Génie de la biocatalyse et génie des procédés. «Production d enzymes industrielles»

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1 Ministère de l Enseignement Supérieur et de la Recherche Scientifique Université Virtuelle de Tunis Génie de la biocatalyse et génie des procédés «Production d enzymes industrielles» Concepteur du cours: Attention! Ce produit pédagogique numérisé est la propriété exclusive de l'uvt. Il est strictement interdit de le reproduire à des fins commerciales. Seul le téléchargement ou impression pour un usage personnel (1 copie par utilisateur) est permis.

2 1. Exemple de production d enzyme à échelle industrielle : BASF BASF est un groupe d industries chimiques. Il s intéresse de plus en plus aux activités de production d enzymes pour sa propre utilisation ou pour la vente à d autres secteurs. BASF produit des enzymes utilisées comme des additifs dans l alimentation pour animaux : volaille et porc. Une enzyme au nom commercial «Natuphos» correspond à une phytase. Cette enzyme est devenue la propriété industrielle exclusive de BASF depuis l achat de tous les brevets, procédés et droits d une autre compagnie qui a participé au lancement du produit. L enzyme est produite dans des fermenteurs de très grands volumes (plusieurs m 3 ) à partir d organisme génétiquement modifié du champignon Aspergillus niger avec un procédé économique en ressources. Le produit est vendu après extraction, et séchage sans purification : sous forme de préparation enzymatique. 2

3 Source : BASF Interim Report 2 nd Quarter Natuphos est mélangée à l alimentation de porc et de volaille. Une fois consommée par l animal, elle aide à mieux assimiler le phosphate contenu dans l aliment d origine végétale. Ceci diminue significativement la quantité de phosphate inorganique ajouté à l aliment. Les excréments de l animal contiennent ainsi moins de phosphates et la contamination du sol et de l eau est réduite de 1/3. Le même procédé permet à l entreprise de produire d autres enzymes qui facilitent la digestion de certains polysaccharides comme Natugrain : xylanase. 3

4 2. Découverte et screening d activités enzymatiques Des activités enzymatiques diverses sont découvertes dans des organismes vivants. Les enzymes industrielles proviennent de plantes, d animaux et essentiellement de microorganismes Screening d isolat naturel Des milliers d échantillons du sol, de matériel végétal et d autres peuvent faire l objet d une recherche automatisée d une activité ou d une voie enzymatique d intérêt. Le screening utilise un milieu spécifique qui ne laisse pousser que les microorganismes exprimant un système enzymatique donné. Exemple : un milieu contenant le xylan comme unique source de carbone et d énergie, ne laisse pousser que les microorganismes produisant des xylanases. 4

5 Le screening peut se baser sur des données écologiques. Par exemple : un environnement salin comme dans les sebkhas, est uniquement habité par des organismes halophiles. On cherche alors dans ces organismes l activité enzymatique résistante au sel qui doit être de préférence stable et extracellulaire. Des méthodes physiques ou basées sur la composition du milieu de culture sont employées pour favoriser le développement d une catégorie de microorganismes ou bien défavoriser le développement d autres. Critères de sélection : pour distinguer l organisme ayant l activité recherchée, on utilise un critère avec lequel il se distingue. Exemple : l utilisation d une couche opaque de caséine comme seule source de carbone sur agar, peut révéler les microorganismes sécrétant des protéases en formant un halo clair dû à l hydrolyse de la caséine autour des colonies développées. D autres méthodes utilisent des indicateurs colorés ou des substrats chromogènes. Le problème souvent rencontré avec le screening classique est la faible concentration de l enzyme d intérêt dans les isolats microbiens naturels ou bien parfois des propriétés insuffisantes pour l utilisation en industrie. Des manipulations génétiques permettent parfois d améliorer les propriétés du microorganisme ou de l enzyme Screening moléculaire Dans le cas où une enzyme aux propriétés intéressantes a été identifiée chez une espèce particulière, une recherche peut être effectuée pour des enzymes homologues chez des espèces proches (reverse genetics). La séquence d acides aminés de la protéine enzymatique peut nous donner une idée sur la séquence probable des 5

6 bases nucléotidiques dans le gène correspondant. En se basant sur cette information une sonde peut être construite de 15 à 20 nucléotides. En utilisant la technique PCR sur l ADN chromosomique d espèce proche, un gène homologue peut être amplifié et transféré à un organisme hôte pour expression de l enzyme homologue Screening génomique Des milliers de gènes sont actuellement séquencés et disponibles dans des banques de données. Les génomes de plus de 800 organismes sont accessibles au public. Exemple : Des méthodes informatiques peuvent alors faciliter la recherche d enzymes aux propriétés bien déterminées Screening protéomique Dans le cas d expression et de purification efficaces des protéines, des analyses directes de la structure et de la fonction sont possibles grâces à des moyens informatiques et à l automatisme. Cette nouvelle technologie permet également l analyse fonctionnelle de grands nombres de protéines recombinantes. 6

7 3. Génie protéique Le génie des protéines utilise un ensemble de techniques pour remplacer un acide aminé par au autre ou une séquence par une autre dans le but de modifier les propriétés de la protéine. Le génie protéique se base sur les progrès : o au niveau des connaissances des structures 3D déterminées par cristallographie aux rayons X ou par spectroscopie RMN, o au niveau de la modélisation informatique, o au niveau des technologies de l ADN recombinant. Les techniques de mutagenèse permettent maintenant d effectuer un très grand nombre de substitutions séparées d acides aminés dans la même protéine pour tester les nouvelles propriétés qui en découlent. Certaines méthodes réalisées au laboratoire miment le processus d évolution naturelle ; on parle alors d «évolution dirigée». Exemple d application industrielle : o l -amylase utilisée pour l hydrolyse de l amidon en industrie doit résister à une opération de chauffage à 7

8 105 C utilisée pour faire exploser les granules d amidon, et doit fonctionner 1 à 2 h à 90 C. o La structure de l -amylase de Bacillus licheniformis a été déterminée et comparée à d autres -amylases d autres sources. Cette enzyme possède plusieurs propriétés intéressantes, mais elle manque de stabilité comparée à d autres sources. Les études structurales ont montré que ceci est dû à des différences à certaines localités de la séquence d acides aminés. Le remplacement de chacun des résidus localisés a permis d améliorer la stabilité aux températures du procédé de quelques dizaines de fois. 4. Méthodes de production d enzymes On distingue les enzymes d extraction (à partir d organismes végétaux ou animaux) ou les enzymes de fermentation (microorganismes). Le procédé industriel typique pour la production d enzymes est la culture en profondeur en milieu aérobie utilisant un microorganisme produisant en grande quantité une enzyme extracellulaire. Les principaux avantages des enzymes de fermentation par rapport aux enzymes d extraction : o Production en grande quantité en fermenteur, o Production indépendante des contraintes géographiques et saisonnières, o Matière première bon marché, 8

9 o Manipulation génétique facile mutants hyperproducteurs, o Purification plus facile en cas d enzymes extracellulaires. Les microorganismes utilisés pour la production d enzymes peuvent être des eucaryotes tels que les levures et les champignons, ou des procaryotes tels que les gram-positifs ou les gram-négatifs. Les caractéristiques recherchées dans une souche produisant une enzyme industrielle sont : taux de croissance important, productivité en enzyme importante, activité spécifique de l enzyme élevée, régulation réduite, résistance à la répression catabolique, peu de produits secondaires, sporulation limitée, nutrition réduite, enzyme extracellulaire, morphologie adaptée à la culture en réacteur. Comme il est difficile de trouver toutes ces caractéristiques chez le même organisme, la majorité des souches servant à la production d enzymes industrielles ont été améliorées par : o mutagenèse (agents chimiques ou irradiation UV) permettant d atteindre rapidement des caractéristiques utiles ou, o génie génétique permettant à des microorganismes de produire des enzymes d organismes supérieurs par insertion du gène correspondant dans le microorganisme. La chymosine (E.C ) a été clonée par différents groupes dans plusieurs microorganismes faciles à cultiver comme la levure pour produire de manière industrielle des préparations enzymatiques coagulant le lait. La fermentation en vue de produire une enzyme se fait à très grande échelle. Quand l enzyme est extracellulaire, on peut utiliser un fermenteur jusqu à 450 m 3. Dans le cas d enzymes 9

10 intracellulaires, la nécessite de traitements pour l extraction impose une limite du volume jusqu à 30 m 3. Dans un fermenteur la production d enzyme est optimisée grâce à un contrôle rigoureux d un maximum de paramètres : UVT Cours ENT Médiathèque Bourse virtuelle C2i Sites de l'uvt 10

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