiques spécifiques de type et sous type : 5 NC ou NS5B! NS5B : meilleur sous-typage! Bonne sensibilité! Méthodes techniquement difficiles et coûteuses! Discussion de la région à utiliser en fonction de l'objectif! Notion de ré-infection

10 1b-D bUNK M b1R D bGEN M b-A F b-A F bJTB D bHD-1 U b2R D b3S D b-FR.ILS b-A B b3R D b-A F bJ483 D bJ D a a a a a a aJ1 D a I21 1a GM2 1aH M67463 Rice 3 5a-A F a-SA aEUH1480 Y a-SA a-34REV a-SA aNZL1 D aK3a D b g-IND a-Y a-HK a a-EG a-EG b-LQ bJ8 D b-T c-D k-A B FR-IL-E aJ6 D a-FR.IL-F a-A B Arbre phylogénétique de la région NS5B (220nt) 0.05

11 Génotypage : Inno-Lipa

12 Génotypage : Inno-Lipa

13 VIROLOGIE PEG-IFN Ribavirine CLINIQUE VHC Foie Virémie Génotype??? alpha2-macroglobuline haptoglobine apolipoprotéine A1 bilirubine totale! glutamyl transpeptidase. ALAT PBH FT

14 Influence de différents paramètres sur la réponse au traitement Le génotype La charge virale TREATMENT OF HEPATITIS C: THE STATE OF THE ART Hepatitis Annual Update 2003 Gary L. Davis La fibrose Le poids L'âge

15 Naive HCV Genotypes 2/3 Patients PegIFN-!2a/ 2a/wk ribavirin/d 81% 93% 79% All (n=224) Genotype 2 (n=42) Genotype 3 (n=182) (Zeuzem et al., EASL 2004)

16 Sérologie Hépatite C (dépistage) Positive Proposition d'algorithme décisionnel simplifié Négative avec notion d'hépatite "PCR" DU VHC Positive Réplication du VHC Négative Appréciation de l'atteinte hépatique Guérison Traitement? OUI NON

17 TRAITEMENT? OUI GÉNOTYPE 2 ou 3 1,4,5,6 VIREMIE QUANTITATIVE J0 - M3 Intérêt de la charge virale précoce S4 < 2 Log réduction ARRET > 2 Log réduction ou virémie indétectable Bi-thérapie 6 mois Bi-thérapie 12 mois Virémie sensible fin de TT Virémie sensible 6 mois après fin de TT

18 Cinétiques Virales précoces 270 patients traités par Peg-IFN!-2a ribavirine VL Decrease (log copies/ml) copies 0 > 0.5 > 2.0 Pas de réponse (~8%) Réponse partielle (4 %) Réponse rapide (~64 %) Réponse lente (~24 %) ETR 270 malades naïfs Pegasys 180!g Copegus 1000/1200mg/j 1 3 mois Zeuzem et al. J Hepatol 2005;43:

19 Valeur prédictive de la disparition de la virémie* à S4, S12, S24 sur la réponse soutenue 263 pts (génotype 1) traités par Peg-IFN!-2a ribavirine 48s S4 S12 S24 N (%) RVS (%) ARN/neg 33 (13) 30 (90) ARN/neg 113 (43) 79 (72) ARN/neg 54 (20) 24 (45) ARN/pos 63 (24) 1 (1) * Seuil 50UI/ml. Ferenci P et al, J Hepatol 2005,43,425-33

20 Le Génome du VHB $ Virus à ADN de 3,2Kb partiellement double brin (brin court) $ 4 ORF Chevauchantes $ Enveloppe $ AgHBc, AgHBe $ Polymérase, $ HBX (Transactivateur oncogènes cell, Transactivateur transcrits viraux) $ Rétro Transcription

21 VARIANTS NÉGATIFS POUR L! AgHBe PROMOTEU PRE-C C R * * * TAG mrna arrêt des synthèses protéiques Diminution de l expression l de l AgHBe Protéine AgHBe

22 Diagnostic Virologique du VHB MARQUEURS DIRECTS de la réplication virale - Ag HBs (tres immunogène) - Ag HBe (marqueur de replication) - ADN viral (PCR ou hybridation) - Ag HBc intrahépatocytaire MARQUEURS INDIRECTS liés à la réponse immune - Ac anti HBs - Ac anti Hbe (arrêt de la Xtion virale) - Ac anti HBc IgM - Ac anti HBc IgG

23 Marqueurs Biologiques Hépatite Incubation Aiguë Chronique Guérie UI/mL Ag HBs Ag HBs Ag HBs Ag HBs Ag HBs Ac HBs Ag HBe Ag HBe Ag HBe Ag HBe Ag HBe Ac HBe Ac HBe Ac HBe IgM HBc IgM HBc IgM HBc IgM HBc IgM HBc IgG HBc IgG HBc IgG HBc IgG HBc IgG HBc Immunotolérance Séro conversion Clairance Temps

24 Profils et marqueurs clés de l'infection par le VHB Ag HBs Anti-HBs IgM HBc Anti- HBc AgHBe Anti-HBe ADN-VHB Aiguë /- /- /- Guérie (-) - /- Vaccination (>10UI/L) Chronique 6 mois Active /- inactive - Indétect. Mutant précore - Réactivation /- /-

25 PERFORMANCES DES TROUSSES DE QUANTIFICATION DE L ADN DU HBV SEUILS ADN branché - 1 ère génération copies/ml - 2 ème génération copies/ml ADN/ARN (Hybrid capture) - Sensible copies/ml ou 0,5 pg d ADN/ml - Ultra sensible copies/ml ou 0,017 pg d ADN/ml PCR (Monitor) - Amplicor copies/ml - Cobas 200 copies/ml PCR temps réel 100 à 1000 copies/ml (12 UI/ml) SPÉCIFICITÉS DE 97,8 À 99,2 %

26 HBV DNA Assays Ranges of Detection 9 PCR Temps réel HBV DNA Log 10 Copies/mL V2.0 V3.0 2 Titer COBAS Monitor Taqman) (PCR) COBAS format (PCR) bdna Liquid Hybridization Hybrid Capture (2 methods)

27 HBV DNA Thresholds Serum HBV DNA (copies/ml) HBeAg () CHB HBeAg (-) CHB Inactive Carrier State

28 Les différents tableaux VHB Définitions Hépatite B chronique Porteur inactif Hépatite B résolue Critères diagnostiques 1. Ag HBs positif > 6 mois 2. CV VHB > 10 5 copies/ml 3. Transaminases > N (persistantes ou transitoires) 4. PBH : signes hépatite chronique Ag HBe/anti-HBe- Ag HBe-/anti-HBe 1. Ag HBs positif > 6 mois 2. Ag HBe - /anti-hbe 3. CV VHB < 10 5? copies/ml 4. Transaminases = N (perm.) 5. PBH : pas de signe hépatite 1. Antécédents connus ou anti-hbc (anti-hbs) 2. Ag HBs - 3. CV VHB non détectable 4. Transaminases = N (perm.) D'après Keeffe et al Clin. Gastro. Hepatol. 2:2

29 Les traitements : suivi maintien du niveau de charge virale le plus bas possible ( UI/mL) Séroconversion Hbe-Séroconversion HBs! Marqueurs biochimiques :! Cytolyse! CHC (AFP)! Marqueurs virologiques :! Sérologie : AgHBe / anti-hbe! Réplication virale : Méthode sensible et quantitative!préthérapeutique!per thérapeutique tous les 3 mois puis tous les 6 mois, et selon clinique et marqueurs de cytolyse! Marqueurs cliniques :! Atteinte histologique : PBH, Fibrotest! Suivi cirrhose

30

31 Gène de la polymérase du VHB et position des principales mutations Terminal protein spacer Pol/RT (rt1) (rt 344) RNaseH 845 a.a. I(G) II(F) GVGLSPFLLA YMDD A B C D E mutants résistants à la lamivudine rt L180M Rt V173L rt M204I/V Gene HBs

32 HBV Resistance Mutations Terminal protein Spacer Pol/RT RNaseH 845 a.a. I(G) II(F) GVGLSPFLLA YMDD A B C D E Lamivudine/FTC Entecavir LdT V173L L180M M204I/V/S M204I/V T184G S202I M250V M204I Adefovir A181V N236T

33 Ampleur du Problème : Incidence de la résistance aux antiviraux Eviter la succession de traitements et préférer l'adjonction d'une nouvelle molécule à celle déjà utilisée

34

35 Indications de la PCR (selon J.O. 14/02/01) En cas de sérologie VHC positive " M.e.e. d une réplication virale " Diagnostic de l infection chez enfant né de mère infectée par le VHC " Evaluation de l efficacité thérapeutique " Imputabilité du VHC au cours d'une hépatopathie ayant plusieurs causes possibles En cas de sérologie VHC négative ou discordante " hépatopathie aiguë d étiologie indéterminée après éliminations des causes possibles d hépatites " Hépatopathie chronique d étiologie indéterminée après éliminations des causes possibles d hépatites, en particulier sur certains terrains tels que sujets immunodéprimés, sujets transplantés et hémodialysés " Exploration d une maladie systémique pouvant être associée au VHC " Diagnostic précoce lors d un risque de contamination après piqure lors d un prélèvement biologique ou d une injection Prise en charge des couples sérodifférents vis-à-vis du VHC en vue de l'amp

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