Indication du test. Contexte clinique. LDBIO-TOXO II IgG 0459 CONFIRMATION NOTICE D'UTILISATION

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1 LDBIO-TOXO II IgG 0459 CONFIRMATION #TOXO II - 24G (24 tests) #TOXO II - 12G (12 tests) #TOXO II - 96G (96 tests) Indication du test 1 Technique d'immunoblot pour usage diagnostique in vitro NOTICE D'UTILISATION LDBIO-TOXO II IgG est un test qualitatif de confirmation par immunoblot du sérodiagnostic IgG de la toxoplasmose. Ce test n est pas destiné au diagnostic de la toxoplasmose congénitale par comparaison des profils immunologiques. Pour cet usage, utiliser la trousse TOXOPLASMA WB IgG IgM (réf. #TOP-WB24GM). Contexte clinique La toxoplasmose est une anthropozoonose cosmopolite très répandue chez le mammifères et les oiseaux. L agent pathogène Toxoplasma gondii est un protozoaire de la sous-classe des coccidies et de la famille des sarcocystidés. T. gondii est un parasite intracellulaire obligatoire. La toxoplasmose est ubicuitaire mais sa prévalence est très hétérogène selon les pays. La toxoplasmose est une pathologie normalement asymptomatique chez le sujet sain (adénopathies, fièvre, asthénie) pouvant évoquer une mononucléose infectieuse. Elle devient une infection redoutable lorsqu elle atteint un sujet immunodéprimé ou une femme enceinte chez laquelle elle peut engendrer une fœtopathie grave. Seuls les examens de laboratoire peuvent confirmer le diagnostic et parmi ceux-ci les examens sérologiques (IgG, IgM et IgA) restent une base essentielle du diagnostic. L ELISA représente la technique usuellement employée dans le dépistage de la toxoplasmose. L interprétation des résultats proches du seuil ou situés dans la zone équivoque de la trousse employée nécessite un contrôle sur un autre prélèvement et peut demander une confirmation des résultats par une technique de référence tel le Dye test de Sabin et Feldman. LDBIO-TOXO II IgG présente une excellente corrélation avec le Dye test. Très sensible et très spécifique, il permet de confirmer ou d infirmer la présence d anticorps IgG anti-t. gondii dans un prélèvement. F202 T2G-f-30/11/2013 v7

2 Principe du test 2 Origine et présentation des bandelettes Les antigènes de Toxoplasma gondii après séparation électrophorétique sur gel de polyacrylamide ont été fixés par électro-transfert sur la surface de bandelettes de nitrocellulose (technique de Western Blot). Les bandelettes sont fournies prêtes à l'emploi, numérotées et prédécoupées. Déroulement du test : Chaque échantillon de sérum à tester est incubé séparément avec une bandelette. Les anticorps anti-t. gondii éventuellement présents se fixent sélectivement sur les antigènes présents sur les bandelettes. Le lavage élimine les anticorps non fixés. Chaque bandelette est ensuite incubée avec le conjugué anti-igg humaines-phosphatase Alcaline qui se lie aux anticorps anti-t. gondii éventuellement fixés. Le lavage élimine le conjugué non fixé. Lors de la dernière étape, cet immuncomplexe réagit sur le substrat : les bandes antigéniques reconnues par les anticorps anti-t. gondii de classe IgG éventuellement présents dans les échantillons sont révélées sous forme de bandes transversales violettes. La réaction de coloration est arrêtée par un lavage à d'eau distillée. Les bandelettes sont séchées ; leur coloration est stable plusieurs années à l'abri de la lumière. Lecture : 5 bandes d'un poids moléculaire compris entre 30 et 45 kda, bien visibles sur la bandelette, sont spécifiques de l infestation toxoplasmique. La présence d'au moins 3 bandes parmi ces 5 bandes, incluant la bande à 30 kda, permet d'interpréter le test comme positif et de conclure à la présence d'anticorps IgG anti-t. gondii dans l'échantillon testé (voir exemple p 15). Réactifs fournis avec la trousse Nota : Les volumes et quantités indiqués (en italique) correspondent au conditionnement de 12 tests #T2-12G. Ceux indiqués en caractères gras correspondent au conditionnement 96 tests #T2-96G.

3 3 R1 : Une (1) pochette de 24 (12, 4x24) BANDELETTES SENSIBILISEES Bandelettes de nitrocellulose, numérotées et prédécoupées mais attachées par leur extrémité supérieure à la souche. Les bandelettes ont été sensibilisées par électro-transfert d antigène Toxoplasma gondii séparés par électrophorèse sur gel de polyacrylamide. R2 : Un (1) flacon contenant 30 (30, 125) ml de DILUANT ECHANTILLONS (Prêt à l'emploi - solution rose) Solution tampon + surfactant + NaN3 (inf. 0.1%). R3 : Un (1) flacon contenant 30 (30, 125) ml de CONJUGUE ANTI-IgG (Prêt à l'emploi - solution bleue) Solution tampon + sérum polyclonal de chèvre anti-igg humaines conjugué à la phosphatase alcaline + NaN3 (inf. 0.1%) + stabilisants. R5 : Un (1) flacon contenant 30 (30, 125) ml de SUBSTRAT (Prêt à l'emploi - flacon opaque marron) Solution tampon + NBT + BCIP + stabilisants. R6 : Un (1) flacon contenant 60 (60, 250) ml de TAMPON DE LAVAGE CONCENTRE 10X (A diluer 10 fois dans de l'eau distillée - solution incolore) Solution tampon + surfactant + NaN3 (inf. 0.1%). R10 Un (1) tube contenant 100 (100, 200) µl de SERUM DE CONTROLE POSITIF (Prêt à l'emploi - bouchon rouge/orange) Solution tampon + pool de sérums humains positif en sérologie toxoplasmose + NaN3 (inf. 0.1%) + stabilisants. Standards colorés (protéines recombinantes) situés dans la pochette (R1) à droite des bandelettes permettant d'estimer de haut en bas la distance de migration et correspondant aux Poids Moléculaires suivants (kda) : Bleu : 250, Bleu : 150, Bleu : 100, Rose : 75, Bleu : 50, Vert : 37, Rose : 25, bleu : 20, bleu : 15. Le coffret contient également, à titre d exemple, la reproduction scanner d'immunoblots provenant de sérums positif et négatif (voir page 19 de la présente notice). F202 T2G-f-30/11/2013 v7

4 Matériel nécessaire mais non fourni 4 - Gants en latex. Pincette pour manipuler les bandelettes - Cuves d'incubation multicanaux en polypropylène adaptées aux miniblots (Réf. LDBIO # WBPP- 08 ou équivalent) - Agitateur oscillant pour immunoblots - Système d'aspiration pour les liquides permettant de vider les cuves d'incubation - Cutter ou scalpel - Règle plate transparente - Papier absorbant de type Whatman - Papier aluminium - Eau distillée ou désionisée de bonne qualité - Pipettes automatiques, micropipettes et pointes à usage unique (volumes de 10µl, 1.2ml et 2ml) - Éprouvettes graduées, récipients adaptés, pissette de laboratoire. - Chronomètre - Ruban adhésif transparent de bonne qualité - Tubes et matériel pour le prélèvement des échantillons. Conditions de conservation Tous les réactifs du coffret doivent être conservés entre 2 et 8 C. Ils sont valables jusqu'à la date de péremption indiquée sur le couvercle de la boîte et les étiquettes des flacons. Une fois dilué, le tampon de lavage est stable 2 mois, conservé entre 2 et 8 C. Précautions spéciales d'emploi Sécurité - pour usage in vitro exclusivement. - Le contrôle positif est un sérum d'origine humaine. Il a subi un dépistage négatif, concernant les anticorps anti-vih 1 et 2, les anticorps anti-vhc et l'ag HBs, mais doit cependant être manipulé comme un produit potentiellement infectieux. - Manipuler selon les Bonnes Pratiques de Laboratoire et considérer tout réactif et tout échantillon comme potentiellement toxique et/ou infectieux. - Le substrat contient un mélange NBT et BCIP toxiques par contact (peau et muqueuses) et inhalation. - Les réactifs contiennent de l'azide de sodium susceptible de former des sels métalliques explosifs avec le plomb ou le cuivre. Rincer à l'eau tout rejet à

5 5 l'évier. - Porter des vêtements protecteurs (blouse, gants, lunettes). - Ne pas boire, manger ou fumer dans le laboratoire. - Ne pas pipeter avec la bouche. Refermer les flacons après usage. - Éliminer les déchets (prélèvements, pointes, tubes, liquides de lavage, réactifs usagés...) conformément aux bonnes pratiques en usage dans la profession et aux règlements en vigueur dans le Pays. Précautions - Ne pas toucher les bandelettes avec les doigts, porter des gants et utiliser une pincette. - Ne pas utiliser de réactif après la date de péremption. - Conserver les réactifs dans le coffret fourni. - Ne pas utiliser ensemble des réactifs de lots différents. - Les réactifs doivent être bien mélangés avant usage. - Ne pas utiliser de réactif provenant d un flacon présentant des signes de fuite. - Ne pas laisser inutilement les réactifs hors du réfrigérateur. - Bien mélanger le tampon de lavage concentré avant dilution. - La qualité de l'eau est importante pour obtenir un bon tampon de lavage. - Ne pas utiliser de solution trouble ou précipitée. - N'utiliser que des cônes de pipette à usage unique. - Éviter toute contamination inter-puits. Attention à la formation d'aérosols. - Établir un plan de distribution précis avant de commencer la manipulation. - L omission de distribution d un échantillon ou la distribution d un volume inapproprié peut faire considérer comme négatif le résultat du test quelque soit son statut réel. Prélèvement des échantillons Prélever de manière aseptique les échantillons sur tube sec. Un minimum de 10 µl de sérum sont nécessaires pour l analyse. Laisser coaguler le sang, centrifuger et décanter le sérum. Conserver les échantillons à 2-8 C. Les congeler à -20 ± 5 C s'ils ne doivent pas être utilisés dans les 72h. Éviter de congeler et décongeler les échantillons plusieurs fois. Préparation des réactifs Tampon de lavage : Pour 4 tests diluer dans un flacon propre 10ml de tampon de lavage concentré 10x (R6) dans 90ml d'eau distillée ou désionisée (le tampon dilué se conserve 2 mois à 2-8 C). F202 T2G-f-30/11/2013 v7

6 Mode opératoire 6 1/ Préparer un plan de distribution des échantillons. Il est vivement conseillé d'y inclure le contrôle positif (R10). L'utilisation de ce contrôle permet de valider techniquement la manipulation et de fournir un modèle très fiable pour l'identification finale des bandes antigéniques révélées. 2/ Distribuer 1.2ml de tampon échantillon (R2) dans chacun des puits selon le plan établi. 3/ Mettre des gants. Ne pas toucher les bandelettes. Utiliser une pincette pour les manipuler. A l'aide d'un cutter (ou scalpel) et d'une règle plate transparente propre et sèche, découper le nombre de bandelettes (R1) nécessaire. Pour cela, maintenir fermement les bandelettes plaquées par la règle et les découper du coté de la souche (les numéros étant visibles au travers de la règle par transparence). 4/ Distribuer les bandelettes numérotées à l'aide des pincettes selon le plan de distribution. Laisser les bandelettes se réhydrater dans le tampon pendant environ 5 minutes, face vers le haut (N visible) et totalement recouvertes par le tampon. 5/ Distribuer (10 µl) les échantillons de sérum et le contrôle positif, selon le plan de distribution. Agiter doucement la cuve après chaque dépôt. Incuber sur un agitateur oscillant pendant 90mn ± 5mn à C. 6/ Lavage : Vider le contenu des puits à l'aide d'une pompe aspirante, d une pipette pasteur ou par retournement de la cuve d incubation et répartir environ 2 à 3 ml de tampon de lavage dilué dans chacun d'eux en évitant de retourner les bandelettes. Agiter doucement la cuve horizontalement puis revider le contenu des puits. Répartir à nouveau environ 2 à 3ml de tampon de lavage dilué en évitant de retourner les bandelettes. Incuber 3 à 5mn sur l'agitateur. Vider le liquide. Répéter cette dernière opération 1 fois. 7/ Distribuer 1.2ml de conjugué anti-igg (R3) dans chacun des puits. Les bandelettes doivent être totalement recouvertes et face vers le haut (numéros visibles). Incuber sur un agitateur oscillant pendant 60mn ± 5mn à C. 8/ Lavage : procéder comme pour l'étape 6.

7 7 9/ Distribuer 1.2ml de substrat NBT/BCIP (R5) dans chacun des puits. Les bandelettes doivent être face vers le haut (N visible) et totalement recouvertes par le substrat. Incuber sur un agitateur oscillant 60mn ± 5mn à C et à l'abri de la lumière directe (recouvrir les cuves d'un papier aluminium). L'arrêt se fait par l'aspiration du substrat avec la pompe et la distribution de 2ml d'eau distillée ou désionisée dans le puits. Laisser incuber 3 à 5mn et répéter une fois ce dernier lavage. 10/ Saisir les bandelettes par leur extrémité numérotée à l'aide de la pincette (cette manipulation est plus aisée si les puits sont pleins d'eau) et les déposer, numéro visible, sur un papier absorbant de type Whatman. Laisser les bandelettes sécher à l'air (éventuellement à proximité d'une lampe à incandescence pour diminuer le temps de séchage). La couleur des bandelettes s'éclaircit naturellement en séchant. 11/ Transférer les bandelettes sur la feuille de papier qui servira à les archiver. Les maintenir avec la règle plate et les coller par le haut à l'aide du ruban adhésif transparent. Éviter de les manipuler avec les doigts. Attention : plus les bandelettes sont sèches, plus elles sont fragiles. F202 T2G-f-30/11/2013 v7

8 Interprétation 8 Étalonnage des poids moléculaires - La juxtaposition de la bandelette d'un échantillon et du standard de poids moléculaire (PM) coloré fourni dans la trousse (pochette R1) permet d'estimer le PM des bandes antigéniques révélées (il faut auparavant le découper à l'aide d'une règle et d'un scalpel comme une bandelette ordinaire et le manipuler avec une pincette). - Le contrôle positif R10 utilisé dans la même série que les échantillons fournit une bandelette témoin qui indique très précisément la position des bandes spécifiques dans la zone 30 à 45kDa. - La reproduction d'immunoblots de sérums positifs testés avec le présent lot de réactifs est incluse dans le coffret à titre d'exemple (p 15). Interprétation Rechercher la présence des bandes spécifiques dans la zone 30-45kDa pour chacun des échantillons testés à l'aide des outils d'étalonnage décrits ci-dessus. Ces bandes, groupées et bien isolées, sont caractéristiques et généralement très facilement repérables. La lecture se fait par comparaison des résultats avec la bandelette du contrôle positif (R10). La présence sur la bandelette d'un minimum de 3 bandes spécifiques dans la zone 30-45kDa incluant la bande à 30kDa, permet d'interpréter le test comme positif et de conclure à la présence d'anticorps IgG anti-t. gondii dans l'échantillon testé (voir exemples p 15). Nota Bene : d autres bandes peuvent être observées. Elles ne sont pas prise en compte dans la lecture du test.

9 Limites du test 9 Les résultats sérologiques doivent être interprétés en fonction des renseignements biologiques, épidémiologiques et cliniques afin d'établir le diagnostic de toxoplasmose. Un résultat sérologique négatif n'écarte pas le diagnostic de toxoplasmose. Problèmes rencontrés "Les bandes sont pâles et peu contrastées" : Certains sérums très peu chargés en anticorps peuvent donner de tels résultats. "Des zones d'ombre se voient, plus ou moins colorées, légèrement diffuses" : - La bandelette n'était pas totalement immergée dans l'un des réactifs et n'a pas incubé correctement sur toute sa longueur. - Des taches peuvent être également présentes à l endroit du dépôt de l échantillon si la cuve n a pas été agitée après la distribution. "Le bruit de fond est important, rendant la lecture très difficile" : Les lavages ont été insuffisants ou la dernière incubation a été trop longue. S'assurer du bon déroulement technique du test, du respect des temps de lavage, de la qualité de l'eau. Diminuer le temps de la dernière incubation. Exceptionnellement, certains sérums peuvent réagir ainsi de façon non spécifique. Le résultat de l'immunoblot ne peut alors être rendu. Ce bruit de fond non spécifique peut également ne concerner qu'une partie de la bandelette, rendant les résultats ininterprétables sur cette partie seulement. "Un précipité apparaît dans la solution lors de la dernière étape de révélation" Le substrat peut effectivement partiellement précipiter (flocons noirs) dans le tampon en fin de révélation. Ce phénomène n'altère pas la qualité de la révélation qui doit être poursuivie normalement. Le lavage final à l'eau distillée élimine les particules solides éventuellement présentes. F202 T2G-f-30/11/2013 v7

10 Contrôle de qualité 10 Le sérum de contrôle inclus dans le coffret doit systématiquement être inclus dans toute série de WB et permet : - de valider techniquement le bon déroulement du test (les bandes doivent apparaître très nettement sur la bandelette), - d'étalonner précisément la position exacte des 5 bandes spécifiques dans la zone 30-45kDa pour aider à l'interprétation des échantillons. Performances L évaluation a été réalisée dans un laboratoire de référence, spécialiste du diagnostic de la toxoplasmose. Le principe de l évaluation a consisté à comparer sur 529 sérums les résultats obtenus par la technique LDBIO-TOXO II IgG (LDBIO IgG), les résultats du DYE TEST de Sabin et Feldman (Dye test), les résultats de deux techniques de dépistage commercialisées, «TEST 1 IgG» et «TEST 2 IgG», ainsi que les données cliniques et biologiques des patients. Seuil des techniques utilisées : négatif équivoque positif DYE TEST (UI/ml) <2 - >=2 TEST 1 IgG (UI/ml) <4 4-8 >=8 TEST 2 IgG (UI/ml) <6 - >=6 LDBIO IgG (index) 0 - >=1 Analyse statistique des résultats : Nous avons établi les valeurs de sensibilité, spécificité lorsque cela était possible. La corrélation des résultats trouvés par différentes techniques a été évaluée par le test CHI-2 de Mac Nemar sur séries appariées.

11 11 Patients : Toutes les analyses ont été effectuées sur des sérums conservés congelés à 20 C. Les échantillons proviennent de 5 groupes de patients différents. Groupe I Dye test Etude sur 200 sérums obtenus lors du dépistage de la toxoplasmose chez des femmes enceintes, et testés par le Dye test (DT). Le sousgroupe «positif» correspond à 98 sérums positifs en DT provenant de femmes immunisées contre T. gondii. Ce sous-groupe comprenait des sérums présentant des titres d IgG modérés en DT (de 2 à 32 UI/ml) afin de tester la sensibilité de LDBIO IgG versus les autres techniques. Le sous-groupe «négatif» correspondait à 102 sérums négatifs en DT, provenant de femmes enceintes non immunisées contre la toxoplasmose. Ces 200 sérums ont été testés en parallèle avec les techniques LDBIO IgG, TEST 1 IgG et TEST 2 IgG. Groupe II - Séroconversions Il s agit de l analyse rétrospective de 17 séquences de sérums (101 échantillons) provenant de patientes ayant présenté une séroconversion toxoplasmique pendant leur grossesse. Chaque série séquentielle comprend le dernier sérum négatif puis une série de 3 à 5 sérums montrant l apparition des IgM spécifiques et la synthèse d IgG spécifiques (TEST 2 IgG). Groupe III suivi enfants non-infectés Il s agit de l analyse rétrospective de 74 échantillons correspondant à 20 séquences du suivi post-natal d enfants nés de mères ayant présenté une séroconversion toxoplasmique en cours de grossesse. Chaque séquence de 2 à 6 sérums montre la décroissance du titre des IgG maternelles transmises jusqu à négativation de la sérologie par la technique TEST 2 IgG (entre 5 et 13 mois). F202 T2G-f-30/11/2013 v7

12 12 Groupe IV suivi enfants infectés Il s agit de l analyse rétrospective de 85 échantillons provenant du suivi post natal de 30 enfants ayant une infection congénitale. Le suivi sérologique était réalisé par TEST 2 IgG. Groupe V sensibilité - spécificité (infections virales et paludisme) Etude sur 69 sérums de patients atteints d infections virales ou de paludisme (tableau 1). Ces échantillons ont été testés par TEST 2 IgG. (Tous étaient négatifs IgM). Tous les négatifs ainsi que les discordants ont été testés en Dye test. agent infect. TEST 2 IgG POS TEST 2 IgG NEG TOTAL EBV VZV CMV VHB VHA VHC VIH PALU Tableau 1 : différentes infections testées dans l étude RESULTATS Groupe I : Dye test DYE TEST LDBIO IgG TEST 1 IgG TEST 2 IgG POS NEG EQUIVOQUE SPECIFICITE - 100% 100% 100% SENSIBILITE - 99% 85% 95% Tableau 2 : Corrélation du Dye test avec les 3 techniques. (La technique TEST 1 IgG présente une zone équivoque). - 4 sérums TEST 2 IgG négatifs sont positifs en LDBIO IgG et Dye test - 11 sérums TEST 1 IgG négatifs sont positifs en LDBIO IgG et Dye test - 25 sérums TEST 1 IgG sont équivoques : 24 sont positifs en LDBIO IgG et Dye test, 1 sérum est négatif en LDBIO IgG et Dye test

13 13 Groupe II : Séroconversions LDBIO IgG TEST 2 IgG POS NEG POS NEG 0 21 Tableau 3 : Corrélation LDBIO IgG / TEST 2 IgG sur 101 sérums de séroconversion. p= Pour 8 / 17 séroconversion (47%) les IgG sont dépistées plus précocement par LDBIO IgG. Groupes III et IV : Suivis de nouveaux nés LDBIO IgG TEST 2 IgG POS NEG POS NEG 0 11 Tableau 4 : Corrélation LDBIO IgG / TEST 2 IgG sur 159 sérums de suivi post natal. p< Enfants indemnes : 13 sérums, correspondant à 10 / 20 suivis postnataux (50%) négatifs en TEST 2 IgG, restent positifs en LDBIO IgG qui met en évidence des anticorps maternels transmis alors que la technique TEST 2 IgG ne les détecte plus. Enfants contaminés : 5 sérums correspondant à 3 enfants sont discordants. L un d entre eux montre une négativation transitoire de sa sérologie par TEST 2 IgG. Le test LDBIO IgG demeure positif, confirmant sa contamination. Pour les 2 autres enfants, le test LDBIO IgG montre une positivité plus précoce que TEST 2 IgG. Il est cependant impossible d affirmer une néosynthèse d IgG, ce test ne différenciant pas les anticorps maternels transmis des anticorps néo-synthétisés. F202 T2G-f-30/11/2013 v7

14 14 Groupe V : Sensibilité et Spécificité (infections virales et paludisme) LDBIO IgG & DYE TEST TEST 2 IgG POS NEG POS 42 2 NEG 2 23 Tableau 5 : Corrélation LDBIO IgG / DYE TEST / TEST 2 IgG sur 69 sérums d infections virales ou de paludisme. Sur cette population, la concordance de LDBIO IgG avec le DYE TEST est de 100% : ces résultats confirment la spécificité et la sensibilité du test LDBIO-TOXO II IgG. L étude met en évidence quatre résultats discordants par la technique TEST 2 IgG, 2 faux négatifs (un HIV et un P.falciparum) et 2 faux positifs (deux P.falciparum) soulignant l intérêt d une technique de confirmation pour tous les résultats proches du seuil.

15 CONCLUSION 15 Groupe I (Dye test) : La corrélation LDBIO IgG / DYE TEST est excellente (sensibilité 99%, spécificité 100%). LDBIO-TOXO II IgG permettrait de confirmer le statut immunitaire des patients présentant au dépistage un résultat équivoque ou un titre faible d anticorps. Groupe II (séroconversions) : La sensibilité de LDBIO IgG est supérieure à TEST 2 IgG (p=0.0016). LDBIO-TOXO II IgG permettrait de confirmer une séroconversion plus précocement que TEST 2 IgG. Groupes III et IV (suivis de nouveaux nés) : la sensibilité de LDBIO IgG est très supérieure à TEST 2 IgG (p<0.0001). Lors du suivi de l enfant, LDBIO-TOXO II IgG pourrait être utilisé pour confirmer ou infirmer la négativation de la sérologie. Cependant LDBIO-TOXO II IgG ne permet pas de différencier les anticorps maternels transmis des anticorps néo-synthétisés par l enfant. Groupe V (infect. virales et paludisme) : la corrélation LDBIO IgG / DYE TEST est excellente (sensibilité 100%, spécificité 100%). Ces résultats mettent en évidence la nécessité d utiliser un test de confirmation pour contrôler les échantillons présentant au dépistage un résultat proche du seuil. Les excellentes performances de la trousse LDBIO-TOXO II IgG justifient son utilisation en confirmation des résultats obtenus par les techniques IgG de dépistage (résultats équivoques, faiblement positifs ou posant des problèmes d interprétation). F202 T2G-f-30/11/2013 v7

16 Bibliographie : 16 Franck J., Derocle G., Saïz A.J. et Dumon H. Evaluation of the kit LDBIO-TOXO II IgG for the confirmation of IgG results obtained by toxoplasmosis serology screening tests. Congress of the French Society of Parasitology Parasites in Mother and Child 2005, 15-16th December, Paris. Franck, Jacqueline, Yves Jean-François Garin, et Henri Dumon. «LDBio-Toxo II immunoglobulin G Western blot confirmatory test for anti-toxoplasma antibody detection». Journal of clinical microbiology 46, n o 7 (2008): Jost, C, F Touafek, A Fekkar, R Courtin, M Ribeiro, D Mazier, et L Paris. «Utility of immunoblotting for early diagnosis of toxoplasmosis seroconversion in pregnant women». Clinical and vaccine immunology: CVI 18, n o 11 (2011): Leslé, F, F Touafek, A Fekkar, D Mazier, et L Paris. «Discrepancies between a new highly sensitive Toxoplasma gondii ELISA assay and other reagents: interest of Toxo IgG Western blot». European journal of clinical microbiology & infectious diseases: official publication of the European Society of Clinical Microbiology 30, n o 10 (2011): Maudry, A., G. Chene, R. Chatelain, B. Bellete, H. Patural, J. Hafid, H. Raberin, R. Tran Manh Sung, et P. Flori. «Expertise du nouveau test Access TOXO-IgGII et comparaison avec trois autres techniques automatisées et la technique Western Blot LDBIO TOXO II IgG». Immuno-analyse & Biologie Spécialisée 24, n o 1 (2009): Maudry, Arnaud, Gautier Chene, Rémi Chatelain, Hugues Patural, Bahrie Bellete, Bernard Tisseur, Jamal Hafid, et al. «Bicentric evaluation of six anti-toxoplasma immunoglobulin G (IgG) automated immunoassays and comparison to the Toxo II IgG Western blot». Clinical and vaccine immunology: CVI 16, n o 9 (2009):

17 17 RESUME DU MODE OPERATOIRE Nota Bene : ne pas pratiquer le test sans avoir préalablement lu la présente notice dans son intégralité. 1/ Etablir un plan de distribution. 2/ Distribuer 1.2ml de R2 (tampon échantillons rose) dans chacun des puits. Agiter doucement la cuve. 3/ Placer une bandelette numérotée R1, face vers le haut, dans chacun de puits. Attendre 1mn puis agiter doucement la cuve pour immerger la bandelette. 4/ Distribuer les échantillons et le contrôle positif R10 (10µl). Agiter doucement la cuve après chaque dépôt. Incubation 90 mn+/-5min sur agitateur. 5/ Laver 3 fois avec R6 dilué au 1/10 6/ Distribuer 1.2ml de R3 (conjugué anti-igg bleu), agiter doucement la cuve, incubation 60 mn+/-5min sur agitateur. 7/ Laver 3 fois avec R6 dilué au 1/10 8/Distribuer 1.2ml de R5 (substrat flacon opaque), agiter doucement la cuve. Incubation 60 mn sur agitateur, arrêter plus tôt les bandelettes dont la coloration devient très forte. 9/ Arrêt de la réaction par 2 lavages à l eau distillée. 10/ Transférer les bandelettes sur un papier filtre. Laisser sécher à l air 15 mn 11/ Comparer le profil de l immunoblot de chaque échantillon avec celui du contrôle positif R10. F202 T2G-f-30/11/2013 v7

18 18 Notes

19 19 LDBIOTOXO II IgG Exemple de résultats obtenus A B Contrôle positif PM en kda Contrôle positif PM en kda A gauche et à droite : représentation du contrôle positif du kit (R10) qui permet d identifier les bandes spécifiques dans la zone kda : 30, 31, 33, 40 et 45. Le test est positif par la présence de 3 bandes minimum parmi les 5 bandes spécifiques et incluant la bande 30. A : exemple d une séroconversion. Les sérums 2 et 3, positifs par LDBIO-TOXO II IgG, étaient négatifs en technique de dépistage «TEST 2 IgG». B : exemple sur un suivi néonatal. Les sérums 5 et 6, positifs par LDBIO-TOXO II IgG, était négatifs en technique de dépistage «TEST 2 IgG». F202 T2G-f-30/11/2013 v7

20 Index 20 n page Indication 1 Contexte clinique 1 Principe du test 2 Réactifs fournis avec la trousse 2-3 Matériels nécessaires non fournis 4 Conditions de conservation 4 Précautions spéciales d'emploi Sécurité 4-5 Précautions 5 Prélèvement des échantillons 5 Préparation des réactifs 5 Mode opératoire 6-7 Interprétation 7-8 Limites du test 9 Problèmes rencontrés 9 Contrôle de qualité 10 Performances Bibliographie 16 Résumé du mode opératoire 17 Notes 18 Exemple d immunoblot (positif et négatif) 19 19A rue Louis Loucheur LYON - FRANCE TEL : +33(0) FAX : +33(0) NF EN ISO ISO 9001

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