Les analyses virologiques pour le diagnostic et la prise en charge thérapeutique de l infection au VHC

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1 Les analyses virologiques pour le diagnostic et la prise en charge thérapeutique de l infection au VHC Donald Murphy, PhD Laboratoire de santé publique du Québec PNMVS, Montréal, 15 octobre 2013

2 Plan de la présentation Introduction au virus Tests virologiques pour le diagnostic Détection des anticorps contre le VHC Détection du virus (test ARN qualitatif) Tests virologiques pour la prise en charge thérapeutique Génotypage Mesure de la charge virale (test ARN quantitatif) Détermination génotypique de la résistance aux inhibiteurs de la protéase 2

3 Virus de l hépatite C Identifié à la fin des années 1980 Se réplique dans le cytoplasme des hépatocytes Demi-vie 2,7 heures; production virale de à virions / jour Virus à transmission hématogène Appartient à la famille Flaviviridae, genre hépacivirus 3

4 Arbre phylogénétique de membres de la famille Flaviviridae (hélicase) Kapoor A et al. mbio 2013; doi: /mbio

5 Arbres phylogénétiques de la région de l hélicase des hépacivirus et pegivirus Kapoor A et al. mbio 2013; doi: /mbio

6 Prévalence du VHC et évolution de la maladie 3% de la population mondiale 170 millions de personnes 0,7% de la population du Canada 240,000 personnes, 50,000 au Québec Risque de chronicité (variable) 75-80% chez l adulte Risque de cirrhose jusqu à 10% dans 20 ans, 20% dans 30 ans Mortalité et incidence du carcinome hépatocellulaire relié à la cirrhose 1 4% / année 6

7 Organisation génomique du VHC Moradpour et al.,

8 Tests virologiques pour le diagnostic Détection des anticorps anti-vhc Détection du virus test de détection qualitative de l ARN du VHC 8

9 Antigènes utilisés dans les tests de détection d anticorps anti-vhc Génération C E1 E2 NS2 NS3 NS4 NS5 5 A B A B 3 1e SOD c e SOD c22-3 SOD c200 3e SOD c22-3 SOD SOD c200 NS5 9

10 Caractéristiques des tests de dépistages Génération Introduction Première NS4 Deuxième NS4 C, NS3 Troisième NS4 C, NS3 NS5 Mai 1990 Mars 1992 Juin 1996 Caractéristiques Réduction de 80% dans l incidence d hépatite post-transfusionnelle non-a, non-b délai d apparition des anticorps dans l infection aiguë absence d une réponse anti-vhc décelable Plus sensible que les essais de 1e génération anticorps contre C et NS3 apparaissent plus tôt dans la période fenêtre détection des patients anti-ns4 (c100-3 et 5-1-1) négatifs Plus sensible que les essais de 2 e génération sur des panels de séroconversion en raison d une plus grande sensibilité à NS3 et non à NS5 10

11 Comparaison des antigènes utilisés dans les tests de détection des anti-vhc Trousse Core E1 E2 P7 NS2 NS3 NS4 NS5 AxSym 3.0 (MEIA) (1-150) HCr43 c33c c100-3 ( ) ( ) c200 ( ) NS5 ( ) Architect (CMIA) (1-150) HCr43 c33c ( ) c100-3 ( ) ADVIA Centaur (CIA) c22p (10-53) c200 ( ) NS5 ( ) Elecsys (ECL) (peptide + protéines recombinantes) C (peptide) NS3 (Ag recomb) NS4 (peptide) VITROS Ortho (CIA) Ortho ELISA (EIA) c22-3 (2-120) c200 ( ) NS5 ( ) Monolisa (EIA) (3 protéines recombinantes E.coli) C NS3 NS4 11

12 Antigènes utilisés dans le test d immunoblot CHIRON RIBA HCV* Génération 1e C E1 E2 NS2 NS3 NS4 NS5 5 A B A B 3 SOD SOD c e SOD c22-3 SOD c100-3 c33c SOD SOD e c22-p p c100p c33c SOD SOD NS5 12 * En mars 2013, Ortho Clinical Diagnostics annonce l abandon de la fabrication de la trousse RIBA HCV 3.0 SIA par Novartis Diagnostics

13 Tests immunoblots sur bandelettes INNO-LIA HCV Score* Chiron RIBA HCV 3.0 SIA Innogenetics * Utilisé par le Laboratoire national de microbiologie, ASPC Ce test n est plus disponible 13

14 Algorithme provincial de diagnostic de l infection par le virus de l hépatite C Épreuve de détection des anticorps (ex. hôpital) Rapport final Absence d anticorps VHC Non réactif Réactif S/co = signal/cut-off : X = 12 AxSym X = 15 Vitros ECI X = 11 Advia Centaur X = 10 Architect s/co < X s/co X Résultat réactif émettre final Soumettre au LSPQ pour confirmation 14

15 Algorithme provincial de diagnostic de l infection par le virus de l hépatite C (suite) Épreuve de dépistage des anticorps Hôpital LSPQ Anti-VHC réactif (s/co < X) Duplex EIA1/EIA2 HR/HR Autres profils NR/NR Présence d anticorps VHC Positif Indéterminé Négatif Absence d anticorps VHC EIA1 : Ortho TM HCV 3.0 ELISA Test System with Enhanced SAVe EIA2 : Monolisa anti-hcv PLUS Version 2 (Bio-Rad) HR : haut réactif = s/co 4.0; NR : non réactif = s/co <

16 Signification d un résultat anti-vhc positif Indique une exposition au VHC dans le passé «La présence d anticorps anti-vhc ne permet pas de distinguer les porteurs cliniques des patients guéris. La recherche de l ARN du VHC par un test RT-PCR qualitatif est recommandée pour déterminer s il y a présence d une virémie.» En 2011, les représentants des laboratoires impliqués dans les épreuves spécialisées pour le VHC à recommandé l ajout de ce commentaire au rapport anti-vhc positif 16

17 Signification d un résultat anti-vhc «indéterminé» (LSPQ) Résultat non concluant, il n est ni positif ni négatif Commentaire ajouté sur le rapport du LSPQ «Le résultat de la recherche des anticorps anti-vhc étant indéterminé, une recherche de l ARN du VHC par un test RT-PCR qualitatif est recommandée pour déterminer s il y a présence d une virémie.» 17

18 Changement au processus de confirmation à compter du 5 janvier 2011 (LSPQ) La confirmation des anti-hcv ne sera plus effectuée chez les patients connus positifs sur 2 sérums antérieurs, le commentaire suivant apparaîtra aux rapports : Nos dossiers indiquent que ce patient est connu positif à une épreuve de confirmation des anticorps VHC sur au moins deux sérums antérieurs. Il est donc jugé inutile de répéter une épreuve de confirmation. Le diagnostic de l infection active doit être établi par une détection de l ARN du VHC à l aide d une épreuve qualitative. 18

19 Résultats Détection qualitative de l ARN génomique du VHC* Positif présence d ARN VHC ARN génomique Négatif absence d ARN VHC (au seuil de détection) * L épreuve qualitative est le seul test de détection de l ARN du VHC approuvé au Canada pour le diagnostic de l infection active. 19

20 Détection qualitative de l ARN génomique du VHC Trois sites désignés (déc. 2012) Montréal CHUM Hôpital Saint-Luc CUSM Hôpital Royal Victoria Québec CHU de Québec Hôtel-Dieu de Québec 20

21 Détection qualitative de l ARN VHC Trousses utilisées au Québec Trousses de Roche (RT-PCR classique) COBAS Amplicor HCV 2.0 Test COBAS AmpliPrep/COBAS Amplicor HCV 2.0 Test (CHUM seulement) Cible génomique : région 5 prime non codante (5 NCR) Limite de détection 50 UI/ml Limite établie par la détection d au moins 95% des échantillons ayant un taux d ARN à 50 UI/ml 21

22 Calcul de la limite de détection Amplicor HCV Test, version 2.0 UI/ml* Nombre testé Détecté Nombre % , ,7 * Standard international de l OMS (96/790) dilué dans du plasma 22

23 Détection qualitative de l ARN génomique du VHC Réactif/Positif Anti-VHC Indéterminé ARN qualitatif* ARN qualitatif* Positif Négatif Positif Négatif Répété l ARN qualitatif dans 4-6 mois * Bien libeller la demande d analyse; voir lettre circulaire 23

24 Tests virologiques pour la prise en charge thérapeutique Génotypage Mesure de la charge virale test de détection quantitative de l ARN du VHC Détermination génotypique de la résistance aux antiviraux 24

25 Arbre phylogénétique du VHC Génome complet NS5B JK049 k d a ED43 QC69 HCV - Tr NZL1 b a? AJ b c HCV - BK a HC - G9 H77 a HC - J8 b h k VN405 2 HC - J6 a BEBE1 c VAT96 k EUHK2 a e GX004 g JK046 VN004 QC69 CS ED43 a d HCV-Tr b a NZL1 k JK049 b HCV-BK a H77 c? HC-G9 AJ c CS EUHK2 a GX004 e JK046 g VN004 h k VN405 b a k HC-J8 HC-J6 0.1 EUH BEBE1 EUH1480 VAT96 25

26 Virus de l hépatite C Classification de l ARN viral en génotypes Génotype Sous-type 1 a - l 2 a - r 3 a - k 4 a - v 5 a 6 a - w 7 (provisoire) a Génome recombinant (ex. RF_2k/1b) 26

27 Exemple d un génome recombinant 5 5 Génome parental 1 (ex. 1b) P NS 7 4A NS4B 3 C E1 E2 NS2 NS3 NS5A NS5B Génome parental 2 (ex. 2k) P NS NS4B 7 4A 3 C E1 E2 NS2 NS3 NS5A NS5B 5 Génome recombinant (ex. 2k/1b) P NS 7 4A NS4B 3 C E1 E2 NS2 NS3 NS5A NS5B 27

28 Recombinants naturel du VHC Recombinant Point de Recombinaison (nucléotides*) 2k/1b NS2 (-235) N687 2i/6p NS2-NS3 (-15 à 21) 2b/1b NS3 (36-37) Souche Géographie Référence D3 SE /5 NS3 (12 à 32) R1 St-Pétersbourg, Russie Ho Chi Minh City, Vietnam Manille, Philippines France (sud-ouest) Kalinina et al Noppornpanth et al., 2006 Kageyama et al., 2006 Legrand-Abravanel. et al., b/6w NS3 (9) D177 Taïwan Lee et al., b/1a NS5B PE22 Lima, Pérou Colina et al., 2004 * Par rapport à NS3 28

29 Génotype décrit par le LSPQ Génotype Origine 1j,1k Haïti 2m Vietnam 2r Haïti 3i Continent Indien 4q Rwanda/Burundi 6q, 6r, 6s Cambodge 7* République démocratique du Congo *Séquence génomique complète déterminée au LSPQ en

30 Rôle du génotype dans le traitement Génotype 1 Peg-interféron alfa + ribavirine + inhibiteur de protéase Autres génotypes (2 à 6) Peg-interféron alfa + ribavirine Génotypes 2 et 3 24 semaines (Tx classique) Génotypes 4, 5, 6 48 semaines (Tx classique) 30

31 Génotypage effectué par séquençage et inférence phylogénétique (LSPQ) 5 NCR P NS 7 4A NS4B 3 C E1 E2 NS2 NS3 NS5A NS5B NCR 196 pb 3e 424 pb 2e 340 pb 1e - Premier choix région NS5B (génotype/soustype; 97%) - Deuxième choix région C/E1 (génotype/soustype; 0,5%) - Troisième choix région 5 NC (génotype; 2,5%) Charge virale < UI/mL Murphy DG et al., J. Clin. Microbiol. 45 (4):

32 Arbre phylogénétique du VHC Séquences de la région NS5B a b c 1c-HCG C+4r BM r-FrSD120 4k-B14 4d-SD006 4c-GB358 4a-ED43 3b-HCVTr 3k-JK049 BM BM BM a-NZL1 BM BM BM BM a-HCV1 BM BM h-VN004 6g-JK046 6d-VN235 6e-VN711 BM e-VN540 6b-Th580 6a-EUHK2 BM BM b-HCVBK BM b-HCJ8 2a-HCJ6 2k-VAT96 5a-EUH1480 2c-BEBE1 32

33 Arbre phylogénétique du VHC Séquences de la région NS5B Génotype l c i d b f h g e a k j 1a-HCV1 1a-QC198 1k-QC328 1k-QC82 1j-QC329 1j-QC2 BM l-M5186N 1l-QC390 1l-CM1427 1c-QC165 1c-HCG9 1i-QC77 1i-FR16 1d-QC167 1d-NL29 1b-QC250 1b-HCVBK 1f-FR2 1h-QC94 1h-CM1521 1g-QC71 1g e-QC248 1e-CAM

34 a 3a 1b P Q 1a-HCV1 S B-2004 B-2006 T U V W X Y 1b-HCVBK H R Z D-2003 C-2002 E A-2006 F A-2003 G 3a-NZl1 I J K L M N O Exemple de comparaison de souches à partir de la région NS5B 34

35 Génotypage du VHC (LSPQ) Effectué à l aide d une technique maison développée au LSPQ Limite de détection : entre 12 et 100 UI/ml Le requérant doit indiquer sur le formulaire d analyse du LSPQ que la personne est connue positive pour l ARN du VHC Le génotypage n est effectué qu une seule fois sauf s il y possibilité de réinfection ceci doit être spécifié sur le formulaire d analyse du LSPQ pour que le test de génotypage soit refaite 35

36 Nombre Génotypage du VHC Échantillons et bénéficiaires /08 08/09 09/10 10/11 11/12 12/13 Échantillons Bénéficiaires 36

37 Pourcentage Distribution annuelle des génotypes du VHC Génotype 07/08 08/09 09/10 10/11 11/12 12/13 37

38 Pourcentage Proportions relatives du génotype 1a et 1b a 1b 07/08 08/09 09/10 10/11 11/12 12/13 38

39 Détection quantitative (mesure de la charge virale) de l ARN du VHC 3 sites désignés (déc. 2012)* Montréal CHUM - Hôpital Saint-Luc CUSM Hôpital Royal Victoria Québec CHU de Québec CHUL * Analyse auparavant effectuée au LSPQ 39

40 Détection quantitative de l ARN VHC Trousse utilisée au Québec Trousse Abbott RealTime HCV (RT-PCR temps réel) Cible génomique : région 5 prime non codante (5 NCR) Linéarité UI/ml Limite de détection de 12 UI/ml (95% des échantillons ayant un taux d ARN à 12 UI/ml) Volume minimal d échantillon requis 1 ml (idéalement 2 ml en cas de reprise) 40

41 Détection quantitative de l ARN VHC Résultats possibles Résultat Non détecté Interprétation ARN du VHC non détecte < 12 UI/ml, détecté ARN du VHC détecté, mais est en dessous de la limite inférieure de quantification 12 à 100 million UI/ml ARN du VHC détecté à la mesure indiquée > 100 million UI/ml ARN du VHC détecté, mais est au dessus de la limite supérieur de quantification 41

42 Détection quantitative de l ARN VHC Le test de détection quantitative est dorénavant utilisé à toutes les étapes de la prise en charge thérapeutique (la détection qualitative ne sera plus utilisée en suivi thérapeutique) Veuillez faire parvenir vos demandes à un des trois établissements désignés selon vos corridors de service Toute demande de charge virale devra être accompagnée du contexte clinique (i.e. prétraitement, 4e semaine de thérapie, etc.) 42

43 Exemples de cédules recommandée des mesures de charge virale du VHC Génotype Type de Tx ARN VHC 1 (pt naïf) 1 (pt naïf) 1 (pt naïf, cirrhose) 1 (pt naïf) 1 (pt naïf) 1 (pt naïf, cirrhose) 2, 3 4, 5, 6 Co-infection VIH (1 à 6) Peg-INF + RIB + BOC Peg-INF + RIB + BOC Peg-INF + RIB + BOC Peg-INF + RIB + TÉL Peg-INF + RIB + TÉL Peg-INF + RIB + TÉL Peg-INF + RIB (classique) Peg-INF + RIB (classique) Peg-INF + RIB (classique) F, facultative; S/O, sans objet Indétectable S8 à S24 Détectable S8, indétectable S24 Indétectable S24 Indétectable S4 et S12 Détectable S4 ou/et S12 Semaine X X X X X X X X X X X X X X X X F X X X X X X X X X X X X X X X X X S/O X X X X X X X S/O X X X X X S/O X F X X X X X S/O X F X X X X X 43

44 Nombre Charge virale du VHC Échantillons analysés /08 08/09 09/10 10/11 11/12 12/13 Échantillons Bénéficiaires 44

45 Pourcentage Distribution des mesures de charge virale Abbott RealTime HCV (UI/ml) /11 11/12 12/

46 Détermination génotypique de la résistance aux inhibiteurs de protéases But : évaluer l émergence de mutations sur le génome virale associées à la résistance à l inhibiteur de protéase (IP) chez des sujets nonrépondeurs Analyse disponible au LSPQ après entente Très peu de demande à ce jour Limite de détection : environ 1000 UI/ml Cible : domaine de la protéase de NS3 46

47 Détermination de la résistance exemples de cas ID Sexe Âge Origine ethnique Génotype VHC Fibrose Tx antérieur Réponse Tx antérieur NR1 Homme 47 Caucasien 1a Cirrhose (F4) Peg IFNα + RBV Répondeur nul NR2 Homme 58 Asiatique 1b + 6a Cirrhose (F4) Peg IFNα + RBV Répondeur nul NR3 Homme 55 Caucasien 1a Fibrose (F2-F3) Peg IFNα + RBV Répondeur nul 47

48 ARN VHC Log UI/mL ARN VHC Log UI/mL ARN VHC Log UI/mL Taux d ARN VHC dans les premières semaines de traitement NR1 (1a) NR2 (1b+6a) Semaines de traitement Semaines de traitement NR3 (1a, VIH +) Semaines de traitement Charge virale déterminée à l aide de la trousse Abbott RealTime HCV 48

49 Résumé sur l utilisation des épreuves de laboratoires pour le VHC Détection des anti-vhc Sérologie - anti-vhc Positive / Indéterminée Détection de l ARN VHC ARN VHC qualitatif Positif Prise en charge traitement envisagé Génotypage Prise en charge traitement imminent en cours ou terminée Prise en charge échec au traitement Mesure de la charge virale Au besoin Résistance aux antiviraux 49

50 Merci de votre attention Remerciements Personnel du LSPQ Secteur Sérodiagnostic et virologie Secteur Biologie moléculaire Direction Personnel du réseau Médecin œuvrant dans le domaine Technologistes de laboratoire Infirmière et pharmacienne 50

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