Production de plantes transgéniques de pomme de terre exprimant un fragment d anticorps recombinant dirigé contre une protéine du PVY

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1 Laboratoire des Biotechnologies Végétales Appliquées à l Amélioration des Cultures Production de de pomme de terre exprimant un fragment d anticorps recombinant dirigé contre une protéine du PVY Radhia Gargouri-Bouzid École Nationale d Ingénieurs de Sfax 1

2 Laboratoire des Biotechnologies Végétales Appliquées à l Amélioration des Cultures Expression d anticorps recombinants chez les Nouvelle approche de production de molécules actives à haute valeur ajoutée la plante est un bio réacteur Nouvelle approche de lutte antivirale chez les plantes amélioration de la résistances aux virus Amélioration de la résistance de la pomme de terre au PVY 2

3 Laboratoire des Biotechnologies Végétales Appliquées à l Amélioration des Cultures Les maladies virales: un problème important en agriculture Les virus peuvent être responsables de pertes considérables dans les rendements et la qualité Nécessité de développer des stratégies efficaces de lutte Elimination des plantes infectées en champs Utilisation d insecticides pour éliminer les vecteurs Création de nouvelles variétés plus résistantes aux virus 3

4 Laboratoire des Biotechnologies Végétales Appliquées à l Amélioration des Cultures Stratégies de Lutte antivirale Protection croisée : prémunition Croisement sexué (méthode classique) transfert de gènes de résistance naturelle vers les plantes d intérêt Pour la pomme de terre nous avons choisi L hybridation somatique par fusion de protoplastes La transformation génétique via Agrobacterium tumefaciens 4

5 Laboratoire des Biotechnologies Végétales Appliquées à l Amélioration des Cultures La pomme de terre Une importance économique quatrième rang mondial dans l alimentation humaine Un modèle d étude se prête facilement aux techniques de culture in vitro Et Transformation génétique La pomme de terre est une culture stratégique en Tunisie Cultivée toute l année Besoins en semences (importation) représentent 30-40% du coût de production 5

6 Laboratoire des Biotechnologies Végétales Appliquées à l Amélioration des Cultures La pomme de terre sensible à différents stress abiotiques la salinité et la sécheresse À différents agents pathogènes champignons, bactéries, virus Les principaux virus qui touchent la pomme de terre en Tunisie: Le PVY: souches N et O Le PLRV PVX Le virus Y de la pomme de terre (potyvirus) Infecte les solanacées (Pomme de terre, Tomate, Piment ) 6

7 Laboratoire des Biotechnologies Végétales Appliquées à l Amélioration des Cultures Le virus Y de la pomme de terre (PVY) Organisation génomique du PVY (Pépin, 2004) P1 : protease ; HC-Pro : helper component - protease ; CI : cytoplasmic inclusion protein; NIa : nuclear inclusion - protease ; VPg : genome linked protein; NIb : nuclear inclusion - polymerase; CP : capsid. 7

8 Expression d anticorps recombinants dans les anticorps entier (IgG, IgM) Fab scfv: single-chain variable fragment bispecific scfv VH 8

9 Expression d anticorps recombinants dans les Expression de fragments d anticorps anti NIa du PVY chez E. coli Fragments scfv ou VH AM ou scfv Anti-NIa MA (2mg/ml) DO à 492nm Anti-NIa scfv VH V Chaîne légère Chaîne lourde Anti-NIa phage-scfv (10 12 pfu/ml) Anti-NIa phage-vh

10 Expression d anticorps recombinants dans les Quatre types de construction transférées chez la pomme de terre Fragments scfv ou VH LB HindIII 35S PelB scfv-cmyc rbcs tnos nptii pnos Expression dans l apoplaste HindIII Peptide signal (PelB) LB 35S PelB VH-cmyc rbcs tnos nptii pnos HindIII Expression dans le cytosol LB 35S Ω scfv-cmyc rbcs tnos nptii pnos HindIII LB 35S Ω VH-cmyc rbcs tnos nptii pnos 10

11 Expression d anticorps recombinants dans les Expression des protéines scfv et VH à des niveaux détectables pour les différentes constructions testées BFe1 BFLH2 BF37 BF53 BF35 BF12 BFF1 BF26 B36 B53 B35 BM17 B12 NiM17 NT MT Expression de la protéine scfv NT ClAI ClPI ClA3 ClG Cl Tp 15kDa Expression de la protéines VH 11

12 Expression d anticorps recombinants dans les Vérification de la localisation cellulaire des fragments d anticorps produits chez la pomme de terre PelB-scFv Culture de protoplastes des différentes lignées transgéniques Culot cellulaire Surnageant de culture scfv PelB-VH 12

13 Expression d anticorps recombinants dans les Étude de la réponse des lignées transgéniques à l infection par le PVY Inoculation mécanique avec le virus Suivi des symptômes Suivi de l accumulation des virions NT2 NT1 13

14 Expression d anticorps recombinants dans les BF176 BF 1353 Absence de symptômes chez les lignées transformées exprimant l anticorps scfv BF1335 BF

15 Expression d anticorps recombinants dans les 1,4 1,2 NT 1 OD at 490 nm 0,8 0,6 0,4 0, Days post inoculation BF4x BF26 BF35 BF36 BF37 BF55 Cl13 Cl4x Cl13c BFlH2 BF136 BF53 BFe1 Les exprimant un scfv anti-nia résistent au PVY O Cl 4x Colloque BIotech 2008 Rennes Juillet 08 15

16 Expression d anticorps recombinants dans les Faible résistance des lignées transgéniques exprimant le fragment VH Accumulation de virions dans les feuilles Semaines postinoculation NT ClA3 NiA Disparition des symptômes après 9 semaines d infection Ni

17 Conclusions et perspectives Expression efficace d anticorps scfv ou VH chez les plantes trangéniques Niveaux d expression détectables quelque soit la construction Expression stable le long du cycle de la plante cultivée en serre La présence de la protéine scfv confère une résistance totale des plantes au PVY pour les deux construction testées Cette résistance est retrouvée chez les plantes de deuxième génération issues de germination de tubercules La protéine VH seule n améliore pas de manière significative la résistance des plantes au PVY Retard d apparition des symptômes Accumulation des virions Disparition des symptômes après 9 semaines d infection 17

18 Perspectives Envisager des essais en champs des lignées transgéniques exprimant le scfv dans des régions où l infection par le PVY est fréquente Déterminer la composition chimique des tubercules produits par ces plantes Déterminer la qualité nutritionnelle des tubercules étude de la réponse chez le rat Utiliser d autres constructions scfv anti capside virale chez les 18

19 `xüv Centre de Biotechnologie de Sfax Radhouane Ellouz Souad Rouis Hammadi Ayadi Malika Ayadi Leila Aydi École Nationale d Ingénieurs de Sfax Mohamed Najib Saidi Donia Bouaziz Amira Mestiri Imen Guidara Raida Jallouli Oumèma Nouri-Ellouz Radhia Gargouri-Bouzid Unité de Génétique et Biochimie du Développement. Institut Pasteur de Paris (France) Pr. J. C. Mazié, Dr Pierre Lafaye Laboratoire de Virologie (INRAT, Tunisie) Mme Monia Mnari-Hattab 19

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