PRINCIPES DE LA PROCÉDURE
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- Sarah Durand
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1 Simplexa CMV REF MOL2200 Rev. D Test PCR en temps réel pour la mesure in vitro du Cytomégalovirus (CMV). Pour diagnostic in vitro APPLICATION Le test Focus Diagnostics Simplexa CMV est conçu pour le dosage in vitro des acides nucléiques du cytomégalovirus (CMV) dans des échantillons de sang et de plasma à l'aide de l Integrated Cycler de 3M. Ce test est prévu pour être utilisé en association avec le tableau clinique et les autres marqueurs biologiques de l'évolution de la maladie pour la prise en charge clinique des patients infectés par le CMV. Le test n'est pas destiné à servir de test de dépistage pour rechercher la présence du CMV dans du sang ou des produits du sang. Ce test est pour usage professionnel uniquement. RÉSUMÉ EXPLICATIF Le cytomégalovirus humain (CMV), un herpèsvirus bêta, est membre de la famille des herpèsvirus humains 1.L infection par le CMV est courante dans toutes les populations humaines. Environ 70 % des adultes ou plus sont séropositifs pour les anticorps contre le CMV, ce qui reflète une infection antérieure par ce virus. Les primo-infections du CMV chez des individus en bonne santé sont asymptomatiques ou provoquent une maladie bénigne non spécifique. Les primo-infections du CMV chez les femmes enceintes peuvent provoquer des infections congénitales du fœtus ou du nouveau-né, et chez les individus ayant reçu une greffe d organe solide, la primo-infection peut entraîner une maladie grave 2,3. Comme c est le cas pour tous les herpèsvirus, le CMV établit une infection latente dans l hôte après que celui-ci se soit rétabli de l infection aiguë. La réactivation du virus peut se produire en cas d immunodépression ou de maladie. Chez les patients immunodéprimés, le CMV est un agent étiologique bien connu de morbidité et de mortalité. 4 Le diagnostic précoce de la réplication du CMV par dosage du taux de virus chez les patients à haut risque est essentiel pour l initiation de traitements prophylactiques. Un traitement antiviral ou des modifications de la posologie immunosuppressive peuvent être indiqués avant l apparition des symptômes cliniques, lorsqu un niveau prédéterminé de virus est atteint dans le sang ou le plasma. Une fois le diagnostic atteint, la prise en charge efficace des infections du CMV chez ces patients exige un test permettant la surveillance et le dosage du CMV dans le sang et le plasma 5,6. Le test Simplexa CMV a été adapté au standard CMV de l OMS 7. La charge virale du test Simplexa CMV est donnée en unités internationales/ml (UI/ml). PRINCIPES DE LA PROCÉDURE Le test est un système d'amplification et de détection par PCR en temps réel qui utilise une sonde-amorce fluorescente bifonctionnelle pour la détection de l'adn du cytomégalovirus dans du sang total et du plasma. Le test comporte deux étapes principales : (1) extraction de l'adn provenant des échantillons du patient, (2) une sonde-amorce fluorescente bifonctionnelle est utilisée conjointement avec une amorce inverse pour amplifier une cible précise (pour l'analyte et le contrôle interne). Le test fournit un résultat ; une région bien conservée du gène UL83 du génome du CMV est ciblée pour identifier l ADN viral dans l échantillon. Un contrôle interne est utilisé pour contrôler le processus d'extraction et pour détecter une inhibition de la PCR. Le signal d'amplification obtenu pour chaque échantillon est comparé à une courbe d'étalonnage et quantifié.
2 Simplexa CMV Page 2 MATÉRIELS FOURNIS Le kit Simplexa TM CMV de Focus Diagnostics contient suffisamment de réactifs pour 100 réactions. Libellé du kit Nom du composant REF SYMBOLES Nom abrégé Couleur Nombre Réactions Volume CE SUR du de par par L'ÉTIQUETTE bouchon flacons flacon/kit flacon Simplexa CMV Primer Mix MOL2201 RÉAC A PM Brun 2 50/ µl Simplexa Master Mix MOL2000 RÉAC B MM Vert 2 50/ µl Simplexa Extraction & Amplification Control MOL9001 CONTRÔL IC IC Bleu 3 50/ µl DNA Simplexa CMV Low Positive Control MOL2202 CONTRÔL + LPC Blanc 6 1/6 200 µl Simplexa CMV High Positive Control MOL2203 CONTRÔL ++ HPC Rouge 6 1/6 200 µl Composant Simplexa CMV Primer Mix (PM) (Mélange d amorces CMV Simplexa ) Simplexa Master Mix (MM) (Mélange maître Simplexa ) Simplexa Extraction & Amplification Control DNA (IC) (ADN de contrôle d'extraction et d'amplification Simplexa ) Simplexa CMV Low Positive Control (LPC) (Contrôle positif bas Simplexa CMV) Simplexa CMV High Positive Control (HPC) (Contrôle positif haut Simplexa CMV) Simplexa CMV Barcode Card (Carte à codebarres Simplexa CMV) Description des composants Description Amorces fluorescentes marquées spécifiques pour la mesure du CMV et du contrôle interne. Sonde Cible fluorophore Marqueur Excitation Émission Gène ciblé (colorant) CMV FAM 495 nm 520 nm Gène UL83 Contrôle interne Q nm 670 nm ADN polymérase, tampon et dntp Gène de A. thaliana Un fragment d'adn comportant 577 paires de bases tirées du gène codant pour la N- méthyltransférase de la grande sous-unité de la ribulose-1,5-bisphosphate carboxylase-oxygénase de la plante Arabidopsis thaliana. CMV inactivé dans une matrice de base humaine. CMV inactivé dans une matrice de base humaine. Paramètres spécifiques au test. MATÉRIELS NÉCESSAIRES MAIS NON FOURNIS 1. Simplexa CMV Quantitation Standards REF MOL Integrated Cycler de 3M avec le logiciel Integrated Cycler Studio version 5.0 ou plus récente 3. Universal Discs utilisables sur l'integrated Cycler 4. Universal Disc Cover Tape 5. a Roche MagNA Pure LC System et consommables associés. 6. a Kit d'isolement d'acide nucléique total Roche MagNA Pure LC Total Nucleic Acid Isolation Kit (Roche, num. cat ) 7. b Appareil biomérieux NucliSENS easymag avec consommables et réactifs associés 8. b Pipette multicanaux Biohit/bioMérieux 9. b Plaque de micropuits ELISA 10. Micropipette(s) monocanal, multicanaux et/ou à répétition ayant une plage de précision de 1 à 10 µl, 10 à 100 µl et 100 à µl 11. Congélateur (dégivrage manuel) à -10 C à -30 C (pour stockage des composants congelés du kit) 12. Réfrigérateur à 2-8 C (pour échantillons et composants du kit décongelés) 13. Enceinte de sécurité (hotte à flux laminaire) pour les extractions 14. Microcentrifugeuse 15. Vortex 16. Embouts antiaérosols, stériles, jetables, sans ARNase/ADNase de micropipetteur. 17. Tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml en polypropylène et portoirs (des tubes sans ARNase/ADNase sont recommandés mais non exigés). 18. Gants à usage unique, non poudrés. 19. Eau sans nucléase (utilisée au cours de l'extraction et comme Contrôle sans matrice [NTC]) 20. Portoirs de glacière pour tubes de microcentrifugeuse de 1,5 ml a À utiliser avec la méthode d'extraction Roche MagNA Pure LC b À utiliser avec la méthode d'extraction biomérieux easymag
3 Simplexa CMV Page 3 DURÉE DE CONSERVATION ET MANIPULATION 1. Conserver les réactifs à une température comprise entre -10 et -30 C (ne pas utiliser de congélateur sans givre). 2. Laisser les réactifs décongeler à température ambiante (entre environ 18 et 25 C) avant utilisation. 3. Ne pas utiliser les kits ou les réactifs au-delà de leur date limite d'utilisation. 4. Utilisez le mélange réactif dans l'heure qui suit sa préparation. Conserver le Mélange réactif à une température comprise entre 2 et 8 C jusqu au moment de poursuivre par la mise en place de la PCR. 5. Une fois décongelés, conserver le mélange d amorces, le mélange maître et l ADN de contrôle d extraction et d amplification à une température de 2 C à 8 C pendant un maximum de 30 jours. 6. Ne pas recongeler le mélange d'amorces, le mélange maître, l'adn de contrôle d'extraction et d'amplification ou les contrôles positifs. 7. Ne pas combiner des réactifs provenant de différents lots de kits. MISES EN GARDE ET PRÉCAUTIONS 1. Tous les matériaux d'origine humaine doivent être considérés comme potentiellement infectieux. Les matériaux sources d'où provient ce produit (y compris les contrôles) ont été testés à la recherche de l'antigène de surface de l'hépatite B, des anticorps anti-hépatite C et anti-vih-1/2 (SIDA) avec des méthodes homologuées par la FDA et sont apparus négatifs. Cependant, comme aucune méthode de test connue ne peut offrir une garantie à 100 % que des produits dérivés du sang humain ne transmettront pas ces agents infectieux (ou d autres), tous les contrôles, échantillons de sérum et équipements rentrant en contact avec ces échantillons doivent être considérés comme potentiellement infectieux et décontaminés ou éliminés en utilisant les précautions concernant les risques biologiques. Les CDC et les National Institutes of Health préconisent que les agents potentiellement pathogènes soient manipulés au niveau de biosécurité 2. 8, 9 2. Portez un équipement individuel de protection comme (mais non limité à) des gants et une blouse de laboratoire lors de la manipulation des réactifs du kit. Lavez-vous soigneusement les mains quand vous avez fini le test. 3. Ne pas pipeter à la bouche. 4. Ne pas fumer, boire, manger, manipuler des lentilles de contact ou se maquiller dans les zones où des réactifs de kits et/ou des échantillons d'origine humaine sont utilisés. 5. Éliminez les réactifs de kits non utilisés ainsi que les échantillons d'origine humaine conformément aux règlements locaux, nationaux et fédéraux. 6. Dans le laboratoire, le flux de travail doit progresser dans une seule direction en commençant dans les zones de préamplification et en allant vers la zone d amplification/détection : vous trouverez ci-dessous la séquence des événements qui se déroulent depuis l extraction de l échantillon jusqu à l amplification par PCR en temps réel : Commencez par l'extraction de l'échantillon, suivie par le réglage de l'appareil de PCR en temps réel, la préparation des réactifs et, finalement, l'amplification par PCR en temps réel. Il n'est pas recommandé de faire des déplacements croisés de fournitures ou d équipement entre les différentes zones. Les fournitures et l'équipement utilisés pour la préparation de l'échantillon ne doivent pas servir aux activités de préparation du réactif, ni au traitement de l'adn amplifié ou d'autres sources d'acide nucléique cible. Toutes les fournitures et l'équipement d'amplification doivent être conservés en permanence dans la zone de l'appareil de PCR en temps réel. L'équipement individuel de protection, comme les blouses de laboratoire et les gants jetables, doit être réservés à la zone de travail. 7. La contamination des échantillons de patients ou des réactifs peut aboutir à des résultats erronés. Utilisez des techniques respectant les règles d'asepsie. 8. Pipetez et manipulez les réactifs avec prudence pour éviter de mélanger les échantillons de puits contigus. 9. Utilisez des techniques de pipetage correctes et conservez le même schéma de pipetage tout au long de la procédure pour garantir l'obtention de valeurs optimales et reproductibles. 10. Ne substituez pas ou ne mélangez pas des réactifs de différents lots de kits ou avec des réactifs d'autres fabricants. 11. N'intervertissez pas les bouchons des tubes de réactifs. Cela pourrait provoquer une contamination et compromettre les résultats des tests. 12. Utilisez uniquement le protocole décrit dans cette notice. Des écarts par rapport au protocole ou l'utilisation de temps et de températures autres que ceux indiqués pourraient aboutir des résultats erronés. 13. L organisation d un test doit être effectuée à température ambiante (entre 18 C et 25 C, environ). Pendant le mélange des réactifs, maintenez les enzymes au froid en utilisant un bloc réfrigérant. 14. Ne réutilisez pas des Universal Discs qui ont été déjà exposés aux échantillons de patients ou à des réactifs. 15. Éliminez le disque utilisé sans détacher l'adhésif qui le recouvre. 16. Si différents kits ou lots Simplexa sont installés sur un même disque, il est nécessaire de tester les contrôles positifs et les contrôles sans matrice de chaque kit. 17. Le Mélange maître contient plus de 1 % de glycérol, ce qui pourrait produire des irritations après inhalation ou contact avec la peau. Les mesures de premiers secours doivent être prises en cas d'inhalation ou de contact avec la peau. Respectez les consignes générales de sécurité lors de la manipulation des produits chimiques. Ce produit n est pas tenu d'être identifié suivant les directives concernant les matériaux dangereux. 18. Il n est pas recommandé de conserver pendant une période prolongée des échantillons à une température comprise entre 2 et 8 C ; la performance du test n a pas été déterminée dans ces conditions. 19. Si le matériau d emballage du kit semble être déchiré ou endommagé, ne pas utiliser et contacter Focus Diagnostics. Les coordonnées de contact sont indiquées à la dernière page de ce document.
4 Simplexa CMV Page 4 MODE D'EMPLOI A. PRÉLÈVEMENT DES ÉCHANTILLONS Les types d'échantillons acceptables sont du sang total ou du plasma recueillis par ponction veineuse. N'utilisez pas de tubes de prélèvement utilisant l'héparine comme anticoagulant. L'héparine inhibe la PCR. B. ZONE D'EXTRACTION DES ÉCHANTILLONS Travaillez dans une zone dédiée à l'extraction de l'échantillon et du contrôle. La préparation des échantillons pour l'extraction doit être effectuée dans une enceinte de sécurité. Extraction selon la méthode Roche MagNA Pure LC 1. Procédez à l'extraction des échantillons de patients et des contrôles du test à l aide du kit Roche MagNA Pure Total Nucleic Acid Isolation et de l'appareil d'extraction automatisé Roche MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid Extractor. Reportez-vous au mode d emploi du fabricant pour l'extraction de l'acide nucléique au moyen de ce kit. 2. Dans le menu déroulant «Protocol» (Protocole) du système MagNA Pure LC System, sélectionnez dans la liste «Total NA» (acide nucléique total), puis «Total NA Variable_elution_volume.blk». Cela chargera les réglages appropriés pour le test. 3. Le protocole de l échantillon doit être : «Total NA Variable_elution_volume». 4. Le volume de l échantillon doit être réglé à 200 µl et le volume d élution doit être réglé à 50 µl. 5. Le volume de dilution doit être réglé à zéro pour tous les échantillons. 6. Assurez-vous que le protocole post élution est réglé sur «None» (aucun). 7. Assurez-vous que les échantillons et les contrôles sont dans le bon emplacement de la cartouche d'échantillons. 8. Passez chaque échantillon et les contrôles positifs bas et hauts (LPC et HPC) au Vortex pendant 2 à 4 secondes et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond des tubes. 9. Pipetez 200 µl de chaque échantillon, du contrôle positif bas (LPC), du contrôle positif haut (HPC) et du contrôle sans matrice dans l emplacement correspondant de la cartouche d échantillons. 10. Vérifiez visuellement le niveau des échantillons et des contrôles dans la cartouche d'échantillons afin de vous assurer que les échantillons ont été ajoutés. 11. Passez 2 fois au Vortex à pulsations l ADN de contrôle d extraction et d amplification (contrôle interne : IC) et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube. 12. Pour chaque ensemble de 16 échantillons (de 1 à 16 échantillons), dispensez à l aide d une pipette 100 µl de l IC dans un tube conique contenant 6 ml de tampon de lyse. Mélangez brièvement au vortex. Ajoutez le plateau adéquat à l'appareil d'extraction MagNA Pure. o Si, par exemple, plus de 16 échantillons (17-32 échantillons) sont extraits, dispensez à l aide d une pipette 200 µl d IC dans un tube conique contenant 12 ml de tampon de lyse. Mélangez brièvement au vortex. Ajoutez le plateau adéquat à l'appareil d'extraction MagNA Pure. 13. Transférez la cartouche d'échantillons dans l'extracteur MagNA Pure LC Automated Nucleic Acid et commencez la procédure d'extraction. 14. Lorsque l'extraction de l'acide nucléique est terminée, la cartouche contenant les contrôles et échantillons de patients extraits peut être retirée de l'appareil MagNA Pure et scellée. Conservez l'adn à une température de 2 à 8 C avant utilisation. Une conservation prolongée à cette température des échantillons extraits n'est pas recommandée. Gardez les échantillons d'adn extrait sur un bloc réfrigérant pendant le chargement du disque. Extraction par la méthode d'extraction biomérieux NucliSENS easymag 1. Reportez-vous au Manuel de l'utilisateur NucliSENS easymag pour le fonctionnement de l'appareil et du logiciel. 2. Choisissez la matrice générique dans le logiciel NucliSENS easymag avec le paramétrage suivant : Default Request (Demande par Generic (or equivalent) (ou équivalent) défaut) : Run Name Prefix (Préfixe du (as appropriate) (selon les besoins) nom de la série) : Sample ID prefix (Préfixe ID (as appropriate) (selon les besoins) d échantillon) : Sample Type (Type Primary (Primaire) d échantillon) : Workflow Defaults (Paramètres On-board lysis Incubation (Incubation de lyse dans l instrument) par défaut du flux de travail) : On-board Silica Incubation (Incubation de silice dans l instrument) Reagent Tracking (Traçabilité réactif) : Sample Addition Guidance Off (Traçabilité échantillons désactivée) Lysis, Silica, Internal Control reagent tracking disabled (Traçabilité des réactifs de lyse, silice et contrôle interne désactivée)
5 Simplexa CMV Page 5 3. Saisissez les renseignements pour chaque échantillon dans l'écran de Demande d extraction comme ci-dessous. ID échantillon : (Enter sample name) (Saisir le nom de l'échantillon) Demande : Generic (or equivalent) (ou équivalent) Volume (ml) : 0,200 Éluat (µl) : 50 Type : Primary (Primaire) Priorité : Normal Matrice : Other (Autre) 4. Créez la série d'extraction dans le logiciel NucliSENS easymag conformément au manuel de l'utilisateur. 5. Passez chaque échantillon et les contrôles positifs bas et hauts (LPC et HPC) au Vortex pendant 2 à 4 secondes et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond des tubes. 6. Pipetez 200 µl de l échantillon, du LPC, du HPC ou du contrôle sans matrice dans le(s) tube(s) d échantillon(s). 7. Passez 2 fois au Vortex à pulsations le contrôle interne et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube. 8. Pipetez 5 µl d IC vers chaque échantillon et tous les puits de contrôles (Control Wells). Changez d'embout entre les échantillons. 9. Chargez le(s) puits d'échantillons, les nouveaux matériels jetables d'aspiration et réactifs dans l'appareil easymag conformément aux instructions du manuel de l'utilisateur. 10. Démarrez la lyse intégrée et incubez les échantillons lysés pendant 10 minutes avant d ajouter le mélange de silice magnétique. 11. Au cours de la période d'incubation de la lyse, préparez le mélange de silice magnétique. Mélangez la silice et diluez dans de l eau sans nucléase en ajoutant 1 partie de silice magnétique à 3 parties d eau sans nucléase (par exemple, 270 µl de silice magnétique µl d eau sans nucléase). Préparez à peine 135 µl de mélange de silice magnétique par échantillon. 12. Pour transférer le mélange de silice dans les plaques de puits ELISA, mélangez la silice magnétique et utilisez 1 pointe ainsi que le mode de fonctionnement P2 de la pipette Biohit. Appuyez sur Start (Démarrer).pour aspirer µl du mélange de silice magnétique et appuyez de nouveau sur Start (Démarrer) pour renvoyer le premier tirage dans le tube de mélange de la silice. Appuyez sur Start (Démarrer) pour distribuer 125 µl du mélange de silice magnétique dans les 8 puits individuels de la plaque ELISA. Répétez selon le besoin pour des plaques ELISA supplémentaires. 13. Après les 10 minutes d incubation de la lyse, utilisez 8 pointes (par plaque ELISA) et le mode de fonctionnement P3 de la pipette Biohit pour transférer 100 µl du mélange de silice magnétique avec chaque échantillon dans le puits d échantillon. Placez les pointes dans les puits des plaques ELISA et appuyez sur Start (Démarrer) pour mélanger et aspirer le mélange de silice magnétique. 14. Transférez le mélange de silice magnétique dans le puits d'échantillon approprié et placez les pointes de pipette dans les échantillons, en dessous du niveau liquide. Appuyez sur Start (Démarrer) pour aspirer, distribuer et mélanger (x3) la silice magnétique et les échantillons. Assurez-vous que les pointes de pipette restent en dessous du niveau liquide afin d'assurer un mélange correct. 15. Répétez les étapes 13 et 14 pour des puits d'échantillons supplémentaires. 16. Après avoir ajouté le mélange de silice magnétique dans tous les échantillons, commencez la série d'extraction. 17. Lorsque la série est terminée, retirez le(s) puits d'échantillon(s) de l'appareil. Si les échantillons ne sont pas destinés à une utilisation immédiate, transférez-les dans des tubes individuels pour limiter au minimum le risque de voir retomber la silice magnétique dans l'échantillon. Conservez l ADN à une température de 2 à 8 C avant utilisation. Une conservation prolongée à cette température des échantillons extraits n'est pas recommandée. Gardez les échantillons d'adn extrait sur un bloc réfrigérant pendant le chargement du disque. C. CONFIGURATION DE L'APPAREIL DE PCR TEMPS-RÉEL 1. Reportez-vous au Guide de l'utilisateur de l'integrated Cycler pour plus de détails sur la façon de configurer le logiciel Integrated Cycler Studio pour ajouter une définition de tests, régler une série de tests et analyser les séries sur l'integrated Cycler. Remarque : Une courbe de référence valide (série de tests de calibrage) doit être définie avant d'effectuer une série de tests de prédiction. D. ZONE DE PRÉPARATION DU RÉACTIF Zone dédiée à la préparation du mélange réactif du test Simplexa TM CMV. 1. Décongelez le mélange d amorces et le mélange maître à température ambiante (entre environ 18 C et 25 C). Chaque flacon de composant du kit contient suffisamment de réactifs pour 50 réactions. Avant chaque utilisation, mélangez doucement les composants du kit (mélange d amorces et mélange maître) par inversion (6 à 8 fois) et centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube. 2. Préparez le volume requis du mélange réactif dans un tube de microcentrifugeuse en polypropylène de taille appropriée par pipetage du volume de chaque composant comme indiqué dans le tableau ci-dessous.
6 Simplexa CMV Page 6 Volumes de mélange réactif Réactif Mélange réactif Mélange réactif Volume / 1 réaction Volume / 10 réactions Simplexa Master Mix 4,0 µl 40 µl Simplexa CMV Primer Mix 1,0 µl 10 µl Volume total 5,0 µl 50 µl 3. Mélangez doucement le mélange réactif par pipetage (8 à 10 fois). 4. Centrifugez brièvement pour recueillir le contenu dans le fond du tube. 5. Poursuivez le paramétrage de la PCR. 6. Utilisez le mélange réactif dans l'heure qui suit sa préparation. Conservez le mélange réactif à une température de 2 à 8 C si le paramétrage de la PCR ne doit pas être réalisé immédiatement après la préparation du mélange réactif. E. ZONE D'AMPLIFICATION PAR PCR EN TEMPS RÉEL Effectuez cette étape dans une zone dédiée à la préparation du Universal Disc à 96 puits pour le test Simplexa CMV. 1. Ajoutez 5,0 µl du mélange réactif à chacun des puits. 2. Ajoutez 5,0 µl des contrôles positifs extraits dans les puits «HPC» et «LPC». 3. Ajoutez 5,0 µl de l extrait de l échantillon de patient dans le puits «S» approprié du disque. 4. Ajoutez 5,0 µl du contrôle sans matrice extrait dans le puits «NTC». 5. Recouvrez le disque avec l'adhésif de couverture pour Universal Disc. 6. Ouvrez le couvercle de l'integrated Cycler. 7. Placez le disque universel scellé sur la platine. 8. Fermez délicatement le couvercle. 9. Cliquez sur Run (Exécuter). 10. Cliquez sur Start (Démarrer). F. ANALYSE DES DONNÉES 1. Reportez-vous au Guide de l'utilisateur de l'integrated Cycler pour plus de détails sur la façon d analyser les données et d exporter les séries de tests, si nécessaire. CONTRÔLE DE QUALITÉ Chaque laboratoire doit définir ses propres plages de contrôle de la qualité et la périodicité des tests de CQ en fonction des lois locales, règlements et bonnes pratiques de laboratoire standards applicables. COMPTES-RENDUS DES RÉSULTATS 1. Validité de la série de tests Déterminez si la série de tests est valide en passant en revue les résultats du CMV et du contrôle interne (IC) en examinant le contrôle positif bas (LPC), le contrôle positif haut (HPC), et le contrôle sans matrice (NTC). Ces trois contrôles doivent répondre aux critères d'acceptation pour qu'une série soit valide. Si une série de tests n'est pas valide, tous les échantillons de patients doivent alors être à nouveau testés. Critères d'acceptation Contrôle CMV ADN de contrôle d extraction et d amplification (IC) Contrôle sans matrice (NTC) Non détecté Détecté Contrôle positif bas (LPC) À l'intérieur de la valeur de tolérance sur l'étiquette de lot spécifique Sans objet Contrôle positif haut (HPC) À l'intérieur de la valeur de tolérance sur l'étiquette de lot spécifique Sans objet Le contrôle sans matrice (NTC) satisfait les critères d acceptation si le CMV n est «Pas détecté» alors que l IC est «Détecté». La détection du CMV dans le contrôle sans matrice indique que les échantillons peuvent avoir été contaminés au cours de leur traitement. Le contrôle positif bas (LPC) satisfait les critères d acceptation si le CMV est «Détecté» dans le LPC à l intérieur des limites de tolérance (comme indiqué sur l étiquette spécifique du lot) et l IC devrait être «Détecté», mais cela n est pas exigé. Le contrôle positif haut (HPC) satisfait les critères d acceptation si le CMV est «Détecté» dans le HPC à l intérieur des limites de tolérance (comme indiqué sur l étiquette spécifique du lot) et l IC devrait être «Détecté», mais cela n est pas exigé.
7 Simplexa CMV Page 7 2. Interprétation des résultats Interprétation des résultats Exemple Valeur CMV Valeur IC* Interprétation 1 Non détecté Détecté CMV non détecté 2 < 713 UI/ml S/O CMV détecté, en dessous du seuil inférieur de mesure (LLoQ : limite inférieure du dosage). 3 X UI/ml S/O CMV détecté à une concentration spécifique. 4 > 3, CMV détecté, au-dessus de la limite supérieure de dosage UL/ml S/O (ULoQ). 5 Non détecté Non détecté Non valide, recommencer l'extraction et le test. 3. Validité des résultats des échantillons Un échantillon est valide si l une de ces conditions est satisfaite 1. CMV n'est pas détecté et l'ic est détecté. 2. CMV est détecté. Il n'est pas nécessaire que l'ic soit détecté pour que les résultats du CMV soient positifs. 3. Les courbes d'amplification seront revues pour chaque résultat, en particulier quand un message «Data Quality» (Qualité des données) est transmis. Une courbe d'amplification valide présente une augmentation lisse et exponentielle. Se reporter au Guide de l utilisateur pour les actions recommandées. LIMITES 1. Pour diagnostic in vitro uniquement. 2. Exclusivement destiné à l exportation. 3. Les techniciens doivent être formés et avoir l'habitude des procédures de tests et de l'interprétation des résultats avant d'effectuer le test. 4. L'Integrated Cycler Studio de 3M conserve le dernier fichier valide d'étalonnage pour quantifier les échantillons inconnus de patients. Les standards de dosage et les échantillons de patients doivent être extraits en utilisant la même méthodologie d'extraction, faute de quoi vos résultats pourraient être erronés. 5. Lors du suivi d'un patient, la même méthode d'extraction doit être utilisée pour tous les dosages, faute de quoi les résultats pourraient ne pas être relatifs. 6. Tous les résultats de ce test et des autres tests doivent être corrélés aux antécédents cliniques, aux données épidémiologiques et aux autres données à la disposition du clinicien évaluant le patient. 7. La prévalence de l infection aura un impact sur la valeur prédictive du test. 8. Comme pour d'autres tests, des résultats négatifs n'éliminent pas la possibilité d'une infection par CMV. 9. Il peut y avoir des résultats faux négatifs lorsque l'organisme infectant présente des nouvelles mutations, insertions, délétions ou réarrangements. 10. Des résultats faux négatifs peuvent survenir si la quantité d'organismes présents dans l'échantillon est insuffisante en raison de faibles charges virales, très tôt au cours de la maladie, ou en raison d'un prélèvement, transport ou manipulation inadéquats. 11. Comme avec d'autres tests, des résultats faux positifs peuvent survenir. Dans certains cas, une répétition du test, ou le renouvellement du test avec un autre appareil peut être indiqué. 12. Les performances de ce test n'ont pas été établies pour le dépistage du CMV dans le sang ou les produits sanguins. 13. Ce test ne peut pas exclure la présence de maladies provoquées par d'autres agents pathogènes bactériens ou viraux.
8 Simplexa CMV Page 8 CARACTÉRISTIQUES DES PERFORMANCES COMPARAISON DES MÉTHODES Une comparaison avec un dispositif marqué EC a été effectuée à l aide de l analyse de régression linéaire Passing-Bablok dans la région linéaire des deux tests. Les paramètres de la régression linéaire (pente et intersection) pour un intervalle de confiance à 95 % ont été calculés à l aide de la méthode Passing-Bablok.
9 Simplexa CMV Page 9 REPRODUCTIBILITÉ Des études de reproductibilité ont été menées à l aide d un panel constitué d échantillons artificiels préparés à partir de sang et de plasma complet dans lesquels avaient été ajoutées différentes concentrations d'une souche de CMV. Le panel comportait des groupes d échantillons négatifs (matrice non enrichie), positifs bas (environ 2 à 4 fois la limite de détection), positif moyen (environ 8 à 10 fois la limite de détection) et positif haut (près de la limite supérieure du test) pour chaque matrice. De plus, chaque niveau de calibrateur provenant d un lot unique d un ensemble (n = 5) de standards de dosage (QS) du CMV a été inclus dans le panel et testé comme «échantillons inconnus». Le panel d échantillons (n = 13), comportant un contrôle positif bas (LPC), un contrôle positif haut (HPC) et un contrôle sans matrice (NTC), a été extrait une fois par jour et par technicien à l aide de l appareil MagNA Pure LC, du kit d isolement d acides nucléiques totaux MagNA Pure et du système NucliSENS easymag en utilisant les réactifs appropriés. Le panel d ADN extraits a été testé en quatre réplicats sur l'appareil Integrated Cycler. Les résultats sont résumés dans le tableau ci-dessous.
10 Simplexa CMV Page 10 Reproductibilité quantitative QCMV Composantes écart type Type d échantillon Nom de l échantillon Méthode d extraction Concentration attendue (UI/ml) Concentration attendue Log (UI/ml) Moyenne géométrique observée (UI/ml) Moyenne observée Log (UI/ml) Nb. de résultats mesurables Entre inst ruments Entre jours Entre séries Dans série Nb. total CONTRÔLES PLASMA QS SANG TOTAL HPC LPC REPRO 6 REPRO 7 REPRO 8 REPRO 2 REPRO 3 REPRO 4 REPRO 5 REPRO 10 REPRO 11 REPRO 9 MagNA Pure 2,00E+06 6, ,060 0,000 0,056 0,029 0,087 2,00E+06 6,301 2,53E+06 6, ,022 0,039 0,042 0,016 0,064 MagNA Pure 2,00E+04 4, ,000 0,000 0,090 0,066 0,112 2,00E+04 4,301 2,14E+04 4, ,000 0,024 0,045 0,037 0,063 MagNA Pure 1,05E+08 8, ,048 0,034 0,064 0,023 0,090 5,00E+07 7,699 3,19E+08 8, ,000 0,053 0,050 0,026 0,077 MagNA Pure 9,72E+03 3, ,094 0,033 0,063 0,063 0,133 7,10E+03 3,851 3,42E+04 4, ,000 0,033 0,069 0,036 0,084 MagNA Pure 3,11E+03 3, ,121 0,042 0,000 0,150 0,197 2,84E+03 3,453 1,26E+04 4, ,000 0,000 0,065 0,036 0,075 MagNA Pure 2,18E+07 7, ,000 0,000 0,056 0,020 0,059 2,05E+07 7,312 2,02E+07 7, ,011 0,018 0,023 0,015 0,035 MagNA Pure 2,24E+05 5, ,000 0,000 0,046 0,025 0,053 2,10E+05 5,322 2,06E+05 5, ,013 0,000 0,027 0,023 0,037 MagNA Pure 2,15E+04 4, ,047 0,000 0,040 0,079 0,100 1,87E+04 4,272 1,91E+04 4, ,000 0,000 0,029 0,047 0,055 MagNA Pure 4,25E+03 3, ,000 0,000 0,000 0,138 0,138 4,74E+03 3,676 5,13E+03 3, ,000 0,022 0,029 0,088 0,095 MagNA Pure 1,47E+04 4, ,085 0,000 0,090 0,069 0,142 7,10E+03 3,851 4,08E+03 3, ,060 0,071 0,322 0,093 0,348 MagNA Pure 5,97E+03 3, ,069 0,000 0,099 0,101 0,157 2,84E+03 3,453 2,23E+03 3, ,126 0,118 0,162 0,117 0,264 MagNA Pure 1,22E+08 8, ,083 0,068 0,066 0,038 0,132 5,00E+07 7,699 3,78E+07 7, ,137 0,000 0,231 0,016 0,269 Le contrôle négatif (NTC), le plasma négatif, le sang total négatif et l un des standards de dosage ont été inclus dans le panel de reproductibilité, et tous étaient reproductibles, mais en dehors de la plage de valeurs rapportables du test ; pour cette raison, ils n ont pas été inclus dans l analyse de reproductibilité quantitative. SENSIBILITÉ ANALYTIQUE/LIMITE DE DÉTECTION Les échantillons de limite de détection (LoD, Limit of Detetion) utilisés dans cette étude ont été créés artificiellement en ajoutant des quantités connues d'une souche de CMV à des matrices de plasma et de sang total négatives, recueillies en clinique. Ce panel comportait un échantillon négatif (matrice seule) et diverses concentrations de CMV à proximité de la LoD attendue déterminée au cours de tests de validation. L étude a utilisé plusieurs séries de tests pour évaluer la LoD du kit expérimental Simplexa CMV selon deux méthodes d extraction. Afin de déterminer la LoD, trois extractions différentes et séries de PCR ont été effectuées. Chacun des échantillons extraits a été testé en huit réplicats (une extraction, 8 puits) en même temps que les contrôles du test (en un seul exemplaire). Globalement, chaque échantillon du panel a été testé un total de 24 fois. La concentration la plus basse ayant donné un taux de détection de 95 % selon une analyse par la méthode des probits correspond à la Lod. Le protocole pour déterminer la LoD a été exécuté pour chaque type d'échantillon préparé en utilisant chacune des deux méthodes d'extraction. Les valeurs individuelles de LoD sont indiquées dans le tableau ci-dessous. La LoD du test CMV, sur la base de la LoD la plus élevée parmi tous les types d'échantillons et méthodes d'extraction, a été calculée à 711 UI/ml.
11 Simplexa CMV Page 11 Plasma Sang total MagNA Pure EasyMag MagNA Pure EasyMag UI/ml * Copies/ml * *La LoD de ce type d'échantillon a été déterminée comme étant la concentration la plus basse affichant > 95 % de détection des 24 réplicats. LIMITE INFÉRIEURE DE QUANTIFICATION (LLoQ, Lower Limit of Quantificaton) La LLoQ a été définie comme la concentration la plus basse à laquelle l'écart type était 0,3 log UI/ml pour tous les types d'échantillons et méthodes d'extraction. La LLoQ a été calculée à 713 IU/ml. LINÉARITÉ La linéarité du test a été déterminée à l aide d échantillons créés artificiellement en ajoutant des quantités connues d'une souche de CMV à des matrices de plasma et de sang total négatives, recueillies en clinique. Le panel comprenait au moins 10 mélanges à des concentrations connues (nombre de copies/ml), couvrant la plage linéaire attendue. Parmi ces mélanges, au moins 3 concentrations se situaient à proximité de la limite inférieure de dosage (LLoQ), 2 à proximité de la limite supérieure de dosage (ULoQ, Upper Limit of Quantitation), et les autres étaient distribués à peu près uniformément entre ces deux limites. Chaque échantillon a été testé de façon aléatoire, en un minimum de 3 réplicats. Le protocole pour déterminer la linéarité a été exécuté pour chaque type d'échantillon préparé en utilisant chacune des deux méthodes d'extraction. Les valeurs individuelles de plage linéaire sont indiquées dans le tableau ci-dessous. Plasma Sang total MagNA Pure EasyMag MagNA Pure EasyMag UI/ml 713 à 3,96 x à 3,96 x à 3,96 x à 3,96 x 10 8 Copies/ml 180 à 1,00 x à 1,00 x à 1,00 x à 1,00 x 10 8
12 Simplexa CMV Page 12 Graphique de linéarité pour le plasma extrait avec easymag Graphique de linéarité pour le sang total extrait avec easymag
13 Simplexa CMV Page 13 Graphique de linéarité pour le plasma extrait avec MagNA Pure Graphique de linéarité pour le sang total extrait avec MagNA Pure
14 Simplexa CMV Page 14 PLAGE DE VALEURS RAPPORTABLES Tous les types d'échantillons préparés par chacune des méthodes d'extraction étaient linéaires jusqu'à 3, UI/ml. La plage rapportable la plus basse du test était basée sur le type d'échantillon et la méthode d'extraction présentant la plus haute limite inférieure de quantification (LLoQ, en UI/ml) qui se situait dans la plage linéaire. La plage de valeurs rapportable du test calculée était 713 UI/ml et 3, UI/ml. Les échantillons supérieurs à la plage linéaire seront rapportés comme ayant > 3, UI/ml et les échantillons inférieurs à la plage linéaire seront rapportés comme ayant < 713 IU/ml. RÉACTIVITÉ ANALYTIQUE/ RÉACTIVITÉ CROISÉE La réactivité analytique / réactivité croisée du test Simplexa a été évaluée. Les études ont indiqué que les amorces sont spécifiques pour le CMV et n ont présenté aucune réactivité croisée avec d autres virus ou bactéries provoquant des symptômes cliniques comparables ou constituant une flore normale dans les types d'échantillons d'intérêt. Chaque agent de réactivité croisée potentiel a été testé en trois réplicats. Organisme (plasma) Résultat Organisme (sang total) Résultat VHB (matériel de contrôle Non détecté S/O S/O utilisé non dilué VHC (matériel de contrôle Non détecté S/O S/O utilisé non dilué Adénovirus Non détecté Adénovirus Non détecté VIH-1 Non détecté VIH-1 Non détecté VIH-2 Non détecté VIH-2 Non détecté VHS-1 Non détecté VHS-1 Non détecté VHS-2 Non détecté VHS-2 Non détecté HHV-6 Non détecté HHV-6 Non détecté VJC Non détecté VJC Non détecté HHV-7 Non détecté HHV-7 Non détecté HHV-8 Non détecté HHV-8 Non détecté Rubéole Non détecté Rubéole Non détecté Parvovirus Non détecté Parvovirus Non détecté Toxoplasma gondii Non détecté Toxoplasma gondii Non détecté VZV Non détecté VZV Non détecté EBV Non détecté EBV Non détecté HTLV-1 Non détecté HTLV-1 Non détecté INTERFÉRENCE Le test Simplexa CMV détecte spécifiquement l ADN du CMV en présence d agents potentiellement interférents. Les substances interférences choisies étaient celles probablement présentes dans les échantillons de patients, des substances exogènes pouvant être présentes dans les échantillons, ou des substances utilisées lors du prélèvement de l échantillon. Pour cette étude, le CMV et les agents interférents ont été ajoutés à des matrices négatives de sang total ou de plasma. Les substances interférentes testées étaient l azathioprine, la cyclosporine, le gancyclovir, l hydroxychloroquine, la prednisone, Abacavir, Éfavirenz et Darunavir. Aucune interférence n a été observée. CONTAMINATION PAR TRANSFERT L'amplification d'une contamination par transfert a été évaluée pour l'instrument et l'universal Disc au moyen d'autres tests. Les études ont recherché la présence de contamination dans des échantillons négatifs hauts. L'étude a été conçue en plaçant l'un à côté de l'autre, en alternance, un échantillon fortement positif et un échantillon fortement négatif sur chaque disque. L'effet de contamination par transfert a été évalué en comparant le taux observé de négatifs pour les échantillons hauts négatifs avec le taux théorique attendu dans les conditions de reproductibilité normale. Aucun effet de contamination par transfert n'a été observé au cours des tests précédents.
15 Simplexa CMV Page 15 RÉFÉRENCES 1. Mocarski, E. S. (1993) Cytomegalovirus biology and replication, p In B. Roizman, R. J. Whitley, and C. Lopez (ed), the Human Herpesviruses. Raven Press, New York, N.Y. 2. Fowler KB, Stagno S, Pass RF, Britt WJ, Boll TJ, Alford CA. The outcome of congenital cytomegalovirus infection in relation to maternal antibody status. N Engl J Med Mar 5;326(10): Grundy JE, Lui SF, Super M, Berry NJ, Sweny P, Fernando ON, Moorhead J, Griffiths PD. Symptomatic cytomegalovirus infection in seropositive kidney recipients: reinfection with donor virus rather than reactivation of recipient virus. Lancet Jul 16;2(8603): Griffiths, P. D. and Emery, V.C. (2002) Cytomegalovirus, p In D. D. Richman, R. J. Whitley, and F. G. Hayden (ed), Clinical Virology second edition. ASM Press, Washington, D.C. 5. Kalpoe, J. S., et al or (A. C. M. Kroes, M. D. de Jong, J. Schinkel, C. S. de Brouwer, M. F. C. Beersma, and E. C. J. Claas) (2004) Validation of Clinical Application of Cytomegalovirus Plasma DNA Load Measurement and Definition of Treatment Criteria by Analysis of Correlation to Antigen Detection p Vol. 42, No. 4 JOURNAL OF CLINICAL MICROBIOLOGY 6. Baldanti F, Lilleri D, Gerna G. Monitoring human cytomegalovirus infection in transplant recipients. J Clin Virol. 2008;41(3): Fryer JF. Heath AB, Anderson R, Minor PD and the collaborative study group. Collaborative study to evaluate the proposed 1st WHO International Standard for human cytomegalovirus (HCMV) for nucleic acid amplification (NAT)-based assays. WHO ECBS Report 2010; WHO/BS/ NCCLS H18-A2. Procedures for the Handling and Processing of Blood Specimens; Approved Guideline. 2nd Ed. (1999). 9. CDC-NIH Manual. (1999) Biosafety in Microbiological and Biomedical Laboratories. 4th ed. And National Committee for Clinical Laboratory Standards (NCCLS). Protection of Laboratory Workers from Instruments, Biohazards and Infectious Disease Transmitted by Blood, Body Fluids and Tissue (NCCLS M29-A). L utilisation des sondes Scorpions dans un but de diagnostic in vitro chez l homme est couverte par une licence accordée à Focus Diagnostics, Inc. par DxS, Ltd. Les marqueurs Black Hole Quencher, CAL Fluor Quasar sont des marques de commerce de Biosearch Technologies, Inc. «BTI»). La technologie des marqueurs Black Hole Quencher, CAL Fluor et Quasar fait l'objet d'une licence aux termes d'un accord avec BTI et ces produits sont vendus exclusivement dans un but clinique, diagnostique ou de recherche-développement. Cette notice est disponible en anglais, français, allemand, italien espagnol et portugais du Brésil à l'adresse et dans d'autres langues auprès de votre distributeur local. REPRÉSENTANT AUTORISÉ mdi Europa GmbH, Langenhagener Str , Langenhagen-Hannover, Allemagne RENSEIGNEMENTS POUR LES COMMANDES Téléphone : Fax : (800) (États-Unis uniquement) (562) (562) (International) PI.MOL2200.OUS Rév. D Date de rédaction : 30 avril 2013 ASSISTANCE TECHNIQUE Téléphone : (800) (États-Unis uniquement) Fax : (562) Consultez notre site internet à l'adresse (562) (International) Cypress, Californie États-Unis
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