L utilisation des gazomètres en Biotechnologie. C. Prier, Merck-Serono Aubonne

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1 L utilisation des gazomètres en Biotechnologie C. Prier, Merck-Serono Aubonne 1

2 Agenda Présentation de la à Merck Serono Importance des gazomètres pour la 1 an dans le département 2

3 Agenda Présentation de la à Merck Serono Importance des gazomètres pour la 1 an dans le département 3

4 Qu est ce que la? Biotechnologie = ensemble de méthodes et techniques qui utilisent des organismes vivants pour des applications dans de multiples domaines : alimentation, agriculture, pharmacie, médecine. 4

5 Utilisation de la à MSA Merck Serono Aubonne : site de production de protéines recombinantes pour des médicaments injectables Technologie : Culture de cellules animales transfectées avec un vecteur d'expression contenant le gène humain de la protéine d intérêt Noyau cellulaire Gène de la protéine d intérêt Vecteur d expression 5

6 Utilisation de la à MSA Processus de production Etape d amplification Bouteilles roulantes, T-flask, wave-bag, bioréacteur Etape de production Etape de purification Bioréacteurs 6

7 Utilisation de la à MSA Objectifs de l entreprise : Garantir la qualité du médicament et son innocuité. Produire la protéine d intérêt en quantité significative. Cela implique d avoir la protéine adéquate (repliement, glycosylation, non-antigénique, biologiquement active) à de grands volumes, identique de lot à lot. L élément-clé : la culture cellulaire 7

8 Utilisation de la à MSA Conditions requises pour le succès de la culture cellulaire Maintien d un environnement physiologique optimal: Fixer des paramètres opérationnels selon les étapes du procédé, Définir les limites de contrôles des paramètres critiques Réguler le procédé pour éviter les dérives Mettre à disposition les nutriments essentiels Offrir une surface / un volume de culture adéquat Règles applicables quel que soit le mode de culture en bioréacteur 8

9 Utilisation de la à MSA Les modes de culture en bioréacteur que nous utilisons Fed-Batch Culture Continue (perfusion) Débit Apport milieu NaOH Air ph P T C gaz Milieu NaOH Air ph P T C gaz Surnageant de culture Surnageant de culture Volume variable Système «ouvert» Volume constant Système «ouvert» Tout dépend du type de cellules et le la fragilité de la molécule 9

10 Utilisation de la à MSA Offrir une surface de culture Milieu NaOH Unité de contrôle Air Cellules en suspension Surnageant de culture 10

11 Utilisation de la à MSA Offrir une surface de culture Milieu NaOH Unité de contrôle Air Cellules + microporteurs Lit fluidisé Surnageant de culture 11

12 Agenda Présentation de la à Merck Serono Importance des gazomètres pour la 1 an dans le département 12

13 Importance des gazomètres pour la Pourquoi des analyseurs de gaz du sang? Nos cultures se font avec des cellules de mammifères Pour des raisons historiques : Premiers analyseurs de gaz du sang vers les années 60 Premiers analyseurs pour la vers les années 90 Pour des raisons de gain de temps Pour des raisons techniques 13

14 Les gazomètres Gazomètres utilisés pour le suivi des productions commerciales en bioréacteur Gazomètres mesurent les paramètres du gaz du sang + ph et selon les modèles, mesurent de paramètres supplémentaires ABL5 (gaz) EML105 (glucose, lactate) ABL805 (gaz, glucose, lactate) 14

15 Importance des paramètres : le ph Procédé avec ph fixe (ph régulé à ± 0,1 unité) ph constamment suivi par une sonde interne ph suivi quotidiennement par une mesure externe contrôle de la dérive de la sonde interne Important en phase de croissance pour : Une multiplication cellulaire rapide Atteindre la densité cellulaire souhaitée Important en phase de production pour : Obtenir une molécule conforme Produire la quantité souhaitée de molécule d intérêt 15

16 Importance des paramètres : la pco2 pco2 varie selon les étapes en bioréacteur Limites de contrôle haute : 120 mmhg pco2 suivie quotidiennement par une mesure externe (Pas de sonde pco2 sur le bioréacteur) Mesure externe difficile (dégazage rapide de l échantillon) Important pour : Contrôler l efficacité de l aération de surface prédire une bonne productivité spécifique 16

17 Importance des paramètres : le glucose et le lactate Les métabolites sont apportés de manière dis/continue dans le bioréacteur (fed batch/perfusion) Paramètres critiques selon le procédé Concentrations des métabolites suivies quotidiennement par dosage externe uniquement Important pour : Piloter la croissance des cellules Piloter la production de molécule d intérêt 17

18 Importance des paramètres : le glucose et le lactate Piloter la croissance des cellules à partir du glucose résiduel Croissance Production Limite : 0,25g/L 18

19 Importance des paramètres : le glucose et le lactate Piloter la croissance des cellules à partir du lactate produit Croissance Production Action 19

20 Importance des paramètres : le glucose et le lactate Piloter la production à partir du «glucose consommation rate specific» ou «lactate production rate specific» Croissance Production Constant 20

21 Importance des gazomètres en Utilisation stricte pour être en adéquation avec les GMP Qualification/documentation pour introduire l appareil Avant utilisation : Vérification de l état du système Vérification de la bonne calibration de l appareil avec un contrôle Suivi des appareils consigné dans les logbooks Consignation des résultats dans les dossiers de production 21

22 Agenda Présentation de la à Merck Serono Importance des gazomètres pour la 6 mois dans le département 22

23 : Jeu de l oie Présentation d évènements liés à la culture cellulaire et aux gazomètres au travers d un jeu de l oie : Vous êtes chef d équipe de l unité de production qui pilote les bioréacteurs Votre but : produire 100 g d hormone humaine recombinante conforme en 1 an 23

24 : Jeu de l oie Durée du procédé : Etape de croissance : 6 jours Etape de production : 32 jours T C croissance : 37 C; T C production : 33 C P=1bar ph=7 Vitesse agitation : 15rpm NaOH Anti-mousse Milieu (débit variable) 3g/L de glucose 0g/L de lactate Air : 45% O 2 Sortie Air Récolte de surnageant de culture Contrôle qualité molécule [cellules inoculation] =30 milliard/ml V culture = 200 L Prélèvement pour analyses off-line Observation visuelle ph, pco2, Glc, Lac, Comptage des cellules 24

25 100 gr! 25

26 Phase de croissance : réglage du débit de milieu Suivi de la production de lactate Références de la précédente campagne Run 1 Suivi du débit de milieu 26

27 100 gr! 27

28 La phase de croissance s est bien déroulée Courbe de la croissance cellulaire Références de la précédente campagne Run 1 28

29 La phase de croissance s est bien déroulée Suivi du glucose résiduel Références de la précédente campagne Run 1 0,45 g/l 29

30 100 gr! 30

31 Phase de production : quelques interventions pour la régulation du ph Régulation du ph ph ABL5 7,06 D > 0,05 ph Sonde 7,00 31

32 100 gr! 32

33 La phase de production s est bien déroulée Suivi de la consommation spécifique en glucose 33

34 Félicitation! Vous avez produit 9,41g Production cumulée de la protéine d intérêt 34

35 100 gr! 35

36 Félicitation! Vous avez produit 29,5 g en 3 runs Run 1 Run 2 Run 3 Mais Beaucoup d intervention sur l EML105 Mesures préventives nécessaires 36

37 100 gr! 37

38 Panne grave sur un EML105 Mesure préventive pour l EML105 : Les appareils sont vieux Remplacement par une nouvelle génération d analyseur Glucose/Lactate Quelle stratégie et quels besoins? Business Case Votre choix : = + 38

39 Introduction de l ABL805 : Documentation du remplacement URS pour le service des achats, CCP dans TrackWise Il faut nous assurer que l appareil répond bien à nos besoins Protocole de qualification d installation et qualification opérationnelle Protocole de qualification des performances Précision, répétabilité Équivalence des paramètres avec les appareils qu il remplace selon la norme DIN (important pour garder la protéine adéquate) Démonstration de l équivalence de mesure En cas de non équivalence, calcul d un facteur de correction Exécution des tests et rédaction des rapports Procédure d utilisation de l appareil 39

40 Pendant ce temps Vous avez conduit 2 runs supplémentaires et produit 49,59 g Run1 Run2 Run3 Run4 Run5 40

41 100 gr! 41

42 Attention déviations! Action : Confirmation ou non par un prélèvement Action corrective Investigation 42

43 Félicitation! Vous avez produit 69,17 g Run1 Run2 Run3 Run4 Run5 Run7 Run8 43

44 100 gr! 44

45 Vous Alarme avez ph! contaminé Glucose très le bioréacteur bas! du run 6! ph < 6 [Glucose] : 0,2 g/l Et les autres paramètres [lactate] : 2,5 g/l pco2 > 120 mmhg Etat frais Investigation sur le germe et la cause 45

46 100 gr! 46

47 Vous avez trouvé les causes de la contamination Germe : Bacillus subtilis Origine de la contamination : filtre à air mouillé 47

48 Félicitation! Vous avez produit 89,29g Run1 Run2 Run3 Run4 Run5 Run7 Run8 Run9 Run10 48

49 100 gr! 49

50 Analyse multivariée des tous les paramètres des campagnes de production Runs : production > 10g ; Runs : 10g > production > 9g ; Runs : production < 9g Suivi de la pco 2 Recommandations 50

51 100,48 g! 100 gr! Run1 Run2 Run3 Run4 Run5 Run7 Run8 Run9 Run10 Run11 51

52 Conclusions Les gazomètres nous permettent d être à l écoute des cellules Ils font partie intégrante de nos procédés Ils participent à la production d une molécule de qualité et à la reproductibilité de cette molécule d un lot à un autre 52

53 Conclusions Merci de votre attention! 53

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