THÈSE PRESENTÉE A L UNIVERSITÉ BORDEAUX 1 ÉCOLE DOCTORALE DES SCIENCES CHIMIQUES. Par Marion-Justine CAPDEVILLE POUR OBTENIR LE GRADE DE DOCTEUR

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1 N d ordre : 4303 THÈSE PRESENTÉE A L UNIVERSITÉ BRDEAUX 1 ÉCLE DCTRALE DES SCIENCES CHIMIQUES Par Marion-Justine CAPDEVILLE PUR BTENIR LE GRADE DE DCTEUR SPÉCIALITÉ : Chimie analytique et environnement ÉTUDES DES CYCLES BIGÉCHIMIQUES DES CNTAMINANTS RGANIQUES DITS «ÉMERGENTS» DANS LES SYSTÈMES AQUATIQUES Thèse dirigée par Dr Hélène BUDZINSKI EPC-LPTC, UMR 5805 CNRS Soutenue le 15 septembre 2011 Après avis de : Mme GMEZ, Éléna Maître de conférence, université Montpellier I Rapporteur Mr LEVI, Yves Professeur, Université Paris-Sud 11, Rapporteur Devant la commission d examen formée de : Mme GMEZ, Éléna Maître de conférence, université Montpellier I Rapporteur Mr LEVI, Yves Professeur, Université Paris-Sud 11, Rapporteur Mr SCHMITTER, Jean-Marie Professeur, Université de Bordeaux 1, Examinateur Mme HERNANDEZ-RAQUET, Guillermina Chargée de recherche INRA, Examinateur Mme BUDZINSKI, Hélène Directeur de recherche CNRS, Directeur de thèse UMR EPC LPTC Environnements et Paléoenvironnements céaniques et Continentaux Laboratoire de Physico- et Toxico-Chimie de l environnement

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3 Remerciements REMERCIEMENTS Bien que sur la couverture apparaisse le nom d une seule personne, une thèse est en réalité le résultat de l investissement de plusieurs personnes que je voudrais ici remercier. MERCI aux membres du jury, Mme Elena Gomez et Mr Yves Lévi, Mme Guillermina Hernandez-Raquet et Mr Jean-Marie Schmitter, pour avoir accepté de juger ce travail. Merci pour votre patience vis-à-vis de la date de soutenance qui a été reportée à plusieurs reprises. Merci pour avoir lu et corrigé le «pavé». Et enfin, merci pour vos remarques et commentaires et pour l échange constructif que nous avons eu lors de ma soutenance. MERCI Hélène, point de départ de cette aventure. Ce n était pas gagné au début, pas tellement plus à la fin, mais j ai énormément appris entre les 2, tant sur le plan professionnel que relationnel. Merci de m avoir accepté dans votre équipe et de m avoir fait confiance (et souvent plus confiance que ce que je me faisais à moi-même). Merci de m avoir fait découvrir le monde de la chimie analytique depuis «le comptage de tout ce qu il y a par 5 dans la pièce 205 pour tenter d identifier les 5 GC/MS» jusqu à «être la première utilisatrice du RRLC/MS/MS en tandem avec Patrick». Merci pour tous les moyens que vous avez mis à ma disposition pour réaliser ce travail (je me souviens encore des 1380 HT pour les 100 mg d amox- 13 C et de la crise de l ACN). D une certaine façon, merci pour l expérience AERES. Comme vous dites «la communication est un art difficile». Puisque les voyages forment la jeunesse, Merci pour toutes les opportunités de formation que vous m avez offertes en France (Pau, Narbonne, Paris, Rennes, Toulouse, Montpellier, Metz, Cannes) et à l étranger (Varsovie, Göteborg, Paphos). Merci pour les «soirs discussion-champagne» et pour les moments de convivialité à base d huitres et de petits-fours. Mais surtout, un grand MERCI pour nos longues conversations dans le hall du Palais de la Culture et de la Science à Varsovie, dans l aéroport d Amsterdam, dans la salle de conférence de l hôtel à Paphos, dans la gare de Toulouse ou plus simplement dans votre bureau jusqu à pas d heure. MERCI aux membres du LPTC, et plus particulièrement à ceux de l équipe C.RG (nouvellement nommée AQUA), pour leur contribution active et quotidienne à la réussite de ces travaux. Merci Patrick P. pour notre duo LC/MS/MS. Depuis nos débuts sur l UPLC et la fameuse croix qu il fallait cocher pour prendre en compte les paramètres du spectro jusqu à notre tandem de choc sur le RRLC, en passant par tes cours de théorie sur la chromato liquide, l attente du téléphone en E215 et les expériences en LC/UV, c était des bons moments. Je garderai aussi en mémoire le souvenir de notre toute première injection sur le RRLC ; le premier soir de sa mise en service, quand on est resté jusqu à plus de 22h pour arriver à lancer la séquence et finalement n obtenir qu une seule analyse de blanc qui a durée toute la nuit. Merci Karyn de m avoir formé à la GC/MS et à l ASE. Merci pour la transmission de ton sens de l organisation et du travail bien fait. Et je n oublierai pas que tu as fait demi-tour un soir, une fois partie du labo, et que tu es revenue exprès pour moi à 21h30 pour m aider sur l ASE «parce qu il ne veut pas marcher si t es pas à coté de lui». Merci Sylvie A. de m avoir formé à la LC/MS et pour veiller à la santé de mes yeux en allumant la lumière dans le bureau à la tombée de la nuit. Merci Laurent P. pour mes premiers pas en HPLC à l époque de mon stage de M2 et les réparations de fuites le soir au moment où tu t apprêtais à partir. Merci Marie-Hélène pour notre tentative Speedvac et tes petits signes de tête le jour de la soutenance. Merci Marie-Ange, Jérôme et Patrick M. pour votre sympathie et votre bienveillance.

4 Remerciements Merci Nathalie T. pour ton aide sur les capteurs passifs, pour les «codes secrets» de l ASE et pour avoir fait le chauffeur soit en m amenant au labo quand j avais mon torticolis soit en me ramenant chez moi le soir quand il était trop tard et que je n avais plus de bus. Merci pour nos discussions sur mon avenir et mon orientation professionnelle que ce soit à la fin de mon M2 ou au cours de la thèse. Merci aux nombreux thésards que j ai côtoyé pendant ces 5 ans et demi pour leur coup de pouce pour décrypter la science ou les comportements humains : Anne T., Kévin C., Marie (t avais raison, j avais pas besoin d elle), Sophie (ma première SPE et mon premier dépouillement de chromato, je n oublierai pas que c est toi qui me les a montrés), Killian, Caroline R., Anne-Laure (j aurai mis un an et demi de plus, mais ça y est, j ai fini. Et au passage, merci pour ma soirée d anniv à Varsovie), Ludovic, Ninette (merci pour les corrections de mes textes en anglais, je garderai en mémoire notre virée à Ax-les-Thermes et notre aprèm photos à la plage), Angel (heureusement que t étais là pour les manip capteurs passifs parce que les calculs de débit, de flux et la gestion au quotidien c était pas mon point fort), Iris (et cette histoire de décapsuleur australien), Caroline GP (très agréable comme colloque de bureau), Nicolas Cr. (toujours présent pour les pots, merci d avoir fait le déplacement pour ma soutenance), Yann, Hoï, Perrine et Matthieu. Merci Thomas G. pour avoir fait, ou refait, toutes les manips DIPERPHA et surtout pour les Petits Ecoliers au chocolat noir. Merci à tous les collègues de passages (techniciens ou ingénieurs contractuels, thésards étrangers ou en collaboration, post-doc et stagiaires) qui par leur gestes de sympathie ou leur bonne humeur ont permis d alléger certaines journées : Sylvain F. (1 er coloc de bureau), Sylvain C., Sylvie R., Damien (merci de m avoir tenue compagnie pendant les pesées de filtres), Jonathan (merci de m avoir prêté ton ordi et ton bureau quand j étais SBF à la fin), Céciline (merci pour les conseils sur les compléments alimentaires), Imilia, Pierre VD (merci pour ton mail d encouragement à quelques jours de la soutenance), Nicholas (merci pour tes bons plans sortie et notamment les infos sur les portes ouvertes des châteaux viticoles), Vincent (et l épisode du mur des lamentations), Justyna, Janos, Elisa, Luminita, Hugues (mille mercis pour ton délicieux fondant au chocolat), Anaïk, Guillaume Bol., Magalie (merci pour la plaquette de Merveille du monde), Raphaël (et le cours de Pottok, encore désolée pour ton pouce), Anne P. (merci pour ton aide sur FLASH), Nathalie B. et Nicolas Ch. (ou le chrono de l introduction pour l oral de soutenance). Merci à Kévin F., Guillaume Bou., Emmanuelle et Simon qui m ont apporté autant en compréhension des relations humaines et des problèmes de communication qu en résultats. Merci Emmanuelle pour les coups de fil, promis maintenant j ai plus peur de téléphoner aux inconnus. Merci Nora et Maylis S. pour vos petites aides logistiques au quotidien depuis le bordereau DHL et les impressions couleurs jusqu à la traduction d une publi. Merci Virginie et Hélène J. pour la gestion des missions et des remboursements. Merci Nadia pour veiller à la propreté de notre univers de travail. Enfin, une pensée pour toutes les autres personnes que j ai pu côtoyer au cours de ces années et qui d une façon ou d une autre ont apporté une petite pierre à cet édifice: Nathalie G., Edith, Cédric, Eric, Pierre-Marie, Blandine et Christelle. MERCI aux collaborateurs extérieures au LPTC pour leur contribution : Guillermina Hernandez-Raquet, Fabienne Petit, Fabrice Béline, Marie-Laure Pype, Jean-Charles Motte, R. Rajagopal, Patrick Balaguère, Christian Mougin et les membres du projet AMPERES. Merci Patrick Dabert pour avoir fait le sale (dans tous les sens du terme) boulot de DIPERPHA : les prélèvements et surtout les longues heures de filtration. Merci Kenny berlé pour la gestion et la réalisation des prélèvements pour FLASH. Merci Lodovico Di Gioia, Liza Viglino et Jean-Luc Guinamant pour vos relectures. Merci à l IMS Health pour m avoir gracieusement fourni des données de ventes de médicaments. Merci au Dr Viel-Mazurier pour m avoir donné son dictionnaire VIDAL.

5 Remerciements MERCI à tout ceux qui, un jour ou l autre, ont eu une attention ou un mot sympa à mon égard et qui m ont particulièrement touché ce jour-là : Merci Fabrice pour les sauvetages informatiques, de la récupération de données à celle de l ordi. Merci Thierry pour les petits «oooo» et le petit signe de main qui va avec, parce que certains jours ça m a vraiment fait du bien au moral. Merci Laurent Servant pour votre soutien administratif et moral au cours des derniers mois. Merci aux dames qui font le service au Haut-Carré pour m avoir mis de coté des assiettes de carottes ou d haricot verts sans ail. Et parce que la thèse c est aussi l occasion de rencontrer des personnes géniales et de créer des amitiés fortes : mille MERCIS à Alexia, Frédéric, Mathieu, Coralie, Amélie, Chloé et Sarah. MERCI Alex d avoir été une coloc de bureau exceptionnelle en dépit de nos moultes déménagements, j aurai pas rêvé mieux. Du partage des madeleines, biscuits et chocolats au partage des problèmes en tout genre et solutions, rien à redire. Merci pour ton écoute, ton réconfort et ta zenatitude. Merci pour le chimiste-sitting dans mes grands jours de manip. Et enfin, merci aussi pour les déjeuners indiens et les séances de badminton-défoulement du jeudi. MERCI Fred pour ta bienveillance et tes attentions à mon égard, depuis le rangement-nettoyage d une paillasse un jour où les solvants m étaient montés à la tête jusqu à la livraison de sushis, makis et brochettes pour «ma nuit de l évaporation». Merci pour nos débats et en particulier celui sur «l obligation de vote». Merci de m avoir laissé gagner notre p tite compétition mais saches que tu avais pourtant toutes tes chances. MERCI Mathieu pour tes conseils prévenants au début et tes encouragements à la fin. Tu m avais bien dit comment se passait la 1 ère, la 2 ème et la 3 ème année de thèse mais tu avais oublié de m expliquer comment se passait une 4 ème et une 5 ème année et j avoue que j ai été un peu perdue. MERCI Coralie pour ton écoute, tes conseils et ton soutien depuis notre période de stage jusqu à notre fin de thèse. Merci aussi pour ta disponibilité et tes sourires. Et tu verras, finalement c est faisable, faut juste être patiente et persévérante. MERCI Amélie pour ton écoute, ton soutien et ta disponibilité à toi aussi. Merci aussi pour ton optimisme et ton boostage pour les candidatures. Bon, on n aura toujours pas eu notre canapé car les paliers entre 2 étages ne sont pas super confortables, mais maintenant on n en a plus tellement besoin, et c est ça qui compte. MERCI Chloé pour tes conseils avisés, en particulier depuis l autre coté de l Atlantique pour la gestion de la soutenance. Bien qu on ait commencé en même temps et avec les mêmes problèmes, notamment une certaine histoire de carbamazépine, ça tombait bien que tu aies fini avant moi comme ça, tu as pu m expliquer les (dé)marches à suivre. MERCI Sarah pour le partage, le soutien et les encouragements vis-à-vis de nos expériences professionnelles et personnelles. Je n aurais jamais cru en débutant DIPERPHA qu on aurait eu autant de points communs. Enfin un IMMENSE MERCI à ma famille et mes amis qui m ont supporté (dans tous les sens du terme). Si j avais un mot plus fort que merci je l utiliserai ici. MERCI papa, maman, Clément et LH, si je devais détailler ici tout ce que vous avez fait pour moi, je pense que cette thèse serait en 2 tomes. MERCI Véro (et les bourriches du dimanche soir), grand-mère, bonne-maman, Delphine et tout le reste de la famille. MERCI morena (pour tes mails quotidiens), cocotte (pour tes textos d encouragement et de soutien), bichette (pour nos coups de fil ou de skype de minimum 64 minutes et 18 secondes), Julie (d être venue me chercher aux quinconces la veille de ton concours parce que je n avais plus de bus), Thomas H. (et nos p tits verres à la Victoire), Ulrika, Maud, Laetitia, Marine, Maylis W., Angélique et toutes les copines du cheval (heureusement qu il y avait nos repas du mardi soir pour

6 Remerciements décompresser), Gaëlle (merci de me confier Hamac), Célia (promis je ne ferai pas caissière à Leclerc), Camille (et les textos du mercredi), ma jumelle et Christophe (t as bien fait de me dire de l accepter cette thèse). En conclusion, je souhaite rapporter ici une petite fable que j ai trouvée sur internet. Je trouve que cette fable correspond bien à certaines périodes de «mon expérience thèse» et c est pourquoi j ai choisi de l ajouter à cette partie Remerciements. ne day a farmer's donkey fell down into a well. The animal cried piteously for hours as the farmer tried to figure out what to do. Finally, he decided the animal was old, and the well needed to be covered up anyway; it just wasn't worth it to retrieve the donkey. He invited all his neighbors to come over and help him. They all grabbed a shovel and began to shovel dirt into the well. At first, the donkey realized what was happening and cried horribly. Then, to everyone's amazement he quieted down. A few shovel loads later, the farmer finally looked down the well. He was astonished at what he saw. With each shovel of dirt that hit his back, the donkey was doing something amazing. He would shake it off and take a step up. As the farmer's neighbors continued to shovel dirt on top of the animal, he would shake it off and take a step up. Pretty soon, everyone was amazed as the donkey stepped up over the edge of the well and happily trotted off! MRAL: Life is going to shovel dirt on you, all kinds of dirt. The trick to getting out of the well is to shake it off and take a step up. Each of our troubles is a steppingstone. You can get out of the deepest wells just by not stopping, never giving up! C est pourquoi je tiens très sincèrement à dire MERCI à tous ceux qui ont contribué à l aboutissement de ces travaux que ce soit par un soutien moral, technique, scientifique, financier, amical ou familial ; mais que finalement, je remercie aussi tous ceux qui ont semé des obstacles sur ce parcours car de les avoir franchis, m a permis de grandir et de réellement savourer la journée du 15 septembre 2011.

7 Publications et communications Publications et communications Liste des publications : Capdeville M.J., Budzinski H., 2011, Trace-level analysis of organic contaminants in drinking waters and groundwaters. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 30, 4, Combalbert S., Capdeville M.J., Pourcher A.M., Budzinski H., Dabert P., Bernet N., Hernandez-Raquet G., 2010, Impact des systèmes de traitement du lisier dans le transfert des perturbateurs endocriniens et des antibiotiques vers l environnement naturel. 42 èmes Journées de la Recherche Porcine, Paris, France, 2-3 février 2010 (proceedings). Capdeville M.J., Pardon P., Coquery M., Martin S., Choubert J.M., Budzinski H., Development of a method for the simultaneous extraction of antibiotics, -blockers, antineoplastics and antivirals by solid-phase extraction followed by liquid chromatography tandem mass spectrometry analysis application to sewage treatment plant effluents (à soumettre dans Journal of Chromatography A). Capdeville M.J., berle K., Piram A., Pardon P., Petit F., Budzinski H., Multi-residue simultaneous analysis of 78 pharmaceutical compounds in aqueous samples: development and application (à soumettre dans Analytical Bioanalytical Chemistry). Capdeville M.J., Buytaert S., Belles A., Budzinski H., Calibration and application of passive sampler for determination of 22 pharmaceuticals in river (à soumettre dans Analytica Chimica Acta) berlé K., Capdeville M.J., Berthe T., Budzinski H., Petit F., Evidence for a complex relationship between antibiotics and antibiotic-resistant Escherichia coli along a hospital complex Waste Water Treatment Plant river continuum (à soumettre dans Environmental Science & Technology)

8 Publications et communications Liste des communications orales : Capdeville M.J., berle K., Piram A., Pardon P., Petit F., Budzinski H. Analysis of Pharmaceuticals: analytical development and study of hospital sewages, wastewater treatment plants and impacted surface waters, 2 nd seminar of PhD students Water & Health, Cannes, France, 29 juin - 1 er juillet Hernandez-Raquet G., Beline F., Combalbert S., Capdeville M.J., Rajinikanth R., Bellet V., Pourcher A.M., Budzinski H., Bernet N., Dabert P., Balaguer P. Développement d un procédé intégré pour la valorisation du lisier porcin et la réduction des risques des pollutions associées : production du biogaz, traitement de l azote et élimination des polluants émergents, antibiotiques et hormones stéroïdes, Salon des équipements, des technologies et des services de l environnement Pollutec, Lyon, France, 30 novembre -3 décembre Combalbert S., Capdeville M.J., Pourcher A.M., Budzinski H., Dabert P., Bernet N., Hernandez-Raquet G. Impact des systèmes de traitement du lisier dans le transfert des perturbateurs endocriniens et des antibiotiques vers l environnement naturel, 42 èmes Journées de la Recherche Porcine, Paris, France, 2-3 février Capdeville M.J., Budzinski H., Pardon P., Hernandez-Raquet G. Développement d une méthode d analyse multi-classe pour le dosage de composés pharmaceutiques dans l eau, Séminaire Agilent LC/MS, Paris Massy, France, 28 mai Budzinski H., Soulier C., Lardy S., Capdeville M.J., Tapie N., Vrana B., Miege C., Ait Aissa S. Passive samplers for chemical substance monitoring and associated toxicity asssessement in water, XENWAC, Paphos, Cyprus, mars Capdeville M.J., Budzinski H., Pardon P., Hernandez-Raquet G. Development of a method for a multi-class analysis of pharmaceuticals in water, XENWAC, Paphos, Cyprus, mars 2009.

9 Publications et communications Liste des communications par affiche (posters) : Capdeville M.J., berle K., Piram A., Pardon P., Soulier C., Petit F., Budzinski H. Développement et application d une méthode d extraction sur phase solide (SPE) et d analyse par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (RRLC/MS/MS) pour le dosage de 78 substances pharmaceutiques mutliclasses dans l eau, Journées Information Eaux, Poitiers, France, septembre Capdeville M.J., Pardon P., Budzinski H. Methodology development (ASE,SPE, LC/MS/MS) and application for the analysis of antibiotics in liquid and solid pig manure, 20 th SETAC Europe, Seville, Spain, may Capdeville M.J., Piram A., Pardon P., Petit F., Budzinski H. Solid Phase Extraction (SPE) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry development and application for the screening of 78 pharmaceuticals in water, 10 th EMEC, Limoges, France, 2-5 décembre Capdeville M.J., Pardon P., Budzinski H. Développement et application d une méthode couplant une étape d extraction en phase solide (SPE) et d analyse par chromatographie liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem pour le dosage de 52 antibiotiques dans des lisiers porcins, SMAP, 26 ème Journée Française de Spectrométrie de Masse, Dijon, France, septembre Capdeville M.J., Pardon P., Budzinski H. Solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry development for the analysis of pharmaceuticals, ISTA 14, Metz, France, 30 aout 4 septembre Capdeville M.J., Pardon P., Budzinski H. Solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry development for the analysis of antibiotics in manure, ISTA 14, Metz, France, 30 aout 4 septembre Capdeville M.J., Pardon P., Budzinski H. Solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry development for the analysis of pharmaceuticals, 19 th SETAC Europe, Göteborg, Sweden, 31 mai 4 juin Capdeville M.J., Pardon P., Budzinski H. Solid-phase extraction and liquid chromatography-tandem mass spectrometry development for the analysis of antibiotics in manure, 19 th SETAC Europe, Göteborg, Sweden, 31 mai 4 juin Capdeville M.J., Pardon P., Budzinski H. Développement d une méthode d extraction en phase solide (SPE) et d analyse par chromatographie en phase liquide couplée à un spectromètre de masse en tandem

10 Publications et communications (RRLC/MS/MS) pour le dosage de substances pharmaceutiques multi-classes dans diverses matrices environnementales, 25 ème Journées Françaises se Spectrométrie de Masse, Grenoble, France, 8-11 septembre Capdeville M.J., Pardon P., Budzinski H. Solid-phase extraction (SPE) and liquid chromatography-tandem mass spectrometry development for the analysis of multi-classes pharmaceuticals, 18 th SETAC Europe, Warsaw, Poland, mai Capdeville M.J., Pardon P., Budzinski H. Développement d une méthode d extraction par SPE et d analyse par chromatographie en phase liquide couplée à un spectromètre de masse en tandem (RRLC/MS/MS) pour le dosage de substances pharmaceutiques dans des matrices environnementales complexes, Journée de l École Doctorale Sciences Chimiques, bordeaux, France, 3 avril Capdeville M.J., Pardon P., Augagneur S., Budzinski H. Développement d une méthode couplant UPLC et spectrométrie de masse en tandem pour le dosage d antibiotiques présents à l état de traces dans les systèmes aquatiques, SMAP, 24 ème Journée Française de Spectrométrie de Masse, Pau, France, septembre Distinctions : Prix des techniques innovantes pour l environnement (catégorie déchets). Pollutec ADEME 2010 pour les travaux concernant le : «Développement d un procédé intégré pour la valorisation du lisier porcin et la réduction des risques des pollutions associées : production du biogaz, traitement de l azote et élimination des polluants émergents, antibiotiques et hormones stéroïdes». Les Prix des Techniques Innovantes pour l'environnement récompensent les laboratoires de recherche publique ayant proposé de présenter au salon Pollutec 2010 des travaux de recherche pouvant faire l'objet d'application ou de développement industriel à court ou moyen terme. Ces prix sont organisés par Pollutec et l'ademe en partenariat avec InfoChimie Magazine, Hydroplus, Environnement Magazine Hebdo, Environnement et Technique, Green News Techno, Mesures et avec le soutien du Ministère de l Ecologie, de l Energie, du Développement durable et de la Mer et du Ministère de l Enseignement Supérieur et de la Recherche. Prix du meilleur poster pour «Développement et application d une méthode d extraction sur phase solide (SPE) et d analyse par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (RRLC/MS/MS) pour le dosage de 78 substances pharmaceutiques mutli-classes dans l eau». Élu par l ensemble des participants du congrès des Journées Information Eaux à Poitiers en septembre 2010.

11 Résumés et mots clés Résumé Les molécules pharmaceutiques font partie du groupe des contaminants émergents du fait de leur intérêt récent dans les études environnementales comparativement à des polluants étudiés depuis plus longtemps tels que les pesticides. Elles correspondent aux principes actifs des médicaments et, à ce titre, sont responsables des propriétés pharmacologiques des médicaments. Ce sont donc des molécules biologiquement actives qui peuvent agir sur les organismes vivants présents dans les écosystèmes impactés. L origine des molécules pharmaceutiques dans l environnement est variable mais les principales sources sont liées à leur utilisation en médecine humaine ou vétérinaire. Une fois consommées, les molécules pharmaceutiques sont excrétées dans les urines ou les fèces et se retrouvent dans les eaux usées (consommation humaine) ou dans les déchets d élevage (consommation vétérinaire). Dans le premier cas, elles peuvent être rejetées directement dans le milieu, ou indirectement, avec les eaux usées traitées ou les boues résiduaires, après traitement dans les stations d épuration (STEP). Dans le deuxième cas, elles atteignent directement le milieu lorsque les animaux sont élevés en prairie ou indirectement lorsque les déchets d élevage sont épandus sur les sols agricoles pour les fertiliser. Ces travaux de thèse se sont attachés à étudier l origine et le devenir de ces molécules dans ces 2 cas de figure. Ainsi en se basant sur des critères de consommation, de présence dans l environnement par rapport à des études antérieures, de toxicité et d écotoxicité, d originalité et de disponibilité des composés standards de référence, 32 puis 78 molécules appartenant aux classes thérapeutiques des antibiotiques, des anticancéreux, des -bloquants, des anti-vih et des inhibiteurs de phosphodiestérase de type 5 (PDE 5) ont été étudiées dans 2 continuums : i) effluents hospitaliers - eaux usées brutes et traitées eaux de surface, et ii) eaux usées brutes et traitées - eaux de surface - eaux de captage souterraines. En s appuyant sur les mêmes critères de sélection, le devenir de 7 antibiotiques a été étudié dans des lisiers porcins dans des filières simples de traitement du lisier (fosse de stockage), dans des filières complexes de traitement du lisier (système de traitement ressemblant à des mini STEP) et dans des mésocosmes en conditions contrôlées. Pour pouvoir réaliser l ensemble de ces études, des protocoles analytiques mettant en œuvre une étape d extraction par SPE (Solide Phase Extraction) ou d extraction ASE (Extraction Accélérée par Solvant) puis de purification par SPE et d analyse par LC/MS/MS (Chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem) ont été développés. Ces protocoles, en remplissant des critères de qualité tels que des limites de détection et de quantification compatibles avec des analyses environnementales (de l ordre du ng/l à la dizaine de ng/l), une bonne linéarité, précision, justesse et performance, ont permis d analyser la phase dissoute des échantillons d eaux et la phase dissoute et solide des échantillons de lisiers. Il ressort des analyses des échantillons aqueux que : i) les - bloquants, les anti-vih et les antibiotiques appartenant aux familles des macrolides, des fluoroquinolones et des sulfonamides, sont les molécules les plus representatifs de la contamination du milieu naturel parmi les classes étudiées ; ii) les rejets de STEP sont une source majeure de la contamination des systèmes aquatiques ; iii) les eaux usées sont davantage contaminées en hiver qu en été ; et iv) les eaux de surface sont davantage contaminées en été qu en hiver. Il ressort des analyses des échantillons de lisiers que : i) les niveaux de contamination du lisier par les antibiotiques sont élevés, de l ordre de la dizaine de µg/l au mg/l ; ii) le niveau de contamination des lisiers n est pas lié au stade physiologique des cochons ; iii) l intérêt de stocker le lisier pour en réduire la contamination en antibiotique préalablement à l épandage n est pas mis en évidence ; iv) l oxytétracycline, la tétracycline, la tylosine et la marbofloxacine sont majoritairement présentes dans la phase solide alors que la sulfadiazine, la lincomycine et la monensine sont essentiellement présentes dans la phase liquide des lisiers ; v) la séparation des phases solides et liquides permet de réduire la 11

12 Résumés et mots clés contamination des lisiers dans les filières de traitement ; et vi) la dégradation des antibiotiques se fait principalement en condition aérobie. Mots clés : molécules pharmaceutiques, antibiotiques, anticancéreux, -bloquants, anti-vih, inhibiteurs de PDE 5, SPE, ASE, LC/MS/MS, eaux, lisiers, continuums 12

13 Résumés et mots clés Abstract Pharmaceutical substances belong to the group of emerging contaminants due to their recent interest in environmental studies in comparison with pollutants who have been studied for a longer time like pesticides. They correspond to the active ingredient of drugs and by this mean are responsible for their pharmacological properties. Consequently they are biologically active molecules that can act on living organisms present in impacted ecosystems. The origin of pharmaceuticals in the environment is variable but the main sources are related to their use in human and veterinary medicine. nce consumed, pharmaceutical substances are excreted in urine or feces and are found in wastewater (human consumption) or animal manure (veterinary consumption). In the first case, they can be discharged directly in the environment, or indirectly, with treated wastewater or sludge from sewage treatment plants (SWTP). In the second case, they directly reach the environment when animals are bred on grassland or indirectly when livestock wastes are spread on agricultural soils as fertilizer. This PhD work has been focused on the study of the origin and fate of pharmaceutical substances in these 2 cases. Thus according to consumption data, occurrence in the environment reported in previous studies, toxicity and ecotoxicity data, originality and availability of reference standard compounds, 32 then 78 molecules belonging to 5 different therapeutic classes (antibiotics, antineoplastics, -blockers, anti-hiv, phosphodiesterase type 5 inhibitors (PDE 5 inhibitor)) were studied in 2 continuums : i) hospital wastewater effluents raw and treated wastewater surface water, and ii) raw and treated wastewater surface water ground water. Based on the same selection criteria, the fate of 7 antibiotics was studied in pig manure in simple manure storage facilities (storage tank), in aerobic manure treatment facilities (treatment system like in small SWTP) and in mesocosms under controlled conditions. In order to achieve all these studies, analytical protocols implementing an extraction step by SPE (Solid Phase Extraction) or an ASE extraction (accelerated solvent extraction) followed by a SPE purification and an analytical step by LC / MS / MS (liquid chromatography tandem mass spectrometry) have been developed. These protocols, by filling out quality criteria such as limits of detection and quantification compatible with environmental analysis (ng/l to dozen of ng/l), good linearity, precision, accuracy and performance, were used to analyze the dissolved phase of water samples and dissolved and solid phases of pig manure samples. The water samples analysis shows : i) -blockers, anti-hiv and antibiotic belonging to the families of macrolides, fluoroquinolones and sulfonamides are the most representative molecules of the environmental contamination from the classes studied; ii) SWTP releases are a major source of aquatic systems contamination; iii) wastewaters are more contaminated in winter than in summer; and iv) surface water are more contaminated in summer than in winter. The pig manure samples analysis shows : i) the levels of contamination of manure by antibiotics are high, from a few µg/l to mg/l; ii) the manure level of contamination is not related to the physiological stage of pigs; iii) the interest to store manure before spreading in order to reduce the antibiotics contamination is not highlighted; iv) oxytetracycline, tetracycline, tylosin and marbofloxacin are mainly present in the solid phase whereas sulfadiazine, lincomycin and monensin are mainly present in the liquid phase of manure; v) the separation of solid and liquid phases reduce manure contamination in aerobic treatment facilities; and vi) antibiotics degradation is mainly aerobic. Key words: pharmaceuticals, antibiotics, antineoplastics, -blockers, anti-hiv, PDE 5 inhibitor, SPE, ASE, LC/MS/MS, water, pig manure, continuums 13

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15 Sommaire Sommaire Général REMERCIEMENTS... 3 PUBLICATINS ET CMMUNICATINS... 7 RESUME ABSTRACT SMMAIRE GENERAL LISTE DES FIGURES LISTE DES TABLEAUX ACRNYMES ET ABREVIATINS INTRDUCTIN GENERALE CHAPITRE 1 : GENERALITES I. GENERALITES SUR LES MLECULES PHARMACEUTIQUES I.1. Définition I.2. Importance de la problématique II. LES DIFFERENTES CLASSES DE MLECULES PHARMACEUTIQUES II.1. Douleurs et fièvres II.2. Troubles respiratoires II.3. Troubles gastriques II.4. Troubles / contrôles hormonaux II.5. Les médicaments de l impuissance II.6. Troubles du comportement et de l humeur II.7. Troubles cardiaques II.8. Infections bactériennes II.9. Cancers II.10. Infections virales II.11. Traitements vétérinaires III. RIGINE DANS L ENVIRNNEMENT IV. DEVENIR IV.1. Devenir dans les stations d épuration IV.2. Devenir dans l environnement V. PRESENCE DANS L ENVIRNNEMENT V.1. Les effluents hospitaliers V.2. Les eaux usées brutes (entrées de STEP) V.3. Les eaux usées traitées (effluents / sorties de STEP) V.4. Les eaux de surface V.5. Les eaux souterraines V.6. Les eaux de boisson V.7. Les boues des STEP V.8. Les effluents d élevage et les sols amendés avec les effluents d élevage V.9. Les sédiments VI. TXICITE ET ECTXICITE VI.1. Toxicité VI.1.1. Effets secondaires / indésirables des médicaments VI.1.2. Toxicité envers les organismes non ciblés VI.1.3. Estimation de la toxicité (EC 50, LEC, NEC, etc.) VI.2. Antibiorésistance VI.3. Evaluation du risque environnemental VI.3.1. La démarche de l évaluation du risque environnemental VI.3.2. Application de l évaluation du risque environnemental VII. LEGISLATIN VIII. PRJETS DE RECHERCHE VIII.1. Européens

16 Sommaire VIII.2. Français BJECTIFS DE CES TRAVAUX DE THESE CHAPITRE 2 : LES CMPSES ETUDIES I. SELECTIN DES CLASSES THERAPEUTIQUES I.1. Consommation I.2. Toxicité I.3. Présence dans l environnement I.4. Persistance I.5. Manque de données I.6. Classes sélectionnées II. SELECTIN DES MLECULES II.1. Les antibiotiques II.1.1. Consommation des antibiotiques II Consommation des antibiotiques en médecine humaine II Consommation des antibiotiques en médecine vétérinaire II.1.2. Toxicité, écotoxicité et antibiorésistance II.1.3. Présence dans le milieu II.1.4. Persistance II.1.5. Manque de données II.2. Les autres classes thérapeutiques : -bloquants, anticancéreux, anti-vih et inhibiteurs de la PDE II.2.1. Consommation II.2.2. Ecotoxicité II.2.3. Présence dans le milieu II.2.4. Persistance II.2.5. Manque de données II.3. Listes des molécules sélectionnées III. CMPARAISN AVEC LES MLECULES RETENUES DANS D'AUTRES ETUDES CHAPITRE 3 : MATERIEL ET METHDE I. REVUE BIBLIGRAPHIQUE SUR LES TECHNIQUES ANALYTIQUES I.1. Echantillons et techniques d échantillonnage I.1.1. Type de prélèvement I.1.2. Matériaux contenant les prélèvements I.1.3. Conservation des prélèvements I.2. Conditionnement des échantillons I.3. Traitement des échantillons / extraction des composés d intérêt I.3.1. Extraction de la phase dissoute par SPE I.3.2. Extraction de la phase solide et particulaire par ASE I.3.3. Extraction des composés piégés dans les échantillonneurs passifs I.4. Techniques analytiques II. PRJETS ET SITES D ECHANTILLNNAGE II.1. Eaux usées et autres échantillons d eau II.2. FLASH II.2.1. Continuum hospitalier II.2.2. Continuum agricole II.3. DIPERPHA II.4. Capteurs passifs II.4.1. Expérience de calibration en laboratoire II.4.2. Application dans la Garonne II.5. Récapitulatif des projets III. TRAITEMENT DES ECHANTILLNS III.1. Échantillons «eau» III.2. Échantillons «lisiers» III.3. Échantillons «PCIS»

17 Sommaire CHAPITRE 4 : DEVELPPEMENTS ANALYTIQUES I. DEVELPPEMENT DES METHDES D ANALYSE PAR CHRMATGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE CUPLEE A LA SPECTRMETRIE DE MASSE EN TANDEM (LC/MS/MS) I.1. Développement de la méthode d analyse pour 32 molécules pharmaceutiques I.2. Extension de la méthode d analyse à 78 molécules pharmaceutiques I.3. Méthode spécifique à l amoxicilline et à l ampicilline I.4. Bilan méthodes analytiques I.4.1. Mode d'ionisation positif (ESI+) I.4.2. Mode d'ionisation négatif (ESI-) I.5. Validation des protocoles II. DEVELPPEMENT DU PRTCLE D EXTRACTIN DES CMPSES CNTENUS DANS LA PHASE LIQUIDE DES ECHANTILLNS PAR SPE II.1. Les échantillons d eau II.2. Le cas particulier de l amoxicilline et de l ampicilline II.3. Les échantillons de lisiers II.4. Bilan protocole extraction phase dissoute III. DEVELPPEMENT DU PRTCLE D EXTRACTIN DES CMPSES CNTENUS DANS LA PHASE SLIDE DES ECHANTILLNS PAR ASE III.1. Développement du protocole III.2. Bilan protocole extraction phase solide IV. CNTRLE QUALITE ET QUANTIFICATIN IV.1. Contrôle qualité IV.2. Méthodes de quantification IV.2.1. Etalonnage externe IV.2.2. Etalonnage interne CHAPITRE 5 : APPLICATINS ENVIRNNEMENTALES I. APPLICATIN AUX MATRICES «EAUX» I.1. Tests d applicabilité des protocoles I.2. Continuum Hérault : STEP surface - captage I.2.1. Résultats de la campagne estivale I.2.2. Résultats de la campagne hivernale I.2.3. Comparaison saisonnière des résultats I.3. Projet FLASH I.3.1. Continuum hospitalier I Etude des classes thérapeutiques spécifiques à ces travaux I Etudes des autres classes thérapeutiques I Bilan toutes classes thérapeutiques confondues I.3.2. Continuum agricole I Etude des classes thérapeutiques spécifiques à ces travaux I Etude des autres classes thérapeutiques I Bilan toutes classes thérapeutiques confondues I.4. Conclusion sur la contamination des eaux II. APPLICATIN AUX MATRICES «LISIERS» II.1. Choix des molécules les plus pertinentes à étudier II.2. Conditionnement des échantillons II.3. rigine de la contamination du lisier stocké II.3.1. rigine du lisier brut et niveau de contamination II.3.2. Niveau de contamination du lisier stocké par rapport aux lisiers bruts II.3.3. Distribution des antibiotiques en fonction du stade physiologique et de l élevage considéré II.4. Devenir des antibiotiques dans les filières de traitement du lisier II.4.1. Filières traditionnelles de stockage du lisier II.4.2. Filières complexes avec traitement du lisier II.5. Devenir des antibiotiques en conditions contrôlées II.5.1. Dégradation en condition mésophile anaérobie et aérobie/anoxique II.5.2. Dégradation en condition mésophile aérobie/anoxique II.5.3. Dégradation en condition thermophile anaérobie II.5.4. Bilan sur le devenir des antibiotiques II.6. Conclusion sur la contamination des lisiers

18 Sommaire CHAPITRE 6 : DEVELPPEMENT ET APPLICATIN DES PCIS I. DEVELPPEMENT DE L UTIL : EXPERIENCES DE CALIBRATIN II. APPLICATIN DES PCIS PUBLICATIN : CALIBRATIN ET APPLICATIN D'ECHANTILLNNEURS PASSIFS PUR LA DETERMINATIN DE 22 MLECULES PHARMACEUTIQUES DANS L'EAU RESUME INTRDUCTIN I. EXPERIMENTALE I.1. Produits chimiques et matériel I.2. Traitement de l'échantillon I.2.1. Extraction des échantillons aqueux et pré-concentration I.2.2. Extraction des PCIS I.3. Chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem I.4. Calibration en laboratoire I.4.1. Conditions expérimentales I.4.2. Determination des constantes d'adsorption et de desorption et des taux d'échantillonnage I.5. Application environnementale I.6. Paramètres de validation et assurance qualité II. RESULTATS II.1. Développement de l'extraction des PCIS II.2. Calibration en laboratoire II Application environnementale, comparaison entre échantillonnage ponctuel et passif CNCLUSIN REMERCIEMENTS REFERENCES CNCLUSIN ET PERSPECTIVES REFERENCES BIBLIGRAPHIQUES ANNEXES Annexe 1 : Elimination des molécules pharmaceutiques dans les STEP Annexe 2 : Présences et niveau de contamination des molécules pharmaceutiques dans différentes matrices environnementales Annexe 3 : Ecotoxicité des antibiotiques Annexe 4 : Structures des 78 molécules pharmaceutiques Annexe 5 : Propriétés physico-chimiques et pharmacocinétique des 78 molécules pharmaceutiques étudiées Annexe 6 : Echantillonnage, extraction et analyse d échantillons environnementaux contenant des molécules pharmaceutiques Annexe 7 : Résultats bruts des différentes séries d analyse, eau et lisier PUBLICATIN 1 : PRBLEMS AND SLUTINS F TRACE LEVEL ANALYSIS F RGANIC CNTAMINANTS IN DRINKING AND GRUND WATERS, REVIEW AND EXPERIENCE FEEDBACK PUBLICATIN 2 : DEVELPMENT F A METHD FR THE SIMULTANEUS EXTRACTIN F ANTIBITICS, -BLCKERS, ANTINEPLASTICS AND ANTIVIRALS BY SLID-PHASE EXTRACTIN FLLWED BY LIQUID CHRMATGRAPHY TANDEM MASS SPECTRMETRY ANALYSIS APPLICATIN T SEWAGE TREATMENT PLANT EFFLUENTS PUBLICATIN 3 : MULTI-RESIDUE SIMULTANEUS ANALYSIS F 78 PHARMACEUTICAL CMPUNDS IN AQUEUS SAMPLES: DEVELPMENT AND APPLICATIN

19 Liste des figures Liste des Figures Figure 1 : Répartition par année, sur les 20 dernières années, du nombre d'articles scientifiques publiés dans des revues à comité de lecture sur la problématique de la contamination de l environnement par les molécules pharmaceutiques Figure 2 : Importance relative du nombre d'articles scientifiques, à comité de lecture, publiés en 1990, 2000 et 2010 sur les thématiques de la contamination de l'environnement pas les molécules pharmaceutiques (pharma.), les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) et les polychlorobiphényles (PCB) Figure 3 : Répartition des articles scientifiques publiés sur les molécules pharmaceutiques entre les différents thèmes de recherche entre 1998 et 2008 (graphique extrait et traduit du projet KNAPPE) Figure 4 : Niveau 1 et 2 du classement ATC humain (MS, 2009) Figure 5 : rigine et distribution des molécules pharmaceutiques dans le milieu Figure 6 : Quantités moyennes de molécules pharmaceutiques et produits de soin corporels en entrée (influent) et sortie (effluent) de deux stations d épuration utilisant des filtres bactériens (Cilfynydd) ou des boues activées (Coslech) comme type de traitement (extrait de Kasprzyk-Hordern et al.,, 2009) Figure 7 : Rendement d'élimination des molécules pharmaceutiques dans les STEP (n = nombre de données) (la croix correspond à la moyenne) (la famille des macrolides intègre aussi les lincosamides) Figure 8 : Elimination des molécules pharmaceutiques en fonction du traitement biologique appliqué (extrait de Kasprzyk Hordern et al., 2009) Figure 9 : Pourcentage d'élimination et temps de demi-vie de différentes molécules pharmaceutiques en fonction du temps de résidence hydraulique (extrait de Gros et al., 2010) Figure 10 : Répartition du nombre d échantillons d eau analysés par type de matrice d après des données bibliographiques (graphique traduit du délivrable D1.1 «List of relevant PPs» du projet KNAPPE, Schlüsener et al., 2007) Figure 11 : Concentrations minimales et maximales relevées dans les diverses classes thérapeutiques pour les différentes matrices aqueuses (nombre de classes thérapeutiques prises en compte, nombre de données prises en compte) Figure 12 : Gammes de concentrations auxquelles les 8 composés représentés peuvent être retrouvés dans différentes matrices aqueuses (gamme représentées par la valeur minimale et maximale trouvées dans les n données récupérées dans la littérature, 0 = 0,1 ng/l). 64 Figure 13 : Plages de concentrations auxquelles les principales classes thérapeutiques peuvent être retrouvées dans les rejets hospitaliers (nombre de données relevées dans chaque classe) Figure 14 : Concentrations relevées dans la littérature pour 46 molécules pharmaceutiques mesurées dans des rejets hospitaliers Figure 15 : Evolution du niveau de concentration en ciprofloxacine (b) et métronidazole (e) dans un effluent hospitalier en fonction de l heure de prélèvement et du débit (extrait de Lindberg et al., 2004) Figure 16 : Plages de concentrations auxquelles les principales classes thérapeutiques peuvent être retrouvées dans les eaux usées en entrée de station d'épuration (nombre de données relevées dans chaque classe) Figure 17 : Concentrations relevées dans la littérature pour 85 molécules pharmaceutiques mesurées dans des eaux usées brutes (entrée de STEP) Figure 18 : Plages de concentrations auxquelles les principales classes thérapeutiques peuvent être retrouvées dans les eaux traitées en sortie de station d épuration (les données de Larsson et al.,, 2007 n ont pas été intégrées ici car elles reflètent un cas particulier d eaux usées issues d industries pharmaceutiques) (nombre de données relevées dans chaque classe) Figure 19 : Concentrations relevées dans la littérature pour 94 molécules pharmaceutiques mesurées dans les eaux usées traitées en sortie de station d épuration (par souci de lisibilité, les composés n ayant qu une seule valeur n apparaissent pas et les croix représentent les données relevées dans Larsson et al., 2007) Figure 20 : Plages de concentrations auxquelles les principales classes thérapeutiques peuvent être retrouvées dans les eaux de surface (nombre de données relevées dans chaque classe) Figure 21 : Concentrations relevées dans la littérature pour 100 médicaments mesurées dans les eaux de surface (par souci de lisibilité, les composés n ayant qu une seule valeur n apparaissent pas sur cette figure) Figure 22 : Plages de concentrations auxquelles les principales classes thérapeutiques peuvent être retrouvées dans les eaux souterraines (nombre de données relevées dans chaque classe) Figure 23 : Concentrations relevées dans la littérature pour 42 molécules pharmaceutiques mesurées dans les eaux souterraines Figure 24 : Plages de concentrations auxquelles les principales classes thérapeutiques peuvent être retrouvées dans les eaux potables (eaux en sortie de station de potabilisation ou eaux de boisson) (nombre de données relevées dans chaque classe) Figure 25 : Concentrations relevées dans la littérature pour 41 molécules pharmaceutiques mesurées dans les eaux potables (AMDPH : 1- acetyl-1-methyl-2-dimethyl-oxamoyl-2-phenylhydrazid) Figure 26 : Répartition des composés pharmaceutiques entre les boues (plein) et les eaux traitées (rayé) dans les STEP. En blanc apparaît la fraction perdue par dégradation (graphique adapté de Heidler et Halden, 2008) Figure 27 : Concentrations relevées dans la littérature pour 54 molécules pharmaceutiques mesurées dans les boues des stations d épuration

20 Liste des figures Figure 28 : Concentrations des molécules pharmaceutiques provoquant des effets toxiques aigus sur les algues, les cyanophytes (cyanobactéries), les invertébrés et les poissons (EC 50) (graphique extrait d'une présentation de J. Garric, mai 2009 (http://www.onema.fr/img/pdf/j.garric_cemagref_atelier_3.pdf, 15/12/10)) Figure 29 : Concentrations des molécules pharmaceutiques provoquant (EC 50) ou ne provoquant pas (NEC) des effets toxiques chroniques sur les algues, les cyanophytes (cyanobactéries), les invertébrés et les poissons (graphique extrait d'une présentation de J. Garric, mai 2009 (http://www.onema.fr/img/pdf/j.garric_cemagref_atelier_3.pdf, 15/12/10)) Figure 30: Répartition des classes de molécules pharmaceutiques en fonction de leur fréquence d analyse dans des échantillons environnementaux (traduit du projet KNAPPE) Figure 31 : Evolution de la consommation des antibiotiques en France en médecine ambulatoire entre 1998 et 2008 (a) et à l hôpital entre 2006 et 2008 (b), exprimée en DDD pour 1000 habitants et par jour (à partir des données ESAC) Figure 32 : Recensement des classes ATC de niveau 3 et 4 pour le groupe des antibiotiques en médecine humaine (d après le site internet 121 Figure 33 : Répartitions entre usage humain et vétérinaire des ventes des différentes familles d antibiotiques (Source 350,19 ANMV-AFSSAPS 2002) Figure 34 : Evolution par familles des ventes d'antibiotiques à usage vétérinaire entre 1999 et 2008 (d après les données de Chevance et al,. 2009) Figure 35 : Répartition de la consommation des antibiotiques vétérinaires en France en 2008 (graphique d'après les données du rapport de l'afssa-anmv, Chevance et al., 2009) Figure 36 : Evolution par familles des ventes d'antibiotiques à usage vétérinaire entre 1999 et 2008 a) pour les porcs et b) pour les bovins d'après les données de consommation exprimées en tonnes de poids vif traité (graphiques extrait du rapport de l AFSSA, Chevance et al., 2009) Figure 37 : Présence et niveau de contamination des différentes familles d'antibiotiques dans les matrices aqueuses d après des données relevées dans la littérature (cf. Annexe - tableau 2 à Annexe - tableau 7) Figure 38: Recensement des classes ATC de niveau 3 et 4 pour le groupe des -bloquants en médecine humaine (d après le site internet 132 Figure 39 : Recensement des classes ATC de niveau 3 et 4 pour le groupe des antinéoplasiques en médecine humaine (d après le site internet 132 Figure 40 : Recensement des classes ATC de niveau 3 et 4 pour le groupe des antiviraux en médecine humaine (d après le site internet 133 Figure 41 : Présence et niveau de contamination des -bloquants, des anticancéreux, des anti-vih et des inhibiteurs de PDE 5 dans les matrices aqueuses d après des données relevées dans la littérature (cf. Annexe - tableau 2 à Annexe - tableau 7) Figure 42 : Les différentes étapes dans le traitement d un échantillon depuis le prélèvement jusqu à l analyse Figure 43: Cartographie des points de prélèvement (STEP, eau de surface, eau de captage) Figure 44 : Représentation schématique du continuum hospitalier et des points de prélèvement Figure 45 : Représentation du continuum agricole et des sites de prélèvement (le point 5 correspond à l eau de surface échantillonnée dans le continuum hospitalier) Figure 46 : Filière simple de traitement du lisier dans un élevage de type naisseur-engraisseur Figure 47 : Filière complexe de traitement du lisier avec séparation par centrifugation du solide et du liquide en sortie de la fosse de stockage (élevage 4) Figure 48 : Filière complexe de traitement du lisier sans séparation des phases solide et liquide (site 2) Figure 49 : Caractéristiques et points de prélèvement lors de la première expérience en réacteur mésophile Figure 50 : Caractéristiques et points de prélèvement lors de la seconde expérience en réacteur mésophile Figure 51 : Caractéristiques et points de prélèvement lors de la troisième expérience en réacteurs thermophile Figure 52: Photos du montage ayant servi aux expériences de calibration des PCIS Figure 53: Prélèvement des PCIS au cours de l expérience de calibration réalisée en laboratoire Figure 54: Localisation des points de prélèvement Figure 55 : Schéma récapitulatif de l'ensemble des études réalisées au cours de ces travaux de thèse Figure 56 : Comparaison de la composition et des teneurs en antibiotiques de la phase particulaire et de la phase solide de mêmes échantillons de lisier (LS1 : lisier stocké site simple 1, LS2 : lisier stocké site simple 2, LS3 : lisier stocké site simple 3, Ls5 : lisier stocké site complexe 5, BA5 : bassin d aération site complexe 5, BE5 : bassin de décantation site complexe 5, Lag5 : lagune site complexe 5) Figure 57 : Schéma explicant le principe de l analyse par chromatographie en phase liquide couplé à un spectromètre de masse en tandem comportant 2 quadrupôles et fonctionnant en mode MRM (Multi-Reaction Monitoring) Figure 58 : Localisation des différentes parties du LC/MS/MS correspondant aux paramètres à optimiser

21 Liste des figures Figure 59 : Chromatogrammes obtenus pour les 27 molécules ionisées en ESI+ en fonction de la constitution des phases mobiles, (a) eau/acn + 0,1 % CH 3CH dans chaque solvant, (b) eau/acn + 0,3 % HCH dans chaque solvant, (c) eau/acn + 2,5 % CH 3CH dans chaque solvant. Exemple de l acide oxolinique en rouge et de l oxytétracycline (oxytc) en bleu Figure 60 : Chromatogrammes obtenus pour les 5 molécules ionisées en ESI- en fonction de la constitution des phases mobiles (abondance normalisée par la quantité injectée), (a) eau/acn sans acide, (b) eau/acn + 0,1 % CH 3CH dans chaque solvant, (c) eau/acn + 0,3 % HCH dans chaque solvant, (d) eau/acn + 2,5 % CH 3CH dans chaque solvant Figure 61 : Chromatogrammes d analyses successives de pénicilline G sans acide dans la phase mobile (a) et avec 0,1 % d acide acétique dans chaque solvant de la phase mobile (b) Figure 62: Chromatogramme des 66 composés pharmaceutiques analysés en ESI Figure 63: Chromatogramme d une solution standard analysée en ESI Figure 64 : Chromatogramme de l'amoxicilline et de l'ampicilline ainsi que des 3 autres -lactames analysés en ESI Figure 66 : Suivi de la carte de contrôle de la méthode d'analyse de 21 antibiotiques en ESI + pour DIPERPHA Figure 67 : Rendement d'extraction moyen pour 15 antibiotiques en fonction du type de cartouche et du solvant employé Figure 68 : Rendement d'extraction moyen pour les 32 molécules pharmaceutiques en fonction du ph de l'échantillon et de l'ajout ou non d'edta Figure 69 : Rendements d évaporation moyens en fonction du niveau d évaporation pour les 32 molécules pharmaceutiques (a) et pour quelques molécules spécifiques (b) (FQ : fluoroquinolones, Q : quinolones, S : sulfonamides, b-b : -bloquants) Figure 70 : Rendements d'extraction moyens (n=16) pour chacun des 32 composés de la première liste de molécules sélectionnées Figure 71 : Rendements d'extraction obtenus au cours du premier test d'optimisation d'un protocole SPE spécifique à l'amoxicilline et à l'ampicilline Figure 72 : Rendements d'extraction obtenus au cours du second test d'optimisation du protocole SPE de l amoxicilline et de l ampicilline Figure 73 : Validation du nouveau protocole d'extraction de l'amoxicilline et de l'ampicilline Figure 74 : Protocoles d extractions multi-résidus (32 et 78 composés) et spécifiques (amoxicilline et ampicilline) de la phase dissoute d échantillons aqueux (eau et lisiers) Figure 75 : Rendements de quantification (n=3) et d extraction (SPE et ASE+SPE noté ASE, n=3) pour 5 des 7 molécules majoritaires (lincomycine, marbofloxacine et sulfadiazine quantifiées par étalonnage interne avec les étalons dans le flacon de récupération, oxytétracycline et monensine quantifiées par étalonnage externe) Figure 76: Comparaison des rendements d'extraction en fonction du moment où les étalons internes (ei) sont ajoutés, dans le flacon collecteur des extraits ou dans la cellule ASE Figure 77 : Protocoles d extractions de la phase solide d échantillons de lisiers porcins Figure 78 : Niveau de contamination et concentrations individuelles en antibiotiques, -bloquants et anti-vih dans 10 effluents de STEP. 224 Figure 79 : Flux totaux, en mg/j (histogramme), de molécules pharmaceutiques émis par les STEP et débits, en m 3 /j (courbe), des STEP Figure 80 : Présence et niveau de contamination des molécules pharmaceutiques en entrée et en sortie de 4 stations d'épuration, en amont et en aval de ces rejets dans des eaux de surface et dans des eaux de captage souterraines en été Figure 81 : Influence des rejets de STEP sur la contamination des rivières et des eaux de surface étudiées le long du continuum Hérault en été Figure 82 : Présence et niveau de contamination des molécules pharmaceutiques en entrée et en sortie de 4 stations d'épuration, en amont et en aval de ces rejets dans des eaux de surface et dans des eaux de captage souterraines en hiver (concentration et présence de l amoxicilline non présenté) Figure 83 : Influence des rejets de STEP sur la contamination des rivières et des eaux de surface étudiées le long du continuum Hérault en hiver Figure 84 : Comparaison saisonnière de la contamination totale des eaux usées en entrée et sortie de STEP, des eaux de surface en amont et en aval de ces rejets et des eaux de captage Figure 85 : Comparaison saisonnière de la contamination des eaux usées en entrée et sortie de STEP pour chacune des 14 molécules détectées dans ces eaux Figure 86 : Comparaison saisonnière de la contamination des eaux de surface en amont et en aval des rejets de STEP et des eaux de captage pour chacune des 7 molécules détectées dans ces eaux Figure 87 : Présence des différentes classes thérapeutiques dans les 5 matrices analysées dans le continuum hospitalier (A-b : antibiotiques, b-b : -bloquants, A-c : anticancéreux, A-VIH : anti-vih) Figure 88 : Présence et niveau de contamination des antibiotiques, -bloquants, anticancéreux, anti-vih et sildénafil, en été et en hiver le long d'un continuum hospitalier Figure 89 : Abattements estivaux et hivernaux des différentes molécules au sein des différentes classes thérapeutiques et famille d antibiotiques (les abattements inférieurs à % apparaissent sur le graphique au niveau de la ligne -100 %) (macro. & linco : macrolides et lincosamides, FQ & Q : fluoroquinolones et quinolones, autres Ab : autres antibiotiques) Figure 90 : Concentration totale ( 78) en molécules pharmaceutiques le long du continuum hospitalier, comparaison été/hiver

22 Liste des figures Figure 91 : Présence des différentes classes thérapeutiques dans les 5 matrices analysées dans le continuum hospitalier (AINS : analgésiques et AINS, A-épi. & A-dép. : antiépileptiques et antidépresseurs, broncho. : bronchodilatateurs, hypolip. : hypolipémiants) Figure 92 : Présence et niveau de contamination des analgésiques et AINS (AINS), des antiépileptiques et antidépresseurs (A-épi. & A-dép.), des bronchodilatateurs (broncho.), des hypolipémiants (hypolip.) et des stimulants, en été et en hiver le long d'un continuum hospitalier (retraite : maison de retraite) Figure 93 : Concentration totale ( 21) en molécules pharmaceutiques le long du continuum hospitalier, comparaison été/hiver Figure 94 : Concentration totale ( 99) en molécules pharmaceutiques le long du continuum hospitalier, comparaison été/hiver Figure 95 : Contribution des 10 classes thérapeutiques étudiées à la contamination totales des eaux le long du continuum hospitalier Figure 96 : Présence et niveau de contamination des antibiotiques, -bloquants, anticancéreux, anti-vih et sildénafil le long d'un continuum agricole, en été et en hiver Figure 97 : Concentration totale ( 78) en molécules pharmaceutiques le long du continuum agricole, comparaison été/hiver Figure 98 : Présence et niveau de contamination des analgésiques et AINS (AINS), des antiépileptiques et antidépresseurs (A-épi. & A-dép.), des bronchodilatateurs (broncho.), des hypolipémiants (hypolip.) et des stimulants, en été et en hiver le long d'un continuum agricole Figure 99 : Concentration totale ( 99) en molécules pharmaceutiques le long du continuum agricole, comparaison été/hiver Figure 100 : Contribution des 10 classes thérapeutiques étudiées à la contamination totales des eaux le long du continuum agricole Figure 101 : Contribution des familles d antibiotiques et des classes thérapeutiques à la contamination des différents échantillons d eau analysés au cours de ces travaux de thèse Figure 102 : A) Flux totaux, en mg/j (histogramme), de molécules pharmaceutiques émis par les STEP étudiées au cours des différents projets et débits, en m 3 /j (courbe) (remarque : flux du continuum Hérault calculé à partir des débits moyens annuels des STEP), B) concentrations totales, en ng/l, en molécules pharmaceutiques émises par les STEP Figure 103 : Fréquence de détection des 18 antibiotiques retrouvés au moins une fois à l issus des premières analyses de la phase dissoute d échantillons de lisier provenant à la fois des filières simples et complexes Figure 104 : Concentration moyenne en antibiotiques d'un même lisier de porc en fonction des différentes conditions de conservation (F + F : frais + formaldéhyde; C + F : congelé + formaldéhyde) Figure 105 : Concentration moyenne (n=3) en antibiotiques d'un même échantillon de lisier porcin en fonction des différentes conditions de traitement (C : congelé; CF : centrifugé/filtré) Figure 106 : Répartition de la contamination des lisiers bruts en fonction de leur bâtiment d'origine (phase solide et phase liquide prise en compte) (ENG : engraissement, MATER : maternité, PS : post-sevrage) Figure 107: Niveau de contamination du lisier stocké et brut en fonction de son origine (LB ENG : lisier brut engraissement, LB MATER : lisier brut maternité, LB PS : lisier brut post-sevrage, LS : lisier stocké). Pour l élevage 2, les données de LB ENG et LS proviennent d analyses qui ont été réalisées sur du lisier prélevé à la même époque mais un an auparavant par rapport à LB MATER et LB PS Figure 108: Part relative de chaque antibiotique à la contamination globale du lisier en fonction de son origine (ENG : lisier brut engraissement, MATER : lisier brut maternité, PS : lisier brut post-sevrage, LS : lisier stocké) Figure 109 : Evolution de la contamination totale du lisier stocké en fosse durant 5 mois dans 3 élevages porcins différents Figure 110 : Evolution de la contamination de la phase dissoute (a) et de la phase solide (b) du lisier stocké en fosse penda nt les 5 mois de suivi dans les 3 élevages Figure 111 : Evolution détaillée par molécule de la contamination du lisier de la fosse de stockage sur 5 mois de suivi dans 3 élevages différents, en tenant compte (haut) ou non (bas) de l oxytétracycline Figure 112 : Evolution et importance relative de chaque antibiotique à la contamination du lisier stocké, dans la phase dissoute (haut) et dans la phase solide (bas) Figure 113 : Répartition des antibiotiques entre la phase dissoute (clair) et la phase solide (foncé) des lisiers stockés pour les 3 élevages étudiés Figure 114 : Evolution de la contamination le long de la filière de traitement dans la phase dissoute (gauche) et dans la phase solide (droite, ng/g de poids sec) de l'élevage Figure 115 : Evolution de la contamination le long de la filière de traitement dans la phase dissoute (gauche) et dans la phase solide (droite, ng/g de poids sec) de l'élevage Figure 116 : Comparaison des évolutions de la contamination du lisier le long des différentes filières de traitement Figure 117 : Concentrations moyennes totales en antibiotiques dans le lisier avant (RLB) et après traitement anaérobie (RLdig) ou couplage aérobie-anoxique (RLsort) mésophile Figure 118 : Concentrations moyennes totales en antibiotiques dans le lisier à l entrée du réacteur (alimentation) et en sortie du réacteur (sortie) aérobie-anoxique mésophile Figure 119 : Concentrations moyennes totales en antibiotiques à l entrée des réacteurs anaérobies thermophiles (alim) et en sortie du premier réacteur (R1) et du second réacteur (R2) Figure 120 : Les différents régimes d'adsorption des échantillonneurs passifs

23 Liste des tableaux Liste des Tableaux Tableau 1 : Mode d action des principaux antalgiques Tableau 2 : Les principales classes thérapeutiques agissant dans les troubles gastriques et leurs modes d action Tableau 3 : Exemples de médicaments impliqués dans les contrôles hormonaux Tableau 4 : Les principales classes thérapeutiques agissant dans les troubles du comportement et de l humeur et leurs modes d action Tableau 5 : Exemples d'hypolipémiants et leurs modes d'action Tableau 6 : Exemples d'anticoagulants et leurs modes d'action Tableau 7 : Modes d action des différentes familles d'antibiotiques Tableau 8 : Modes d action des différentes classes anticancéreux Tableau 9 : Exemple d'antiparasitaires vétérinaires et leurs modes d'actions Tableau 10 : Exemple d anti-inflammatoires vétérinaires et leurs modes d action Tableau 11 : Modes d action des antibiotiques administrés en médecine vétérinaire Tableau 12 : Concentrations minimales et maximales relevées dans les eaux usées brutes (entrée de STEP) et traitées (sortie de STEP) ainsi que les boues de STEP pour deux classes thérapeutiques majeures (concentrations indiquées en ng/l dans les eaux et en ng/g da ns les boues) Tableau 13 : Nombre d'informations recueillies dans les différentes matrices aqueuses Tableau 14 : Concentrations des antibiotiques analysés dans les effluents d'élevage et les sols enrichis avec ces déchets (ng/g) Tableau 15 : Concentrations en antibiotiques trouvées dans les sédiments (ng/g) Tableau 16 : Concentrations effectives en µg/l (EC 50) pour 24 antibiotiques relevées dans la littérature Tableau 17: Différences de sensibilité d'une cyanobactéries et de 2 algues à différents antibiotiques (d après Holten Lützhøft et al., 1999), (0,015) : en dehors de la gamme de mesure du test pratiqué Tableau 18: Les étapes de l'évaluation du risque environnemental (traduit du tableau 1, EMEA, 2006) Tableau 19 : Evaluation de la toxicité de différentes molécules pharmaceutiques selon le rapport PEC / PNEC Tableau 20 : Répartition des ventes de médicaments par classe ATC de niveau 2 sur le marché officinal en quantité en 2004, 2006, 2007 et 2008 (millions d unités vendues (part du marché %)) Tableau 21 : Répartition des ventes de médicaments en quantité et en valeur sur le marché officinal en 2008 (part du marché %). Sont indiquées en gras les classes communes aux 2 classements Tableau 22 : Répartition des ventes de médicaments par classe ATC de niveau 2 sur le marché hospitalier en valeurs en 2004, 2006, 2007 et 2008 (part du marché %) Tableau 23 : Classes thérapeutiques et molécules pharmaceutiques les plus recherchées dans les stations d'épuration (traduit de Miège et al., 2009) Tableau 24 : Synthèse des classes de médicaments retenues suivant les différents critères de choix Tableau 25 : Nombre d unités vendues sur les 100 premières molécules du marché ambulatoire français en 2007 et 2008 (données IMS Health) Tableau 26 : Nombre d'unités d'antibiotiques (classe ATC J01) vendues en France en 2007 et 2008 en officines (données IMS Health) Tableau 27 : Nombre d'unités de -bloquants (classe ATC C07) vendues en France en 2007 et 2008 en officines (données IMS Health) Tableau 28 : Nombre d'unités d'anticancéreux (classe ATC L01 et L02) vendues en France en 2007 et 2008 en officines (données IMS Health) Tableau 29 : Nombre d'unités vendues d'anti-vih (classe ATC J05) en France en 2007 et 2008 en officines (données IMS Health) Tableau 30 : Liste des composés sélectionnés avec les informations relatives à leur structure, leur consommation, leur pharmacocinétique, leurs propriétés physico-chimiques, et les critères de sélection Tableau 31 : Comparaison de la liste de molécules étudiées au cours de la thèse avec celles établies par d autres études française ou européenne Tableau 32 : Répartition des 28 références bibliographique précisant dans quel type de contenant les échantillons sont recueillis (détails dans l Annexe - tableau 11) Tableau 33 : Répartition des références bibliographique précisant le mode de conservation des échantillons (détails dans l Annexe - tableau 11) Tableau 34 : Répartition des références bibliographique en fonction de la porosité des filtres employés (détails dans l Annexe - tableau 11) Tableau 35 : Répartition des références bibliographique en fonction de la technique extractive employée (détails dans l Annexe - tableau 12)

24 Liste des tableaux Tableau 36 : Principe des différentes techniques extractives (T : température, P : pression) Tableau 37 : Répartition des références bibliographiques utilisant l extraction par SPE entre les différentes sortes de cartouches (détails dans l Annexe - tableau 12) Tableau 38 : Répartition des références bibliographiques entre les différentes systèmes d analyse ( détails dans l Annexe - tableau 13) Tableau 39: Caractéristiques des stations d'épuration où les échantillons ont été prélevés Tableau 40 : Informations relatives au prélèvement et au traitement des échantillons Tableau 41 : Caractéristiques des quatre stations d'épuration étudiées Tableau 42 : Caractéristiques des prélèvements le long du continuum hospitalier au cours des 2 campagnes Tableau 43 : Caractéristiques des prélèvements le long du continuum agricole au cours des 2 campagnes Tableau 44 : Caractéristiques des élevages étudiés possédant un système de traitement simple du lisier Tableau 45 : Dates de prélèvement du lisier stocké et des lisiers bruts en fonction du bâtiment d élevage d origine Tableau 46 : Dates de prélèvement dans la fosse de stockage du lisier sur les élevages possédant un système simple de traitement Tableau 47 : Caractéristiques des élevages étudiés possédant un système complexe de traitement du lisier Tableau 48 : Volumes (ml) des prises d'essai pour les différents projets traités Tableau 49 : Conditions d'extraction de la phase solide des lisiers porcins par ASE Tableau 50 : Valeurs des paramètres de validation du protocole analytique spécifique au dosage de l'amoxicilline et de l'ampicilline Tableau 51 : Paramètres communs à l'ensemble des composés analysés en ESI Tableau 52 : Transitions de quantification (TQ) et de confirmation (TC), ainsi que les valeurs des énergies du fragmentor et des énergies de collision (E.C), de l'ensemble des composés pharmaceutiques analysés en mode d'ionisation positif Tableau 53 : Transitions de quantification (TQ) et de confirmation (TC), ainsi que les valeurs des énergies du fragmentor et des énergies de collision (E.C), de l'ensemble des composés pharmaceutiques analysés en mode d'ionisation négatif Tableau 54 : Paramètres analytiques de validation de la méthode multi-résidus pour 78 molécules à l'exception de l'amoxicilline et de l'ampicilline qui ont leur propre protocole Tableau 55 : Volume de fuite déterminés pour l ensemble des 32 composés (n.d : non determiné car rendements d extraction trop faibles ou nuls) Tableau 56 : Paramètres expérimentaux de validation de la méthode de dosage des 78 molécules à l'exception de l'amoxicilline et de l'ampicilline qui ont leur propre protocole. Rendements calculés par étalonnage interne ou externe Tableau 57 : Protocoles ASE testés pour l'extraction des antibiotiques dans la phase solide des lisiers Tableau 58 : Rendements de quantification (justesse analytique) et d'extraction obtenus lors des différentes séries d analyses des échantillons de lisier provenant des élevages Tableau 59 : Mode de quantification de chacun des composés étudiés Tableau 60 : Exemple de rendements de manipulation (extraction + analyse) obtenus pour 3 molécules différentes au cours d une même expérience en fonction du mode d étalonnage utilisé Tableau 61 : Liste des 32 molécules pharmaceutiques recherchées au cours de cette première étude et leurs résultats d'analyse (concentration ng/l) en comparaison avec d'autres études françaises ayant recherchées et retrouvées, ou non, ces mêmes molécules dans dans des rejets de STEP (cases blanches : composés non recherchés, n.d : composés recherchés mais non détectés, valeurs : concentrations mesurées en ng/l pour les composés détectés) Tableau 62 : Flux de molécules pharmaceutiques en sorties de STEP exprimés en mg/j Tableau 63: Flux des molécules pharmaceutiques en entrée et en sortie de STEP en été, calculés à partir des débits moyens annuels de chacune des STEP, exprimés en mg/j Tableau 64 : Abattement (%) des molécules pharmaceutiques dans les 4 STEP étudiées (calculé quand les molécules ont été quantifiées en entrée et en sortie de STEP) Tableau 65 : Comparaison des abattements dans les STEP pour 2 fluoroquinolones, la ciprofloxacine et l ofloxacine, entre cette étude et celle de Castiglioni et al., Tableau 66 : Fréquences (F) de détection des 32 molécules communes recherchées dans l ensemble de tous les effluents de STEP analysés au cours de ces travaux de thèse Tableau 67 : Concentrations moyennes en antibiotiques dans la phase dissoute et dans la phase solide des lisiers avant (RLB) et après traitement anaérobie (RLdig) ou couplage aérobie-anoxique (RLsort) mésophile Tableau 68 : Concentrations moyennes en antibiotiques dans la phase dissoute et solide des lisiers à l entrée du réacteur (alimentation) et en sortie du réacteur (sortie) aérobie-anoxique mésophile Tableau 69 : Concentrations moyennes en antibiotiques dans la phase dissoute et dans la phase solide à l entrée des réacteurs anaérobies thermophiles (alim) et en sortie du premier réacteur (R1) et du second réacteur (R2) Tableau 70: Régime d'adsorption sur 15 jours d exposition et valeurs des paramètres calculés pour les 22 molécules pharmaceutiques

25 Acronymes et abréviations Acronymes et abréviations Ab : antibiotique Ac : anticancéreux ACN : acétonitrile AFSSA : Association Française de Sécurité Sanitaire des Aliments ANSES : Agence Nationale de Sécurité Sanitaire, de l alimentation, de l environnement et du travail APCI : Atmospheric Pressure Chemical Ionisation (ionisation chimique à pression atmosphérique) ASE : Accelerated Solvant Extraction (extraction accélérée par solvent) AVIH : anti-vih CH 3 CH : acide acétique DCE : Directive Cadre sur l'eau DCM : dichlorométhane EC 50 : Effect Concentration 50 (concentration provoquant des effets sur 50 % des organismes étudiés) EI : Electron Impact (impact électronique) EI : étalon interne ESI : ElectroSpray Ionisation (ionisation en mode éléctrospray) GC : Gas Chromatography (chromatographie en phase gazeuse) GC/MS : Gas Chromatography / Masse Spectrometry (chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse) GC/MS/MS : Gas Chromatography tandem Masse Spectrometry (chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse en tandem) HAP : Hydrocarbure Aromatique polycyclique HCL : acide chlorhydrique HCH : acide formique HDPE : High Density PolyEthylen (polyéthylène haute densité) HPLC : High Performance Liquid Chromatography (chromatographie en phase liquide haute performance) IDL : Instrumental Detection limit (limite de détection instrumentale) INNTI : Inhibiteur Non Nucléosidique de la Transcriptase Inverse INTI : Inhibiteur Nucléosidique de la Transcriptase Inverse IQL : Instrumental Quantification limit (limite de quantification instrumentale) IT : Ion Trap (trappe à ion) LC/MS : Liquid Chromatography / Masse Spectrometry (chromatographie en phase liquide haute performance couplée à un spectromètre de masse) LC/MS/MS : Liquid Chromatography tandem Masse Spectrometry (chromatographie en phase liquide haute performance couplée à un spectromètre de masse en tandem) LC 50 : Lethal Concentration 50 (concentration léthale pour 50 % des organismes étudiés) LD : Limit f Detection (limite de détection) LEC : Lowest bserved Effect Concentration (plus petite concentration provoquant les effets observés) LQ : Limit f quantification (limite de quantification) MAE : Microwave-Assisted Extraction (extraction assistée par micro-ondes) MDL: Method Detection limit (limite de détection méthodologique) MEC : Mesured Environmental Concentration (concentration mesurée dans l'environnement) MeH : méthanol 25

26 Acronymes et abréviations MM : masse molaire MQL : Method Quantification limit (limite de quantification méthodologique) MRM : Multiple Reaction Monitoring (suivi de réaction multiple) MS : Mass Spectrometry (spectromètre de masse) Na 2 -EDTA : Ethylen-Diamine-Tetra-Acetic acid dissodium salt NaH : hydroxyde de sodium (soude) NMW : Natural Mineral Water (eau minérale naturelle) NEC : No bserved Effect Concentration (concentrations sans effet observé) CDE : rganisation de Coopération et de Développement Économiques MS : rganisation Mondial pour la Santé PDE 5 : Phospho-Di-Estérase de type 5 PEC : Predicted Environmental Concentration (concentration prédite dans l'environnement) PES : PolyEtherSulfone PNEC : Predicted Non Effect Concentration (concentration prédite sans effet observé) PCIS : Polar rganic Chemical Integrative Sampler PTFE : PolyTétraFluoroEthylène (Teflon ) Q : Quadrupole (quadrupôle) QQQ : triple quadrupôle QTF : quadrupôle temps de vol en tandem RRLC : Rapid Resolution Liquid Chromatography SIM : Single Ion Monitoring (suivi d'un ion) SIR : Single Ion Recording (suivi d'un ion) SPE : Solid Phase Extraction (extraction en phase solide) SPME : Solid Phase Micro-Extraction (micro-extraction en phase solide) TF : Time f Flight (temps de vol) UE : Union Européene UPLC : Ultra Performance Liquid Chromatography US : Ultra-Sons VIH : Virus Immunodéficience Humaine -b : -bloquant 26

27 Introduction 27

28 28

29 Introduction générale Introduction Générale Les molécules pharmaceutiques font partie des contaminants dits émergents du fait de leur récent intérêt dans les études environnementales comparativement à des composés reconnus comme polluants de façon plus ancienne tels que les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP), les polychlorobiphényles (PCB) ou les pesticides. Malgré tout, les premières études remontent au milieu des années 70 avec par exemple, la parution en 1977 d un article de Hignite et Azarnoff «Drugs and drug metabolites as environmental contaminants: chlorophenoxyisobutyrate and salicylic acid in sewage water effluent». Du fait de leur faible niveau de concentration dans les différents compartiments environnementaux et de leur hydrophilie, il a fallu attendre le développement d outils analytiques adaptés capables de descendre en terme de limites de détection et d analyser des composés polaires dans des matrices aqueuses pour pouvoir les mettre en évidence dans les milieux naturels. Généralement les analyses chimiques de ces molécules sont réalisées avec des couplages chromatographie-spectrométrie de masse. Les premières applications de la spectrométrie de masse datent de 1968 et c est en 1975 que la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse a été développée, améliorant ainsi l analyse des composés hydrophiles et faiblement volatils (Laprévote, 2007). Parallèlement à ces avancées techniques, la découverte des effets perturbateurs endocriniens, comme par exemple la présence de vitellogénine chez des poissons mâles exposés à des rejets de stations d épuration (Purdom et al., 1994), a amené les scientifiques à s interroger sur les causes de ces désordres et à en rechercher les composés responsables. Il est donc devenu important d identifier les composés présents dans les effluents des stations d épuration. Les premiers effets mis en évidence remonteraient au milieu des années 1980 (Routledge et al., 1998). Parmi l ensemble des contaminants organiques, les molécules pharmaceutiques représentent une catégorie particulière. En effet, à la différence des plastifiants comme le bisphénol A ou des détergents comme les alkylphénols polyéthoxylés, les molécules pharmaceutiques sont produites pour être biologiquement actives. De plus, à la différence des pesticides, leurs rejets sont principalement diffus et chroniques car liés à la présence humaine, continus car non liés à des pratiques agricoles saisonnières et non règlementés. La présence de ces molécules dans les milieux aquatiques et édaphiques représente donc un risque potentiel pour les écosystèmes. La féminisation des poissons mâles et les problèmes de maintien de population que cela engendre (Kidd et al., 2007) ou la disparition d une espèce de vautour au Pakistan lié à l absorption de diclofénac (aks et al., 2004) en sont des illustrations. Par ailleurs, les résidus d antibiotiques dans la viande ou le lait destinés à la consommation humaine et les résidus de médicaments dans l eau du robinet (Stackelberg et al., 2007; Garcia-Ac et al., 2009; Vulliet et al., 2009), phénomènes de plus en plus vulgarisés et médiatisés, étendent jusqu à l Homme les risques représentés par les molécules pharmaceutiques. Il y a donc un intérêt fort à étudier les molécules pharmaceutiques pour : - identifier leurs sources dans le milieu et ainsi tenter de réduire leurs apports (diminution de leur utilisation avec par exemple l interdiction depuis 2006 d utiliser les antibiotiques comme promoteurs de croissance chez les animaux d élevage), - comprendre leur devenir depuis leur excrétion de l organisme, humain ou animal, jusqu au milieu naturel (dégradation abiotique et biotique, persistance) et ainsi tenter de les éliminer à des endroits stratégiques comme les stations d épuration par exemple, 29

30 Introduction générale - connaître leur répartition entre les différents compartiments (eau, boue, sédiment, etc.) et ainsi identifier les zones de stockage et les sources secondaires potentielles, - préciser les dangers qu ils représentent d après leurs effets secondaires, leurs sites d action en médecine humaine ou vétérinaire (exemple : récepteurs -adrénergiques) et la présence de ces mêmes sites d action dans les organismes pour lesquels ils ne sont pas destinés. Les dangers peuvent également être évalués au travers d études de modélisation ou de tests écotoxicologiques pratiqués sur des cellules ou des organismes entiers de différents niveaux trophiques (bactérie, phytoplancton, zooplancton, poisson). L ensemble des informations ainsi recueillies par les scientifiques doivent permettre aux pouvoirs publics de prendre des décisions. A l heure actuelle, il n existe pas de réglementation spécifique à la présence des molécules pharmaceutiques dans l environnement. Elles sont englobées dans des directives plus larges relatives à la qualité chimique et biologique de l eau (exemple : directive cadre sur l eau). Néanmoins, l engagement 103 du Grenelle Environnement prévoit la «maitrise des risques liés aux résidus médicamenteux» ; et «l amélioration de la connaissance et la réduction des risques liés aux rejets de médicaments dans l environnement» constitue la cinquième mesure phare du deuxième plan national santé-environnement (PNSE 2, ). Ainsi pour atteindre ces objectifs, il a été mis en place, par les ministères en charge de la santé et de l environnement, un Plan National sur les Résidus de Médicaments dans l Eau (PNRM) dont les deux axes sont (i) l évaluation et (ii) la gestion des risques sanitaires et environnementaux. A terme, ces mesures devraient permettre de passer d une surveillance exploratoire à une surveillance réglementaire. En conséquence, la présence, le devenir et l impact dans les systèmes naturels des molécules pharmaceutiques suscitent un vif intérêt et sont des enjeux majeurs de connaissances. Le développement d outils et de méthodes permettant leurs analyses dans diverses matrices environnementales devient alors un enjeu scientifique important. De par leur mode de consommation, humaine ou vétérinaire, les molécules pharmaceutiques peuvent atteindre tous les milieux aquatiques et terrestres. Par conséquent, il faut que les méthodologies soient applicables à une large gamme de matrices environnementales, des matrices les moins concentrées et les moins chargées en matière organique comme les eaux de boisson aux matrices les plus chargées telles que les lisiers porcins. C est dans ce contexte que ces travaux de thèse s inscrivent. Ce manuscrit s articule en 6 chapitres. Une synthèse bibliographique sur l état des connaissances constitue le chapitre 1. Ce chapitre présente des généralités relatives aux molécules pharmaceutiques comme leurs sources d introduction dans l environnement, leur devenir dans les stations d épuration et dans le milieu naturel ou encore l étendue et le niveau de la contamination des systèmes aquatiques. Cette première partie comporte également un paragraphe détaillé sur les dangers toxicologiques et écotoxicologiques que représentent les médicaments. Elle présente aussi les différents programmes de recherche européens et français s intéressant à la pollution de l environnement par les molécules pharmaceutiques. Le deuxième chapitre de ce manuscrit justifie le choix des composés étudiés notamment au travers des données de consommation. La présentation des 78 molécules sélectionnées y est réalisée. La sélection des molécules est ensuite comparée à celle d autres études françaises ou à celle d organisme de référence comme l Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments (AFSSA). 30

31 Introduction générale En s appuyant sur une synthèse bibliographique, la première partie du chapitre 3 a pour objectif de présenter les différentes techniques qui existent pour analyser les molécules pharmaceutiques dans diverses matrices environnementales, depuis le prélèvement des échantillons jusqu à leur analyse à proprement parler en passant par leur traitement pour maximiser les performances analytiques. Les méthodes d analyse mises en œuvre au cours de ces travaux sont décrites dans la suite de ce chapitre. Les sites d études et les stratégies d échantillonnage y sont détaillés. Le traitement des échantillons depuis le prélèvement jusqu à l étape d évaporation/reconcentration, ultime étape avant l analyse, y figure de façon succincte. Les développements méthodologiques, portant sur les étapes d extraction, d évaporation/ reconcentration et d analyse, réalisés au cours de ces travaux de thèse sont présentés dans le chapitre 4. Les protocoles finaux aux quels ils ont permis d aboutir, en particulier les méthodes d analyse par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem, sont récapitulés dans ce chapitre. Ces développements ont fait l objet de 2 publications qui sont visibles à la fin de ce manuscrit. Une attention particulière a été portée à la qualité des résultats qui pouvaient être fournis lors d analyse de composés organiques présents à l état de traces. Ce travail a fait l objet d une troisième publication qui apparaît également à la fin de ce manuscrit. La contamination de l environnement par les molécules pharmaceutiques peut provenir de leur utilisation en médecine humaine ou en médecine vétérinaire. Selon la source de contamination, rejets humains ou vétérinaires, le type de composés et le type de matrice à analyser ne seront pas les mêmes. Ces deux volets ont été étudiés au cours de ces travaux de thèse et constituent respectivement la première et la deuxième partie du chapitre 5. La première partie traite donc essentiellement de l origine humaine de la contamination de l environnement (eaux usées et rejets de stations d épuration). Elle concerne la contamination des eaux (eaux usées, eaux de surface et eaux souterraines) par l ensemble des molécules pharmaceutiques étudiées. Les résultats des analyses conduites dans le cadre des projets «continuum Hérault» et FLASH (Devenir des antibiotiques, FLux de gènes et de bactéries Antibiorésistantes dans les Systèmes Hydriques de surface) y sont rapportés. La deuxième partie traite de l origine vétérinaire de la contamination de l environnement en se focalisant sur la présence et le devenir des antibiotiques dans les déchets d élevage tels que les lisiers porcins. Elle est dédiée aux résultats obtenus dans le cadre du projet DIPERPHA (Dynamique et Impact des Perturbateurs endocriniens et des composés Pharmaceutiques issus des élevages agricoles). Les résultats du suivi sur 5 mois du devenir des antibiotiques dans une fosse à lisier sur des exploitations possédant un système simple de traitement des déchets ainsi que les résultats des suivis le long des filières de traitement dans des exploitations possédant des systèmes complexes de traitement des déchets y sont présentés. L influence du stade physiologique des animaux sur le niveau de la contamination des lisiers a été étudiée et les résultats sont exposés dans cette partie. Enfin, l étude de la dégradation des antibiotiques dans des réacteurs en conditions contrôlées est rapportée avec les principaux résultats. Le chapitre 6 est dédié à l échantillonnage passif, au développement des PCIS (Polar rganic Chemical Integrative Sampler) comme outil de prélèvement et de pré-concentration et à leur application dans le milieu naturel. Enfin, la dernière partie du manuscrit est consacrée aux conclusions et aux perspectives découlant de ces différents travaux. 31

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33 CHAPITRE 1 Généralités 33

34 34

35 Chapitre 1 : Généralités Chapitre 1 : Généralités I. GENERALITES SUR LES MLECULES PHARMACEUTIQUES I.1. Définition I.2. Importance de la problématique II. LES DIFFERENTES CLASSES DE MLECULES PHARMACEUTIQUES II.1. Douleurs et fièvres II.2. Troubles respiratoires II.3. Troubles gastriques II.4. Troubles / contrôles hormonaux II.5. Les médicaments de l impuissance II.6. Troubles du comportement et de l humeur II.7. Troubles cardiaques II.8. Infections bactériennes II.9. Cancers II.10. Infections virales II.11. Traitements vétérinaires III. RIGINE DANS L ENVIRNNEMENT IV. DEVENIR IV.1. Devenir dans les stations d épuration IV.2. Devenir dans l environnement V. PRESENCE DANS L ENVIRNNEMENT V.1. Les effluents hospitaliers V.2. Les eaux usées brutes (entrées de STEP) V.3. Les eaux usées traitées (effluents / sorties de STEP) V.4. Les eaux de surface V.5. Les eaux souterraines V.6. Les eaux de boisson V.7. Les boues des STEP V.8. Les effluents d élevage et les sols amendés avec les effluents d élevage V.9. Les sédiments VI. TXICITE ET ECTXICITE VI.1. Toxicité VI.1.1. Effets secondaires / indésirables des médicaments VI.1.2. Toxicité envers les organismes non ciblés VI.1.3. Estimation de la toxicité (EC 50, LEC, NEC, etc.) VI.2. Antibiorésistance VI.3. Evaluation du risque environnemental VI.3.1. La démarche de l évaluation du risque environnemental VI.3.2. Application de l évaluation du risque environnemental VII. LEGISLATIN VIII. PRJETS DE RECHERCHE VIII.1. Européens VIII.2. Français Ce chapitre commence par définir le terme «molécules pharmaceutiques» et par présenter les différentes molécules pharmaceutiques. Il développe ensuite leurs sources d introduction dans l environnement, leur devenir dans les stations d épuration et dans le milieu naturel et l étendue et le niveau de la contamination des systèmes aquatiques. Puis il comporte un paragraphe détaillé sur les dangers toxicologiques et écotoxicologiques que représentent les médicaments. Enfin, il expose la législation et les différents programmes de recherche européens et français s intéressant à la pollution de l environnement par les molécules pharmaceutiques. 35

36 Chapitre 1 : Généralités I. Généralités sur les molécules pharmaceutiques I.1. Définition Dans le langage courant, pour parler de quelque chose qui soigne, le terme de «médicament» est employé. Un médicament est «une substance active utilisée pour traiter une affection, une manifestation morbide» (Grand Robert de la langue française). Dans la directive 2001/83/CE du parlement européen et du conseil du 6 novembre 2001, un médicament est défini comme «toute substance ou composition présentée comme possédant des propriétés curatives ou préventives à l'égard des maladies humaines» ; ou encore comme «toute substance ou composition pouvant être administrée à l'homme en vue d'établir un diagnostic médical ou de restaurer, corriger ou modifier des fonctions physiologiques chez l'homme» (European Commission, 2001a). Ces définitions sont également applicables aux médicaments vétérinaires qui sont administrés aux animaux (European Commission, 2001b). Le point commun entre ces définitions est le terme substance. Dans la pratique, les médicaments peuvent être fabriqués par différents laboratoires. Ils portent alors un nom différent bien qu ils contiennent la même substance dite «matière active» ou «principe actif». C est cette dernière qui est responsable des propriétés pharmacologiques du médicament, et c est cette molécule chimique qui est étudiée lorsque sont mises en œuvre des analyses chimiques pour observer la contamination de l environnement. n emploie alors le terme de «molécules pharmaceutiques» plutôt que celui de médicaments. I.2. Importance de la problématique Suite à l émergence d outils analytiques capables de détecter des molécules présentes à l état de traces et suite à la mise en évidence d effets biologiques liés à la présence de ces mêmes molécules, un nouveau groupe de polluants, appelé les contaminants émergents, a été reconnu. Les molécules pharmaceutiques font partie de ce groupe. Elles sont considérées comme des contaminants de l environnement depuis une trentaine d années environ. Cependant, cette problématique n a réellement pris de l ampleur qu au cours de la dernière décennie si on en juge par le nombre croissant d articles scientifiques publiés sur ce sujet (Figure 1). Les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) et les polychlorobiphényles (PCB) sont reconnus depuis plus longtemps comme polluants chimiques de l environnement. Une rapide étude bibliométrique sur le nombre d articles scientifiques parus en 1990, 2000 et 2010 sur le sujet de la contamination de l environnement par les molécules pharmaceutiques, les HAP et les PCB met en avant la croissance de la part prise par les molécules pharmaceutiques dans les études environnementales (Figure 2). Les études environnementales sur les molécules pharmaceutiques se répartissent en différents thèmes de recherche : - développement de techniques et de protocoles analytiques, - analyse de leur présence dans le milieu, - étude de leur devenir, - impact des procédés de traitement sur elles, - observation de leur toxicité, 36

37 nombre d'articles Chapitre 1 : Généralités - évaluation du risque environnemental et sanitaire qu elles représentent. nombre d'articles scientifiques relatifs aux substances pharmaceutiques publiées ces 20 dernières années Figure 1 : Répartition par année, sur les 20 dernières années, du nombre d'articles scientifiques publiés dans des revues à comité de lecture sur la problématique de la contamination de l environnement par les molécules pharmaceutiques. (résultats obtenus après une recherche dans la base de données Scopus en indiquant les termes «pharmaceutical» or «emerging contaminant» et «environment» à rechercher dans le titre, le résumé ou les mots clés; en sélectionnant les thèmes suivant : «pharmacology, importance relative toxicology du nombre and d'articles pharmaceutics», «environmental science», «chemistry», «biochemistry, genetic scientifiques and molecular publiés biology sur le thème», «de agricultural la and biological sciences» et «contamination de l'environnement par les multidisciplinary» ; et en éliminant les revues médicales, pharmacologiques ou de synthèse chimique) substances pharmaceutiques, les HAP et les PCB en 2000 pharma. PCB HAP % 21% 38% 27% 30% 45% 51% 35% 25% Figure 2 : Importance relative du nombre d'articles scientifiques, à comité de lecture, publiés en 1990, 2000 et 2010 sur les thématiques de la contamination de l'environnement pas les molécules pharmaceutiques (pharma.), les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) et les polychlorobiphényles (PCB). (pharma. : résultats obtenus après une recherche dans la base de données Scopus en indiquant les termes «pharmaceutical» or «emerging contaminant» et «environment» à rechercher dans le titre, le résumé ou les mots clés; en sélectionnant les thèmes suivant : «pharmacology, toxicology and pharmaceutics», «environmental science», «chemistry», «biochemistry, genetic and molecular biology», «agricultural and biological sciences» et «multidisciplinary» ; et en éliminant les revues médicales, pharmacologiques ou de synthèse chimique. HAP : résultats obtenus après une recherche dans la base de données Scopus en indiquant les termes «PAH» et «environment» à rechercher dans le titre, le résumé ou les mots clés; en sélectionnant les thèmes suivant : «environmental science», «pharmacology, toxicology and pharmaceutics», «engineering», «agricultural and biological sciences», «earth and planetary sciences», «chemistry», «biochemistry, genetic and molecular biology», «energy», «chemical engineering», «immunology and microbiology» et «multidisciplinary». PCB : résultats obtenus après une recherche dans la base de données Scopus en indiquant les termes «PCB» et «environment» à rechercher dans le titre, le résumé ou les mots clés; en sélectionnant les thèmes suivant : «environmental science», «pharmacology, toxicology and pharmaceutics», «engineering», «agricultural and biological sciences», «earth and planetary sciences», «chemistry», «biochemistry, genetic and molecular biology», «materials science», «chemical engineering», «immunology and microbiology» et «multidisciplinary».) 37

38 < proportion de la littérature (%) Chapitre 1 : Généralités La Figure 3, provenant des résultats d une étude bibliographique réalisée au cours du projet KNAPPE (www.knappe-eu.org, 16/11/2010), présente la répartition des articles publiés entre ces différents thèmes de recherche. Il apparaît qu à la fin des années 90, les études portaient majoritairement sur la présence des molécules pharmaceutiques alors qu à la fin des années 2000, elles semblent davantage porter sur la toxicité et les risques représentés par ces produits ainsi que sur les moyens de les éliminer. 100% 80% 60% 40% 20% 0% Evaluation du risque Toxicité Général Analyses Devenir Processus traitement Présence Figure 3 : Répartition des articles scientifiques publiés sur les molécules pharmaceutiques entre les différents thèmes de recherche entre 1998 et 2008 (graphique extrait et traduit du projet KNAPPE). II. Les différentes classes de molécules pharmaceutiques Le dictionnaire Vidal 2010 répertorie 5000 médicaments. L AFSSA recense 3000 molécules pharmaceutiques à usage humain et 300 à usage vétérinaire. Il existe donc un très grand nombre de molécules pharmaceutiques. Elles peuvent être classées selon différents critères : leur mode d action, leur indication thérapeutique ou leur structure chimique. Depuis 1976, l rganisation Mondiale pour la Santé (MS) les classe selon la classification ATC (Anatomique, Thérapeutique, Chimique) qui s est inspirée de la classification anatomique développée par l «European Pharmaceutical Market Research Association» (EphMRA) et le «Pharmaceutical Business Intelligence and Research Group» (PBIRG) (MS, 2003). Dans le système ATC, les molécules pharmaceutiques sont réparties selon l organe sur lequel elles agissent et/ou leurs caractéristiques thérapeutiques et chimiques. Cette classification comprend 5 niveaux : le premier niveau est le niveau «anatomique» ; le deuxième, le niveau «thérapeutique» ; le troisième, le niveau «thérapeutique/pharmacologique» ; le quatrième, le niveau «chimique/thérapeutique/ pharmacologique» ; le cinquième niveau est celui de la «substance chimique» (AFSSAPS, 2010). Les deux premiers niveaux de ce classement sont présentés Figure 4 (MS, 2009). De la même façon, il existe un classement ATC pour les molécules pharmaceutiques à usage vétérinaire. Le classement ATCvet est basé sur le classement ATC de la médecine humaine mais toute la nomenclature est précédée de la lettre Q. Ainsi, par exemple, dans le classement ATC humain l amoxicilline possède le code J01CA04 et dans le classement ATCvet, le code QJ01CA04. Ces classements sont exhaustifs mais présentent l inconvénient de répertorier plusieurs fois une même molécule selon l organe sur lequel elle agit. Par exemple, la molécule d érythromycine se retrouve en D10AF02 quand elle est administrée sous forme de crème 38

39 Chapitre 1 : Généralités pour le traitement de l acné, en J01FA01 quand elle est administrée comme antibiotique pour traiter des infections pulmonaires et en S01AA17 quand elle est administrée en ophtalmologie. Il serait donc beaucoup trop lourd de passer en revue tout ce classement pour faire l état de l art sur les molécules pharmaceutiques. Dans un souci de simplification, les principales molécules seront donc présentées en fonction des maux ou maladies courantes auxquelles elles se rapportent. A- Voies Digestives et Métabolisme A01 préparations stomatologiques A02 médicaments pour les troubles de l acidité A03 médicaments pour les troubles fonctionnels gastro-intestinaux A04 antiémétiques and antinauséeux A05 thérapie hépatique (bile et foie) A06 laxatives A07 antidiarrhéique, antiinflammatoire intestinal/ agent antiinfectieux A08 préparations antiobésité, à l exclusion des produits diététiques A09 médicaments de la digestion A10 médicaments du diabète A11 vitamines A12 suppléments minéraux A13 toniques A14 anabolisants à usages systémique A15 stimulants de l appétit A16 autres médicaments du système digestif et du métabolisme D- Médicaments dermatologiques D01 antifongiques pour usage dermatologique D02 émollients et protecteurs D03 préparations pour traitement des plaies et ulcères D04 antiprurigineux incluant les anesthésiques D05 médicaments contre le psoriasis D06 antibiotiques et anticancéreux pour usage dermatologique D07 préparations dermatologiques corticoïdes D08 antiseptiques et désinfectants D09 pansements médicamenteux D10 préparations antiacnéiques D11 autres préparations dermatologiques J- Antiinfectieux J01 antibactériens à usage systémique J02 antimycosiques à usage systémique J04 antimycobactériens J05 antiviraux à usage systémique J06 immunsérums et immunoglobulines J07 vaccins B- Sang et organes hématopoïétiques B01 antithrombotiques B02 antihémorragiques B03 préparations antianémiques B05 substituts du sang et solution de perfusion B06 autres agents hématologiques C- Système cardio-vasculaire C01 médicaments en cardiologie C02 antihypertenseurs C03 diurétiques C04 vasodilatateurs périphériques C05 vasculoprotecteurs C07 bétabloquants C08 inhibiteurs calciques C09 médicaments du système rénine-angiotensine C10 hypolipidémiants G- Médicaments du système génito-urinaire et hormones sexuelles G01 antiinfectieux et antiseptiques gynécologiques G02 autres médicaments gynécologiques G03 hormones sexuelles et modulateurs de système génital G04 médicaments urologiques H- Hormones systémiques, hors hormones sexuelles et insulines H01 hormones hypophysaires et analogues H02 corticoïdes à usage systémiques H03 médicaments de la thyroïde H04 hormones pancréatiques H05 médicaments de l équilibre calcique M- Muscles et squelette M01 antiinflammatoires et antirhumatismal M02 produits topiques pour douleurs articulaire et musculaire M03 myorelaxants M04 antigoutteux M05 médicaments des désordres osseux M09 autres médicaments des désordres musculaires et osseux L- Antinéoplasiques et immunomodulateurs L01 antinéoplasiques L02 thérapeutique endocrine L03 immunostimulants L04 immunosuppresseurs P- Produits antiparasitaires, insecticides et répellants P01 antiprotozoaires P02 anthelminthiques P03 antiparasitaires externes, incluant scabicides, insecticides et répellants V- Divers V01 allergènes V03 tous autres médicaments V04 médicaments pour le diagnostic V06 nutriments V07 tous autres produits non-thérapeutiques V08 produits de contrastes V09 diagnostic radiopharmaceutique V10 thérapeutique radiopharmaceutique N- Système nerveux N01 anesthésiques N02 analgésiques N03 antiépileptiques N04 antiparkinsoniens N05 psycholeptiques N06 psychoanaleptiques N07 autres médicaments du système nerveux R- Système respiratoire R01 préparations nasales R02 préparations pour la gorge R03 médicaments des syndromes obstructifs des voies aériennes R05 médicaments rhume et toux R06 antihistaminiques à usage systémique R07 autres médicaments du système respiratoire S- rganes sensoriels S01 médicaments ophtalmologiques S02 médicaments otologiques S03 préparations ophtalmologiques et otologiques Figure 4 : Niveau 1 et 2 du classement ATC humain (MS, 2009). 39

40 Chapitre 1 : Généralités II.1. Douleurs et fièvres Généralement ces deux symptômes sont soignés par les mêmes médicaments. La sensation de douleur est traitée par les antalgiques (ou analgésiques). Ils agissent soit directement sur les centres de la douleur situés dans le cerveau, soit en bloquant la transmission de la douleur au cerveau. Cependant, ils ne soignent pas les causes de la douleur. La fièvre est soignée par les antipyrétiques. Ces médicaments sont utilisés pour abaisser la température du corps. Les antiinflammatoires sont des molécules qui ont à la fois des propriétés antalgiques et antipyrétiques mais qui luttent en plus contre l'inflammation c'est-à-dire la réaction naturelle de défense de l organisme. Ils peuvent être dérivés de la cortisone (anti-inflammatoires stéroïdiens) ou non (anti-inflammatoires non stéroïdiens, AINS). Enfin, les morphiniques sont des molécules apparentées à la morphine. La morphine est une molécule extraite du pavot qui possède des propriétés sédatives et antalgiques puissantes. Le Tableau 1 donne des exemples de molécules pharmaceutiques entrant dans la composition de ces médicaments et résume leurs modes d action. classe thérapeutique exemple de molécules Tableau 1 : Mode d action des principaux antalgiques. exemple de médicament mode d action (http://www.biam2.org, 07/10/10 ; dictionnaire Vidal, 2006 ; 07/10/10) analgésique paracétamol Doliprane baisse le taux des prostaglandines dans l hypothalamus anti-inflammatoire non stéroïdien (AINS) anti-inflammatoire stéroïdien (corticoïde) morphinique mineur morphinique majeur aspirine (acide acétylsalicylique) ibuprofène Aspégic Aspro Advil inhibe les enzymes cyclooxygénases (CX) impliquées dans la synthèse des prostaglandines prednisolone Solupred inhibe le recrutement des globules blancs vers le site de l'inflammation inhibe l expression du complexe majeur d'histocompatibilité de type II et l expression des cyclooxygénases de type 2 prévenant ainsi la production de prostaglandines, inhibe l'activité de la phospholipase A2, inhibe la sécrétion des cytokines par les lymphocytes T, inhibe la prolifération des lymphocytes B et des cytokines impliquées dans la synthèse des immunoglobulines codéine Codenfan agoniste des récepteurs morphiniques μ morphine Actiskenan bloque les synapses dans le cheminement central de la douleur, agoniste des récepteurs morphiniques μ, δ et κ II.2. Troubles respiratoires Les quintes de toux et l essoufflement sont les deux symptômes majeurs des troubles respiratoires. Ils proviennent de l inflammation (ex. : asthme, bronchite, pneumonie, bronchopneumopathie chronique obstructive (BPC)), l encombrement ou la destruction des bronches (ex. : mucoviscidose) ou du rétrécissement des voies aériennes (ex. : asthme, BPC). Suivant le type de toux, sèche ou grasse, les médicaments utilisés ne sont pas les mêmes. Ainsi, en cas de toux sèche ou irritative, des antitussifs seront recommandés. Ils agissent directement sur le centre de commande cérébrale provoquant le réflexe de toux. n distingue les antitussifs opiacés qui peuvent contenir de la codéine par exemple, des antitussifs antihistaminiques comme l oxomémazine contenu dans Toplexil par exemple. Les toux 40

41 Chapitre 1 : Généralités grasses sont dues à une accumulation, dans les poumons, de mucus qu il faut éliminer. Dans ces cas là, des fluidifiants bronchiques sont administrés. Les molécules les plus connues de cette classe sont l acétylcystéine (Exomuc ) et la carbocistéine (Bronchokod ). Elles agissent sur la structure des sécrétions en rompant les ponts disulfures des glycoprotéines (dictionnaire Vidal, 2006). L asthme est une maladie inflammatoire chronique des bronches. Elle est la conséquence de l action d un agent irritant sur les bronchioles : elles se contractent tout en secrétant du mucus de manière importante. Les antiasthmatiques visent à réduire cette réaction, en limitant la réaction inflammatoire (corticoïdes) ou en provoquant la dilatation des bronches pour faciliter le passage de l air (anticholinergiques, agonistes sélectifs -2 adrénergique ). Le bronchodilatateur le plus connu est la Ventoline dont le principe actif est le salbutamol. Après inhalation, le salbutamol exerce une action stimulante sur les récepteurs -2 du muscle lisse bronchique, entraînant ainsi une bronchodilatation rapide (dictionnaire Vidal, 2006). II.3. Troubles gastriques Les troubles gastriques sont de nature très diverse ; par conséquent les médicaments de ce groupe ont des propriétés et des modes d actions également très différents. Tableau 2 : Les principales classes thérapeutiques agissant dans les troubles gastriques et leurs modes d action. classe thérapeutique antispasmodique musculotrope exemple de molécules phloroglucinol alvérine exemple de médicament Spasfon Meteospasmyl mode d action (http://www.biam2.org, 07/10/10 ; dictionnaire VIDAL, 2006) agit directement sur la fibre lisse et se comporte comme un antagoniste du calcium au niveau de la membrane cellulaire, élève le 3'5'AMP par inhibition de la phosphodiestérase pansement gastrique diméticone Pepsane forme une pellicule protégeant la muqueuse gastrique (produit neutre, actif par ses propriétés physiques) antiacide pantoprazole Eupantol pro drogue qui, après activation en milieu acide dans les cellules pariétales de la muqueuse gastrique, inhibe sélectivement et de manière irréversible la pompe ATPasique proton/potassium et s'oppose au transport du proton vers la lumière gastrique anti-ulcéreux famotidine Pepdine antagoniste compétitif de l'histamine sur les récepteurs H2, réduit le volume de la sécrétion gastrique ainsi que la production d'acide et de pepsine antiémétiques métopimazine Vogalene agit spécifiquement au niveau des récepteurs de la Trigger Zone (centre du vomissement), activité antidopaminergique élective laxatif osmotique macrogol Forlax entraîne un accroissement du volume des liquides intestinaux laxatif lubrifiant paraffine Lansoyl agit par action mécanique en lubrifiant le contenu colique antidiarrhéique lopéramide Imodium stimule l'absorption d'eau et d'électrolytes, diminue la sécrétion des fluides et des électrolytes vers la lumière intestinale, ralentit le transit (fixation sur les récepteurs morphiniques cérébraux et sur les entérocytes intestinaux) Les médicaments des troubles gastriques sont : - les antispasmodiques qui luttent contre les spasmes en empêchant la contraction de fibres musculaires présentes dans la paroi de l'intestin ou des voies urinaires ; - les antiacides qui neutralisent l'acidité des sécrétions gastriques ou qui bloquent les glandes responsables de la sécrétion d'acide ; 41

42 Chapitre 1 : Généralités - les antiulcéreux qui peuvent être des antihistaminiques de type H2. Ces antihistaminiques s opposent aux effets de l histamine qui est, entre autre, impliquée dans la sécrétion du suc gastrique ; - les antiémétiques qui luttent contre les vomissements ; - les laxatifs qui facilitent le transit et l'élimination des selles ; - les antidiarrhéiques qui regroupent les anti-sécrétoires et les ralentisseurs du transit. Le Tableau 2 donne des exemples de molécules pharmaceutiques entrant dans la composition de ces médicaments et résume leurs modes d action. II.4. Troubles / contrôles hormonaux Ce groupe comprend les hormones administrées pour compenser les déficits naturels, lors du traitement de la ménopause ou de l hypothyroïdie par exemple, et les hormones synthétiques administrées pour leurs effets contraceptifs. Quelques exemples sont donnés dans le Tableau 3. classe thérapeutique hormone sexuelle contraceptive de synthèse Tableau 3 : Exemples de médicaments impliqués dans les contrôles hormonaux. exemple de molécules exemple de médicament éthinylestradiol Jasminelle mode d action (dictionnaire Vidal, 2006) inhibe l'ovulation et modifie l'endomètre hormone thyroïdienne lévothyroxine Levothyrox augmente essentiellement la consommation tissulaire d'oxygène, le métabolisme de base, le rythme cardiaque hormone sexuelle naturelle 17 estradiol romone remplace l'arrêt de production des estrogènes chez les femmes ménopausées, soulage les symptômes de la ménopause et prévient l ostéoporose II.5. Les médicaments de l impuissance Ce sont les inhibiteurs de la phosphodiestérase de type 5 (inhibiteurs PDE 5) comme le sildénafil citrate, le vardénafil et le tadalafil contenu respectivement dans le Viagra, le Levitra et le Cialis (Nieto et al., 2010a). En inhibant sélectivement la phosphodiestérase de type 5 responsable de la dégradation de la guanosine monophosphate cyclique (GMPc) au niveau des corps caverneux, le sildénafil entraîne une augmentation des concentrations de GMPc ce qui induit un relâchement des muscles lisses du corps caverneux et favorise l afflux sanguin (dictionnaire Vidal, 2006). Le sildénafil peut également être prescrit pour des problèmes d hypertension artérielle pulmonaire (Revatio ). II.6. Troubles du comportement et de l humeur Ce groupe comprend les antidépresseurs, les anxiolytiques, les antipsychotiques, les anticonvulsivants et les antiparkinsoniens. Les antidépresseurs agissent contre la dépression mais aussi contre les troubles obsessionnels compulsifs. Ils sont divisés en 3 familles en fonction de leurs modes d'action et de leurs effets indésirables : les antidépresseurs tricycliques dérivés de l imipramine, les inhibiteurs de la recapture de la sérotonine (IRS) et de la recapture de la sérotonine et de la noradrénaline 42

43 Chapitre 1 : Généralités (IRSNA) et les inhibiteurs de la monoamine-oxydase (IMA, sélectifs ou non sélectifs). Les anxiolytiques luttent contre le stress et les angoisses. Les antipsychotiques traitent les délires et les hallucinations. Les anticonvulsivants sont utilisés pour traiter les différentes formes d'épilepsie. Ils sont classés en barbituriques (phénobarbital) et non barbituriques (http:// 07/10/10). Enfin, les antiparkinsoniens sont destinés à lutter contre les symptômes de la maladie de Parkinson. Les plus utilisés des antiparkinsoniens stimulent ou remplacent l'action de la dopamine sur les centres dopaminergiques du cerveau et d autres empêchent sa dégradation par la catéchol-ométhyltransférase (CMT) et la monoamine oxydase (MA), ce sont les inhibiteurs de la CMT (ICMT) ou de la MA (http://www.eurekasante.fr/maladies/systeme-nerveux /maladie-parkinson.html?pb=traitement, 22/11/10). Le Tableau 4 donne des exemples de médicaments agissant sur les troubles du comportement et de l humeur. Il résume aussi leurs modes d action. Tableau 4 : Les principales classes thérapeutiques agissant dans les troubles du comportement et de l humeur et leurs modes d action. classe thérapeutique antidépresseur tricyclique exemple de molécules imipramine amitriptyline exemple de médicament Tofranil Laroxil mode d action (http://www.biam2.org, 07/10/10) s'oppose au recaptage de la noradrénaline au niveau de la membrane axonale, inhibe le recaptage de la sérotonine dans le cerveau surtout au niveau de l'hypothalamus et empêche l'action des hydroxylases des microsomes hépatiques sur les barbituriques (éphédrine et amphétamine) antidépresseur IRS fluoxétine Prozac facilite la transmission sérotoninergique en inhibant la recapture de la sérotonine antidépresseur IRSNA venlafaxine Effexor inhibe de la recapture de la sérotonine et de la noradrénaline antidépresseur IMA sélectif antidépresseur IMA non sélectif moclobémide Moclamine inhibe préférentiellement et de façon réversible la monoamine oxydase de type A iproniazide Marsilid inhibe la dégradation des monoamines cérébrales : indolamines (tryptamine et sérotonine) et catécholamines (dopamine, noradrénaline, adrénaline) anxiolytique bromazépam Lexomil agoniste du récepteur aux benzodiazépines ce qui favorise l'action du récepteur GABA et augmente la fréquence d'ouverture du canal chlore antipsychotique ripéridone Risperdal antagoniste dopaminergique D2 et puissante activité antagoniste 5-HT2 anticonvulsivant carbamazépine Tégrétol antagoniste des récepteurs centraux à l'adénosine, s'oppose à l'augmentation des taux d'amp cyclique, bloque les canaux sodiques voltage-dépendants antiparkinsonien lévodopa Sinemet précurseur de la dopamine qui franchit la barrière hématoencéphalique et provoque une élévation de la dopamine cérébrale antiparkinsonien apomorphine Apokinon agoniste dopaminergique stimulant les récepteurs D1 et D2 antiparkinsonien tolcapone Tasmar inhibe la catéchol--méthyltransférase responsable de la dégradation de la dopamine II.7. Troubles cardiaques Les troubles cardiaques peuvent être liés à des problèmes de fonctionnement du cœur luimême ou peuvent résulter de problèmes circulatoires. Les hypolipémiants (ou 43

44 Chapitre 1 : Généralités hypolipidémiants), les antiarythmiques, les anticoagulants et les -bloquants sont regroupés dans cette catégorie. Les hypolipémiants aident à lutter contre le cholestérol. L'excès de cholestérol est un facteur de risque pour certaines maladies du cœur et des vaisseaux. Il provoque une perte d élasticité des artères et réduit leur diamètre (http://www.eurekasante.fr/maladies/coeur-circulationveines/ cholesterol.html, 07/10/10). Il existe plusieurs familles d hypolipémiants qui sont illustrées dans le Tableau 5. classe thérapeutique Tableau 5 : Exemples d'hypolipémiants et leurs modes d'action. exemple de molécules exemple de médicament mode d action (dictionnaire Vidal, 2006) les statines atorvastatine Tahor inhibe de façon sélective et compétitive l'hmg-coa réductase, l'enzyme responsable du contrôle du taux de biotransformation de la 3- hydroxy-3-méthyl-glutaryl-coenzyme A en mévalonate, précurseur des stérols et en particulier du cholestérol les fibrates fénofibrate Fegenor réduction de la cholestérolémie due à l'abaissement des fractions athérogènes de faible densité (VLDL et LDL). Elle améliore la répartition du cholestérol plasmatique en réduisant le rapport cholestérol total/cholestérol HDL, accru au cours des hyperlipidémies athérogènes colestyramine colestyramine Questran résine basique synthétique échangeuse d ions qui fixe les acides biliaires sous forme d un complexe insoluble, inhibant ainsi leur cycle entérohépatique et augmentant leur élimination fécale ézétimibe ézétimibe Ezetrol inhibe de façon sélective l'absorption intestinale du cholestérol et des phytostérols apparentés acide nicotinique oméga 3 acide nicotinique triglycérides d'acide oméga 3 Niaspan LP Ysomega inhibe la libération des acides gras libres à partir des tissus adipeux ce qui entraîne une diminution de l apport d acides gras libres au niveau du foie. L acide nicotinique diminue le taux de synthèse hépatique du VLDL cholestérol et donc du LDL cholestérol. baisse le taux de triglycérides dans le sang Les anticoagulants empêchent le sang de coaguler et préviennent ainsi la formation de caillots dans les vaisseaux sanguins. Ils sont utilisés pour traiter ou prévenir les phlébites, les embolies pulmonaires et certains infarctus. Ils permettent également d'empêcher la formation de caillots dans le cœur lors de troubles du rythme comme la fibrillation auriculaire. Il existe deux grands types d'anticoagulants (Tableau 6) : les anticoagulants oraux qui bloquent l'action de la vitamine K et les anticoagulants injectables qui sont dérivés de l'héparine (http://www.eurekasante.fr/lexique-medical/a.html, 07/10/10). classe thérapeutique Tableau 6 : Exemples d'anticoagulants et leurs modes d'action. exemple de molécules exemple de médicament mode d action (http://www.eurekasante.fr/recherche.html?q=anticoagulant&x=0&y=0) anti-vitamine K acénocoumarol Sintrom inhibe la synthèse par le foie des facteurs de la coagulation en se substituant à la vitamine K anticoagulant oraux rivaroxaban Xarelto inhibe de façon sélective le facteur Xa, une enzyme spécifique de la coagulation anticoagulant injectable daltéparine Fragmine héparine de bas poids moléculaire caractérisée par une activité anti-xa 44

45 Chapitre 1 : Généralités Les antiarythmiques sont indiqués dans les troubles du rythme cardiaque. Le Rythmodan par exemple, qui contient du disopyramide, est un inhibiteur des canaux sodiques à effet stabilisant de membrane. Il modifie la vitesse de transmission de l'influx nerveux au sein du muscle cardiaque (dictionnaire Vidal, 2006). Enfin, les -bloquants sont des molécules qui bloquent l action stimulante de molécules naturellement présentes dans le corps comme les catécholamines (ex. : l adrénaline ou la noradrénaline). Ces molécules stimulent l appareil cardiovasculaire, la respiration et le métabolisme. En bloquant leur action, les -bloquants peuvent traiter l hypertension, la tachycardie, l insuffisance cardiaque chronique ainsi que la migraine et le glaucome (sous forme de collyre) (http://www.cite-sciences.fr/lexique/definition1.php?definition=2&idmot =395&iddef=876&idmedia=&page=&rech_lettre=b&num_page=4&recho=&radiob=&resulta t=&habillage=standard&lang=fr&id_expo=25&id_habillage=42, 24/11/2006). Les - bloquants agissent par inhibition compétitive. Ils entrent en compétition avec des molécules naturellement présentes dans le corps pour occuper à leur place leur site d action à savoir les récepteurs du système adrénergique mais la fixation des -bloquants n entraîne pas de réponse de la part du récepteur (Huggett et al., 2003). Ces molécules se distinguent selon le type de récepteurs sur lesquels elles se fixent: les récepteurs 1 qui prédominent dans les tissus cardiaques et le rein ou les récepteurs 2 situés dans les vaisseaux et les bronches. Les principaux -bloquants sont l acébutolol, l aténolol, le bétaxolol, le bisoprolol, le métoprolol le nadolol, l oxprénolol, le pindolol, le propranolol et le timolol. Parmi eux, certains sont spécifiques des récepteurs 1 (acébutolol, aténolol, bisoprolol, métoprolol) alors que d autres sont non sélectifs (nadolol, oxprénolol, pindolol, propranolol, timolol) (Huggett et al., 2003 ; dictionnaire Vidal, 2006). II.8. Infections bactériennes Ce sont les antibiotiques qui permettent de traiter les infections bactériennes. Découverte en 1928 par Alexander Fleming, la pénicilline a été le premier antibiotique introduit en thérapeutique en 1941 (InVS, 2004) ; depuis, de nombreuses autres molécules ont été découvertes et sont utilisées comme médicaments. Les antibiotiques sont des molécules chimiques produites soit de façon naturelle par des micro-organismes (bactéries ou champignons), soit de façon synthétique (obtenues soit à partir de dérivés artificiels, soit en recréant des molécules primitivement extraites de micro-organismes), soit de façon semisynthétique (obtenues en modifiant en laboratoire une substance produite par un microorganisme) (http://crdp.ac-clermont.fr/etabliss/bpambert/eleves/medicaments/antibiotiques.htm, 19/10/06). Ces molécules agissent à très petites doses en empêchant la croissance d'autres micro-organismes (bactériostatiques) ou en les détruisant (bactéricides). Leur action est spécifique car elles dérèglent le métabolisme de certains micro-organismes sans affecter les cellules humaines ou animales (http://agora.qc.ca/mot.nsf/ Dossiers/Antibiotique, 19/10/06). Les modes d action de ces molécules sont variés (Tableau 7) ; certaines inhibent la synthèse de la paroi bactérienne (ex. : les -lactames) ; d autres agissent au niveau de la membrane plasmique (ex. : les polymyxines) ; d autres encore inhibent la synthèse protéique (ex. : les macrolides, les phénicolés, les aminosides ou les tétracyclines) ; certaines empêchent le métabolisme des acides nucléiques (ex. : les quinolones et fluoroquinolones ou les sulfonamides et les diaminopyridines) ; et d autres enfin agissent par inhibition compétitive 45

46 Chapitre 1 : Généralités comme antimétabolites (ex. : sulfonamides) (http://www.123bio.net/cours/antibio/modedac tion.html, 05/10/06). famille d antibiotique Tableau 7 : Modes d action des différentes familles d'antibiotiques. exemple de molécules exemple de médicament mode d action (http://www.123bionet/cours/antibio/index.html, 05/10/06 ; 05/10/06 ; Beutin et al., 1981) tétracyclines doxycycline toléxine inhibent la synthèse protéique en empêchant la liaison de l'aminoacyl- ARNt à la sous unité 30S du ribosome bactérien phénicolés (ou amphénicols) chloramphénicol thiamphénicol pénicillines amoxicilline Augmentin Clamoxyl inhibent la synthèse protéique en empêchant l'élongation de la chaîne peptidique suite à leur fixation sur la sous unité 50S du ribosome bactérien inhibent la synthèse de la paroi bactérienne suite à leur liaison avec les protéines penicillin-binding et surtout à l'inhibition de l'activité des trans-peptidases impliquées dans la synthèse de la paroi céphalosporines cefpodoxime relox inhibent la synthèse de la paroi bactérienne sulfonamides (ou sulfamides) et triméthoprime macrolides et lincosamides aminosides (ou aminoglycosides) quinolones et fluoroquinolones sulfaméthoxazole triméthoprime Bactrim anti-métabolite, inhibent la synthèse de l'acide tétrahydrofolique, cofacteur de la synthèse des bases puriques et pyrimidiques roxithromycine Rulid inhibent la synthèse protéique en empêchant l'élongation de la chaîne peptidique suite à leur fixation sur la sous unité 50S du ribosome bactérien streptomycine ofloxacine norfloxacine flocet Noroxine inhibent la synthèse protéique suite à leur fixation sur la sous unité 30S du ribosome bactérien empêchent le métabolisme des acides nucléiques agissent sur la topoisomérase IV et sur l'adn-gyrase bactérienne glycopeptides vancomycine inhibent la synthèse de la paroi bactérienne imidazoles métronidazole Birodogyl fonctionnent que chez les bactéries anaérobies en piégeant les électrons au dépendent de d'autres composants de la chaîne de transfert d'électron (NAD, NADP) nitrofuranes polyéthers (ou ionophores) furazolidone nitrofurazone monensine salinomycine quinolaxines olaquindox inhibent la synthèse de l'adn inhibent des enzymes impliquées dans la dégradation du glucose et du pyruvate, agissent au niveau du rein (antagonistes des fluoroquinolones) influencent le transport des ions au travers des membranes cellulaires, inhibent le développement des bactéries gram + et stimule la croissance II.9. Cancers Egalement appelés antinéoplasiques ou anti-tumoraux, les anticancéreux sont des molécules cytotoxiques qui ont pour objectif de détruire de façon sélective les cellules malignes issues de la tumeur d origine. Deux problèmes se posent en raison de leur sélectivité et de leur cytotoxicité. Les anticancéreux agissent sur la reproduction et la division cellulaire mais ils peuvent interagir avec toutes les cellules de l organisme (http://www.caducee.net/dossier Specialises/cancérologie/agentsanticancereux.asp#definition, 24/11/06). Si le point commun entre tous les anticancéreux est leur cytotoxicité, en revanche, leurs mécanismes d action sont très variés (Tableau 8). Certains modifient la structure de l ADN comme les agents intercalants (ex. : les anthracyclines telles que l épirubicine ou la daunorubicine), les agents alkylants (ex. : le busulfan ou les moutardes azotées comme l ifosfamide, le cyclophosphamide ou le chlorambucil) ou la bléomycine qui casse les brins d ADN. D autres 46

47 Chapitre 1 : Généralités inhibent la synthèse de l ADN en empêchant la synthèse des bases puriques et pyrimidiques (ex. : les antagonistes des folates comme le méthotréxate ou les antimétabolites tels que le 5- fluorouracile ou la 6-mercaptopurine). D autres empêchent la re-ligature des brins d ADN provoquant ainsi leur coupure définitive, ce qui amène à l apoptose de la cellule comme les anti-topoisomérases (ex. : le topotécan ou l étoposide). Les sels de platines, comme le cisplatine ou la carboplatine, inhibent la réplication de l ADN. D autres encore ont une action sur la formation du fuseau mitotique comme la vincristine, la vinblastine ou le paclitaxel. Enfin, l asparaginase prive les cellules leucémiques d asparagine, nutriment indispensable et le tamoxifen est un anti-œstrogène, prescrit pour lutter contre le cancer du sein notamment, et qui agit par inhibition compétitive sur les récepteurs à œstrogènes (http://www.baclesse.fr /cours/fondamentale/c15-chimiothérapie/chimio-8.htm, 09/10/06; 24/11/06). Tableau 8 : Modes d action des différentes classes anticancéreux. classes d anticancéreux exemple de molécules mode d action (dictionnaire Vidal, 2006) antagonistes des folates anti-métabolites agents alkylants agents alkylants, moutardes azotées sels de platine anthracyclines (antibiotiques) anti-topoisomérases méthotréxate 5-fluorouracile cytarabine 6-mercaptopurine mitomycine C, busulfan, ifosfamide, melphalan, chlorambucil cisplatine, carboplatine doxorubicine (ou adriamycine), daunorubicine irinotécan, topotécan ténoposide, étoposide inhibe la synthèse de l ADN en inhibant de façon compétitive l'enzyme dihydrofolate réductase bloque la méthylation de l uracile en thymine en se liant à la thymidilate synthétase ce qui empêche la synthèse de l'adn, entraîne des erreurs de traduction lors de la synthèse des protéines en étant incorporé à la place de l uracile dans les ARNs inhibent la synthèse de l'adn analogue des purines, bloque la formation d'adénosine et de guanine agissent au niveau de l'adn, empêchent la séparation et la réplication de l ADN grâce à leurs groupements alkylés qui permettent d établir des liaisons covalentes stables entre les groupements nucléophiles des 2 brins de l ADN inhibent la séparation et la réplication de l'adn en se fixant dessus et en produisant des liaisons alkyles responsables de la formation de ponts entre les 2 brins d ADN agent intercalant, s'insèrent entre les 2 brins de l'adn, provoquant des changements de structure de l ADN et empêchant la progression des ADN et ARN polymérases ce qui bloque la synthèse d ADN et d ARN anti-topoisomérase I, inhibent l ADN topo-isomérase I ce qui induit des lésions simple brin de l ADN qui bloquent la fourche de réplication anti-topoisomérase II, inhibent l entrée en mitose des cellules tumorales en inhibant l ADN topo-isomérase II chargée de ressouder les brins d ADN après leur cassure anti-hormones tamoxifen antiœstrogène, inhibition compétitive des récepteurs de l estradiol autres anticancéreux paclitaxel, docétaxel, vincristine, vinblastine, bléomycine asparaginase agissent au niveau des microtubules, désorganisent le réseau intracellulaire de microtubules qui est essentiel aux fonctions vitales de l interphase et de la mitose casse un des 2 brins de l'adn enzyme hydrolysant l asparagine, constituant de base de la substance protéique cellulaire. Les cellules leucémiques ne peuvent produire elles-mêmes cet acide aminé, elles doivent utiliser l asparagine extracellulaire or celle-ci est détruite par l asparaginase. La carence en asparagine provoque la destruction des cellules incapables d en faire une synthèse endogène 47

48 Chapitre 1 : Généralités II.10. Infections virales La grippe hivernale et la gastro-entérite sont deux des infections virales les plus courantes. Dans ces deux cas ce sont essentiellement les symptômes qui sont soignés. La grippe, l herpès ou le VIH (Virus Immunodéficience Humaine) sont dus aux rétrovirus. Les rétrovirus sont des virus dont le génome est formé d ARN (Acide RiboNucléique) et qui possèdent une enzyme, la transcriptase inverse, permettant la transcription de cet ARN viral en ADN (Acide DésoxyriboNucléique) proviral alors capable de s intégrer au génome de la cellule hôte grâce à l action d une autre enzyme, l intégrase (http://www.chups.jussieu.fr/polys/pharmaco /poly/antiretroviraux.html, 27/03 /08). Ces virus ont donc besoin d infecter une cellule afin de se servir de la machinerie cellulaire pour se multiplier. Les antirétroviraux agissent à différents niveaux du cycle de réplication du virus. Dans le cas de la grippe A (H1N1) par exemple, l oseltamivir (Tamiflu ) ou le zanamivir (Relenza ) inhibent de façon sélective les neuraminidases du virus. Les neuraminidases sont impliquées dans la pénétration du virus dans les cellules et dans la libération des particules virales nouvellement formées. Dans le cas d herpes, l'acyclovir (Activir ou Zovirax ) après avoir été phosphorylé en acyclovir triphosphate inhibe la synthèse de l'adn viral par inhibition compétitive sélective avec l'adn polymérase virale (dictionnaire Vidal, 2006). Les antirétroviraux impliqués dans le traitement du VIH sont répartis en 3 groupes principaux en fonction de leur mode d action. Ainsi on distingue les inhibiteurs de fusion, les inhibiteurs de protéases et les inhibiteurs de la transcriptase inverse (TI) catégorisés en 3 sous-groupes : les inhibiteurs nucléosidiques, les inhibiteurs non nucléosidiques et les inhibiteurs nucléotidiques. Les molécules du premier groupe empêchent la particule virale de se lier à sa future cellule hôte (ex. : l enfuvirtide, 27/03/08). Celles du second agissent sur les protéases qui sont les enzymes responsables du clivage d une macro-protéine primaire inactive, fabriquée par la cellule suite à l intégration du génome viral au sien, en protéines virales actives plus petites. Ces dernières interviennent dans la formation de nouvelles particules virales (http://www.aidsmap.com/fr/docs/4 6CBB628-1F B5EC-C13096FB620A.asp#522dee de3-a244-b6afde43e8c3, 26/02/08). L indinavir, le ritonavir, le nelfinavir ou encore le saquinavir appartiennent à ce groupe des inhibiteurs de protéase. Enfin, les inhibiteurs de la TI agissent au niveau de l enzyme transcriptase inverse, qui intervient dans la transformation de l ARN viral en ADN. Sans cette étape, la multiplication virale n est plus possible. L efavirenz et la névirapine sont des inhibiteurs non nucléosidiques de la TI alors que l abacavir, la lamivudine ou la zidovudine sont des inhibiteurs nucléosidiques de la TI (http://www.fda.gov/oashi/aids/ virals.html, 27/03/08). Dans le traitement du VIH ces médicaments sont souvent associés par 2 ou 3 (trithérapie). II.11. Traitements vétérinaires Il existe 6 classes majeures de médicaments vétérinaires auxquels se rajoutent les vaccins. Il s agit des antiparasitaires, des anti-inflammatoires, des antibiotiques, des hormones, des vitamines et des anesthésiques (http://www.simv.org/publications/guide-medicament/sommaire.htm, 28/04/2011). Les antiparasitaires se partagent entre les antiparasitaires externes et les antiparasitaires internes. Certains antiparasitaires, les endectocides, agissent à la fois sur les parasites internes 48

49 Chapitre 1 : Généralités et sur les parasites externes. Les antiparasitaires externes sont utilisés dans les traitements préventifs et curatifs des infestations par les puces, les tiques, la gale et les poux. Bien qu administré comme médicaments, la majorité des molécules de cette sous-classe appartiennent au groupe chimique des pesticides tels que les organophosphorés ou les phénylpyrazoles. Les antiparasitaires internes agissent sur les vers comme les strongles pulmonaires et digestifs ou les douves et les coccidies. Les strongylicides se divisent en 3 groupes : i) les benzimidazoles tels que le fenbendazole ou l oxibendazole ; ii) le lévimazole ; et iii) les macrolides antiparasitaires comme l ivermectine ou la doramectine qui peuvent également agir sur les parasites externes. Certains antibiotiques de la famille des sulfonamides sont administrés comme anticoccidiens. Des exemples de molécules et leurs modes d actions sont répertoriés dans le Tableau 9. sous-classe d antiparasitaires (famille) externes phénylpyrazole endectocides avermectines internes strongylcides benzimidazole internes strongylcides imidazothiazoles internes douvicides salicylanilides internes anticoccidiens Tableau 9 : Exemple d'antiparasitaires vétérinaires et leurs modes d'actions. exemple de molécules exemple de médicament animaux traités fipronil Frontline chiens, chats mode d action (http://www.anmv.afssa.fr/, 28/04/11) inhibe le complexe GABA en se fixant dans le canal chlore, bloquant ainsi le transfert des ions chlore ce qui provoque une activité incontrôlée du système nerveux central et la mort des insectes et des acariens ivermectine Cevamec porcins se lie de manière sélective au récepteur du glutamate des canaux à chlorures de la membrane des cellules nerveuses et musculaires des invertébrés parasites provoquant un blocage des canaux à chlorures en position ouverte et donc un flux entrant d'ions chlorures au sein de ces cellules. L'augmentation de la perméabilité de la membrane cellulaire aux ions chlorure et l'hyperpolarisation de la cellule musculaire ou nerveuse qui en résultent conduisent à la paralysie et à la mort des parasites ciblés. oxibendazole Pig Helm porcins inhibe la polymérisation de la tubuline en microtubules. La destruction du réseau microtubulaire conduit souvent à la désagrégation et à la mort cellulaire. Il possède une action ovicide, larvicide et adulticide. levamisole oxyclozanide Zanil Anthelminticide porcins, 15 % bovins, ovins, volailles suspension décoquinate Rumicox bovins, ovins veaux et agneaux sevrés agit au niveau des ganglions nerveux du nématode en se fixant sur les récepteurs de l'acétylcholine entrainant alors une paralysie à l'origine de la mort du parasite perturbe le métabolisme énergétique du parasite en découplant la phosphorylation oxydative mitochondriale + permet le passage de protons à travers les membranes, en particulier de la membrane mitochondriale interne. perturbe le transport des électrons dans le système mitochondrial Comme en médecine humaine, les anti-inflammatoires se répartissent entre les antiinflammatoires stéroïdiens (AIS) et non-stéroïdiens (AINS) selon qu ils sont dérivés de la cortisone ou non. Les AIS sont utilisés pour traiter les inflammations aiguës de l appareil locomoteur (ex. : arthrites), les états inflammatoires ostéoarticulaires, allergiques ou consécutifs à un choc. Les AINS sont employés pour traiter les inflammations et les douleurs musculaires ou squelettiques et réduire la fièvre. Des exemples d anti-inflammatoires et leurs modes d action ainsi que les animaux auxquels ils sont administrés sont présentés dans le Tableau

50 Chapitre 1 : Généralités exemple de molécules Tableau 10 : Exemple d anti-inflammatoires vétérinaires et leurs modes d action. exemple de médicament animaux traités déxaméthasone Dexasone équins, bovins, chiens, chats, caprins, porcins, prédnisolone acide acétylsalicylique mode d action (http://www.anmv.afssa.fr/, 28/04/11) diminue la réponse immunitaire en inhibant la dilatation des capillaires, la migration des leucocytes et la phagocytose Megasolone 5 chiens, chats inhibe la phospholipase A2, provoquant une diminution de la synthèse d'acide arachidonique, précurseur de nombreux métabolites proinflammatoires ; induit la synthèse de lipocortines qui possèdent une activité anti-phospholipase et empêchent la libération d'enzymes hors du sac lysosomial ; diminue la production d'anticorps et inhibe plusieurs facteurs du complément ; inhibe la libération d'histamine par les mastocytes Aspirine 50 Coophavet veaux, agneaux, chevreaux, porcins, chevaux, volailles inhibe de façon irréversible les enzymes cyclooxygénases impliquées dans la synthèse des prostaglandines ; inhibe l'agrégation plaquettaire en bloquant la synthèse plaquettaire du thromboxane A2 flunixine Meflosyl équins, bovins, porcins inhibe de façon réversible et non sélective les cyclooxygénases impliquée dans la synthèse des prostaglandines, prostacyclines et tromboxanes Les antibiotiques se répartissent en différentes familles telles que les pénicillines et céphalosporines, les macrolides et lincosamides, les quinolones et fluoroquinolones, les tétracyclines, les sulfonamides, les aminosides, les polypeptides, les polyéthers et les phénicolés. Ils sont administrés pour traiter les infections bactériennes de l appareil respiratoire, digestif et uro-génital, les panaris interdigités, les mammites, les métrites, les plaies infectées et les infections post-opératoires. Ils peuvent être utilisés en curatif et / ou en préventif en milieux infectés dans les élevages. Un exemple de molécule antibiotique par famille et son mode d action est récapitulé dans le Tableau 11. Les hormones comme l alfaprostol (Alfabédyl ) ou le cloprosténol (Planate ) sont des analogues de synthèse de la prostaglandine F2. Elles sont administrés pour contrôler la reproduction soient en permettant la synchronisation de l œstrus soit en permettant l induction et la synchronisation de la parturition. Dans les autres classes, les vitamines sont administrées pour prévenir les carences et les anesthésiques, en agissant sur le système nerveux central, induisent et entretiennent l anesthésie générale. Au sein de ces 6 classes, certaines molécules sont spécifiquement administrées aux animaux alors que d autres sont communes avec celles administrées aux humains. Par exemple, l amoxicilline, un antibiotique de la famille des pénicillines, est utilisé aussi bien en médecine humaine que vétérinaire alors que la marbofloxacine, un antibiotique de la famille des fluoroquinolones, n est administrée qu en médecine vétérinaire. D autres molécules encore sont utilisées en médecine humaine et vétérinaire mais sous formes différentes. Par exemple, l oxytétracycline est utilisée sous forme de pommade chez les humains alors qu elle est utilisée sous forme injectable ou de poudre pour suspension buvable chez les animaux. 50

51 Chapitre 1 : Généralités famille d'antibiotiques Tableau 11 : Modes d action des antibiotiques administrés en médecine vétérinaire. exemple de molécules exemple de médicament animaux traités pénicillines amoxicilline Clamoxyl la bovins, porcins, ovins, caprins, chiens, chats céphalosporines ceftiofur Cevaxel bovins, porcins macrolides tylosine Tylan 200 bovins adultes, veaux, caprins, ovins, porcins lincosamides lincomycine lincocine intramammaire vaches laitières fluoroquinolones enrofloxacine Chanenro bovins, porcins, chiens, chats mode d action (http://www.anmv.afssa.fr/, 28/04/11) empêche la formation de la paroi bactérienne en inhibant l'activité des transpeptidases qui catalysent la polymérisation des unités glycopeptides, constituants de la paroi bactérienne inhibe la synthèse de la paroi des cellules bactériennes inhibe la synthèse des protéines par fixation à fraction 50S des ribosomes inhibe la synthèse des protéines par fixation à la sousunité 50 S du ribosome bactérien inhibe l'adngyrase bactérienne empêchant ainsi la soudure de la double hélice d ADN ce qui provoque une dégradation irréversible de l'adn chromosomique ; altère la perméabilité de la membrane externe phospholipidique de la paroi cellulaire quinolones acide oxolinique Inoxyl salmonidés inhibe l'adngyrase bactérienne tétracyclines oxytétracycline Acti-tetra B veaux, porcins, agneaux, chevreaux, lapins, volailles sulfonamides sulfadiméthoxine Methox 23,2 veaux, agneaux, chevreaux, volailles, lapins inhibe la synthèse protéique en se liant de façon réversible aux récepteurs de la fraction ribosomale 30S, ceci conduisant à un blocage de la liaison de l'aminoacyl-arnt au site correspondant du complexe ribosome-arn messager inhibe la multiplication cellulaire par inhibition compétitive de la synthèse de l'acide dihydrofolique à partir de l'acide p-aminobenzoïque bloquant ainsi les réactions nécessaires à la synthèse des purines, de la thymine et l'initiation de la synthèse protéique au niveau des ribosomes polypeptides colistine Cofalac veaux désorganise la membrane cytoplasmique des bactéries, conduisant à une altération de la perméabilité cellulaire et à une perte de matériel intracellulaire phénicolés florphénicol Fenflor porcins inhibe la synthèse protéinique au niveau ribosomique aminosides dihydrostreptomycine Dipropen bovins, ovins, caprins, porcins perturbe la biosynthèse des protéines bactériennes et la perméabilité de la membrane bactérienne la III. rigine dans l environnement La consommation de médicaments est la principale origine des molécules pharmaceutiques dans l environnement. En effet, une fois administrés, les médicaments sont excrétés via les urines et les fèces. Dans le cas d une consommation humaine, ils se retrouvent alors dans les eaux usées. Ces dernières peuvent être déversées directement dans le milieu naturel, ou dirigées vers des stations d épuration (STEP) où elles seront traitées avant d être rejetées. Lorsque les molécules pharmaceutiques ne sont pas éliminées au cours du traitement, elles aboutissent dans les milieux aquatiques où sont rejetées les eaux traitées, tels que les cours 51

52 Chapitre 1 : Généralités d eau, les lacs ou le milieu marin. Le traitement des eaux usées dans les STEP génère des boues résiduaires dans lesquelles les polluants peuvent être piégés. Ces boues sont ensuite épandues sur les sols cultivés afin de les fertiliser. Les molécules pharmaceutiques qui y étaient retenues se retrouvent alors dans le milieu édaphique. Cette voie d introduction présente le double inconvénient d atteindre à la fois le milieu terrestre et le milieu aquatique à cause des ruissellements d eau de pluie sur les sols amendés (atteinte des nappes phréatiques sous-jacentes et des eaux de surface à proximité). Dans le cas d une consommation vétérinaire, les résidus de médicament contenus dans les excréments atteignent directement le sol des pâturages lorsque les animaux sont élevés en plein champ, ou se retrouvent dans les déchets d élevage (lisier, fumier, etc.). Comme les boues de STEP, les déchets d élevage sont appliqués sur les sols agricoles pour les enrichir. De la même façon, les produits pharmaceutiques qu ils contenaient sont alors dispersés dans le milieu naturel. Lorsque les médicaments ne sont pas consommés et qu ils sont jetés dans les éviers ou les toilettes, ils se retrouvent alors dans les eaux usées et suivent le même circuit que s ils avaient été utilisés. Dans d autres cas, ils sont jetés avec les déchets ménagers et finissent dans les décharges. Les lixiviats de ces décharges contenant des polluants de toute sorte, dont les molécules pharmaceutiques, contaminent les sols et les eaux de surface avoisinantes. Une autre source de pollution est la production des molécules pharmaceutiques (Velagaleti 1997 ; Larsson et al., 2007 ; Phillips et al., 2010). La fabrication et le conditionnement des médicaments ne sont pas de façon générale les sources de contamination les plus importantes ; néanmoins, aux endroits où les rejets de ces usines ont lieu, les concentrations peuvent être extrêmement importantes et contribuer de façon majoritaire à la pollution (Larsson et al., 2007 ; Phillips et al., 2010). Par ailleurs, même si ce n est pas une généralité (Langford et Thomas, 2009 ; Mullot, 2009), les centres de soins et en particulier les hôpitaux sont connus pour être des «hot spot» de la contamination des eaux usées par les molécules pharmaceutiques. Ceci est d autant plus vrai pour les molécules entrant dans les traitements administrés exclusivement à l hôpital. La production naturelle de ces molécules par les végétaux ou les bactéries, comme pour les antibiotiques de la famille des -lactames ou la streptomycine par exemple, est minoritaire dans les sols et n a jamais été mise en évidence dans les systèmes aquatiques (Kümmerer, 2009a). Enfin, le déversement direct dans les fermes aquacoles constitue une autre voie d entrée de ces molécules dans le milieu naturel. En résumé, il existe de nombreuses voies d entrée des molécules pharmaceutiques dans l environnement : - les rejets directs d eaux usées, - les rejets d eaux traitées dans les stations d épuration, - les épandages de boues résiduaires provenant du traitement des eaux dans les STEP, - les épandages des déchets d élevage, - les déjections animales émises directement dans le milieu, - les déversements dans les fermes aquacoles, - les lixiviats de décharges, - les usines de fabrication et de conditionnement, - la production naturelle. 52

53 Chapitre 1 : Généralités La Figure 5 schématise ces différentes voies d entrée. PRDUCTIN Production naturelle (animal, végétal, minéral) Production hémisynthétique Synthèse chimique Rejets usines de fabrication et conditionnement Consommation humaine CNSMMATIN Consommation vétérinaire fficines Hôpitaux Animaux d élevage Animaux de compagnie Médicaments non utilisés EXCRETIN Natifs Métabolites Conjugués DISPERSIN / CNTAMINATIN rigine humaine rigine animale Eaux usées Décharge Aquaculture Déchets d élevage Station d épuration boues SLS stockage / traitement eaux traitées EAUX DE SURFACE EAUX SUTERRAINES Station de potabilisation EAUX PTABLES Figure 5 : rigine et distribution des molécules pharmaceutiques dans le milieu. Les formes, sous lesquelles ces molécules sont retrouvées dans le milieu, sont très variables. En effet quand il y a épandage direct dans les fermes aquacoles, quand ils proviennent des usines de production ou quand ils sont excrétés sans avoir subi de transformation métabolique, les composés se retrouvent sous leurs formes natives. De plus, quand ils proviennent des usines de production, leurs précurseurs, issus des déchets intermédiaires de la chaine de production, peuvent également être observés dans les rejets et donc dans l environnement (Velagaleti, 1997). Quant au contraire ils ont été métabolisés dans le corps ou biotransformés par les bactéries dans les STEP, ce sont leurs métabolites qui sont 53

54 Chapitre 1 : Généralités rencontrés dans l environnement. Ces derniers peuvent alors être des molécules bien différentes des composés parents et ont leur propre comportement et influence sur le milieu et les organismes. Dans d autres cas, ils sont sous formes conjuguées et peuvent revenir à leur forme native lors des processus de biodégradation/biotransformation. C est par exemple le cas de la carbamazépine qui peut être issue de la déconjugaison de la carbamazépine-nglucuronide dont la moitié glucuronide est clivée par les activités glucuronidases des bactéries présentes dans les boues de STEP (Vieno et al., 2007 ; AFSSA, 2010). IV. Devenir Quel que soit le milieu considéré (eaux usées, de surface ou souterraines, sols, etc.), le devenir des composés est lié à leur comportement qui est dicté par les propriétés physico-chimiques des molécules. Le pka par exemple, conditionne, en fonction du ph du milieu, la forme acide ou basique des molécules. En fonction de leur forme, ces dernières pourront interagir différemment avec les éléments qui les entourent. Mais le pka n est pas le seul facteur qui peut influencer la répartition et le devenir des composés. Le coefficient de partage octanol-eau (Kow) ou la constante organique des sols (Koc) sont aussi à prendre en compte. Les propriétés physico-chimiques les plus utiles sont définies ci-après : Le coefficient de partage octanol-eau, Kow, correspond au rapport des concentrations d une substance, S, dans l octanol et dans l eau: Kow = [S] octanol / [S] eau. Il permet de définir si une substance est liposoluble ou hydrosoluble. Il est exprimé généralement sous sa forme logarithmique (log Kow) et si : log Kow(S) > 3 alors S est dite liposoluble (Tissier et al., 2005). La constante organique des sols, Koc, est le coefficient de partage entre la fraction de carbone organique et l eau dans le sol, les boues ou les sédiments. Il est exprimé sans dimension ou en l.kg -1 et permet de prévoir la distribution d un composé entre la phase liquide et la phase solide des sols, boues et sédiments. Il indique approximativement le degré d adsorption d une substance, S, et si Koc(S) > 3 alors S est dite adsorbable (Tissier et al., 2005). La solubilité d une substance dans l eau est sa concentration de saturation dans l eau à une température donnée ; elle est exprimée en kg.m -3 ou mg.l -1. Une substance est considérée non soluble si sa solubilité est inférieure à 1 mg.l -1 (Tissier et al., 2005). La constante de Henry caractérise la capacité d une substance à se partager entre l air et l eau ; elle est exprimée en Pa.m 3.mol -1. Une substance est considérée comme volatile si sa constante de Henry est supérieure à 1 Pa.m 3.mol -1 (Tissier et al., 2005). Ainsi, à partir de l ensemble de ces caractéristiques, on peut prévoir le devenir des molécules : des composés à la fois lipophiles (log Kow(S) > 3), adsorbables sur le carbone (Koc(S) > 3) et non solubles dans l eau (solubilité < 1 mg.l -1 ) se retrouveront principalement dans les boues de STEP, dans la phase particulaire des eaux naturelles ou dans les sédiments ; à l inverse, des composés non adsorbables et solubles comme les pénicillines se retrouveront très probablement dans la phase aqueuse des eaux naturelles et des effluents de STEP, s ils n ont pas été dégradés au moment du traitement. Par ailleurs, une substance lipophile sera probablement davantage bioaccumulée ou bioconcentrée dans les organismes qu une substance hydrophile. 54

55 Chapitre 1 : Généralités IV.1. Devenir dans les stations d épuration Les stations d épuration ont été installées pour traiter les eaux usées avant qu elles ne soient rejetées dans le milieu naturel. Leur objectif était d éliminer les matières solides, la matière organique dissoute et les nutriments comme l azote ou le phosphore. Pour cela, la plupart des STEP françaises comportent une étape de prétraitement puis un traitement primaire et un traitement secondaire. Le prétraitement consiste généralement en un dégrillage, dessablage et dégraissage qui permet d éliminer les éléments solides, le sable et les graisses. Le traitement primaire porte sur les matières particulaires décantables. Dans certain cas, un traitement physico-chimique est appliqué à ce niveau. Il consiste à ajouter des floculants aux eaux sortant du prétraitement pour finir d en éliminer les matières en suspension. Les traitements secondaires sont des traitements biologiques réalisés par des bactéries dans le but d éliminer la matière organique dissoute (carbone principalement mais aussi azote et phosphore). Il en existe de différentes sortes : le lagunage, les cultures libres (boues activées et bioréacteur à membranes) et les cultures fixées (biofiltres, lits bactériens, disques biologiques, filtres plantés) où les bactéries se développent sur un support. A l issue du traitement secondaire, les boues issues de la dégradation des matières organiques sont récupérées par curage (lagune) ou par clarification (décantation) (ADEME fiche technique assainissement ; Gabet-Giraud, 2009). Figure 6 : Quantités moyennes de molécules pharmaceutiques et produits de soin corporels en entrée (influent) et sortie (effluent) de deux stations d épuration utilisant des filtres bactériens (Cilfynydd) ou des boues activées (Coslech) comme type de traitement (extrait de Kasprzyk-Hordern et al.,, 2009). 55

56 Chapitre 1 : Généralités Initialement les stations d épuration n ont donc pas été conçues pour éliminer les micropolluants organiques comme les molécules pharmaceutiques. Néanmoins, les concentrations totales mesurées dans la phase dissoute des eaux rejetées en sortie de station sont souvent plus faibles que celles mesurées dans les eaux usées en entrée de station ce qui signifie que les traitements appliqués permettent d éliminer certains micropolluants (Figure 6). En revanche, l abattement n est pas le même pour tous les composés. Par exemple, d après les données de Kasprzyk-Hordern et al. (2009), les concentrations en paracétamol diminuent fortement entre l entrée ( ng/l) et la sortie ( ng/l) de la STEP «Cilfynydd» utilisant un traitement par filtres bactériens alors que celles de la carbamazépine augmentent passant de ng/l en entrée à ng/l en sortie. Toutes les molécules pharmaceutiques ne sont donc pas éliminées de la même façon dans les stations de traitement mais une même molécule n est pas non plus éliminée de la même façon en fonction de la saison (Castiglioni et al., 2006), du traitement appliqué dans la station (Vieno et al., 2007 ; Kasprzyk Hordern et al., 2009) et de l étude considérée. Par exemple, l ofloxacine semble ne pas être éliminée en hiver alors qu elle est au moins éliminée à 33 % en été d après Castiglioni et al. (2006). Pour Vieno et al. (2007), elle peut être éliminée à 75 % dans une STEP possédant un système de boues activées avec canal d oxydation et à 88 % dans une STEP possédant un système de boues activées avec dénitrification. Enfin, suivant la STEP étudiée, son abattement peut varier entre 20 et 99 % pour Gros et al. (2010). Au final, en considérant tous les articles, l élimination de l ofloxacine dans les stations d épuration varie entre 0 et 99 % et aucune valeur globale ne peut être dégagée. De la même façon, suivant l étude considérée, les taux d abattement des -bloquants, et en particulier du propranolol, sont très différents. Par exemple, d après Ternes (1998) le propranolol est éliminé à 96% dans les STEP alors que pour Bendz et al. (2005), Gabet-Giraud et al. (2010) ou Roberts et Thomas (2005 dans Fent et al., 2006) il est éliminé respectivement à 32 %, 22 % ou même, pas éliminé du tout. Gabet-Giraud et al. (2010) constatent également de fortes variations dans les abattements des -bloquants d une station de traitement à une autre. En revanche, pour les antibiotiques appartenant à la famille des macrolides, les diverses études seraient davantage en accord pour conclure à une présence plus forte de ces composés en sortie qu en entrée de station se traduisant par des abattements nuls ou même négatifs (Richardson et Bowron, 1985 dans Halling-Sørensen et al., 1998 ; Castiglioni et al., 2006 ; Gros et al., 2010,). Néanmoins, ils peuvent atteindre les 50 % dans certains cas (Kasprzyk Hordern et al., 2009 ; Miège et al., 2009). Göbel et al. (2007) justifient ce comportement par le fait que ces composés sont principalement rejetés de l organisme par la bile et les fèces et sont par conséquent emprisonnés dans des particules fécales en entrée de STEP. Les apports sont donc sous-estimés quand les phases dissoutes et particulaires sont analysées mais pas la phase solide. Au cours du traitement dans les STEP, les macrolides sont libérés et sont donc détectables dans les eaux traitées en sortie de station. La Figure 7 est issue d une synthèse bibliographique de 18 articles scientifiques à comité de lecture dont 2 reviews (Fent et al., 2006 ; Miège et al., 2009). Les données brutes relevées dans la littérature et utilisées pour générer ce graphique sont présentées en annexe (Annexe - tableau 1). Les composés pour lesquels moins de 3 valeurs ont été relevées ne sont pas représentés sur le graphique (en particulier anticancéreux et anti-viraux). Quand des plages de taux d élimination ont été relevés (ex. : ), les deux valeurs extrêmes ont été considérées séparément comme deux données différentes (ex. : 30 et 100). Dans le but de maximiser la lisibilité du graphique, les valeurs négatives ont été ramenées à zéro. Par ailleurs, il est important de noter que les taux d élimination rapportés dans la littérature sont généralement calculés à partir de la différence entre les concentrations mesurées dans la phase 56

57 acide méfénamique (n=6) acide méfénamique (n=6) acide salicylique (n=6) acide salicylique (n=6) aspirine (n=5) aspirine (n=5) diclofénac (n=18) diclofénac (n=18) ibuprofène (n=27) ibuprofène (n=27) kétoprofène (n=15) kétoprofène (n=15) naproxène (n=20) naproxène (n=20) paracétamol (n=6) paracétamol (n=6) carbamazépine (n=17) carbamazépine (n=17) acide clofibrique (n=12) acide clofibrique (n=12) acide fénofibrique (n=4) acide fénofibrique (n=4) bézafibrate (n=18) bézafibrate (n=18) gemfibrozil (n=10) gemfibrozil (n=10) cimétidine (n=4) cimétidine (n=4) ranitidine (n=6) ranitidine (n=6) salbutamol (n=7) salbutamol (n=7) enalapril (n=6) enalapril (n=6) furosémide (n=8) furosémide (n=8) pénicillines (n=4) pénicillines (n=4) macrolides (n=17) macrolides et lincosamides (n=17) fluoroquinolones (n=30) fluoroquinolones (n=30) tétracycline (n=5) tétracycline (n=5) sulfonamides (n=21) sulfonamides (n=21) imidazoles (n=3) imidazoles (n=3) aténolol (n=19) aténolol (n=19) métoprolol (n=15) métoprolol (n=15) propranolol (n=9) propranolol (n=9) sotalol (n=6) sotalol (n=6) Rendement (%) Rendement (%) Chapitre 1 : Généralités dissoute en entrée et en sortie des stations de traitement. L élimination des composés ne signifie donc pas toujours qu ils ont été dégradés au cours du traitement mais qu ils ont disparu de la phase dissoute, ils peuvent être adsorbés sur les particules ou les boues Figure 7 : Rendement d'élimination des molécules pharmaceutiques dans les STEP (n = nombre de données) (la croix correspond à la moyenne) (la famille des macrolides intègre aussi les lincosamides). Cette figure met clairement en évidence l étendue des taux d élimination dans les STEP pour 28 molécules ou familles de molécules (antibiotiques). Les plages les plus larges, entre le premier et le troisième quartile, sont celles du propranolol, du bézafibrate et du salbutamol. Néanmoins, malgré la diversité des données, il ressort que le paracétamol, l aspirine et l acide salicylique, son métabolite, sont bien éliminés avec des pourcentages d élimination supérieurs à 80 %. A l opposé, il ressort que la carbamazépine, les macrolides et lincosamides et les imidazoles sont difficilement éliminés avec des taux d abattement inférieurs à 30 % si on tient compte des données comprises entre le premier et le troisième quartile. Entre ces deux extrêmes, certains composés comme les 3 anti-inflammatoires non stéroïdien (AINS) ibuprofène, kétoprofène et naproxène semblent relativement être bien éliminés alors que l acide méfénamique ou le métoprolol paraissent difficilement être abattus. Les variations observées peuvent être expliquées par les propriétés physico-chimiques de la molécule étudiée et le procédé de traitement appliqué. La Figure 8, extraite de Kasprzyk- Hordern et al. (2009), montre l impact du traitement appliqué sur les taux d élimination des molécules pharmaceutiques. Bien que les deux systèmes comparés soient tous deux des traitements biologiques, il ressort que les composés sont généralement mieux éliminés par les boues activées que par les filtres bactériens. Ceci est particulièrement mis en évidence pour le sulfaméthoxazole, l érythromycine, la sulfapyridine ou encore l acide 5-aminosalicylique. 57

58 Chapitre 1 : Généralités Figure 8 : Elimination des molécules pharmaceutiques en fonction du traitement biologique appliqué (extrait de Kasprzyk Hordern et al., 2009) (filtres bactériens : trickling filters, ou boues activées : activated sludges). La différence de procédé mis en œuvre dans la station de traitement n est pas le seul facteur qui puisse justifier de telles différences dans l épuration des eaux usées. En effet, pour six STEP appliquant un même procédé de traitement par boues actives, Gabet-Giraud et al. (2010) ont remarqué des variations de 233 %, 79 % et 93 % respectivement pour le propranolol, le métoprolol et le sotalol. En réalité, les propriétés physico-chimiques de la molécule étudiée et le procédé de traitement appliqué mais aussi les conditions climatiques (dilution des eaux brutes suites à des épisodes pluvieux ou à la fonte des neiges, température, ensoleillement) peuvent influencer l élimination des molécules pharmaceutiques dans les STEP. En conséquence, les abattements des composés peuvent être différents d une station à une autre mais aussi au sein d une même station (Vieno et al., 2007 ; Kasprzyk Hordern et al., 2009). Par exemple, la température du compartiment des boues activées influence l élimination de l aténolol (Gabet-Giraud et al., 2010). Par ailleurs, Vieno et al. (2007) ont observé qu en période de pluie, l élimination des -bloquants, en particulier de l acébutolol, l aténolol et le métoprolol était diminuée. De même une moins bonne efficacité dans les processus d élimination a été observée en période de pluie pour le métronidazole, l ibuprofène, le diclofénac, la codéine, la carbamazepine, les -bloquants, la cimétidine et le furosémide par Kasprzyk Hordern et al. (2009). Lorsque le système de collecte des eaux pluviales n est pas différencié de celui des eaux usées, alors en période pluvieuse, les eaux usées se retrouvent diluées par les eaux de pluie. Si la dilution des eaux contaminées est un avantage dans les systèmes naturels, en revanche dans les STEP c est un inconvénient car pour arriver à traiter les plus gros débits, les temps de résidence sont réduits, diminuant d autant l efficacité du traitement. Il semble qu un paramètre important dans l efficacité du traitement soit le temps de résidence hydraulique (TRH) et le temps de résidence des boues (Vieno et al., 2007 ; Gros et al., 2010). Gros et al. (2010) ont calculé les temps de demi-vies de certaines molécules pharmaceutiques en se basant sur les concentrations moyennes mesurées en entrée et en sortie de stations d épuration. A partir de ces temps de demi-vie, ils ont pu estimer les taux d élimination des composés en fonction du TRH. Il ressort de leurs 58

59 Chapitre 1 : Généralités résultats que des composés ayant des temps de demi-vie assez long seront faiblement éliminés dans des STEP possédant des TRH courts (7-10 heures) alors qu ils seront mieux éliminés dans des STEP possédant des TRH longs (32 heures) (Figure 9). Figure 9 : Pourcentage d'élimination et temps de demi-vie de différentes molécules pharmaceutiques en fonction du temps de résidence hydraulique (extrait de Gros et al., 2010). De nos jours, de plus en plus de stations s équipent d un traitement tertiaire comme la filtration sur sable, la décantation rapide, le lagunage de finition, l ozonation, l osmose inverse ou la filtration sur charbon actif. Ces traitements tertiaires sont prometteurs pour éliminer les micropolluants organiques. L ozonation semble efficace pour éliminer certaines molécules pharmaceutiques (Castiglioni et al., 2006). Gabet-Giraud et al. (2010) ont ainsi observé des rendements d élimination supérieurs à 80 % pour les -bloquants quand des traitements par ozonation, osmose inverse ou filtration sur charbon actif étaient appliqués. Le sulfaméthoxazole semble également être efficacement dégradé par l ozonation (Dantas et al., 2007 dans Kümmerer, 2009a). Les principaux mécanismes impliqués dans l élimination des molécules pharmaceutiques dans les STEP sont la biodégradation par hydrolyse, par oxydation ou par déméthylation, l adsorption sur les particules ou les boues, la filtration et l oxydation chimique. L élimination par volatilisation de ces composés est très peu probable (Miège et al., 2009). Par exemple, l adsorption sur les boues est la voix principale d élimination des fluoroquinolones (Golet et al., 2003). En conclusion, pour comprendre le devenir des molécules pharmaceutiques dans les stations d épuration il faut tenir compte : du composé étudié (classe thérapeutique et propriétés physico-chimiques), du procédé de traitement appliqué dans la station considérée (le type de traitement et la présence d un traitement tertiaire), des conditions climatiques (température, précipitations, ensoleillement). 59

60 Chapitre 1 : Généralités IV.2. Devenir dans l environnement Le devenir des molécules pharmaceutiques dans les milieux naturels est lié à deux phénomènes : l adsorption, sur les particules, les sédiments ou le sol, et la dégradation. La disparition des composés natifs dans la phase aqueuse ne signifie pas obligatoirement qu ils ont été éliminés. Les tétracyclines par exemple sont connues pour se fixer sur les particules du sol ou pour former des complexes avec les ions présents (ex. : Na 2+, Ca 2+ ) (Thiele-Bruhn, 2003 ; Kümmerer, 2009b). La sulfadiazine et d autres sulfonamides s adsorbent aussi sur les particules du sol (Kümmerer, 2009a). L adsorption des tétracyclines présente l avantage de réduire les risques de dispersion via la phase aqueuse mais l inconvénient de les mettre en contact avec les bactéries du sol. De plus, la fixation des tétracyclines sur les cations divalents comme le calcium ou le magnésium des eaux marines oblige les fermes aquacoles à utiliser de plus grosses quantités d antibiotiques, augmentant ainsi les problèmes de pollution (Kümmerer, 2009b). La présence de substances humiques peut modifier l adsorption des composés en supprimant ou en améliorant leurs interactions avec les surfaces minérales (Kümmerer, 2009a). L adsorption des contaminants, comme les HAP ou les PCB, sur la matière organique peut être estimée au travers de la valeur du log Kow. Cependant, pour les antibiotiques d autres paramètres rentrent en ligne de compte. Ainsi, en fonction du ph du milieu, des interactions ioniques peuvent se produire par le fait que ces composés possèdent des fonctions acides et basiques. Par exemple, les fluoroquinolones qui sont des composés zwitterioniques (pka CH = 5,9-6,4, pka NH2 = 7,7-10,2) s adsorbent sur la matière organique des boues de STEP grâce à des interactions électrostatiques (Golet et al., 2003). Ainsi l adsorption des composés pharmaceutiques dépend du log Kow mais aussi du ph, du potentiel redox, de la stéréochimie de la structure et de la nature chimique de l adsorbant et des composés (Kümmerer, 2009b). La dégradation peut être de différente nature : chimique comme les réactions de photodégradation, hydrolyse et thermolyse ou biologique par action des micro-organismes (bactéries et champignons). La photodégradation dépend de l intensité du rayonnement, de la profondeur de l eau, de la saison et de la latitude, de la présence et de la composition de la matière organique (Mompelat et al., 2009). Par exemple les sulfonamides sont mieux photodégradés dans une eau naturelle que dans une eau pure grâce à la présence de matière organique dissoute (Boreen et al., 2005). Certains composés sont connus pour être sensibles à la lumière. Les fluoroquinolones et la tylosine par exemple sont dégradés par le rayonnement UV (Kümmerer, 2009a). En revanche, les fluoroquinolones et les sulfonamides sont insensibles à l hydrolyse. Lors d études en laboratoire, les pénicillines ont été rapidement hydrolysées (Kümmerer, 2009a). De plus, la pénicilline G est décomposée par la chaleur. Les -lactames peuvent être dégradées par les -lactamases qui sont des enzymes présentes dans les bactéries. Cependant, des tests de biodégradation pratiqués sur des antibiotiques selon les normes CDE (rganisation de Coopération et de Développement Économiques) ont montré une lente biodégradation de ces derniers à l exception de la pénicilline G (Alexy et al., 2004 dans Mompelat et al., 2009 ; Gartiser et al., 2007 dans Mompelat et al., 2009). Maki et al. (2007 dans Kümmerer, 2009a) ont trouvé que l ampicilline, l oxytétracyline, la doxycycline et le thiamphénicol sont biodégradés alors que la josamycine reste intacte. V. Présence dans l environnement Les molécules pharmaceutiques sont ubiquistes. n les retrouve dans : 60

61 Chapitre 1 : Généralités les rejets industriels (industrie pharmaceutique) : Larsson et al., 2007 ; Li et al., 2008 ; Phillips et al., 2010 les eaux usées des centres de soin (hôpitaux, maison de retraite, hôpitaux psychiatriques) : Steger-Hartmann et al., 1996 ; Kümmerer et al., 1997 ; Steger-Hartmann et al., 1997 ; Hartmann et al., 1998 ; Lindberg et al., 2004; Gomez et al., 2006 ; Mahnik et al., 2007 ; Catastini et al., 2009; Mullot, 2009 ; Watkinson et al., 2009 ; Chang et al., 2010 les eaux usées brutes et traitées (entrée et / ou sortie de STEP) : Steger-Hartmann et al., 1996 ; Kümmerer et al., 1997 ; Ternes, 1998 ; Hirsch et al., 1999 ; Golet et al., 2001 ; Sedlak et Pinkston, 2001 ; Golet et al., 2002a ; Andreozzi et al., 2003 ; Huggett, 2003 ; Ferrari et al., 2004; Huschek et al., 2004 ; Bendz et al., 2005 ; Cha et al., 2006 ; Gagne et al., 2006 ; Gros et al., 2006 ; Pomati et al., 2006 ; Segura et al., 2006 ; Vieno et al., 2006 ; Piram et al., 2008 ; Coetsier et al., 2009 ; Watkinson et al., 2009 ; Chang et al., 2010 ; Gabet- Giraud et al., 2010 ; Nieto et al., 2010a ; Prasse et al., 2010 les boues de STEP : Golet et al., 2002b ; Lindberg et al., 2005 ; Thomas et al., 2007 ; Díaz- Cruz et al., 2009 ; Jelić et al., 2009 ; Nieto et al., 2010b les effluents d élevages (lisiers, fumiers, etc.) : Hamscher et al., 2002 ; Pierini et al., 2004 ; Martínez-Carballo et al., 2007 le sol après épandage des boues de STEP ou des déchets d élevage : Golet et al., 2002b ; Hamscher et al., 2002 ; Jacobsen et al., 2004 ; Martínez-Carballo et al., 2007 ; Kemper et al., 2008 ; Weiss et al., 2008 les sédiments :Yang et al., 2010 ; Zuccato et al., 2000 les eaux de lessivage des sols enrichis avec les boues de STEP ou les déchets d élevage (lixiviat) : Kemper, 2008 ; Weiss et al., 2008 les eaux de surface (ruisseau, rivière, fleuve, lac, estuaire, mer, océan) : Ternes, 1998 ; Hirsch et al., 1999 ; Zuccato et al., 2000 ; Lindsey et al., 2001 ; Golet et al., 2002a ; Kolpin et al., 2002 ; Stackelberg et al., 2004 ; Bendz et al., 2005 ; Cha et al., 2006 ; Gros et al., 2006 ; Hao et al., 2006 ; Pomati et al., 2006 ; Vieno et al., 2006 ; Kasprzyk- Hordern et al., 2007 ; Focazio et al., 2008 ; Nageswararao et al., 2008 ; Tamtam et al., 2008 ; Vulliet et al., 2009 ; Watkinson et al., 2009 ; Chang et al., 2010 ; Prasse et al., 2010 les eaux souterraines: Sacher et al., 2001 ; Barnes et al., 2008 ; Focazio et al., 2008 ; Avisar et al., 2009 les eaux potables (en sortie de station de potabilisation, eau du robinet, eau embouteillée) : Zuccato et al., 2000 ; Heberer, 2002 ; Reddersen et al., 2002 ; Wenzel et al., 2003 ; Stackelberg et al., 2004 ; Chen et al., 2006 ; Stackelberg et al., 2007 ; Ye et al., 2007 ; Zuehlke et al., 2007 ; Togola et Budzinski, 2008 ; Garcia-Ac et al., 2009 ; Vulliet et al., 2009 ; Watkinson et al., 2009 les animaux (traités ou non) : poissons (Dasenaki et Thomaidis, 2010), crevettes (Furusawa, 2008), vautours (aks et al., 2004) les plantes : Hu et al., 2010 la nourriture suite aux traitements des animaux (antibiotiques) : lait bovin (Keever et al., 1998) ; muscles et lait bovins (Becker et al., 2004), miel (Hammel et al., 2008). Au niveau environnemental, les eaux, et la phase dissoute en particulier, sont les matrices les plus analysées. Par exemple, sur les 117 publications étudiées par Miège et al. (2009) sur les molécules pharmaceutiques et les produits de soin corporels dans les stations d épuration, seulement 15 traitent des boues et une seule de la phase particulaire. De plus, d après les 2 61

62 nombre d'échantillons Chapitre 1 : Généralités 500 articles étudiés au cours du premier volet du projet KNAPPE, sur l ensemble des matrices aqueuses, les eaux usées traitées (sortie de STEP) et les eaux de surface sont les matrices les plus étudiées. Environ, 75 % des échantillons analysés, et dont les résultats sont présentés dans la littérature entre 1998 et 2007, se rapportent à ces matrices (Figure 10) Figure 10 : Répartition du nombre d échantillons d eau analysés par type de matrice d après des données bibliographiques (graphique traduit du délivrable D1.1 «List of relevant PPs» du projet KNAPPE, Schlüsener et al., 2007). En ce qui concerne la synthèse bibliographique sur les matrices aqueuses présentée dans ce chapitre, 55 articles et 2 rapports scientifiques ont été pris en compte. Les données relevées sont rapportées dans les tableaux présentés en annexe (Annexe - tableau 2 à Annexe - tableau 8). Seules les valeurs chiffrées positives, supérieures aux limites de quantification, ont été reportées. Les informations relatives aux composés recherchés mais non trouvés ou dont les concentrations étaient inférieures aux limites de détection et de quantification n ont pas été rapportées. La totalité des valeurs collectées ont été utilisées pour générer les différents graphiques présentés dans les paragraphes suivants (Figure 12 à Figure 25). rejets hopitaux (8, 275) entrée STEP (14, 206) sortie de STEP (16, 386) eau de surface (17, 407) eau souterraine (11, 47) eau potable (10, 90) concentration (µg/l) 0,0001 0,001 0,01 0, Figure 11 : Concentrations minimales et maximales relevées dans les diverses classes thérapeutiques pour les différentes matrices aqueuses (nombre de classes thérapeutiques prises en compte, nombre de données prises en compte). 62

63 Chapitre 1 : Généralités Dans l ensemble des matrices aqueuses (Figure 11), les composés sont majoritairement présents à des concentrations comprises entre quelques ng/l et quelques µg/l. Cette gamme là correspond aux plus faibles valeurs de concentration relevées dans les rejets hospitaliers et les eaux usées alors qu elle correspond aux plus fortes valeurs relevées dans les eaux souterraines et les eaux potables. Des concentrations en paracétamol ou agents de contraste iodés atteignant le mg/l dans les rejets d hôpitaux ont été relevées. A l inverse, des concentrations de l ordre du dixième de ng/l ont été relevées pour diverses classes thérapeutiques dans les eaux potables et les eaux souterraines. Ainsi, les concentrations sont généralement comprises entre la dizaine de ng/l et la centaine de µg/l dans les rejets hospitaliers et dans les eaux usées en entrée de STEP, entre le ng/l et la dizaine de µg/l dans les eaux traitées en sortie de STEP, entre le dixième de ng/l et la dizaine de µg/l dans les eaux de surface et les eaux souterraines et entre le dixième de ng/l et la centaine de ng/l dans les eaux potables. Préalablement à l étude détaillée de chacune des matrices liquides, afin de comparer de façon plus précise les niveaux de contamination entre les rejets hospitaliers, les eaux usées en entrée et en sortie de STEP, les eaux de surface, souterraines et potables, 8 molécules détectées dans ces 6 compartiments aqueux, à l exception du cyclophosphamide, ont été sélectionnées. Il s agit du diclofénac, du paracétamol, de la carbamazépine, du bézafibrate, de la roxithromycine, du sulfaméthoxazole, de l aténolol et du cyclophosphamide. Elles représentent les principales classes thérapeutiques analysées (analgésiques et antiinflammatoires, antiépileptiques et antidépresseurs, hypolipémiants, antibiotiques, - bloquants et anticancéreux). Les plages de contamination de ces 8 molécules sont représentées Figure 12 en utilisant les valeurs les plus faibles et les plus fortes relevées dans la littérature dans chacune des 6 matrices. D une façon générale, en se basant sur les valeurs maximales de chaque molécule, le gradient de contamination suivant peut être observé : rejets hospitaliers (70 ng/l - 1,3 mg/l, 77 données prises en compte) > entrée de STEP (400 ng/l - 43 µg/l, 72 données prises en compte) > sortie de STEP (300 ng/l - 11 µg/l, 160 données prises en compte) > eau de surface (54 ng/l - 10 µg/l, 189 données prises en compte) > eau souterraine (3 ng/l - 1,1 µg/l, 32 données prises en compte) > eau potable (3-258 ng/l, 44 données prises en compte). Cependant, la carbamazépine, le bézafibrate et la roxithromycine présentent des concentrations maximales plus élevées dans les eaux traitées (sortie de STEP) que dans les eaux usées brutes (entrée de STEP). Par ailleurs, à l exception des eaux potables et des rejets hospitaliers, les plages de concentration se superposent entre les différentes matrices pour une même molécule. En conséquence, des eaux souterraines peuvent être autant contaminées en diclofénac, paracétamol, carbamazépine, sulfaméthoxazole et aténolol que des rejets de STEP ; ou des eaux de surface peuvent être autant contaminées que des eaux usées brutes (entrée de STEP ou rejets hospitaliers) pour l ensemble de ces 8 composés. De plus, dans les eaux potables, même si les niveaux de contamination sont principalement inférieurs à la dizaine de ng/l, des valeurs de l ordre de la centaine de ng/l ont été relevées pour le paracétamol et la carbamazépine. En ce qui concerne la synthèse bibliographique effectuée dans le cadre de ce travail sur les matrices solides (boues de STEP, déchets d élevage, sols, sédiments), 16 articles et 1 rapport scientifique ont été pris en compte. Du fait de la complexité de ces matrices et des difficultés analytiques qu elles engendrent, elles sont moins étudiées que les eaux et la phase dissoute. Les données relevées sont rapportées dans l Annexe - tableau 8 et dans le Tableau 14 et le Tableau 15 présentés dans les paragraphes V.7 à V.9. Comme pour la phase liquide dissoute, seules les valeurs chiffrées positives, supérieures aux limites de quantification, ont été reportées dans les tableaux et les graphiques. Les informations relatives aux composés 63

64 Figure 12 : Gammes de concentrations auxquelles les 8 composés représentés peuvent être retrouvés dans différentes matrices aqueuses (gamme représentées par la valeur minimale et maximale trouvées dans les n données récupérées dans la littérature, 0 = 0,1 ng/l). (carba. : carbamazépine, roxithro. : roxithromycine, sulfamétho. : sulfaméthoxazole, cyclophos. : cyclophosphamide) (hôpital : rejets hospitaliers, entrée STEP : eaux usées, sortie STEP : eaux traitées, surface : eaux de surface, souterraine : eaux souterraines, potable : eaux potables) cyclophos. aténolol sulfamétho. roxithro. bézafibrate carba. paracétamol diclofénac Chapitre 1 : Généralités recherchés mais non trouvés ou dont les concentrations étaient inférieures aux limites de détection et de quantification n ont pas été rapportées. hôpital (n=11) entrée STEP (n=13) sortie STEP (n=34) surface (n=30) souterraine (n=6) potable (n=5) hôpital (n=11) entrée STEP (n=10) sortie STEP (n=11) surface (n=22) souterraine (n=4) potable (n=6) hôpital (n=3) entrée STEP (n=10) sortie STEP (n=37) surface (n=38) souterraine (n=7) potable (n=14) hôpital (n=0) entrée STEP (n=5) sortie STEP (n=18) surface (n=21) souterraine (n=2) potable (n=6) hôpital (n=4) entrée STEP (n=2) sortie STEP (n=8) surface (n=9) souterraine (n=2) potable (n=4) hôpital (n=20) entrée STEP (n=14) sortie STEP (n=31) surface (n=44) souterraine (n=9) potable (n=5) hôpital (n=12) entrée STEP (n=15) sortie STEP (n=14) surface (n=22) souterraine (n=2) potable (n=4) hôpital (n=16) entrée STEP (n=3) sortie STEP (n=7) surface (n=3) souterraine (n=0) potable (n=0) concentration (ng/l)

65 Chapitre 1 : Généralités Suivant la classe thérapeutique considérée, les concentrations relevées dans les boues de STEP peuvent être plus importantes que celles mesurées dans les eaux usées, brutes ou traitées, comme pour les antibiotiques ou au contraire beaucoup plus petites comme pour les analgésiques et anti-inflammatoire (Tableau 12). En revanche, il n y a pas de différence de niveau de contamination entre les eaux de surface et les sédiments. Dans les deux matrices les concentrations en antibiotiques varient entre le dixième de ng/l ou de ng/g et le µg/l ou le µg/g avec des extrêmes pouvant atteindre la dizaine voire la centaine de µg/l ou µg/g. Tableau 12 : Concentrations minimales et maximales relevées dans les eaux usées brutes (entrée de STEP) et traitées (sortie de STEP) ainsi que les boues de STEP pour deux classes thérapeutiques majeures (concentrations indiquées en ng/l dans les eaux et en ng/g dans les boues). matrice analgésiques et anti-inflammatoires antibiotiques minimum maximum n données minimum maximum n données entrée de STEP boues de STEP 2, , sortie de STEP La contamination de chacune des différentes matrices (rejets hospitaliers, eaux usées brutes et traitées, eau de surface, souterraines et de boisson, sédiments, boues de STEP, déchets d élevage et sols enrichis avec les boues de STEP ou les déchets d élevage) par les molécules pharmaceutiques est passée en revue dans les paragraphes suivants. V.1. Les effluents hospitaliers Dans les eaux usées provenant d hôpitaux, les plus fortes concentrations rapportées concernent les agents de contraste utilisés pour les diagnostics médicaux. Ils sont retrouvés à des valeurs supérieures au mg/l (Figure 13). Les analgésiques et anti-inflammatoires sont également dosés à des niveaux élevés de concentration (mg/l) mais leur gamme de concentrations est très étendue puisque certains composés ont été quantifiés à des concentrations de l ordre de la dizaine de ng/l seulement. Les antibiotiques et les anticancéreux sont des classes thérapeutiques possédant aussi des plages de contamination étendues, de la dizaine de ng/l à la centaine de ng/l alors que les -bloquants sont retrouvés sur une gamme de concentrations un peu plus réduite allant de la centaine de ng/l à la centaine de µg/l. Les autres classes thérapeutiques ont été moins étudiées et leur niveau de contamination est plus variable. Le détail des plages de concentrations de chaque composé à l intérieur des différentes classes thérapeutiques est présenté Figure 14. Dans la classe des analgésiques et des antiinflammatoires, le paracétamol et l ibuprofène sont les 2 molécules retrouvées aux plus fortes concentrations, respectivement 1,4 mg/l (Suède, Thomas et al., 2007) et 151 µg/l (Espagne, Gomez et al., 2006), mais l ensemble des composés est dosé à des concentrations importantes. Contrairement aux autres matrices aqueuses, la carbamazépine a été peu analysée dans les effluents hospitaliers et ses concentrations sont relativement faibles. L iobitridol et l ioméprol, les deux agents de contrastes, sont tous deux présents à de très fortes concentrations avec une concentration maximale en iobitridol de 9,9 mg/l (France, Mullot, 2009). Au sein des antibiotiques, les niveaux de concentrations sont plus variés et les valeurs maximales sont relevées pour la ciprofloxacine (101 µg/l ; Suède, Lindberg et al., 2004), le 65

66 Chapitre 1 : Généralités métronidazole (90,2 µg/l ; Suède, Lindberg rejets hospitaliers et al., 2004), le triméthoprime (15 µg/l ; Suède, Thomas et al., 2007) et le sulfaméthoxazole (12,8 µg/l ; Suède, Lindberg et al., 2004). anticancéreux (56) b-bloquants (23) antibiotiques (128) histamine antagonistes récepteurs H2 (3) agents de contraste iodés (4) antiépiléptiques et antidépresseurs (3) anesthésiques (7) analgésiques et anti-inflammatoires (51) 0,001 0,01 0, concentration (µg/l) Figure 13 : Plages de concentrations auxquelles les principales classes thérapeutiques peuvent être retrouvées dans les rejets hospitaliers (nombre de données relevées dans chaque classe). codéine diclofénac ibuprofène kétoprofène kétorolac méthylprednisolone paracétamol propofol carbamazépine iobitridol ioméprol ranitidine amoxicilline pénicilline V céfalexine érythromycine érythromycine-h2 oléandomycine roxithromycine clindamycine lincomycine ciprofloxacine enrofloxacine loméfloxacine norfloxacine ofloxacine acide nalidixic sulfadiazine sulfaméthoxazole triméthoprime chlortétracycline déméclocycline doxycycline oxytétracycline tétracycline iso-chlortétracycline métronidazole aténolol métoprolol propranolol cyclophosphamide ifosfamide doxorubicine fluorouracil étoposide méthotréxate concentration (ng/l) Figure 14 : Concentrations relevées dans la littérature pour 46 molécules pharmaceutiques mesurées dans des rejets hospitaliers. 66

67 Chapitre 1 : Généralités Cependant, il faut savoir que les concentrations varient fortement suivant le moment de la journée où le prélèvement a été effectué (Lindberg et al., 2004). Des échantillons prélevés à un même endroit en milieu d après-midi, en fin de matinée ou dans la nuit ne seront pas contaminés de la même façon (Figure 15). L aténolol est le -bloquant dosé à la plus forte concentration (122 µg/l ; Espagne, Gomez et al., 2006). Enfin, au sein des anticancéreux, le fluorouracil est le composé détecté à la plus forte concentration de 123,5 µg/l (Autriche, Manik et al., 2007) alors que les autres molécules sont plutôt dosées à des concentrations maximales variant entre la centaine de ng/l et quelques µg/l. Figure 15 : Evolution du niveau de concentration en ciprofloxacine (b) et métronidazole (e) dans un effluent hospitalier en fonction de l heure de prélèvement et du débit (extrait de Lindberg et al., 2004). V.2. Les eaux usées brutes (entrées de STEP) Dans les eaux usées, 3 classes thérapeutiques dominent en terme de nombre de données disponibles dans la littérature et d étendue des gammes de concentrations (Figure 16). Il s agit des antibiotiques, des -bloquants et des analgésiques et anti-inflammatoires. Elles sont dosées à des concentrations allant de quelques ng/l à plusieurs dizaines de µg/l. Cependant, les plus fortes concentrations ont été relevées pour la classe des stimulants dont le principal représentant est la caféine. La caféine a été dosée à une concentration maximale de 640 µg/l (Heberer, 2002). Les hypolipémiants, antiviraux et les antiépileptiques et antidépresseurs sont les 3 autres classes fréquemment analysées et dont plus d une quinzaine de données ont été relevées pour chacune dans la littérature. Leurs gammes de concentration vont de quelques ng/l à quelques µg/l. Peu de données ont été relevées pour les autres classes thérapeutiques, soit parce qu un moins grand nombre de molécules appartiennent à ces classes, soit parce qu elles sont moins étudiées et donc les informations qui leur sont relatives sont plus rares (ex. : les inhibiteurs de phosphodiestérase de type 5). Les gammes de concentration individuelle de chaque composé appartenant à ces 14 classes thérapeutiques sont présentées Figure 17. A l exception de la codéine et de l indométhacine, les différents analgésiques et anti-inflammatoires sont retrouvés dans des gammes de concentration similaires, entre la centaine de ng/l et la dizaine de µg/l. Comme dans les effluents hospitaliers, les valeurs les plus fortes ont été relevées pour le paracétamol (43,2 µg/l ; Suède, Thomas et al., 2007) et l ibuprofène (18,4 µg/l ; Espagne, Gros et al., 2009). Comparativement aux autres antiépileptiques et antidépresseurs, de nombreuses données ont été saisies pour la carbamazépine. Les concentrations auxquelles elle a été retrouvée varient d un facteur 100 ( ng/l). L acide clofibrique, le bézafibrate et le gemfibrozil sont 67

68 Chapitre 1 : Généralités les hypolipémiants les plus analysés. Bien que rarement détectés, les antibiotiques de la famille des -lactames sont quantifiés à des concentrations importantes dans les eaux usées brutes (valeurs maximales de plusieurs µg/l à plusieurs dizaines de µg/l). D après le nombre de données recueillies, la ciprofloxacine, l enrofloxacine, la norfloxacine et l ofloxacine pour les fluoroquinolones et le sulfaméthoxazole et le triméthoprime pour les sulfonamides, sont les antibiotiques les plus recherchés et les plus retrouvées dans les eaux usées brutes. Les plus importantes concentrations sont celles de la ciprofloxacine (6,3 µg/l ; France, Mullot, 2009). Parmi les -bloquants, 4 molécules sont particulièrement bien documentées : l aténolol, le métoprolol, le propranolol et le sotalol. Elles sont généralement dosées à de fortes concentrations, entre la centaine de ng/l et la dizaine de µg/l. Les données recueillies pour les antiviraux sont variables et peu de données ont été saisies pour les anticancéreux, probablement car c est une classe moins fréquemment analysée que les autres. eaux usées entrée de STEP antiviraux (16) anticancéreux (5) b-bloquants (72) antibiotiques (95) inhibiteurs PDE 5 (7) antidiabétiques (2) diurétiques (6) antihypertenseurs (3) histamine antagonistes des récepteurs H2 (9) hypolipémiants (21) antiépileptiques et antidépresseurs (15) anesthésiques (2) stimulants (3) analgésiques et anti-inflammatoires (63) concentration (ng/l) Figure 16 : Plages de concentrations auxquelles les principales classes thérapeutiques peuvent être retrouvées dans les eaux usées en entrée de station d'épuration (nombre de données relevées dans chaque classe). 68

69 Chapitre 1 : Généralités acide méfénamic acide salicylique codéine diclofénac ibuprofène hydroxy-ibuprofène carboxy-ibuprofène indométhacine kétoprofène naproxène paracétamol propyphenazone caféine propofol carbamazépine fluoxétine lorazépam acide clofibrique atorvastatine mevastatin bézafibrate gemfibrozil cimétidine famotidine ranitidine enalapril hydrochlorothiazide furosémide glibendamide sildénafil Vardenafil Tadalafil amoxicilline pénicilline G pénicilline V cloxacilline céfalexine céfochlor azithromycine clarithromycine oléandomycine roxithromycine tylosine clindamycine lincomycine ciprofloxacine enrofloxacine norfloxacine ofloxacine acide nalidixic sulfadiazine sulfaméthazine sulfaméthoxazole sulfathiazole sulfasalazine triméthoprime chlortétracycline doxycycline oxytétracycline tétracycline métronidazole salinomycine acébutolol aténolol bêtaxolol bisoprolol métoprolol nadolol oxprénolol pindolol propranolol sotalol timolol cyclophosphamide ifosfamide tamoxifen acyclovir penciclovir oseltamivir oseltamivir carboxylate abacavir lamivudine névirapine stavudine zidovudine concentration (µg/l) 0,0001 0,001 0,01 0, Figure 17 : Concentrations relevées dans la littérature pour 85 molécules pharmaceutiques mesurées dans des eaux usées brutes (entrée de STEP). 69

70 Chapitre 1 : Généralités V.3. Les eaux usées traitées (effluents / sorties de STEP) Les classes pour lesquelles le plus de données ont été recueillies dans les eaux traitées sont les antibiotiques (193), les analgésiques et anti-inflammatoires (172), les -bloquants (138), les hypolipémiants (79) et les antiépileptiques et antidépresseurs (58) (Figure 18). A l exception des -bloquants qui sont retrouvés à des concentrations inférieures au ng/l, l ensemble des classes est retrouvé à des concentrations comprises entre quelques ng/l et la dizaine de µg/l. Par ailleurs, aucune classe ne se détache des autres en terme de niveau de concentration. L étendue des gammes de concentrations semble proportionnelle au nombre d informations recueillies. sortie de STEP anti-viraux (10) anticancéreux (19) b-bloquants (138) antibiotiques (193) inhibiteurs PDE 5 (13) antidiabétiques (2) diurétiques (9) antihypertenseurs (2) vasodilatateurs (2) b-agonistes (7) antagonistes des récepteurs H2 (8) hypolipémiants (79) antiépileptiques et antidépresseurs (58) anesthésiques (2) stimulants (12) analgésiques et anti-inflammatoires (172) concentration (ng/l) Figure 18 : Plages de concentrations auxquelles les principales classes thérapeutiques peuvent être retrouvées dans les eaux traitées en sortie de station d épuration (les données de Larsson et al.,, 2007 n ont pas été intégrées ici car elles reflètent un cas particulier d eaux usées issues d industries pharmaceutiques) (nombre de données relevées dans chaque classe). A l exception de 5 molécules (4 antiviraux : penciclovir, abacavir, lamivudine, stavudine et 1 antibiotique : salinomycine), les 85 molécules détectées dans les eaux usées brutes (Figure 17) sont retrouvées dans les eaux traitées (Figure 19). Ainsi, en dépit des traitements appliqués dans les STEP, les composés identifiés en entrée le sont aussi généralement en sortie. Au sein des analgésiques et anti-inflammatoires, les composés les plus recherchés et pour lesquels le plus grand nombre de données ont été saisies sont l ibuprofène (35), le diclofénac (34), le naproxène (24), le kétoprofène (19) et le paracétamol (11). Le plus petit nombre de données recueillies pour le paracétamol, par rapport au diclofénac ou à l ibuprofène alors que dans les eaux en entrée de STEP le nombre de données était équivalent (diclo. 13, ibu. 11, para. 11), montre bien que ce dernier est moins retrouvé que les autres dans eaux traitées. Ce constat suggère que le paracétamol est mieux éliminé dans les STEP que les autres molécules de sa catégorie, ce qui est en accord avec les taux d abattement relevés dans la littérature (Figure 7). Cependant, le paracétamol et l ibuprofène restent les 2 composés possédant les plus fortes concentrations, respectivement 11,3 (France, Togola et Budzinski, 2008) et 12 µg/l (Espagne, Gros et al., 2009). Avec la caféine, ce sont les 3 seuls composés possédant des concentrations supérieures à 10 µg/l si on exclut les données relevées dans Larsson et al. (2007). Au sein des antiépileptiques et antidépresseurs, la carbamazépine demeure le composé plus recherché 70

71 Chapitre 1 : Généralités et le plus retrouvé. Ses concentrations varient entre 31 ng/l (France, Togola et Budzinski, 2008) et 6,3 µg/l (Allemagne, Ternes, 1998). Au sein des hypolipémiants, le gemfibrozil, le bézafibrate, l acide clofibrique et le fénofibrate sont les composés les plus retrouvés avec respectivement 24, 18, 13 et 11 données recueillies pour chacun. A l exception du fénofibrate, les concentrations auxquelles ils sont retrouvés varient entre quelques ng/l et quelques µg/l. Chez les antibiotiques, proportionnellement à leur niveau de consommation, les -lactames ne sont que très peu détectés dans l eau (Kümmerer, 2009a). Seul l amoxicilline est représenté Figure 19 pour avoir plus d une valeur relevée dans la littérature. Si les données de Larsson et al. (2007) sont exclues, les macrolides sont les antibiotiques les plus abondants avec des concentrations comprises entre la dizaine de ng/l et le µg/l. L érythromycine, la roxithromycine, l azithromycine et la clarithromycine sont les 4 molécules de cette famille les plus souvent recherchées et détectées. Les fluoroquinolones (ciprofloxacine, norfloxacine, ofloxacine, etc.) sont fréquemment recensés dans les effluents de STEP à des concentrations allant de la dizaine à la centaine de ng/l. A titre exceptionnel et à titre de comparaison avec l ensemble des données collectées ici, les données de Larsson et al. (2007) sont rapportées. Ils ont dosé certains fluoroquinolones comme l enrofloxacine ou la norfloxacine à des concentrations qui atteignent la centaine de µg/l et voir la dizaine de mg/l pour la ciprofloxacine dans un effluent de STEP en Inde en raison d un apport important d eaux usées provenant des industries pharmaceutiques en entrée de la station de traitement étudiée. Le sulfaméthoxazole et le triméthoprime sont les sulfonamides les plus détectés dans les effluents de STEP avec des concentrations généralement aux alentours de la centaine de ng/l et des valeurs maximales, respectivement, de 2 µg/l (Allemagne, Hirsch et al., 1999) et de 1,26 µg/l (Suède, Thomas et al., 2007). Quelques tétracyclines comme la chlortétracycline, l oxytétracycline ou la doxycycline sont détectées dans les eaux de STEP. Les antibiotiques appartenant aux autres classes sont moins recherchés et/ou retrouvés en concentrations plus faibles. Les -bloquants sont très régulièrement détectés dans les effluents de STEP à des concentrations variant du ng/l (ex. : l acébutolol à 0,4 ng/l en France, Piram et al., 2008) au µg/l (ex. : acébutolol à 3,6 µg/l, aténolol à 2,3 µg/l et sotalol à 3,3 µg/l en France Gabet- Giraud et al., 2010 ; métoprolol à 2,2 µg/l en Allemagne, Ternes, 1998 ; ou le propranolol à 1,9 µg/l aux U.S.A, Huggett et al., 2003). Comme pour les fluoroquinolones, les fortes concentrations dosées en métoprolol par Larsson et al. (2007) s expliquent par la présence d effluents industriels en amont de la STEP étudiée. Les anticancéreux, quand ils sont détectés dans les effluents de STEP, sont principalement à des concentrations de l ordre de quelques dizaines de ng/l (cyclophosphamide à 20 ng/l en Allemagne, Ternes, 1998 ; tamoxifen compris entre 53 et 102 ng/l en France, Coetsier et al., 2009) mais peuvent parfois atteindre le µg/l (ifosfamide à 2,9 µg/l en Allemagne, Ternes, 1998). Des antiviraux et en particulier des anti-vih à des concentrations variables (7,2 ng/l névirapine, 564 ng/l zidovudine ; Prasse et al., 2010) sont aussi détectés dans les eaux en sortie de stations de traitement. 71

72 Chapitre 1 : Généralités acide méfénamic acide salicylique aspirine codéine diclofénac fénoprofène flurbiprofène ibuprofène 1-hydroxy-ibuprofène 2-hydroxy-ibuprofène indométhacine kétoprofène naproxène -desméthylnaproxène paracétamol phenazone propyphenazone caféine propofol carbamazépine fluoxétine zolpidem alprazolam diazépam oxazépam lorazépam acide clofibrique acide fénofibrique acide-4-chlorobenzoïque atorvastatine mevastatine bézafibrate fénofibrate gemfibrozil cimétidine ranitidine salbutamol clenbutérol terbutaline pentoxifylline enalapril hydrochlorothiazide furosémide glibendamide sildénafil Vardenafil Tadalafil amoxicilline azithromycine clarithromycine érythromycine novobiocine roxithromycine tylosine clindamycine lincomycine ciprofloxacine danofloxacine enoxacine enrofloxacine loméfloxacine marbofloxacine norfloxacine ofloxacine sulfadiazine sulfaméthazine sulfaméthoxazole sulfapyridine sulfasalazine triméthoprime chlortétracycline doxycycline oxytétracycline métronidazole acébutolol aténolol bêtaxolol bisoprolol métoprolol nadolol oxprénolol propranolol sotalol timolol cyclophosphamide ifosfamide méthotréxate tamoxifen bléomycine acyclovir oseltamivir oseltamivir carboxylate névirapine zidovudine concentration (ng/l) Figure 19 : Concentrations relevées dans la littérature pour 94 molécules pharmaceutiques mesurées dans les eaux usées traitées en sortie de station d épuration (par souci de lisibilité, les composés n ayant qu une seule valeur n apparaissent pas et les croix représentent les données relevées dans Larsson et al., 2007). 72

73 Chapitre 1 : Généralités V.4. Les eaux de surface Avec respectivement, 732 et 779 données collectées, 122 et 124 composés différents étudiés et 16 et 17 classes thérapeutiques différentes rescensées, les eaux de surface et les eaux de rejets de STEP sont les matrices les plus analysées et pour lesquelles on dispose de plus grand nombre d information (Tableau 13). Ce constat est en accord avec celui du projet KNAPPE. Tableau 13 : Nombre d'informations recueillies dans les différentes matrices aqueuses. matrice nombre de nombre de nombre de classes données collectées composés étudiés thérapeutiques recensées rejets hôpitaux entrée STEP sortie de STEP eau de surface eau souterraine eau potable Comme pour les autres matrices aqueuses, en se basant sur le nombre de données recueillies, les principales classes thérapeutiques étudiées sont les antibiotiques, les analgésiques et antiinflammatoires, les antiépileptiques et antidépresseurs, les -bloquants et les hypolipémiants (Figure 20). La majorité des gammes de concentrations se situe entre le ng/l et quelques µg/l mais les antibiotiques et les analgésiques et anti-inflammatoires atteignent la dizaine de µg/l. Des classes thérapeutiques peu représentées et/ou peu étudiées comme les antihypertenseurs, les antagonistes des récepteurs calciques ou les vasodilatateurs sont présents à des concentrations relativement élevées de l ordre de la centaine de ng/l. Contrairement aux effluents hospitaliers, les agents de contraste ne sont plus les composés les plus abondants dans les eaux de surface. eau de surface antiviraux (22) anticancéreux (10) b-bloquants (76) antibiotiques (278) antidiabétiques (6) diurétiques (9) antihypertenseurs (4) antagonistes des récepteurs calciques (2) vasodilatateurs (2) b-agonistes (9) antagonistes des récepteurs angiotensine II (4) histamine antagonistes des récepteurs H2 (13) agents de contraste iodés (2) hypolipémiants (74) antiépileptiques et antidépresseurs (77) stimulants (22) analgésiques et anti-inflammatoires (169) concentration (ng/l) Figure 20 : Plages de concentrations auxquelles les principales classes thérapeutiques peuvent être retrouvées dans les eaux de surface (nombre de données relevées dans chaque classe). 73

74 Chapitre 1 : Généralités Certaines études montrent l impact qu un rejet de STEP peut avoir sur la contamination des rivières par exemple (Bendz et al., 2005; Kasprzyk Hordern et al., 2009). La contamination des eaux de surface par les molécules pharmaceutiques est visible dans de nombreux endroits du monde : France (Togola et Budzinski, 2008 ; Coetsier et al., 2009), Espagne (López- Roldán et al., 2010), Allemagne (Prasse et al., 2010), Royaume Unis (Kasprzyk-Hordern et al., 2007), Italie (Zuccato et al., 2000), Pologne (Kasprzyk-Hordern et al., 2007), Suède (Bendz et al., 2005), Finlande (Vieno et al., 2006), U.S.A (Huggett et al., 2002 ; Kolpin et al., 2002 ; Focazio et al., 2008), Canada (Chen et al., 2006 ; Garcia-Ac et al., 2009) Australie (Watkinson et al., 2009), Chine (Chang et al., 2010), Inde (Nageswararao et al., 2008), Japon (Nakada et al., 2006), Brésil (Stumpf et al., 1999). La majorité des concentrations relevées pour les analgésiques et anti-inflammatoires ainsi que celles relevées pour la carbamazépine et le sulfaméthoxazole se situent entre quelques ng/l et le µg/l alors que pour les autres classes thérapeutiques et les autres composés, la majorité des concentrations se situent entre quelques ng/l et la centaine de ng/l dans les eaux de surface. Au sein des analgésiques et anti-inflammatoires, les concentrations maximales recueillies sont celles du paracétamol (10 µg/l, U.S.A, Kolpin et al.,, 2002), de l acide salicylique (4,1 µg/l, Allemagne, Ternes, 1998) et de l ibuprofène (2,7 µg/l, Espagne, Fernandez et al., 2009). La caféine est fréquemment dosée dans les eaux de surface (17 données relevées) à des concentrations variant entre 4 et ng/l. La carbamazépine est le composé de la classe des antiépileptiques et antidépresseurs le plus recherché et par conséquent le plus retrouvé. Ses concentrations dans les eaux de surface varient entre 0,1 ng/l (France, AFSSA, 2009) et ng/l (Allemagne, Ternes, 1998). Dans la même classe thérapeutique, le lorazépam est fréquemment retrouvé en France (AFSSA, 2009 ; Coetsier et al., 2009 ; Vulliet et al., 2009) à des concentrations variant entre 0,7 et 39 ng/l. Au sein des hypolipémiants, le bézafibrate et le gemfibrozil sont les 2 molécules les plus détectées avec des concentrations variant respectivement entre 0,2 et ng/l et entre 0,3 et 790 ng/l. Les antibiotiques les plus dosés sont le sulfaméthoxazole (44 données relevées) et le triméthoprime (42 données relevées) pour la famille des sulfonamides et la norfloxacine (23 données relevées) pour les fluoroquinolones. Toutes familles confondues, la concentration la plus forte, 15 µg/l, a été obtenue pour la sulfadiméthoxine par Lindsey et al. (2001) aux U.S.A. Au sein des macrolides, l érythromycine et la déhydroérythromycine sont les 2 composés quantifiés aux plus fortes concentrations de 1,7 µg/l (Hirsch et al., 1999 ; Kolpin et al., 2002). La ciprofloxacine (1,3 µg/l) et la norfloxacine (1,15 µg/l) sont les deux fluoroquinolones dosées à plus d un µg/l dans les eaux de surface (Australie, Watkinson et al., 2009). En dehors de la sulfadiméthoxine, en plus d être le composé le plus recherché, le sulfaméthoxazole est aussi le plus abondant de la famille des sulfonamide avec des concentrations maximales de 2 µg/l (Australie, Watkinson et al., 2009) et 1,9 µg/l (U.S.A, Kolpin et al., 2002). L oxytétracycline est l antibiotique de la famille des tétracyclines dosé à la plus forte concentration de 1,34 µg/l (U.S.A, Lindsey et al., 2001). Les 3 -bloquants les plus recherchés et les plus mesurés sont l aténolol, le métoprolol et le propranolol. Ils sont présents à des concentrations variant respectivement entre 0,2 et 334 ng/l, entre 1 et ng/l et entre 0,1 et 590 ng/l. Les anticancéreux sont peu recherchés et peu retrouvés dans les eaux de surface. Dans cette classe, les 3 molécules identifiées sont le cyclophosphamide, le tamoxifène et la bléomycine. Les antiviraux, et en particulier les anti-vih, sont peu recherchés mais ont été retrouvés dans les eaux de surface. Les plus fortes concentrations relevées sont celles de l acyclovir (190 ng/l), utilisée dans les traitements de l herpès, et de la zidovudine (170 ng/l), utilisée dans le traitement du VIH (Prasse et al., 2010). 74

75 Chapitre 1 : Généralités concentration (ng/l) acide méfénamic acide salicylique aspirine codéine diclofénac ibuprofène hydroxy-ibuprofène carboxy-ibuprofène indométhacine kétoprofène naproxène paracétamol phenazone propyphenazone tramadol caféine diméthylxanthine carbamazépine diphénylhydantoin gabapentin chlorpromazine fluoxétine fluphénazine diazépam lorazépam oxazépam acide clofibrique acide fénofibrique acide-4-chlorobenzoïque atorvastatine parvastatine bézafibrate fénofibrate gemfibrozil iopromide cimétidine loratidine ranitidine valsartan salbutamol clenbutérol pentoxifylline déhydronifédipine enalaprilat diltiazèm hydrochlorothiazide furosémide glibendamide metformine amoxicilline azithromycine clarithromycine érythromycine érythromycine-h2 oléandomycine roxithromycine spiramycine tylosine clindamycine lincomycine ciprofloxacine danofloxacine enoxacine enrofloxacine norfloxacine ofloxacine sarafloxacine acide nalidixic acide oxolinique fluméquine sulfadiazine sulfadiméthoxine sulfaméthazine sulfaméthizole sulfaméthoxazole sulfapyridine sulfathiazole triméthoprime chlortétracycline oxytétracycline tétracycline métronidazole ornidazole chloramphénicol monensine acébutolol aténolol métoprolol nadolol propranolol sotalol timolol cyclophosphamide tamoxifen acyclovir oseltamivir oseltamivir carboxylate névirapine stavudine zidovudine Figure 21 : Concentrations relevées dans la littérature pour 100 médicaments mesurées dans les eaux de surface (par souci de lisibilité, les composés n ayant qu une seule valeur n apparaissent pas sur cette figure). 75

76 Chapitre 1 : Généralités V.5. Les eaux souterraines Dans les eaux souterraines, les analgésiques et anti-inflammatoires, les antibiotiques et les antiépileptiques et antidépresseurs demeurent les classes thérapeutiques les plus recherchées et par conséquent les plus retrouvées (Figure 22). Alors que dans les autres matrices aqueuses, les -bloquants sont fréquemment détectés, peu de données ont été relevées sur leur présence dans les eaux souterraines. Néanmoins, la gamme de concentrations auxquelles ils peuvent être quantifiés reste étendue, de quelques dixièmes de ng/l à plusieurs centaines de ng/l. Bien que les concentrations soient plus faibles que dans les effluents hospitaliers, les agents de contraste, lorsqu ils sont recherchés et détectés, sont présents à des niveaux de concentration importants, de la centaine de ng/l au µg/l. Lorsqu ils sont recherchés et détectés, les composés de certaines classes peu étudiées comme les antagonistes des récepteurs calciques (déhydronifédipine) ou les antihypertenseurs (diltiazème) sont présents à des concentrations non négligeables d une vingtaine de ng/l. b-bloquants (6) antibiotiques (22) antidiabétiques (2) diurétiques (2) antihypertenseurs (1) antagonistes des recéptueurs calciques (1) agents de contraste iodés (2) hypolipémiants (11) antiépileptiques et antidépresseurs (20) stimulants (2) analgésiques et anti-inflammatoires (28) eau souterraine concentration (ng/l) Figure 22 : Plages de concentrations auxquelles les principales classes thérapeutiques peuvent être retrouvées dans les eaux souterraines (nombre de données relevées dans chaque classe). Les concentrations auxquelles les molécules pharmaceutiques peuvent être dosées dans les eaux souterraines sont variables. En effet, deux composés de la même classe peuvent être dosés à des valeurs très différentes comme par exemple le naproxène qui est dosé à des concentrations inférieures à la dizaine de ng/l (0,4-2 ng/l) alors que l ibuprofène est dosé à des concentrations supérieures à la centaine de ng/l ( ng/l) ; mais un même composé peut également être dosé à des valeurs très différentes (ex. : acide salicylique 1, ng/l). L acide clofibrique, un hypolipémiant, est le composé qui a été relevé à la plus forte concentration (7,3 µg/l ; Allemagne, Heberer, 2002) parmi les 42 molécules pharmaceutiques répertoriées Figure 23. Le sulfaméthoxazole (9 données saisies), la carbamazépine (7 données saisies) et le diclofénac (6 données saisies) sont les composés les plus souvent recherchés dans les eaux souterraines et pour lesquels le plus d informations ont pu être recueillies. Ils sont présents à des concentrations variant respectivement entre 0,2 et ng/l, entre 0,1 et 900 ng/l et entre 0,2 et 590 ng/l. 76

77 Chapitre 1 : Généralités concentration (ng/l) acide salicylique diclofénac ibuprofène 1-hydroxy-ibuprofène kétoprofène naproxène paracétamol phenazone propyphenazone caféine diméthylxanthine carbamazépine fluoxétine bromazépam diazépam lorazépam oxazépam zolpidem acide clofibrique acide fénofibrique bézafibrate fénofibrate gemfibrozil acide amidotrizoïque iopamidol déhydronifédipine diltiazèm furosémide metformine érythromycine-h2 roxitromycine lincomycine danofloxacine enrofloxacine marbofloxacine sulfaméthazine sulfaméthoxazole clotrimazole aténolol métoprolol propranolol sotalol Figure 23 : Concentrations relevées dans la littérature pour 42 molécules pharmaceutiques mesurées dans les eaux souterraines. V.6. Les eaux de boisson Bien que les concentrations soient faibles, 41 molécules pharmaceutiques différentes appartenant à 10 classes thérapeutiques différentes ont été rapportées dans des eaux destinées à la consommation humaine (Figure 24 et Figure 25). Comme pour les autres matrices aqueuses, les analgésiques et anti-inflammatoires, les antiépileptiques et antidépresseurs, les antibiotiques, les hypolipémiants et les -bloquants sont toujours les principales classes thérapeutiques étudiées et pour lesquelles le plus d information sont disponibles. A l exception des analgésiques et anti-inflammatoires, les concentrations, auxquelles les composés sont dosés, sont généralement inférieures à quelques centaines de ng/l. 77

78 Chapitre 1 : Généralités eau potable anticancéreux (3) b-bloquants (10) antibiotiques (23) antidiabétiques (2) antagoniste des recépteurs calciques (1) agents de contraste iodés (5) hypolipémiants (21) antiépileptiques et antidépresseurs (25) stimulants (5) analgésiques et anti-inflammatoires (38) concentration (ng/l) Figure 24 : Plages de concentrations auxquelles les principales classes thérapeutiques peuvent être retrouvées dans les eaux potables (eaux en sortie de station de potabilisation ou eaux de boisson) (nombre de données relevées dans chaque classe). L AMDPH (1-acétyl-1-méthyl-2-diméthyl-oxamoyl-2-phénylhydrazide), un analgésique dérivé du diméthylaminophénazone, est le composé quantifié à la plus forte concentration dans les eaux potables (900 ng/l, Allemagne, Reddersen et al., 2002). Les deux autres analgésiques de la même famille, le phénazone et le propyphénazone, sont également dosés à de fortes concentrations, 400 ng/l et 120 ng/l respectivement (Reddersen et al., 2002). Contrairement aux autres matrices aqueuses passées en revue jusqu ici, le diclofénac ou l ibuprofène ne font plus partie des analgésiques et anti-inflammatoires les plus fortement concentrés dans les eaux potables. La concentration maximale relevée pour le diclofénac est de 3 ng/l et celle pour l ibuprofène de 1 ng/l. En revanche, le paracétamol fait toujours partie des composés les plus abondants. Sa concentration maximale est de 210 ng/l (France, Togola et Budzinski, 2008). La caféine est fréquemment détectée dans les eaux potables à des concentrations variant entre 7 ng/l (Canada, Chen et al., 2006) et 119 ng/l (U.S.A, Stackelberg et al., 2004). D après le nombre de données collectées (14), la carbamazépine est la molécule la plus détectée dans les eaux de boisson (Figure 25). Ses concentrations varient entre 0,8 ng/l (Canada, Chen et al., 2006) et 258 ng/l (U.S.A, Stackelberg et al., 2004). Des antidépresseurs comme l oxazépam et des hypolipémiants comme l acide fénofibrique ou le bézafibrate sont régulièrement retrouvés dans les eaux de boisson à des concentrations variant du dixième de ng/l (acide fénofibrique 0,2 ng/l ; France, Vulliet et al., 2009) à plusieurs dizaines de ng/l (oxazépam 56 ng/l ; France, AFSSA, 2009). Alors que les agents de contraste sont présents dans les eaux potables à des concentrations toujours supérieures à la diazine de ng/l, les concentrations relevées pour les antibiotiques sont toujours inférieures à cette valeur, à l exception de la roxithromycine quantifiée une fois à 18 ng/l (France, AFSSA, 2009). L aténolol et le métoprolol sont les deux -bloquants identifiés dans les eaux potables. Leurs concentrations sont inférieures ou égales à la dizaine de ng/l. Deux anticancéreux ont été retrouvés dans les eaux de boisson, il s agit du méthotréxate et de la bléomycine. Les anti-vih ou les inhibiteurs PDE 5 n ont jamais été recherchés dans les eaux potables. 78

79 Chapitre 1 : Généralités acide salicylique codéine diclofénac ibuprofène kétoprofène naproxène paracétamol AMDPH phenazone propyphenazone caféine carbamazépine amitriptyline fluoxétine diazépam lorazépam oxazépam acide clofibrique acide fénofibrique acide-4-chlorobenzoïque parvastatine bézafibrate diatrizoate iomeprol iopamidol iopromide déhydronifédipine metformine érythromycine roxithromycine tylosine ofloxacine acide oxolinique fluméquine sulfaméthoxazole sulfathiazole triméthoprime aténolol métoprolol méthotréxate bléomycine concentration (ng/l) Figure 25 : Concentrations relevées dans la littérature pour 41 molécules pharmaceutiques mesurées dans les eaux potables (AMDPH : 1-acetyl-1-methyl-2-dimethyl-oxamoyl-2-phenylhydrazid). V.7. Les boues des STEP D'après le bilan massique réalisé par (Heidler et Halden, 2008), basé sur un ensemble de données publiées dans des articles scientifiques à comité de lecture, la répartition des composés entre les boues et les eaux traitées ne peut pas être généralisée à l'ensemble des molécules d'une même classe thérapeutique. En effet, au sein des antibiotiques par exemple, des molécules comme le triméthoprime ou le sulfaméthoxazole, de la famille des sulfonamides, se retrouvent majoritairement dans les eaux alors que des composés de la famille des fluoroquinolones, comme la norfloxacine ou la ciprofloxacine par exemple, se retrouvent à plus de 70 % dans les boues (Figure 26). D'après Heidler et Halden (2008), la répartition des composés entre les différentes matrices (eau/boue) dans les STEP est liée à leur propriété physico-chimique et peut être estimée à partir des coefficients de partage octanol-eau (Kow) ou de la constante organique des sols (Koc). 79

80 Chapitre 1 : Généralités carbamazépine triméthoprime triméthoprime sulfaméthoxazole clarithromycine norfloxacine norfloxacine ciprofloxacine ciprofloxacine bilan massique (%) Figure 26 : Répartition des composés pharmaceutiques entre les boues (plein) et les eaux traitées (rayé) dans les STEP. En blanc apparaît la fraction perdue par dégradation (graphique adapté de Heidler et Halden, 2008). acide méfénamic diclofénac ibuprofène indométhacine kétoprofène naproxène paracétamol phenazone caféine carbamazépine fluoxéthine diazépam acide clofibrique atorvastatine bézafibrate fénofibrate gemfibrozil cimétidine famotidine ranitidine clenbutérol salbutamol oméprazole hydrochlorothiazide furosémide glibendamide sildénafil Vardenafil Tadalafil azithromycine clarithromycine érythromycine josamycine roxithromycine tylosine ciprofloxacine norfloxacine ofloxacine sulfaméthazine sulfaméthoxazole sulfapyridine sulfathiazole triméthoprime doxycycline 4-épitétracycline tétracycline métronidazole chloramphénicol miconazole aténolol nadolol pindolol propranolol sotalol concentration (ng/g) Figure 27 : Concentrations relevées dans la littérature pour 54 molécules pharmaceutiques mesurées dans les boues des stations d épuration. 80

81 Chapitre 1 : Généralités Les données, relevées dans la littérature, sur le niveau de concentration des molécules pharmaceutiques dans les boues de STEP sont présentées Figure 27. Les antibiotiques sont les composés les plus abondants dans les boues de STEP avec des concentrations dépassant fréquemment le µg/g en particulier pour les familles des macrolides (ex. : azithromycine 5,2 µg/g (US EPA, 2009) ; tylosine 4 µg/g (Nieto et al., 2007)) ; des fluoroquinolones (ex. ciprofloxacine 97,5 µg/g (Thomas et al., 2007) ; ofloxacine 58,1 µg/g (US EPA, 2009)) ou des tétracyclines (ex. : tétracycline 5,27 µg/l (US EPA, 2009) ; doxycycline 5,09 (US EPA, 2009)). Les fortes concentrations en fluoroquinolones relevées concordent avec les résultats du bilan massique réalisé par Heidler et Halden (2008). En revanche, certains antibiotiques comme le sulfaméthoxazole qui faisait partie des composés les plus abondants dans les eaux traitées (Figure 21) sont parmi les antibiotiques les moins concentrés dans les boues de STEP. En plus des antibiotiques, 3 composés, la carbamazépine (max. 6,03 µg/g), la fluoxétine (max. 3,13 µg/g) et la cimétidine (max. 8,33 µg/g), sont dosés à des concentrations supérieures au µg/g dans les boues de STEP (US EPA, 2009). Contrairement aux eaux traitées, les composés appartenant aux classes des hypolipémiants et des analgésiques et anti-inflammatoires ne sont pas les plus présents dans les boues de STEP. Leurs concentrations sont inférieures à la centaine de ng/g. Bien que présents en faible quantité, des inhibiteurs de PDE 5 ont été détectés dans les boues de STEP à des concentrations variant entre 3 et 17 ng/g de boue (Allemagne, Nieto et al., 2010a). V.8. Les effluents d élevage et les sols amendés avec les effluents d élevage En médecine vétérinaire, deux classes de molécules pharmaceutiques sont majoritairement administrées aux animaux d'élevage : les antibiotiques et les antiparasitaires. Les antiparasitaires n'ont pas été étudiés au cours de cette synthèse bibliographique car ils ne constituent qu'un quart des ventes de médicaments vétérinaires. De plus, certains principes actifs antiparasitaires peuvent également être utilisés dans des produits phytosanitaires (AFSSA, 2010). Ainsi la présence dans l'environnement de ces composés n'est pas exclusivement liée à leur usage médical. En raison de leur forte utilisation dans le traitement des animaux, la tétracycline, l'oxytétracycline et la chlortétracycline pour la famille des tétracyclines, la sulfadiazine, la sulfaméthazine et le triméthoprime pour la famille des sulfonamides et la tylosine pour la famille des macrolides sont les antibiotiques les plus souvent recherchés dans les effluents d élevage (Tableau 14). Thiele-Bruhn (2003) rapporte des concentrations de 3,5 mg/kg pour les sulfonamides et de 4 mg/kg pour les tétracyclines dans les lisiers et fumiers. En France, d après le rapport de l ADEME de Algros et Jourdain (2007), l oxytétracycline, la doxycycline, la tétracycline, la sulfaméthazine et la fluméquine ont été dosées respectivement à 20,4 µg/l, 0,53 µg/l, 0,19 µg/l, 4,59 µg/l et 1,51 µg/l dans des lisiers mais de la tylosine, de la clindamycine, de l acide oxolinique et de l enrofloxacine ont aussi été détectés. D après ce même rapport, dans des fumiers, de l oxytétracycline (1,61 mg/kg), de la tylosine (0,65 mg/kg), et de la sulfaméthazine (0,18-0,73 mg/kg) ont été trouvées. L ordre de grandeur de la contamination des lisiers et fumiers est le µg/g ou µg/l. 81

82 Chapitre 1 : Généralités Tableau 14 : Concentrations des antibiotiques analysés dans les effluents d'élevage et les sols enrichis avec ces déchets (ng/g). composés matrices quantités trouvées références bibliographiques tylosine sol 9 jours après épandage 8-57,4 Jacobsen et al., 2004 sol 155 jours après épandage 2,9-18 Jacobsen et al., 2004 lincomycine lisier hiver Hu et al., 2010 sol hiver 1,1-11,7 Hu et al., 2010 ciprofloxacine sol 450 Martinez-Carballo et al., 2007 lisier hiver Hu et al., 2010 sol hiver 10,3-30,1 Hu et al., 2010 sol été 0,8 Hu et al., 2010 enrofloxacine lisier porcin (fosse) µg/l Pierini et al., 2004 lisier porcin (lagune) < 0,6 µg/l Pierini et al., 2004 lisier porcin Martinez-Carballo et al., 2007 lisier de poulet Martinez-Carballo et al., 2007 lisier de dinde Martinez-Carballo et al., 2007 sol 370 Martinez-Carballo et al., 2007 ofloxacine lisier hiver Hu et al., 2010 lisier été Hu et al., 2010 sol été 0,6-1,6 Hu et al., 2010 péfloxacine lisier hiver Hu et al., 2010 sulfachloropyridazine lisier hiver Hu et al., 2010 lisier été Hu et al., 2010 sol hiver 1,3-2,5 Hu et al., 2010 sol été 0,18 Hu et al., 2010 sulfadiazine lisier de poulet Martinez-Carballo et al., 2007 lisier de dinde Martinez-Carballo et al., 2007 sulfadoxine lisier hiver Hu et al., 2010 lisier été Hu et al., 2010 sol hiver 1,2-9,1 Hu et al., 2010 sulfaméthazine lisier porcin Martinez-Carballo et al., 2007 lisier hiver Hu et al., 2010 lisier été Hu et al., 2010 sol hiver 0,1-0,9 Hu et al., 2010 sol été 0,03 Hu et al., 2010 triméthoprime lisier de poulet Martinez-Carballo et al., 2007 chloramphénicol lisier hiver Hu et al., 2010 lisier été Hu et al., 2010 sol hiver 0,1-1,1 Hu et al., 2010 chlortétracycline lisier porcin 100 Hamscher et al., 2002 sol 4,6-7,1 Hamscher et al., 2002 lisier porcin Martinez-Carballo et al., 2007 lisier de poulet Martinez-Carballo et al., 2007 lisier de dinde Martinez-Carballo et al., 2007 sol 9 jours après épandage 8,9-15,5 Jacobsen et al., 2004 sol 155 jours après épandage 0,7-0,8 Jacobsen et al., 2004 lisier hiver Hu et al., 2010 lisier été Hu et al., 2010 sol hiver 33, Hu et al., 2010 oxytétracycline lisier porcin Martinez-Carballo et al., 2007 lisier de poulet Martinez-Carballo et al., 2007 lisier hiver Hu et al., 2010 lisier été Hu et al., 2010 sol hiver Hu et al., 2010 tétracycline lisier porcin Hamscher et al., 2002 sol Hamscher et al., 2002 lisier porcin Martinez-Carballo et al., 2007 lisier hiver Hu et al., 2010 lisier été Hu et al., 2010 sol hiver 20,9-105 Hu et al., 2010 sol été 2,5 Hu et al.,

83 Chapitre 1 : Généralités Thiele-Bruhn (2003) rapporte des concentrations de µg/kg pour les tétracyclines, de µg/kg pour les macrolides et de 6-52 µg/kg pour les fluoroquinolones dans des sols amendés par des déchets d élevage. Dans ce même type de matrice, Kemper (2008) rapporte des concentrations de 305 µg/kg pour l oxytétracycline, de 200 à 900 µg/kg pour la tétracycline, de 39 µg/kg pour la chlortétracycline, de 6 à 52 µg/kg pour la ciprofloxacine, de 11 µg/kg pour la sulfaméthazine, de 8,5 µg/kg pour la lincomycine, de 1 µg/kg pour la sulfadiazine et de 0,5 µg/kg pour le triméthoprime. L ordre de grandeur de la contamination du sol après enrichissement par des déchets d élevage est de la dizaine à la centaine de µg/kg soit la perte d un facteur dix à cent par rapport aux effluents d élevage. V.9. Les sédiments Peu d études portent sur l analyse des molécules pharmaceutiques dans les sédiments. En effet, alors que 425 références d articles sont parus en 2009 (213) et en 2010 (212) sur l étude des molécules pharmaceutiques dans l environnement (Figure 1), seulement une cinquantaine, 28 en 2010 et 26 en 2009, traitent des sédiments (résultats obtenus après une recherche dans la base de données Scopus en indiquant les termes «pharmaceutical» et «sediment» à rechercher dans le titre, le résumé ou les mots clés et en éliminant les articles traitant des tests de toxicité en laboratoire). Par ailleurs, lorsque les molécules pharmaceutiques sont recherchées dans les sédiments, elles ne sont pas toujours détectés (Jelić et al., 2009 ; Pérez- Carrera et al., 2010). Tableau 15 : Concentrations en antibiotiques trouvées dans les sédiments (ng/g). composés pays valeur valeur référence minimale maximale bibliographique érythromycine Italie 0,01 0,63 Zuccato et al., 2000 érythromycine-h 2 Chine 1, Yang et al., 2010 roxithromycine Chine 0, Yang et al., 2010 spiramycine Italie 0,38 2,9 Zuccato et al., 2000 tylosine Italie 0,13 2,64 Zuccato et al., 2000 lincomycine Italie 0,13 Zuccato et al., 2000 ciprofloxacine Chine 9, Yang et al., 2010 norfloxacine Chine 19, Yang et al., 2010 ofloxacine Chine 11, Yang et al., 2010 sulfadiazine Chine 3,08 83,9 Yang et al., 2010 sulfaméthazine Chine 1, Yang et al., 2010 tétracycline Chine 2,96 72 Yang et al., 2010 oxytétracycline Chine 0, Yang et al., Halling-Sorensen et al., 1998 (d'après Björklund et al., 1990 et 1991 ; Coyne et al., 1994 ; Poliquen et al., 1993; Weston et al., 1994 ; Kerry et al., 1995) Halling-Sorensen et al., 1998 (d'après Samuelsen et al., 1992) Halling-Sorensen et al., 1998 (d'après Jacobsen et Berglind, 1988) Thiele-Bruhn,

84 Chapitre 1 : Généralités Quelques données, relevées dans la littérature, sur la contamination des sédiments par les antibiotiques sont présentées dans le Tableau 15. Les fluoroquinolones comme la norfloxacine et l ofloxacine sont dosées à des concentrations importantes de l ordre du mg/kg par Yang et al. (2010) mais les valeurs les plus fortes sont rapportées par Halling-Sorensen et al. (1998) pour l oxytétracycline avec une concentration maximale de 285 mg/kg. VI. Toxicité et écotoxicité Les molécules pharmaceutiques sont produites pour être biologiquement actives et agir sur les récepteurs humains et animaux ou être toxiques envers les organismes infectieux (Jelić et al., 2009). Cependant, elles peuvent être la cause de réactions indésirables dans les organismes (toxicité), ou être responsable d'effets néfastes dans les écosystèmes (écotoxicité). Lorsque le médicament a volontairement été consommé et que des réactions indésirables se produisent, on parle d'effet secondaire. Ce sujet est abordé dans le premier paragraphe de la partie sur la toxicité des molécules pharmaceutiques. Des interactions entre les molécules pharmaceutiques et des organismes non ciblés peuvent également avoir lieu, et être néfastes pour ces organismes, s ils possèdent les sites d actions de ces molécules (ex. : enzymes, récepteurs, etc.). Ce volet est étudié dans le deuxième paragraphe de la première partie. Pour estimer la toxicité d une molécule et définir les concentrations auxquelles des effets toxiques sont observés, des tests de toxicité sont réalisés. Ce sujet est traité dans le troisième paragraphe de la première partie. La deuxième partie est consacrée à la problématique de l'antibiorésistance. Enfin, la troisième partie est dédiée à l'écotoxicité des molécules pharmaceutiques au travers de la démarche de l'évaluation du risque environnemental (ERA, Environmental Risk Assessment). VI.1. Toxicité VI.1.1. Effets secondaires / indésirables des médicaments La toxicité d'un médicament peut s'évaluer d'après les effets indésirables qu'il génère. Selon les directives 2001/83/CE et 2001/82/CE, un effet indésirable est «une réaction nocive et non voulue à un médicament, se produisant aux posologies normalement utilisées chez l'homme/l animal pour la prophylaxie, le diagnostic ou le traitement d'une maladie ou pour la restauration, la correction ou la modification d'une fonction physiologique». Par conséquent, un médicament peut être nocif et représenter un danger pour l'homme ou l'animal à qui il a été administré. Les effets indésirables ou effets secondaires de certains médicaments, comme les antibiotiques qui provoquent des troubles digestifs, sont parfois courants et ne représentent pas un grave danger. En revanche, les réactions allergiques à la pénicilline par exemple peuvent être plus graves jusqu à provoquer des chocs anaphylactiques. De même, l hépatotoxicité du paracétamol ne représente pas un risque aux posologies habituelles mais un surdosage important entraîne la mort. Les anti-inflammatoires non stéroïdiens comme l'ibuprofène, de par leur mode d'action, détruisent les globules blancs du système immunitaire. De plus, ils sont responsables de troubles gastro-intestinaux et de la formation d ulcères (dictionnaire Vidal, 2006). L ibuprofène est également un néphro-toxique. Certains antidépresseurs sont également responsables de troubles digestifs (nausée, constipation, etc.) et de tachycardie. Les -bloquants peuvent provoquer des troubles cardiaques, une constriction des bronches ou des hypoglycémies (http://www.cite-sciences.fr/lexique/ 84

85 Chapitre 1 : Généralités definition1.php?definition=2&idmot=395&iddef=876&idmedia=&page=&rech_lettre=b&nu m_page=4&recho=&radiob=&resultat=&habillage=standard&lang=fr&id_expo=25&id_habil lage=42, 24/11/2006). Les anticancéreux agissent sur la reproduction et la division des cellules cancéreuses mais ils peuvent aussi interagir avec toutes les cellules de l organisme et provoquer de nombreux effets secondaires comme des problèmes de toxicité gastrointestinale, rénale, vésicale, dermatologique, cardiaque, hépatique, pulmonaire, (http:// http: //www.med.univ-rennes1.fr/resped/s/pharma co/antican/an tican.ppt, 24/11/2006). Les antiviraux utilisés pour le traitement du VIH sont lourds à supporter à cause de leurs effets secondaires tels que les diarrhées, les nausées, les neuropathies (affection des cellules nerveuses), la lipodystrophie (modification de la répartition des graisses dans le corps : creusement des joues, amas de graisses au niveau du cou, du ventre ) ou encore les effets neuropsychiques (vertiges, troubles d humeur, dépression) (http://www.solidaritesida.org/index.php3?dossier=sidamst&partie=sidamst_traitements, 26/02/2008). L'organisation mondiale pour la santé (MS) écrit même à propos des anti-vih qu'il sont "responsables d un large éventail de toxicités allant de la simple intolérance de grade 1 ou 2 (gêne légère, limitation des activités) et de résolution spontanée, aux effets secondaires pouvant mettre en jeu le pronostic vital" (MS, 2008). En conséquence, même volontairement consommés les médicaments ne sont pas sans risque pour la santé humaine. VI.1.2. Toxicité envers les organismes non ciblés Une fois que les molécules pharmaceutiques ont atteint les écosystèmes naturels, si les récepteurs avec lesquels elles interagissent sont présents dans les organismes non ciblés, elles pourront avoir un effet sur ces organismes. Par exemple, des -bloquants comme le métoprolol peuvent agir sur les récepteurs 1 des érythrocytes de truites ou le nadolol et le propranolol peuvent agir à la fois sur les récepteurs 1 des érythrocytes et sur les récepteurs 2 des cellules cardiaques de truites arc-en-ciel (Huggett et al., 2003). De la même façon, des anti-inflammatoires non-stéroïdiens activent les cytochromes P 450 de différents organismes et la fluoxétine inhibe l activité de l acétylcholine-estérase. Le sulfaméthizole inhibe l activité basale de l ERD (éthoxyresorufin--deéthylase) (Laville et al., 2004 dans Boxall, 2004). Dans leur synthèse bibliographique sur la toxicité et l écotoxicité des molécules pharmaceutiques, Fent et al. (2006) passent en revue différentes classes thérapeutiques, le mode d action des molécules qui les composent et l existence ou non des récepteurs et biomolécules dans les organismes vertébrés ou invertébrés. Les AINS par exemple inhibent les enzymes cyclo-oxygénases (CX) ; or des homologues de ces enzymes CX ont été trouvés chez la truite arc-en-ciel (ncorhynchus mykiss). Les AINS pourraient donc avoir un effet sur la truite arc-en-ciel. De la même façon, les fibrates (hypolipémiants) se fixent sur les récepteurs PPAR (Peroxysome Proliferator-Activated Receptors) pour stimuler l expression de la lipoprotéine lipase or des gènes PPAR ont été trouvés chez divers poissons comme le carrelet, le saumon d Atlantique ou le poisson zèbre (Fent et al., 2006). Par ailleurs, des effets toxiques ont été mis en évidence sans pour autant que des homologies de récepteurs aient été recherchées. Selon Gagné et al. (2006), la pénicilline G, à 100µM, provoque le déclanchement du métabolisme oxydatif par l oxydation du NADPH dans des hépatocytes de truites (tests in vitro) et il en est de même pour le sulfaméthoxazole, la sulfapyridine, l oxytétracycline et la novobiocine. Une étude réalisée in vitro par Miller et al. (1999) met en évidence une inhibition de la synthèse de la vitellogénine par le paracétamol dans des cellules de foie de truites. Pour Pomati et al. (2006), 13 molécules pharmaceutiques 85

86 Chapitre 1 : Généralités en mélange (aténolol, bézafibrate, carbamazepine, cyclophosphamide, ciprofloxacine, furosémide, hydrochlorothiazide, ibuprofène, lincomycine, ofloxacine, ranitidine, salbutamol et sulfaméthoxazole) inhibent la croissance des cellules embryonnaires HEK293 de 10 à 30 % et cette inhibition est associée à une réponse au stress cellulaire et au blocage du cycle cellulaire. Pour Caminada et son équipe (2006), d après des tests in vitro de toxicité cellulaire, la doxorubicine est cytotoxique à partir de 1,14 mg/l. D autres études se sont focalisées sur la mise en évidence d'effets toxiques comme la génotoxicité, la mutagénicité ou la cytotoxicité. Ainsi Hartmann et ses co-auteurs (1998) ont montré au travers de tests umuc que les composés responsables de la génotoxicité des eaux usées d hôpitaux n étaient pas des anticancéreux comme la doxorubicine, la bléomycine, le cisplatine, la dacarbazine, l étoposide, le fluorouracil ou la mitomycine C mais la ciprofloxacine, un antibiotique de la famille des fluoroquinolones. Toujours d après ces auteurs, les antibiotiques tels que l amoxicilline, la norfloxacine, le métronidazole et l ornidazole ne sont pas des composés génotoxiques. En revanche pour Giuliana et ses collaborateurs (1996 dans Halling-Sørensen et al., 1998), le cisplatine et la mitomycine C sont responsables de la génotoxicité des rejets hospitaliers. Par ailleurs, les anticancéreux tels que l ifosfamide et le cyclophosphamide (Steger-Hartmann et al., 1996 et 1997) ou les antibiotiques de la classe des quinolaxines tels que le carbadox et l olaquindox (Beutin et al., 1981) sont présentés comme mutagènes et cancérigènes. Enfin, dans un autre domaine, Huggett et al. (2002) ont étudié la reprotoxicité du propranolol. Ce -bloquant affecte la reproduction (diminution du nombre de nouveaux-nés par femelle) de l amphipode Hyalella azteca après 27 jours d exposition à 100 µg/l. Il peut également affecter la reproduction du cladocère Ceriodaphnia dubia en provoquant une diminution du nombre de nouveaux-nés par individu après 7 jours d exposition à 250 µg/l. De plus, après 2 semaines d exposition au propranolol à des concentrations inférieures ou égales à 500 µg/l, le nombre d œufs pondus et le pourcentage d œuf viables éclos ne change pas mais, le niveau de testostérone chez les médakas mâles est diminué et celui d oestradiol chez les médakas femelles augmenté. En revanche, le propranolol réduit le nombre d œufs pondus par ryzias latipes (médaka) et le pourcentage d œuf viables éclos après 4 semaines d exposition à 0,5 µg/l. VI.1.3. Estimation de la toxicité (EC 50, LEC, NEC, etc.) Pour estimer l'impact des molécules pharmaceutiques sur les communautés ou sur les organismes, des tests de toxicité sont réalisés. Classiquement, ils sont pratiqués sur des vertébrés comme les médakas ou les poissons zèbres, des invertébrés comme les daphnies ou des cyanobactéries (recommandées pour les antibiotiques). Ils permettent de définir les concentrations effectives (EC 50, concentrations pour lesquelles la molécule aura un impact sur la croissance ou la reproduction de 50 % des organismes étudiés), les concentrations léthales (LC 50, concentrations pour lesquelles la molécule provoquera la mort de 50 % des individus) ou encore les LEC (Lowest bserved Effects Concentration) et les NEC (No bserved Effects Concentration) c'est-à-dire les plus petites concentrations provocant des effets observables et les concentrations n'entraînant pas d'effets observables. 86

87 Chapitre 1 : Généralités Figure 28 : Concentrations des molécules pharmaceutiques provoquant des effets toxiques aigus sur les algues, les cyanophytes (cyanobactéries), les invertébrés et les poissons (EC 50 ) (graphique extrait d'une présentation de J. Garric, mai 2009 (http://www.onema.fr/img/pdf/j.garric_cemagref_atelier_3.pdf, 15/12/10)). Des niveaux de concentrations provoquant des effets toxiques aigus (EC 50 ) sont présentés Figure 28. La majorité des valeurs de toxicité aiguë chez les invertébrés sont comprises entre le mg/l et la centaine de mg/l. Cependant, des antidépresseurs comme la sertraline, la paroxétine ou la fluoxétine présentent des EC 50 plus faibles de l'ordre de la centaine de µg/l. De même, le propranolol présente des EC 50 plus faibles que les autres composés ou que les autres -bloquants comme le nadolol ou l'acébutolol. Néanmoins, à l exception des eaux usées (rejets hospitaliers et entrée de STEP), les molécules pharmaceutiques sont rarement dosées à des concentrations supérieures à la dizaine de µg/l. Il y a donc peu de risque que les molécules pharmaceutiques soient toxiques (toxicité aiguë) pour les invertébrés aux concentrations environnementales auxquelles elles sont mesurées. La toxicité aiguë des molécules pharmaceutiques envers les algues et les cyanobactéries (cyanophytes) a majoritairement été testée pour les antibiotiques et quelques autres composés. Les concentrations effectives relevées sont comprises entre la centaine de µg/l et la dizaine de mg/l pour les algues, à l'exception de celles de la clarithromycine et de l'érythromycine, deux antibiotiques de la famille des macrolides, et de la fluoxétine, un antidépresseur, qui sont comprises entre le µg/l et la centaine de µg/l. Les concentrations effectives relevées sont comprises entre le µg/l et la centaine de µg/l pour les cyanobactéries. Avec les plus faibles 87

88 Chapitre 1 : Généralités EC 50 (< 10 µg/l), l'amoxicilline, la pénicilline G (benzylpénicilline), la spiramycine, la streptomycine et la ciprofloxacine sont les antibiotiques les plus toxiques pour les cyanobactéries. Dans l environnement, des concentrations de l ordre de quelques µg/l ont été relevées pour les antibiotiques. Aussi, le risque que les antibiotiques soient toxiques (toxicité aiguë) pour les cyanobactéries aux concentrations environnementales auxquelles ils sont mesurés existe. Figure 29 : Concentrations des molécules pharmaceutiques provoquant (EC 50 ) ou ne provoquant pas (NEC) des effets toxiques chroniques sur les algues, les cyanophytes (cyanobactéries), les invertébrés et les poissons (graphique extrait d'une présentation de J. Garric, mai 2009 (http://www.onema.fr/img/pdf/j.garric_cemagref_atelier_3.pdf, 15/12/10)). Des niveaux de concentrations provocant ou non des effets toxiques chroniques (EC 50 ou NEC) sont présentés Figure 29. Les concentrations sans effets observables sur les invertébrés sont généralement supérieures à la centaine de µg/l mais des NEC de l'ordre du µg/l ont été relevées pour la sertraline, le propranolol et le clofibrate. Ces informations sur la sertraline et le propranolol viennent confirmer les données de toxicité aiguë (Figure 28). Par rapport aux concentrations environnementales auxquelles les molécules pharmaceutiques sont mesurées, le risque qu elles soient toxiques (toxicité chronique) pour les invertébrés est limité mais pourrait s exprimer pour quelques molécules comme la sertraline ou le propra- 88

89 amoxicilline mécillinam pénicilline G clarithromycine érythromycine roxithromycine tylosine Tableau 16 : Concentrations effectives en µg/l (EC50) pour 24 antibiotiques relevées dans la littérature (Halling-Sorensen et al., 1998 ; Holten Lützhoft et al., 1999 ; Halling-Sorensen et al., 2000 ; Golet et al., 2002a ; Thiele-Bruhn, 2003 ; Ferrari et al., 2004 ; Huschek et al., 2004). ciprofloxacine fluméquine ofloxacine sarafloxacine acide oxolinique sulfadiazine sulfaméthoxazole triméthoprime chlortétracycline oxytétracycline tétracycline métronidazole streptomycine chloramphénicol bacitracine lincomycine olaquindox bactérie , bactéries Vibrio sp Pseudomonas putida Microcystis aeruginosa 3, cyanobactéries Synechococcus leopolensis 16 26,8 Selenastrum capricornutum Pseudokirchneriella subcapitata algues Chlorella sp Cyclotella meneghiniana 90, Rhodomonas salina zooplancton Daphnia magna poisson Chapitre 1 : Généralités 89

90 Chapitre 1 : Généralités nolol. Comme dans le cas de l'évaluation des effets toxiques aigus, la toxicité chronique des molécules pharmaceutiques envers les algues et les cyanobactéries (cyanophytes) a principalement été évaluée pour les antibiotiques et quelques autres composés. A l'exception de la fluoxétine, les NEC sont comprises entre la dizaine de µg/l et la centaine de mg/l pour les algues. Les NEC pour les cyanobactéries sont inférieures à la dizaine de µg/l pour les antibiotiques alors qu'elles sont supérieures à la centaine de mg/l pour les autres molécules pharmaceutiques. Ce constat met en évidence le caractère plus toxique des antibiotiques par rapport aux autres médicaments vis-à-vis des cyanobactéries. Ce point est confirmé par les EC 50 des antibiotiques pour les cyanobactéries (cyanophytes). Les EC 50 sont majoritairement comprises entre le µg/l et la centaine de µg/l ce qui est proche ou du même ordre de grandeur que certaines concentrations mesurées dans les eaux de surface (ex. : ciprofloxacine 1,3 µg/l Watkinson et al., 2009). En conclusion, que se soit du point de vue de la toxicité aiguë ou de la toxicité chronique, les antibiotiques sont davantage toxiques envers les cyanobactéries qu'envers les autres taxons et semblent être pour ces espèces les molécules pharmaceutiques les plus toxiques. En raison du caractère plus toxique des antibiotiques par rapport aux autres molécules pharmaceutiques, les informations à suivre dans ce paragraphe ne concerneront que cette classe de médicaments. Des valeurs de EC 50, LC 50, NEC et LEC relevées dans la littérature ont été rassemblées dans l Annexe - tableau 9. Le Tableau 16 récapitule ici l'ensemble des EC 50 qui ont été collectées. Selon l'antibiotique concerné et l'organisme testé, les valeurs des concentrations effectives peuvent être très variables. Par exemple, l'amoxicilline est le composé qui possède à la fois la plus forte (3,7 µg/l vis-à-vis de Microcystis aeruginosa) et la plus faible toxicité (3 108 mg/l vis-à-vis de Rhodomonas salina). De même, Holten Lützhøft et ses collaborateurs (1999) ont montré que la sensibilité à un même antibiotique ou à une même classe d antibiotiques était très variable entre une cyanobactérie d eau douce (Microcystis aeruginosa), une algue verte d eau douce (Selenastrum capricornutum) et une cryptophycée marine (Rhodomonas salina) (Tableau 17). Tableau 17: Différences de sensibilité d'une cyanobactéries et de 2 algues à différents antibiotiques (d après Holten Lützhøft et al., 1999), (0,015) : en dehors de la gamme de mesure du test pratiqué. Microcystis aeruginosa antibiotique (EC 50, mg/l) Rhodomonas salina antibiotique (EC 50, mg/l) Selenastrum capricornutum antibiotique (EC 50, mg/l) Amoxicilline (0,0037) xytétracycline (1,6) xytétracycline (4,5) Sarafloxacine (0,015) Acide xolinique (10) Fulméquine (5) Sulfadiazine (0,135) Triméthoprime (16) Sulfadiazine (7,6) Fulméquine (0,159) Fulméquine (18) Acide xolinique (16) Acide xolinique (0,180) Sarafloxacine (24) Sarafloxacine (16) xytétracycline (0,207) Sulfadiazine (403) Triméthoprime (130) Triméthoprime (112) Amoxicilline (3,108) Amoxicilline (250) Néanmoins, les données de EC 50 (Tableau 16) viennent confirmer l'effet toxique possible des antibiotiques sur les bactéries et cyanobactéries puisque certaines EC 50 sont comparables à des concentrations environnementales. Par exemple, la ciprofloxacine a été quantifiée par Watkinson et al. (2009) à 1,3 µg/l dans des eaux de surface alors que Halling-Sorensen et al. (2000) ont noté une EC 50 de ce même composé à 5 µg/l vis à vis des cyanobactéries 90

91 Chapitre 1 : Généralités Microcystis aeruginosa et que Golet et al. (2002a) ont noté une LEC de la ciprofloxacine sur les bactéries Salmonella thyphimurium à 5 µg/l. Concernant les autres taxons, les valeurs des EC 50 sont supérieures aux concentrations mesurées dans l'environnement (Figure 21, Figure 23, Figure 25) et le risque que les antibiotiques soient toxiques pour eux est faible. Dans un autre domaine, au niveau du sol, Hamscher et al. (2002) ont mis en évidence un risque de toxicité aiguë pour les bactéries en contact avec des blocs de lisiers ou fumiers qui ne se seraient pas mélangés au sol lors de leur épandage. En effet, des concentrations en tétracycline et chlortétracycline de l ordre de 0,35 mg/kg et 1,44 mg/kg ont été relevées dans ces blocs or la concentration minimale inhibitrice (MIC), c'est-à-dire la plus petite concentration pour laquelle la croissance des bactéries est affectée, est comprise entre 0,5 et 2 mg/l pour ces antibiotiques. En dehors des tests de toxicité, il existe une autre façon pour définir les effets toxiques des molécules pharmaceutiques sur les organismes. Elle consiste à utiliser la modélisation. L approche QSAR (Quantitative Structure Activity Relationship) par exemple est cette mise en avant par la directive REACH (Registration, Evaluation, Authorisation and Restriction of Chemicals) (Kar et Roy, 2010). Cette technique ne sera pas détaillée ici mais il est intéressant de noter que par sa mise en œuvre, Escher et al. (2010) et Kar et Roy (2010) ont pointé un risque de toxicité pour les anti-vih comme le ritonavir dans les rejets hospitaliers (Escher et al., 2010) ou la stavudine vis-à-vis des poissons (Kar et Roy, 2010). VI.2. Antibiorésistance Que ce soit en santé humaine ou du point de vue environnemental, un danger spécifique aux antibiotiques est à noter. Il s agit des phénomènes de résistances bactériennes aux antibiotiques. Ces phénomènes ont pour conséquence la difficulté à traiter et guérir certaines maladies jusqu ici facilement soignables. Sur la page de présentation du site internet de l InVS (Institut de Veille Sanitaire) dédié au suivi de la résistance aux anti-infectieux, on peut lire : «La France connaît, depuis la fin des années 1970, une diffusion épidémique des staphylocoques dorés résistants à la méticilline (SARM) dans les établissements de santé. En médecine de ville, un tiers des pneumocoques est aujourd hui résistant à la pénicilline alors qu ils étaient largement sensibles à cet antibiotique il y a 15 ans. Ils nécessitent une antibiothérapie de plus en plus lourde, notamment pour la prise en charge des infections de l oreille moyenne chez l enfant. A l échelon mondial, le traitement des cas de tuberculose multirésistante aux antibiotiques représente un surcoût important et le paludisme chimiorésistant une cause notable de décès (1,5 à 2,7 millions de personnes dans le monde).» (http://www.invs.sante.fr/surveillance/resistance/, 14/12/2010) Certaines bactéries sont résistantes à des antibiotiques de manière innée. n parle de résistance naturelle. D autres sont initialement sensibles à certains antibiotiques mais y deviennent résistantes suite à des modifications génétiques, on parle de résistance acquise. Les modifications génétiques proviennent de mutations sur les chromosomes bactériens ou d échanges de plasmides ou de transposons entre bactéries. Lorsque les modifications touchent le chromosome bactérien, la résistance qui en résulte ne concerne généralement qu un antibiotique ou une famille d antibiotiques. Elle est héréditaire mais ne peut être transmise aux autres bactéries en dehors de la descendance. En revanche, lorsque les modifications proviennent d un transfert de plasmide par exemple, les bactéries peuvent devenir polyrésistantes en étant insensibles à plusieurs antibiotiques ou familles 91

92 Chapitre 1 : Généralités d antibiotiques. En effet, les bactéries peuvent déjà être résistantes, de façon innée ou acquise, à certains antibiotiques et acquièrent par ces transferts de nouvelles résistances. Les transferts peuvent avoir lieu d une souche ou d une espèce de bactéries à une autre. La résistance plasmidique est donc transmissible à la descendance comme aux autres bactéries. Plusieurs mécanismes sont responsables de la résistance : la production d enzymes inhibant l antibiotique (ex. : les -lactamases), l imperméabilisation de la membrane de la bactérie ou la modification de la cible de l antibiotique (ex. : protéine de liaison de la pénicilline, cible ribosomiale, etc.). (http://www.invs.sante.fr/surveillance/resistance/, 14/12/2010) L utilisation importante des antibiotiques en médecines humaines et animales est considérée comme la raison majeure de l accroissement de la résistance bactérienne aux antibiotiques, et de la contamination de l environnement (eau et sol) par les antibiotiques. Dans le corps humain ou animal, les bactéries résistantes sont sélectionnées en cas d antibiothérapie de durée insuffisante ou inadaptée ou si les quantités d antibiotiques utilisés sont trop faibles. Dans ces différents scénarii, les bactéries les plus sensibles disparaissent et seules les bactéries qui ont résisté au traitement survivent et se multiplient. Dans l environnement, 2 hypothèses expliqueraient l existence de bactéries résistantes : i) la présence constante d antibiotiques, consécutive aux rejets humains (effluents de STEP) ou animaux (épandage lisier/fumier sur les sols agricoles), à des concentrations inférieures aux seuils thérapeutiques (Goñi-Urriza et al., 2000); ii) le rejet dans le milieu de bactéries résistantes présélectionnées dans les organismes humains ou animaux (Séveno et al., 2002 ; Reinthaler et al., 2003 ; Salyers et al., 2004). Dans la première hypothèse, la sélection de bactéries résistantes se ferait dans l environnement alors que dans la deuxième hypothèse, il y aurait un transfert de gène porteur de résistance entre des bactéries d origine fécale (humaine ou animale) et des bactéries uniquement présentes dans le milieu naturel. La présence de bactéries résistantes aux antibiotiques dans l environnement, et en particulier dans les eaux, représente un danger sanitaire et un danger écologique. En effet, du point de vue sanitaire, l homme est exposé à ces bactéries résistantes soit de façon directe lorsqu elles survivent aux traitements de potabilisation et qu elles sont consommées avec les eaux de boisson ou lorsqu elles ont remonté la chaîne alimentaire jusqu aux coquillages filtreurs consommés par les hommes, comme les moules par exemple ; soit de façon indirecte lorsqu elles sont dans les eaux récréatives comme les eaux de baignades. Du point de vue environnemental, un premier risque est lié à la dissémination de gène de résistance au sein des communautés microbiennes. Le deuxième risque écologique est lié aux possibles perturbations des communautés microbiennes autochtones impliquées dans les cycles biogéochimiques. VI.3. Evaluation du risque environnemental VI.3.1. La démarche de l évaluation du risque environnemental Du point de vue environnemental, on ne parle plus de toxicité mais d écotoxicité. Dans le cas d évaluation du risque environnemental il est toujours utile de confronter l ensemble des données que l on possède sur une molécule. En effet, un composé très facilement dégradé, même si ses concentrations effectives (EC 50 ) ou sa concentration la plus basse pour avoir un effet observé (LEC) sont faibles (dizaine de µg/l ou moins), sera moins dangereux qu un autre composé ayant une concentration effective (EC 50 ) plus forte (centaine de µg/l par exemple) mais très persistant dans le milieu. De plus, un composé même cytotoxique ou 92

93 Chapitre 1 : Généralités génotoxique, s il n est jamais détecté dans l environnement ne représente pas un danger avéré important à condition que les techniques d'analyse aient des limites de détection suffisamment faibles et que les concentrations provoquant les effets ne soient pas inférieures aux limites de détection. Par ailleurs, concernant les composés étudiés, il faut également tenir compte de leurs origines dans le milieu. En effet, du fait de leur apport constant dans le milieu, les composés provenant de rejets de STEP s apparentent à une pollution de type chronique, même s ils peuvent être facilement dégradés. Ainsi pour évaluer le risque que représente une molécule pour l environnement, il faut prendre en compte de multiples paramètres tels que la source de contamination, la toxicité (EC 50, LC 50, cytotoxicité, ), les quantités auxquelles elle est présente dans le milieu, la persistance, les produits de dégradation (les métabolites étant parfois plus toxiques que le composé parent), etc. L évaluation du risque environnemental pour les molécules pharmaceutiques au niveau européen est régi par le «guide sur l évaluation du risque environnemental pour les produits médicaux à usage humain» (Guideline on The Environmental Risk Assessment of Medicinal Products for Human Use) rédigé par l EMEA (European Medicines Agency) et approuvé par le CHMP (Committee for Medicinal Products for Human use). La première version date de 2000 et la version définitive de 2006, elle a pris effet le 1 er décembre 2006 (EMEA, 2006). L évaluation du risque environnemental suit une démarche par étape. Le principe général de la démarche est présenté dans le Tableau 18. Tableau 18: Les étapes de l'évaluation du risque environnemental (traduit du tableau 1, EMEA, 2006) Etape dans la normalisation de l évaluation Etapes dans l évaluation du risque bjectifs Méthode Test / données requises Phase I Pre-screening Estimation de l exposition Limites/champ d action Phase II Screening Prédiction initiale du risque Evaluation du partie A risque Phase II partie B Etendu Affinement avec les données sur la molécule et sur son compartiment spécifique et évaluation du risque Evaluation du risque Données de consommation, log Kow Données de base sur la toxicologie aquatique et le devenir Données étendues sur l émission, le devenir et les effets Dans ce guide, l ERA (Environmental Risk Assessment) passe dans un premier temps par l estimation de l exposition grâce au calcul de la PEC (Predicted Environmental Concentration). La PEC correspond à la concentration environnementale prédite pour une molécule. Pour l eau de surface, elle est calculée à partir de la dose journalière maximum consommée par habitant, à partir du facteur de pénétration c est à dire de la proportion de personnes traitées par jour avec cette molécule, à partir du volume d eau utilisée par jour et par habitant et à partir du facteur de dilution (dilution entre l effluent de STEP et l eau de surface). n ne tient pas compte dans ce premier calcul de la transformation métabolique que le composé peut subir dans l organisme ni de sa dégradation dans l environnement (STEP et milieu aquatique). Si la PEC SURFACE est inférieure à 0,01 µg/l, et qu il n y a pas de données sur la toxicité de la molécule à plus faibles doses (comme les perturbateurs endocriniens qui agissent à des concentrations inférieures au ng/l), alors la molécule est considérée comme ne représentant pas de risque pour l environnement. Si la PEC SURFACE est supérieure ou égale à 0,01 µg/l alors on passe à l étape suivante de l ERA. 93

94 Chapitre 1 : Généralités Dans la partie A de la 2 ème phase, on tente de prédire, à partir des propriétés physicochimiques (notamment log Kow et Koc), le devenir, comme l adsorption sur les particules par exemple, des composés identifiés comme représentant un risque pour l environnement dans la phase I (PEC SURFACE 0,01 µg/l). A partir de résultats de tests de toxicité (EC 50, LEC, NEC), on essaie également de prédire la PNEC (Predicted Non Effect Concentration) c està-dire la concentration pour laquelle les composés n auront pas d effet sur les organismes. Cette concentration est calculée en appliquant un facteur de "précaution", AF (Assessment Factor), à la plus basse NEC (No bserved Effect Concentration) connue pour la molécule. L AF permet de prendre en compte la variabilité inter- et intra-spécifique ainsi que l extrapolation de résultats obtenus en laboratoire à des études de terrain. Une valeur de 10 est généralement appliquée comme AF. Au final, on établit le rapport PEC / PNEC pour les molécules qui demeurent intéressantes pour le milieu aquatique, celles qui restent dans l eau et qui ne sont pas adsorbées sur les particules des boues de STEP par exemple. Pour les composés qui s'adsorbent sur les boues de STEP une ERA spécifique au milieu terrestre est nécessaire en complément en utilisant des PEC TERRESTRE. Si le ratio PEC / PNEC est inférieur à 1 alors la PEC est inférieure à la PNEC et la molécule ne représente pas de risque pour l environnement. Dans le cas contraire, PEC / PNEC 1, une évaluation plus poussée est nécessaire dans la partie B de la 2 ème phase de l ERA. Le ratio PEC / PNEC est établi à la fois pour l eau de surface (PEC SURFACE / PNEC EAU ), l eau souterraine (PEC EAU SUTERRAINE / PNEC EAU SUTERRAINE, PEC EAU SUTERRAINE = 0,25 x PEC SURFACE ) et pour les microorganismes (PEC SURFACE / PNEC MICR-RGANISMES ) notamment dans le cas des antibiotiques. De plus, si la molécule a le potentiel à se bioaccumuler (Kow > 1000 soit log Kow > 3) alors le facteur de bioconcentration (BCF) doit être pris en compte dans la partie B de la 2 ème phase. En plus d une ERA complémentaire pour le milieu terrestre dans le cas où le composé a la capacité de s adsorber sur le carbone et donc sur les boues de STEP (Koc > l.kg -1 ) qui seront ultérieurement répandues sur le sol, une ERA pour les sédiments doit également être mise en œuvre dans le cas où la molécule n est pas facilement biodégradable et se retrouve dans les sédiments (plus de 10 % du composé retrouvé 14 jours après le premier prélèvement dans les sédiments). Dans cette partie B de la 2 ème étape de l ERA, une PEC affinée (PEC SURFACEreffine ) est calculée en intégrant au calcul de la PEC SURFACE le pourcentage de molécule excrétée sous forme inchangée, la capacité de la STEP locale considérée, la fraction non éliminée et émise par la STEP dans l eau de surface et un facteur prenant en compte l adsorption des composés sur les MES (Matières En Suspension). Une PEC SEDIMENT et une PEC BAC D AERATIN (à mettre en relation avec la PNEC MICR-RGANISMES ) sont également calculées. Les ratio PEC / PNEC sont établis et si les résultats sont supérieurs à 1 alors une analyse au cas par cas est nécessaire en tenant compte des données sur les voies d excrétion, sur la quantité et la qualité de composés excrétés, sur la toxicité à long terme, sur la biodégradation et sur l inhibition bactérienne. Les molécules qui s avèreraient représenter un risque pour l environnement devront comporter une indication sur leur emballage pour prévenir l usager et pour l informer sur le comportement à tenir lorsque le médicament ne sera plus utilisé ou que la date de péremption aura expirée. Dans certaines études, les ratios PEC / PNEC sont remplacés par les ratios MEC / PNEC de façon à mieux correspondre à la réalité environnementale. La MEC correspond à la concentration mesurée dans l environnement (MEC : Mesured Environmental Concentration). 94

95 Chapitre 1 : Généralités VI.3.2. Application de l évaluation du risque environnemental Des valeurs de PEC et de PNEC ainsi que le ratio PEC / PNEC ou MEC / PNEC ont été calculés pour diverses molécules pharmaceutiques : antibiotiques (clarithromycine, érythromycine, ciprofloxacine, ofloxacine, sulfaméthoxazole, triméthoprime etc.), analgésiques (paracétamol, diclofénac, indométhacine, etc.), antiépileptique (carbamazépine, etc.), antidépresseurs (diazépam, etc.), hypolipémiants (gemfibrozil, acide clofibrique, etc.), -bloquants (métoprolol, propranolol, etc.) et anticancéreux (ifosfamide, etc.). D après Ferrari et ses co-auteurs (2004), le sulfaméthoxazole représente un risque toxique aigu pour l environnement aussi bien en France qu en Allemagne (PEC / PNEC aiguë = 11,4 en France et 59,3 en Allemagne). En Allemagne, il pourrait également poser un problème de toxicité chronique (PEC / PNEC chronique = 2,72) mais pas en France (PEC / PNEC chronique = 0,52). Dans le cas d'une contamination chronique, toujours d après Ferrari et son équipe, le propranolol représente un risque toxique aussi bien en Allemagne qu en France (PEC / PNEC chronique = 104 en France et 11,9 en Allemagne). Dans le cas d'une contamination aiguë, le propranolol n'est pas toxique en Allemagne. En revanche, en France, il possède une toxicité aiguë mais celle-ci est relativement faible comparé à la toxicité chronique (PEC / PNEC aiguë = 4,25 et PEC / PNEC chronique = 104). Pour Huschek et al. (2004), le propranolol n est pas toxique pour Daphnia magna. Ainsi à partir d une même stratégie d évaluation, il n y a pas une seule vérité (toxique / non toxique) pour une même molécule car les rapports PEC / PNEC dépendent de divers facteurs. Ils dépendent de la molécule considérée, de la consommation qui en est faite dans le pays considéré, de son élimination dans les STEP et de son taux d excrétion sous forme non métabolisée (variation PEC) ; ils dépendent aussi du test de toxicité pratiqué (contamination aiguë ou chronique) et de l organisme considéré (bactérie, phytoplancton, zooplancton, poisson) (variation PNEC). Différentes valeurs du rapport PEC ou MEC / PNEC ont été relevées dans la littérature et sont présentées dans le Tableau 19. Bien que les analgésiques et anti-inflammatoires soient les composés qui contribuent le plus à la contamination de l environnement, ils ne semblent pas poser de risque toxique d après les rapports établis par Ferrari et al. (2004), Huschek et al. (2004) et Gros et al. (2010), à l exception de l acide salicylique pour les bactéries et du paracétamol pour Daphnia magna dont les valeurs sont légèrement supérieures à 1 (Huschek et al., 2004). En revanche, les antibiotiques poseraient davantage de risque puisque les rapports établis sont fréquemment supérieurs à 1. Ainsi, la clarithromycine représenterait un danger pour les bactéries, l érythromycine pour les daphnies, la ciprofloxacine pour les cyanobactéries et les bactéries, l ofloxacine pour les cyanobactéries, le sulfaméthoxazole pour les cyanobactéries et les algues et enfin le triméthoprime pour les algues. De plus, les valeurs de ces rapports peuvent être très élevées (ex. : PEC / PNEC ciprofloxacine = 97 Huschek et al., 2004). Le propranolol de la classe des -bloquants semble également représenter un danger avec des valeurs du rapport PEC / PNEC parfois très supérieures à 1 (ex. : PEC / PNEC propranolol = 104 Ferrari et al., 2004). D autres composés comme la carbamazépine, l acide clofibrique, la fluoxétine ou encore l atorvastatine ont des rapports supérieurs à 1. Ils présenteraient donc des risques vis-à-vis du zooplancton comme les daphnies ou vis-à-vis des poissons. Néanmoins, dans la plupart des cas, les rapports PEC / PNEC restent inférieurs à 1 et les risques que les molécules pharmaceutiques soient dangereuses sont faibles. 95

96 Chapitre 1 : Généralités Tableau 19 : Evaluation de la toxicité de différentes molécules pharmaceutiques selon le rapport PEC / PNEC. classe molécule pays matrice toxicité aiguë / chronique organisme testé rapport PEC (MEC) / PNEC références AINS ibuprofène Allemagne eau de surface aiguë Daphnia magna < 1 Huschek et al., 2004 ibuprofène Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue < 1 Gros et al., 2010 kétoprofène Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue < 1 Gros et al., 2010 naproxène Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue < 1 Gros et al., 2010 analgésiques acide acétylsalicylique Allemagne eau de surface aiguë Daphnia magna < 1 Huschek et al., 2004 acide acétylsalicylique Allemagne eau de surface aiguë bactérie > 1 (1,74) Huschek et al., 2004 acide salicylique Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue < 1 Gros et al., 2010 codéine Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue < 1 Gros et al., 2010 diclofénac France eau de surface aiguë Synechococcus leopolensis < 1 Ferrari et al., 2004 diclofénac Allemagne eau de surface aiguë Synechococcus leopolensis < 1 Ferrari et al., 2004 diclofénac France eau de surface chronique Ceriodaphnia dubia < 1 Ferrari et al., 2004 diclofénac Allemagne eau de surface chronique Ceriodaphnia dubia < 1 Ferrari et al., 2004 diclofénac Allemagne eau de surface aiguë Daphnia magna < 1 Huschek et al., 2004 diclofénac Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue < 1 Gros et al., 2010 indométhacine Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie < 1 Gros et al., 2010 paracétamol Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue < 1 Gros et al., 2010 paracétamol Allemagne eau de surface aiguë Daphnia magna > 1 (1,1) Huschek et al., 2004 phénazone Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue < 1 Gros et al., 2010 propyphénazone Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue < 1 Gros et al., 2010 Ab pénicillines mécilliname Europe eau aiguë Microcystis aeruginosa < 1 Halling-Sorensen et al., 2000 Ab macrolides clarithromycine Allemagne eau de surface aiguë bactérie > 1 (1,19) Huschek et al., 2004 clarithromycine Allemagne eau de surface aiguë poisson < 1 Huschek et al., 2004 clarithromycine Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie < 1 Gros et al., 2010 érythromycine Espagne effluent STEP aiguë daphnie > 1 (9,5) Gros et al., 2010 érythromycine Espagne eau de surface aiguë daphnie > 1 (2) Gros et al., 2010 érythromycine Espagne eau de surface aiguë poisson, algue < 1 Gros et al., 2010 roxithromycine Allemagne eau de surface aiguë poisson < 1 Huschek et al., 2004 roxithromycine Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue < 1 Gros et al., 2010 Ab fluoroquinolones ciprofloxacine Europe eau aiguë Microcystis aeruginosa > 1 (13,3) Halling-Sorensen et al., 2000 ciprofloxacine Allemagne eau de surface aiguë bactérie > 1 (97) Huschek et al., 2004 ciprofloxacine Allemagne eau de surface aiguë Daphnia magna < 1 Huschek et al., 2004 ciprofloxacine Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue < 1 Gros et al., 2010 ofloxacine France eau de surface aiguë Synechococcus leopolensis > 1 (8,75) Ferrari et al., 2004 ofloxacine France eau de surface chronique Synechococcus leopolensis < 1 Ferrari et al., 2004 ofloxacine Espagne eau de surface aiguë daphnie < 1 Gros et al., 2010 Ab sulfonamides sulfaméthoxazole France eau de surface aiguë Synechococcus leopolensis > 1 (11,4) Ferrari et al., 2004 sulfaméthoxazole Allemagne eau de surface aiguë Synechococcus leopolensis > 1 (59,3) Ferrari et al., 2004 sulfaméthoxazole France eau de surface chronique Synechococcus leopolensis < 1 Ferrari et al., 2004 sulfaméthoxazole Allemagne eau de surface chronique Synechococcus leopolensis > 1 (2,72) Ferrari et al., 2004 sulfaméthoxazole Espagne effluent STEP aiguë algue > 1 (22,96) Gros et al., 2010 sulfaméthoxazole Espagne eau de surface aiguë algue > 1 (1,28) Gros et al., 2010 sulfaméthoxazole Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie < 1 Gros et al., 2010 sulfaméthazine Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue < 1 Gros et al., 2010 triméthoprime Europe eau aiguë bactérie < 1 Halling-Sorensen et al., 2000 triméthoprime Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue < 1 Gros et al., 2010 Ab tétracyclines tétracycline Espagne effluent STEP aiguë algue > 1 (3,77) Gros et al., 2010 tétracycline Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie < 1 Gros et al., 2010 anticancéreux ifosfamide Allemagne eau de surface aiguë Daphnia magna < 1 Huschek et al., 2004 antidépresseurs diazépam Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue < 1 Gros et al., 2010 fluoxétine Espagne eau de surface aiguë poisson, algue < 1 Gros et al., 2010 fluoxétine Espagne eau de surface aiguë daphnie > 1 Gros et al., 2010 antidiabétiques metformine Allemagne eau de surface aiguë Daphnia magna < 1 Huschek et al., 2004 antiépileptiques carbamazépine France eau de surface aiguë Cyclotella meneghiniana < 1 Ferrari et al., 2004 carbamazépine Allemagne eau de surface aiguë Cyclotella meneghiniana < 1 Ferrari et al., 2004 carbamazépine France eau de surface chronique Ceriodaphnia dubia > 1 (2,4) Ferrari et al., 2004 carbamazépine Allemagne eau de surface chronique Ceriodaphnia dubia > 1 (3,85) Ferrari et al., 2004 carbamazépine Allemagne eau de surface aiguë algue < 1 Huschek et al., 2004 carbamazépine Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue < 1 Gros et al., 2010 antigoutteux allopurinol Allemagne eau de surface aiguë poisson < 1 Huschek et al., 2004 antihypertenseurs captopril Allemagne eau de surface aiguë poisson < 1 Huschek et al., 2004 histamine agoniste des récepteurs H2 ranitidine Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue < 1 Gros et al., 2010 bronchodilatateurs théophylline Allemagne eau de surface aiguë Daphnia magna < 1 Huschek et al., agonistes salbutamol Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue < 1 Gros et al., 2010 hypolipémiants acide clofibrique Allemagne eau de surface aiguë Synechococcus leopolensis < 1 Ferrari et al., 2004 acide clofibrique Allemagne eau de surface chronique Brachionus calyciflorus < 1 Ferrari et al., 2004 acide clofibrique Espagne eau de surface aiguë daphnie > 1 Gros et al., 2010 acide clofibrique Espagne eau de surface aiguë poisson, algue < 1 Gros et al.,

97 Chapitre 1 : Généralités classe molécule pays matrice toxicité aiguë / chronique organisme testé rapport PEC (MEC) / PNEC références hypolipémiants atorvastatine Espagne effluent STEP aiguë poisson > 1 (1,18) Gros et al., 2010 atorvastatine Espagne eau de surface aiguë poisson < 1 Gros et al., 2010 bézafibrate Allemagne eau de surface aiguë poisson < 1 Huschek et al., 2004 bézafibrate Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue < 1 Gros et al., 2010 fénofibrate Allemagne eau de surface aiguë poisson < 1 Huschek et al., 2004 gemfibrozil Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue < 1 Gros et al., 2010 pravastatine Espagne eau de surface aiguë poisson < 1 Gros et al., bloquants aténolol Espagne eau de surface aiguë daphnie < 1 Gros et al., 2010 métoprolol Allemagne eau de surface aiguë poisson < 1 Huschek et al., 2004 métoprolol Espagne eau de surface aiguë poisson, daphnie, algue < 1 Gros et al., 2010 propranolol France eau de surface aiguë Cyclotella meneghiniana > 1 (4,25) Ferrari et al., 2004 propranolol Allemagne eau de surface aiguë Cyclotella meneghiniana < 1 Ferrari et al., 2004 propranolol France eau de surface chronique ryzias latipes > 1 (104) Ferrari et al., 2004 propranolol Allemagne eau de surface chronique ryzias latipes > 1 (11,9) Ferrari et al., 2004 propranolol Allemagne eau de surface aiguë Daphnia magna < 1 Huschek et al., 2004 AINS : anti-inflammatoires non stéroïdiens, Ab : antibiotiques Cyanobactérie : Microcystis aeruginosa, Synechococcus leopolensis ; algue : Cyclotella meneghiniana ; zooplancton : Brachionus calyciflorus, Ceriodaphnia dubia, Daphnia magna ; poisson : ryzias latipes Bien que ces rapports PEC / PNEC permettent d évaluer le risque toxique, ils ne permettent pas complètement d évaluer le danger représenté par une molécule. Par exemple, l ifosfamide, d après Huschek et al. (2004), ne serait absolument pas toxique (PEC / PNEC = 0,00003 pour les daphnies) alors que pour Steger-Hartmann et al. (1996) et pour Kümmerer et al. (1997) il serait mutagène, cancérigène et tératogène. Ces effets à long terme ne sont en effet pas pris en compte dans les tests de toxicité qui permettent d évaluer les PNEC. Dans un rapport datant d octobre 2009, l INERIS (Institut National de l Environnement et des RISques) en collaboration avec l NEMA (ffice National de l Eau et des Milieux Aquatiques) et AQUAREF (laboratoire national de référence pour la surveillance des milieux aquatiques) évoque les limites des tests écotoxicologiques traditionnels utilisés pour définir les PNEC. En effet, les tests de toxicité qui permettent de déterminer les EC 50, LEC, NEC, et par extension de définir les PNEC, sont essentiellement basés sur des critères tels que la mortalité ou l inhibition de la croissance bactérienne ou algale (toxicité aiguë) et la reproduction ou la croissance (toxicité chronique). Ils ne mettent donc pas en évidence les problèmes à long terme comme les effets mutagènes et cancérigènes ni les troubles physiologiques (ex. : rythme cardiaque, production d œufs) ou du comportement (ex. : prédation, nidification, alimentation). Dans ce rapport l INERIS souligne que des différences significatives ont été observées entre les résultats des tests de toxicité traditionnels et ceux des nouveaux tests évaluant la capacité à maintenir un nid, la production d'œufs, le rythme cardiaque ou l'activité de nourrissage par exemple. En comparant les concentrations correspondant aux plus faibles réponses toxiques obtenues pour ces tests de toxicité, ou pour des tests traditionnels, avec des concentrations mesurées dans l environnement, il ressort que le 17 -éthinylestradiol, le paracétamol, le 17 / -œstradiol et l acide salicylique peuvent poser un risque pour les écosystèmes avec des concentrations mesurées supérieures de plusieurs ordres de grandeur à celles donnant les plus faibles réponses toxiques. VII. Législation La convention SPAR (slo / Paris) d une part et la DCE (Directive Cadre sur l Eau européenne) d autre part, permettent, en complément de nombreuses autres directives comme celle du 15 février 2006 relative aux rejets de substances dangereuses, de protéger et de préserver le milieu aquatique et sa qualité. La convention SPAR (98/249/CE) du 7 octobre 97

98 Chapitre 1 : Généralités 1997, entrée en vigueur le 25 mars 1998, relative à la protection du milieu marin de l Atlantique Nord-Est, a pour objectif de prévenir et d éliminer la pollution ainsi que de protéger la zone maritime contre les effets néfastes des activités humaines (http://www.europa.eu/scadplus/printversion/fr/lvb/ htm, décembre 2006). Initialement, le clotrimazole, un antibiotique de la famille des imidazoles, était la seule molécule pharmaceutique à faire partie de la liste SPAR des produits chimiques prioritaires (http://www.ospar.org/content/content.asp?menu= _000000_000000, 15/12/ 10). Depuis la liste a été étendue à des "substances potentiellement préoccupantes". Dans cette nouvelle liste, 19 molécules appartiennent à la classe des médicaments comme par exemple le midazolam (un anesthésique) ou l'acide niflumique (un AINS). La DCE (directive 2000/60/CE) du 23 octobre 2000 a deux objectifs. D une part elle prévoit pour les Etatsmembres l atteinte du bon état écologique et chimique des eaux de surface et souterraines et d autre part elle vise à réduire la pollution due aux substances prioritaires et à éliminer les rejets des substances dangereuses prioritaires (http://europa.eu/scadplus/leg/fr/lvb/ l28002b.htm, décembre 2006). Les molécules pharmaceutiques ne font pas partie de la liste des 33 puis des 41 ni des 132 molécules prioritaires établie dans le cadre de la DCE en s appuyant sur les listes I et II de la directive 76/464/CEE (directive 2008/105/CE et arrêté 21 mars 2007). Cependant, 4 d entre elles, le diclofénac, l ibuprofène, le 17 -éthinylestradiol et le 17 -œstradiol ont été proposées par AQUAREF et sont actuellement en cours d évaluation pour intégrer la liste des substances européennes prioritaires. De plus, la DCE oblige également les Etats Membres à identifier et inclure dans les programmes de surveillance une liste de polluants pertinents spécifiques au niveau national par bassin versant. Dans ce cadre là, l INERIS a proposé au Ministère de l écologie, du développement durable, du transport et du logement d ajouter la carbamazépine à la liste des molécules pertinentes au niveau français et pour lesquelles une définition de la Norme de Qualité Environnemental (NQE) est à établir. Par ailleurs, bien que non encore officiellement intégrées à la liste des substances prioritaires de la DCE, les molécules pharmaceutiques n en restent pas moins préoccupantes, en particulier les antibiotiques, et sont donc à ce titre intéressantes à étudier afin de remplir le deuxième objectif de la DCE à savoir l atteinte du bon état écologique et chimique des eaux de surface et souterraines. Les molécules pharmaceutiques n ont pas de réglementation spécifique quant à leurs rejets dans le milieu et en particulier le milieu aquatique contrairement à certaines molécules issues de l industrie dont les rejets sont règlementés et les quantités que l on peut retrouver dans l eau fixées. Cependant, il existe des valeurs seuils quant aux résidus de médicament, et d antibiotiques en particulier, qui peuvent être détectés dans les denrées alimentaires comme la viande, les œufs, le lait et le miel. La première directive (CEE n 2377/90) date du 26 juin Elle consistait à établir une procédure communautaire pour la fixation des limites maximales de résidus de médicaments vétérinaires dans les aliments d'origine animale. Depuis plusieurs textes ont abrogé cette directive. La dernière version date du 22 décembre 2009 (UE n 37/2010). Elle est relative aux molécules pharmacologiquement actives et à leur classification en ce qui concerne les limites maximales de résidus dans les aliments d origine animale. En annexe de cette directive, on trouve un tableau répertoriant les molécules pharmacologiquement actives, l'espèce animale considérée, les denrées ciblées et les limites maximales de résidus (LMR). Par exemple, pour l'amoxicilline, toutes les espèces productrices d'aliments sont concernées et les LMR sont de 50 µg/kg dans les muscles, les graisses, le foie et les reins de 4 µg/kg dans le lait. 98

99 Chapitre 1 : Généralités VIII. Projets de recherche Bien qu il n y ait pas de réglementation spécifique aux molécules pharmaceutiques dans l environnement, leur présence, leur devenir et l impact qu elles peuvent avoir n en restent pas moins des sujets de préoccupation comme en attestent les nombreux programmes de recherche européens et français listés ci-après. VIII.1. Européens ERAVMIS ( , Environmental Risk Assessment of Veterinary Medicines In Sludge) portait sur le devenir (adsorption et biodégradation) des médicaments à usage vétérinaire (antibiotiques) dans le sol et la toxicité associée au travers d analyses environnementales, de tests pratiqués en laboratoire et de modélisation. REMPHARMAWATER ( , ecotoxicological assessment and REMoval technologies for PHARMaceuticals in wastewaters) avait pour objectifs d'évaluer (i) la présence des produits pharmaceutiques les plus utilisés dans les eaux usées et leur devenir pendant les procédés de traitement, (ii) leur persistance (temps de demi-vie), (iii) leurs effets toxiques sur les organismes vivants (algues, invertébrés, poissons), et (iv) d étudier des traitements complémentaires pour réduire leurs concentrations afin de prévenir la pollution des eaux de surface et souterraines due aux molécules pharmaceutiques. PSEIDN ( , Assessment of technologies for the removal of pharmaceuticals and personal care products in sewage and drinking water facilities to improve the indirect potable water reuse) était focalisé sur l élimination des molécules pharmaceutiques et des produits de soins corporels dans les stations de traitement. Les objectifs étaient d'améliorer et de protéger les réserves en eau, de minimiser les impacts environnementaux et de prévenir d éventuels risques pour la santé humaine. Ses objectifs étaient en lien avec la directive cadre sur l'eau et la directive eaux urbaines résiduaires. ENVIPHARMA (2003, European conference on human and veterinary pharmaceutical products in the aquatic environment: fate, effects and regulation : knowledge and future needs) était une conférence organisé en 2003 en France pour présenter l avancée des travaux des trois projets de recherche listés ci-dessus (ERAVMIS, REMPHARMWATER, PSEIDN). TRITN ( , Scheme to provide training and assistance for research players for the assessment of the fate and removal of pharmaceuticals and estrogenic compounds (PECS) released into the environment) venait à la suite de ERAVMIS, REMPHARMWATER, PSEIDN et avait pour objectif de communiquer les connaissances nouvelles sur la toxicité des produits et les technologies de dépollution aux jeunes scientifiques pré- ou post-doctorants qui se forment dans ce domaine. SWIFT-WFD ( , Screening methods for Water data InFormaTion in support of the implementation of the Water Framework Directive) avait 5 objectifs : i) améliorer la qualité des données de surveillance du milieu aquatique; ii) obtenir des données comparables entre les différents bassins d étude européens en se basant sur des procédures d assurance qualité et de contrôle qualité communes ; iii) le développement, la validation et l application de techniques de screening, chimiques ou biologiques, à faible cout pour le suivi de la qualité 99

100 Chapitre 1 : Généralités des masses d eau dans le cadre de la DCE ; iv) le transfert des savoirs et des technologies entre l Europe et le tiers monde ; et v) évaluer l impact socio-économique des nouveaux outils de screening utilisés. ERAPHARM ( , Environmental Risk Assessment of PHARMaceuticals) avait comme objectif de faire avancer les connaissances existantes et l'utilisation des procédures dans l'évaluation du risque environnemental (ERA) de médicaments à usage humain et vétérinaire. F & F ( , Pharmaceutical products in the environment: development and employment of novel methods for assessing their origin, fate and effects on human fecundity) cherchait à identifier les produits pharmaceutiques affectant la fécondité de l'homme et les mécanismes impliqués. Il visait à évaluer l environnement, l alimentation et l exposition des populations aux produits pharmaceutiques présentant des risques importants. NRMAN ( , Network f Reference laboratories for monitoring of emerging environmental pollutants) avait pour objectif de créer un réseau de laboratoires de référence afin d'améliorer l'échange d'informations et de données sur les contaminants émergeants de l'environnement, et d'harmoniser les méthodes de mesure et les outils de suivi. Depuis le réseau NRMAN continue d exister sous la forme d une association loi 1901 qui s occupe de gérer des groupes de rencontres d experts, des banques de données et des exercices de validation de méthodes par le biais d exercice d intercalibration. CST (european Coperation in the field of Scientic and Technical research) action 636 : Xenobiotics in the Urban Water Cycle ( ) avait pour objectif principal d évaluer le rôle des xenobiotiques (composés métalliques ou organiques issus des activités humaines : lessivage des sols, retombées atmosphériques, utilisation des produits d entretien ou de médicaments) dans le cycle urbain de l eau et d élaborer des stratégies pour minimiser leur impact sur l Homme et les écosystèmes. La création d un réseau européen de scientifiques et d experts travaillant sur la problématique des xenobiotics dans le cycle urbain de l eau et la création d un réseau de jeunes chercheurs travaillant sur cette même problématique faisaient partie des objectifs secondaires du projet. KNAPPE ( , Knowledge and Need Assessment on Pharmaceutical Products in Environmental Waters) avait pour objectif d identifier, à partir des connaissances actuellement disponibles et des avancées scientifiques en cours, les actions prioritaires à mener dans les domaines scientifiques, réglementaires et sociaux pour limiter l occurrence et l impact des molécules pharmaceutiques dans l environnement. VIII.2. Français Plan Micropolluant PNAR ( , Plan National d'action pour lutter contre la pollution des milieux aquatiques) se divise en 4 axes. Le premier axe vise à réduire les émissions à la source par i) une action sur les molécules les plus préoccupantes en soutenant le retrait ou la substitution des molécules les plus dangereuses par exemple, ii) une action sur les secteurs d activité les plus contributeurs en réduisant l usage des pesticides ou en réduisant les déversements de substances dans les réseaux de collecte des eaux usées par exemple, et iii) une action sur les milieux les plus dégradés et les plus importants comme les 100

101 Chapitre 1 : Généralités eaux de captage utilisées pour la production d eau potable par exemple. Le deuxième axe vise à améliorer la connaissance de l état des masses d eau en améliorant la comparabilité des données de surveillance des milieux et des rejets, en réalisant l inventaire des émissions et rejets ponctuels et diffus des substances définissant l état chimique des eaux ou encore en définissant des règles claires d interprétation des résultats de la surveillance utilisables par l ensemble des acteurs. Le troisième axe vise à améliorer les connaissances scientifiques et techniques pour identifier les marges de progrès et hiérarchiser l action des pouvoirs publics. Pour cela, il est nécessaire d identifier les voies de réduction des rejets dans l environnement pour les molécules les plus déclassantes de l état des masses d eau ou d améliorer le diagnostic de la contamination et la connaissance de l impact des molécules sur les milieux aquatiques. Enfin, le quatrième axe est relatif à la communication des progrès. La réduction des pollutions des milieux aquatiques par les micropolluants répond à i) des enjeux environnementaux en raison de l impact toxique possible à faible dose de ces micropolluants, ii) des enjeux sanitaires en protégeant les ressources en eau destinées à la production d eau potable, et iii) économique en réduisant les coût de traitement en protégeant les milieux aquatiques. PNRM (Plan National sur les Résidus de Médicaments dans l eau, dans le cadre du PNSE 2, , Plan National Santé Environnement) a comme objectifs l évaluation et la gestion des risques sanitaires et environnementaux liés à la présence des molécules pharmaceutiques dans l environnement. L évaluation des risques passe par un renforcement des connaissances sur l état des milieux et sur l exposition aux résidus de médicaments et leurs effets sur l environnement et la santé. La gestion de ces risques potentiels passe par la mise en place de stratégies visant à réduire les sources de pollution et à renforcer la surveillance. De plus, parallèlement au PNRM, le ministère en charge de la santé a demandé un bilan sur la présence de ces molécules dans les eaux destinées à la consommation humaine. Une campagne nationale d analyse des eaux de surface et souterraine servant à la production d eau potable (eaux brutes) et des eaux traitées en sortie de station de potabilisation a alors été lancé en septembre L ANSES (Agence Nationale de Sécurité sanitaire de l'alimentation, de l'environnement et du travail) a publié les résultats de cette étude en mars Il ressort que plus de 50% des eaux de surfaces brutes et plus de 80 % des eaux souterraines brutes ou des eaux de surface et souterraine traitées présentent une teneur cumulée en résidus médicamenteux inférieure à 25 ng/l. Dans les eaux brutes, les molécules les plus fréquemment détectées (hors caféine) ont été la carbamazépine, l oxazépam, le paracétamol et l époxy-carbamazépine et dans les eaux traitées, l époxycarbamazépine, la carbamazépine, l oxazépam et l hydroxyibuprofène (ANSES, 2011). 101

102 102

103 bjectifs 103

104 104

105 bjectifs de ces travaux de thèse bjectifs de ces travaux de thèse L'ensemble des informations contenues dans le premier chapitre peut être résumé de la façon suivante: - il existe de nombreuses molécules pharmaceutiques aux propriétés thérapeutiques variées (analgésique, antibiotiques, antidépresseurs, hypolipémiants, -bloquants, etc.) et à la pharmacocinétique différente (métabolisation ou non, transformation, conjugaison, etc.) ; - la présence des molécules pharmaceutiques dans l'environnement est majoritairement due à une consommation humaine (rejets d'eaux usées traitées ou non, épandage des boues résiduaires de STEP) ou animale (déjections émises directement dans le milieu, épandages des déchets d élevage, déversements dans les fermes aquacoles) des médicaments; - le devenir des molécules pharmaceutiques dans le milieu naturel est lié à leurs propriétés physico-chimiques (répartition entre la phase dissoute et la phase solide: eau/particules/boue dans les STEP, eau/particules/sédiment dans les écosystèmes aquatiques, sol/eau d'infiltration ou de ruissellement dans le milieu édaphique) ; - les molécules pharmaceutiques ont des sensibilités différentes vis-à-vis des traitements appliqués dans les stations d'épuration et certaines classes ou familles sont plus ou moins bien éliminées de la phase dissoute lors de leur passage dans les STEP ; - la présence des molécules pharmaceutiques a principalement été étudiée dans les rejets des stations d'épuration ou dans les eaux de surfaces mais ces molécules ont été mise en évidence dans l'ensemble des matrices étudiées : eaux usées, eaux traitées, eaux de surface, eaux souterraines, eaux de boisson, déchets d'élevage, sol, sédiments, animaux et plantes ; - les molécules pharmaceutiques sont des molécules biologiquement actives qui peuvent être à l'origine d'effets indésirables (effets secondaires) lorsqu'elles sont consommées volontairement, et qui peuvent aussi être responsables d'effets toxiques envers des organismes non ciblés si des homologies de récepteurs ou de site d'action sont présents chez ces derniers; - les antibiotiques se révèlent être parmi les composés les plus toxiques envers les cyanobactéries et des applications de l'era ont mis en évidence un risque environnemental de ces composés envers les algues et les cyanobactéries ; - la résistance des bactéries aux antibiotiques est un enjeu sanitaire et environnemental majeur ; - bien que régulièrement étudiées au cours de nombreux programmes de recherche européens, la présence des molécules pharmaceutiques dans l'environnement n'est pas encore spécifiquement réglementée. Dans ce contexte, il est donc apparu important de compléter ces informations en étudiant : i) à la fois l origine humaine et vétérinaire de la contamination de l'environnement, et plus particulièrement celle des systèmes aquatiques, par les composés pharmaceutiques et notamment par les antibiotiques ; ii) le devenir de ces composés au travers d une approche dite de "continuum" qui consiste à suivre la contamination depuis les rejets des centres de soins jusqu'aux eaux de surface ou depuis les entrées de STEP jusqu'aux eaux de captage ou encore le long des filières de traitement dans des élevages porcins ; et iii) le lien présence/effets en couplant les analyses chimiques avec des tests d'antibiorésistance réalisés par d'autres équipes lors de collaborations au cours des programmes de recherches support. L attention particulière portée aux antibiotiques se justifie par 2 raisons : i) les antibiotiques sont des composés utilisés à la fois en médecine humaine et vétérinaire, ils contribuent donc doublement à la contamination du milieu puisque les deux voies majeures d'introduction sont possibles; et ii) ils représentent des risques environnementaux et sanitaires réels notamment au travers de la problématique de l'antibiorésistance. L étude de la contamination des systèmes aquatiques par les molécules pharmaceutiques constitue donc l objectif principal de 105

106 bjectifs de ces travaux de thèse ces travaux de thèse. Cependant, pour l atteindre, il a été nécessaire de répondre à un autre objectif. Ce deuxième objectif concerne le développement de méthodes d analyse permettant le dosage de composés pharmaceutiques appartenant à différentes classes thérapeutiques dans diverses matrices environnementales L'originalité de ces travaux réside donc dans le développement de méthodes multi-résidus adaptées à un large panel de molécules pharmaceutiques aux propriétés physico-chimiques variées, et dans les approches conjointes car peu d'études ont travaillé en même temps sur l origine humaine et vétérinaire de la contamination, sur la notion de continuum et enfin, sur la présence d'antibiotiques et l'antibiorésistance potentiellement associée. Ce dernier point n est cependant pas détaillé dans ce manuscrit mais fera l objet de publications écrites en collaboration avec les équipes de recherche ayant réalisées les tests d antibiorésistance. Ces travaux de thèse ont été appuyés sur 2 programmes de recherche : le projet «Seine Aval» FLASH (Devenir des antibiotiques, FLux de gènes et de bactéries Antibiorésistantes dans les Systèmes Hydriques de surface) et l'anr SEST DIPERPHA (Dynamique et Impact des Perturbateurs endocriniens et des composés Pharmaceutiques issus des élevages agricoles). Le projet FLASH vise à étudier le devenir des antibiotiques, le transfert des bactéries antibiorésistantes et le flux de gène correspondant le long de 2 types de continuum : i) rejets hospitaliers - STEP - eaux de Seine, et ii) exploitation animale (bovins) eaux de rivière estuaire de Seine. Cette étude s inscrit dans une démarche d analyse du risque associé au rejet dans le milieu, d antibiotiques et de bactéries antibiorésistantes. Le risque environnemental est défini comme la dissémination de gènes de résistances dans les communautés microbiennes et le rejet de concentration en antibiotiques favorables à l émergence ou au maintien de bactéries résistantes dans l environnement. Une collaboration avec le laboratoire de microbiologie du froid (université de Rouen-CNRS) a permis de réaliser les études relatives à l'antibiorésistance. Le projet FLASH a supporté les études liées à l'origine humaine de la contamination des systèmes aquatiques par les molécules pharmaceutiques. A l'occasion de ces prélèvements, d'autres classes thérapeutiques ont été analysées. Il s'agit des - bloquants, des anticancéreux, des anti-vih et des inhibiteurs de PDE 5. Les -bloquants ont été choisis comme traceurs pour servir de point de comparaison car ils sont fréquemment recherchés dans les rejets de STEP. Miège et al. (2009) rapportent une fréquence de recherche de 8,7 % et de 2,8 % respectivement pour les antibiotiques et les -bloquants dans les rejets de STEP. Et les autres classes ont été choisies pour compléter les informations relatives à la contamination des systèmes aquatiques par les molécules pharmaceutiques car elles étaient moins étudiées que d autres classes et à ce titre méritaient des investigations supplémentaires. Les objectifs de l'anr DIPERPHA sont d une part : (i) de connaître le devenir réel des œstrogènes et des antibiotiques issus des élevages bovins et porcins, lors du stockage et du traitement de ces effluents, (ii) de déterminer le transfert vers les sols et la plante lors de l épandage des déchets dans des terres agricoles, (iii) de déterminer les conditions de dégradation (biologique et thermique) des œstrogènes et des antibiotiques présents dans ces déchets et d optimiser cette dégradation. D'autre part, cette étude vise à : (iv) déterminer l effet endocrinien et toxique des rejets d élevage et des produits de son traitement à travers des modèles cellulaires, (v) identifier l impact des antibiotiques présents dans les rejets d élevage sur le développement des résistances microbiennes à ces composés et, finalement, (vi) identifier et caractériser d autres composés œstrogènes présents dans les rejets d élevage. Ces objectifs impliquent le suivi en conditions réelles des concentrations en œstrogènes et en composés pharmaceutiques dans les systèmes de stockage et de traitement des déchets d élevage porcin avec un suivi dans le temps et au cours des différentes étapes de traitement (fosse de stockage, bassin biologique, boues). 106

107 CHAPITRE 2 Les composés étudiés 107

108 108

109 Chapitre 2 : Les composés étudiés Chapitre 2 : Les composés étudiés I. SELECTIN DES CLASSES THERAPEUTIQUES I.1. Consommation I.2. Toxicité I.3. Présence dans l environnement I.4. Persistance I.5. Manque de données I.6. Classes sélectionnées II. SELECTIN DES MLECULES II.1. Les antibiotiques II.1.1. Consommation des antibiotiques II Consommation des antibiotiques en médecine humaine II Consommation des antibiotiques en médecine vétérinaire II.1.2. Toxicité, écotoxicité et antibiorésistance II.1.3. Présence dans le milieu II.1.4. Persistance II.1.5. Manque de données II.2. Les autres classes thérapeutiques : -bloquants, anticancéreux, anti-vih et inhibiteurs de la PDE II.2.1. Consommation II.2.2. Ecotoxicité II.2.3. Présence dans le milieu II.2.4. Persistance II.2.5. Manque de données II.3. Listes des molécules sélectionnées III. CMPARAISN AVEC LES MLECULES RETENUES DANS D'AUTRES ETUDES Ce deuxième chapitre expose les différents critères qui ont permis de sélectionner les composés étudiés. Il détail en particulier le critère relatif à la consommation des molécules pharmaceutiques. Il contient ensuite une présentation des 78 molécules sélectionnées. Une comparaison de cette sélection avec celle d autres études françaises ou à celle d organisme de référence comme l Agence Française de Sécurité Sanitaire des Aliments (AFSSA) est réalisée à la fin de ce chapitre. 109

110 Chapitre 2 : Les composés étudiés I. Sélection des classes thérapeutiques Au vu de la grande diversité des molécules pharmaceutiques et du nombre important de molécules (plus de 3000 en médecine humaine et 300 en médecine vétérinaire), toutes ne peuvent être étudiées. La première étape consiste donc à cibler les composés à analyser. Le premier niveau de choix concerne les classes thérapeutiques. La consommation des médicaments constitue l un des critères de sélection. La pertinence de ce critère repose sur le postulat suivant : plus une molécule est vendue, plus elle est consommée et plus elle est susceptible de se retrouver dans l environnement car rejetée en partie lors de sa consommation. Les données de consommation sont issues des rapports annuels de l AFSSAPS sur "L analyse des ventes de médicaments aux officines et aux hôpitaux en France". Le choix a aussi été appuyé sur des données de toxicité présumée en se basant sur les effets secondaires indésirables des médicaments, sur des données pharmacologiques comme les mécanismes d action et sur des résultats d ERA. La représentativité des classes sélectionnées a également été prise en compte en prenant en considération des résultats d études antérieures révélant la présence et la distribution de médicaments dans l environnement (Daughton et Ternes, 1999 ; Sacher et al., 2001 ; Kolpin et al., 2002 ; Gros et al., 2006 ; Touraud, 2008 ; Miège et al., 2009). La persistance des molécules, notamment au cours des traitements en station d épuration, a été intégrée aux critères de sélection. Enfin le manque d informations relatives à certaines classes thérapeutiques a également été pris en considération dans le but de combler ces lacunes. Les différents critères sont passés en revue dans les paragraphes suivants. I.1. Consommation D après les rapports de l AFSSAPS sur les analyses des ventes de médicaments (AFSSAPS, 2006 ; AFSSAPS, 2008 ; AFSSAPS, 2009 ; AFSSAPS, 2010), en France, depuis 2004 et jusqu en 2008, les antibactériens à usage systémique (J01, antibiotiques) arrivent en 3 ème position du classement des médicaments les plus vendus, en quantité, aux officines, derrière les analgésiques (N02) et les psycholeptiques (N05) (Tableau 20). Après les médicaments du système nerveux (classes ATC N), ce sont les médicaments des voies digestives et du métabolisme (classe ATC A) qui sont les plus vendus en officine entre 2004 et Les médicaments pour les troubles gastro-intestinaux (antispasmodiques et anticholinergiques, classe A03) et pour les troubles de l acidité (antiacides et antiulcéreux, classe A02) se positionnent généralement autour de la 6 ème place de ce classement. Les médicaments les plus vendus dans la classe ATC C (médicaments du système cardio-vasculaire) sont les médicaments agissant sur le système rénine-angiotensine (C09), les hypolipémiants (C10) et les vasculoprotecteurs (C05). Les -bloquants (C07) n apparaissent dans ce classement qu en 2008, en 20 ème position. Les médicaments du rhume et de la toux (R05) et les préparations nasales (R01) figurent également dans ce listing des 20 classes ATC de niveau 2 les plus vendues en officine. En revanche, les anticancéreux, les antiviraux ou les immunomodulateurs ne font pas partie de ce classement. Les données de l AFSSAPS relatives aux ventes de médicaments sur le marché officinal sont indiquées soit en millions d euros (chiffre d affaire) et soit en millions d unité vendues. Les données exprimées en millions d unité vendues reflètent réellement la quantité de médicaments vendus et donc supposés consommés (Tableau 20). Ces informations sont directement exploitables dans le cas de la démarche de sélection appliquée ici. En revanche, 110

111 N02 - analgésiques Tableau 20 : Répartition des ventes de médicaments par classe ATC de niveau 2 sur le marché officinal en quantité en 2004, 2006, 2007 et 2008 (millions d unités vendues (part du marché %)). N05 - psycholeptiques J01 - antibactériens R05 - rhume et toux C05 - vasculoprotecteurs A02 - troubles de l'acidité N06 - psychoanaleptiques 2004 S01 - médicaments ophtalmologiques G03 - hormones sexuelles C10 - hypolipidémiants A03 - troubles gastro-intestinaux C09 - système rénine-angiotensine R01 - préparations nasales A10 - médicaments du diabète M01 - AI et antirhumatismaux A06 - laxatifs A12 - suppléments minéraux C01 - médicaments en cardiologie A07 - antidiarrhéiques R06 - antihistaminiques systémiques 515 (16,2) 162 (5,1) 134 (4,2) 126 (4,0) 103 (3,2) 90 (2,8) 86 (2,7) 83 (2,6) 78 (2,5) 77 (2,4) 71 (2,2) 70 (2,2) 69 (2,2) 56 (2,1) 66 (2,1) 63 (2,0) 61 (1,9) 56 (1,8) 51 (1,6) 50 (1,6) N02 - analgésiques N05 - psycholeptiques J01 - antibactériens A02 - médicaments pour les troubles de l'acidité ; A03 - médicaments troubles fonctionnels gastro-intestinaux C09 - médicaments agissant sur le système rénine-angiotensine G03 - hormones sexuelles et modulateur de la fonction génitale J01 - antibactériens à usage systémique M01 - anti-inflammatoires et antirhumatismaux R05 - médicaments du rhume et de la toux 2006 V03 - tous autres médicaments S01 - médicaments ophtalmologiques N06 - psychoanaleptiques A03 - troubles gastro-intestinaux C09 - système rénine-angiotensine C05 - vasculoprotecteurs A02 - troubles de l'acidité C10 - hypolipidémiants R01 - préparations nasales A10 - médicaments du diabète R05 - rhume et toux G03 - hormones sexuelles M01 - AI et antirhumatismaux A06 - laxatifs A01 - préparations stomatologiques B01 - antithrombotiques R06 - antihistaminiques systémiques 583 (18,4) 165 (5,2) 131 (4,1) (3,3) 86 (2,7) 84 (2,7) 86 (2,6) 82 (2,6) 81 (2,6) 77 (2,4) 76 (2,4) 73 (2,4) 71 (2,3) 71 (2,2) 67 (2,1) 68 (2,1) 62 (2,0) 62 (1,9) 60 (1,9) 59 (1,9) N02 - analgésiques N05 - psycholeptiques J01 - antibactériens 2007 V03 - tous autres médicaments S01 - médicaments ophtalmologiques A02 - troubles de l'acidité A03 - troubles gastro-intestinaux N06 - psychoanaleptiques C09 - rénine-angiotensine R01 - préparations nasales C10 - hypolipidémiants R05 - rhume et toux A10 - médicaments du diabète C05 - vasculoprotecteurs M01 - AI et antirhumatismaux G03 - hormones sexuelles A01 - préparations stomatologiques R06 - antihistaminiques systémiques A06 - laxatifs B01 - antithrombotiques 628 (19,5) 164 (5,1) 134 (4,2) (3,7) 88 (2,7) 87 (2,7) 86 (2,6) 83 (2,6) 82 (2,6) 78 (2,5) 74 (2,3) 74 (2,3) 72 (2,2) 72 (2,2) 71 (2,2) 66 (2,0) 64 (2,0) 63 (2,0) 63 (2,0) 63 (2,0) N02 - analgésiques N05 - psycholeptiques J01 - antibactériens 2008 V03 - tous autres médicaments S01 - médicaments ophtalmologiques A03 - troubles gastro-intestinaux A02 - troubles de l'acidité N06 - psychoanaleptiques C09 - rénine-angiotensine R01 - préparations nasales R05 - rhume et toux C10 - hypolipidémiants M01 - AI et antirhumatismaux A10 - médicaments du diabète B01 - antithrombotiques A01 - préparations stomatologiques A06 - laxatifs G03 - hormones sexuelles R06 - antihistaminiques systémiques C07 - -bloquants 607 (19,4) 161 (5,1) 131 (4,2) (3,4) 86 (2,7) 85 (2,7) 85 (2,7) 82 (2,6) 80 (2,5) 77 (2,5) 73 (2,3) 71 (2,3) 69 (2,2) 69 (2,2) 64 (2,1) 64 (2,1) 63 (2,0) 62 (2,0) 62 (2,0) 52 (1,7) Chapitre 2 : Les composés étudiés 111

112 Chapitre 2 : Les composés étudiés les données relatives aux ventes de médicaments sur le marché hospitalier sont exprimées uniquement en millions d euros (chiffre d affaire). Elles prennent alors en compte à la fois la quantité de médicaments vendus mais aussi le prix du médicament. Dans ce classement, une classe ATC composée de médicaments qui coutent chers mais qui sont peu vendus pourra se retrouver au même niveau qu une classe ATC composée de médicament peu couteux mais beaucoup vendus. Cependant, en comparant le classement des ventes de médicaments sur la marché officinal exprimées en valeur (chiffre d affaire en million d euros) avec celui basé sur les données exprimées en quantité (millions d unité vendues) (Tableau 21), il ressort que plus de la moitié des classes ATC de niveau 2 sont communes aux deux classements. De plus, sur les 10 classes les plus vendues en valeur, 8 font partie des classes les plus vendues en quantité. En conséquence, en dépit de l influence du prix du médicament, les données de vente exprimées en valeur reflètent un certain niveau de consommation. Les données de l AFSSAPS sur les ventes de médicaments sur le marché hospitalier exprimées en valeur sont donc exploitables à condition de ne pas tenir compte de l ordre du classement. Tableau 21 : Répartition des ventes de médicaments en quantité et en valeur sur le marché officinal en 2008 (part du marché %). Sont indiquées en gras les classes communes aux 2 classements. classes ATC de niveau 2 les plus vendues en quantité classes ATC de niveau 2 les plus vendues en valeur N02 - analgésiques (19,4) C09 - système rénine-angiotensine (7,0) N05 - psycholeptiques (5,1) C10 - hypolipidémiants (5,7) J01 - antibactériens (4,2) N02 - analgésiques (5,1) V03 - tous autres médicaments (3,4) R03 - syndromes obstructifs des voies aériennes (4,9) S01 - médicaments ophtalmologiques (2,7) B01 - antithrombotiques (4,3) A03 - troubles gastro-intestinaux (2,7) A02 - troubles de l'acidité (4,3) A02 - troubles de l'acidité (2,7 N06 - psychoanaleptiques (4,1) N06 - psychoanaleptiques (2,6) J05 - antiviraux à usage systémique (3,4) C09 - système rénine-angiotensine (2,5) A10 - médicaments du diabète (3,3) R01 - préparations nasales (2,5) J01 - antibactériens (3,2) R05 - médicaments du rhume et de la toux (2,3) N05 - psycholeptiques (2,9) C10 - hypolipidémiants (2,3) J07 - vaccins (2,8) M01 - AI et antirhumatismaux (2,2) L03 - immunostimulants (2,8) A10 - médicaments du diabète (2,2) L04 - immunosuppresseurs (2,8) B01 - antithrombotiques (2,1) S01 - médicaments ophtalmologiques (2,6) A01 - préparations stomatologiques (2,1) G03 - hormones sexuelles (2,5) A06 - laxatifs (2,0) L02 - thérapeutique endocrine (2,1) G03 - hormones sexuelles (2,0) M01 - AI et antirhumatismaux (2,0) R06 - antihistaminiques systémiques (2,0) B03 - préparations antianémiques (1,9) C07 - -bloquants (1,7) L01 - antinéoplasiques (1,8) A02 - médicaments pour les troubles de l'acidité ; A03 - médicaments troubles fonctionnels gastro-intestinaux C09 - médicaments agissant sur le système rénine-angiotensine G03 - hormones sexuelles et modulateur de la fonction génitale J01 - antibactériens à usage systémique M01 - anti-inflammatoires et antirhumatismaux R03 - médicaments syndromes obstructifs des voies aériennes D après les rapports de l AFSSAPS sur les analyses des ventes de médicaments (AFSSAPS, 2006 ; AFSSAPS, 2008 ; AFSSAPS, 2009 ; AFSSAPS, 2010), en France, depuis 2004 et jusqu en 2008, les anticancéreux (antinéoplasiques), les antihémorragiques, les antiviraux, les substituts du plasma et solutions de perfusion ou encore les antibactériens, les psycholeptiques et les analgésiques sont parmi les classes ATC de niveau 2 les plus vendues 112

113 Tableau 22 : Répartition des ventes de médicaments par classe ATC de niveau 2 sur le marché hospitalier en valeurs en 2004, 2006, 2007 et 2008 (part du marché %) L01 - antinéoplasiques J05 - antiviraux B03 - préparations antianémiques B02 - antihémorragiques B05 - plasma et perfusion J01 - antibactériens L04 - immunosuppresseurs V03 - tous autres médicaments N01 - anesthésiques J06 - immunsérums et Ig J02 - antimycosiques L03 - Immunostimulants B01 - antithrombotiques C02 - antihypertenseurs A16 - voies digestives N05 - psycholeptiques N02 - analgésiques V08 - produits de contraste V09 - radiopharmaceutiques M03 - myorelaxants (20,2) (10,6) (10,0) (7,8) (5,4) (4,9) (3,5) (3,3) (3,1) (3,0) (2,3) (2,2) (2,1) (2,0) (2,0) (1,9) (1,6) (1,3) (1,2) (0,9) L01 - antinéoplasiques 2006 B02 - antihémorragiques J05 - antiviraux B05 - plasma et perfusion J01 - antibactériens J06 - immunsérums et Ig B03 - préparations antianémiques L04 - immunosuppresseurs B01 - antithrombotiques N01 - anesthésiques J02 - antimycosiques V03 - tous autres médicaments A16 - voies digestives N05 - psycholeptiques N02 - analgésiques V09 - radiopharmaceutiques V08 - produits de contraste C02 - antihypertenseurs N06 - psychoanaleptiques M03 - myorelaxants (28,8) (9,0) (6,9) (6,2) (4,6) (3,7) (3,3) (3,3) (3,2) (2,9) (2,8) (2,7) (2,5) (2,0) (1,9) (1,4) (1,3) (1,3) (1,0) (1,0) L01 - antinéoplasiques B02 - antihémorragiques J05 - antiviraux A16 - autres médicaments des voies digestives B05 - substituts du plasma et solutions de perfusion J01 - antibactériens à usage systémique ; J02 - antimycosiques à usage systémique ; antiviraux à usage systémique ; J06 - immunsérums et immunoglobulines V09 - produits radiopharmaceutiques 2007 L01 - antinéoplasiques B02 - antihémorragiques J05 - antiviraux B05 - plasma et perfusion J06 - immunsérums et Ig L04 - immunosuppresseurs J01 - antibactériens A16 - voies digestives B01 - antithrombotiques B03 - préparations antianémiques J02 - antimycosiques V03 - tous autres médicaments N01 - anesthésiques N05 - psycholeptiques N02 - analgésiques V09 - radiopharmaceutiques C02 - antihypertenseurs V08 - produits de contraste M03 - myorelaxants N06 - psychoanaleptiques (28,9) (9,3) (7,1) (5,5) (4,2) (3,8) (3,8) (3,4) (3,3) (3,2) (2,7) (2,7) (2,6) (1,9) (1,9) (1,7) (1,4) (1,2) (1,1) (1,0) 2008 L04 - immunosuppresseurs B05 - plasma et perfusion J06 - immunsérums et Ig A16 - voies digestives B01 - antithrombotiques J01 - antibactériens B03 - préparations antianémiques J02 - antimycosiques N01 - anesthésiques V03 - tous autres médicaments V09 - radiopharmaceutiques N02 - analgésiques N05 - psycholeptiques C02 - antihypertenseurs V08 - produits de contraste M03 - myorelaxants D08 - antiseptiques et désinfectants (30,1) (9,3) (7,2) (5,3) (5,2) (4,5) (3,6) (3,4) (3,3) (2,8) (2,6) (2,5) (2,3) (1,8) (1,8) (1,7) (1,5) (1,0) (0,9) (0,9) Chapitre 2 : Les composés étudiés sur la marché hospitalier (Tableau 22). Certaines classes sont spécifiques à ce marché comme les antihémorragiques, les produits de contraste ou les anesthésiques alors que d autres sont communes avec le marché officinal comme les antibiotiques ou les analgésiques. 113

114 Chapitre 2 : Les composés étudiés En conclusion, à partir des données de ventes affichées dans les rapports de l AFSSAPS, il ressort que les analgésiques (N02), les psycholeptiques (N05) et les antibiotiques (J01) sont les médicaments les plus consommés aussi bien en officine qu à l hôpital ; que les médicaments des voies digestives et du métabolisme (classes ATC A02, A03), du système cardio-vasculaire (classes ATC C05, C9, C10, C07) et du système respiratoire (classes ATC R01, R05) sont aussi fortement consommés spécifiquement sur le marché officinal ; et que les anticancéreux (L01), les antiviraux (J05) et les médicaments de la classe ATC B (sang et organes hématopoïétiques, B01, B02, B05) sont les plus consommés sur le marché hospitalier. Par ailleurs, pour certains médicaments qui sont vendus sans prescription, comme ceux disponibles sur internet par exemple, il est très difficile d avoir un chiffre exact sur leurs ventes ou sur leurs consommations. C est le cas par exemple des inhibiteurs de PDE 5 comme le sildénafil contenu dans le viagra. Vu la facilité d accès à de tels médicaments, leur consommation est supposée être importante mais aucune donnée précise n est vraiment disponible. I.2. Toxicité Les éléments présentés dans ce paragraphe reprennent brièvement les données présentées dans la partie VI. Toxicité et écotoxicité du chapitre 1. D après les informations disponibles sur les effets secondaires des médicaments dans le dictionnaire Vidal (2006), dans le guide «Traitement antirétroviral de l infection à VIH chez l adulte et l adolescent en situation de ressources limitées» (MS, 2008) ou sur le site internet Drugs.com (http://www.drugs.com), il s avère que les anticancéreux et les anti-vih comptent parmi les composés les plus cytotoxiques et pour lesquels le plus d effets secondaires indésirables ont été rapportés (ex. : nausée, perte des cheveux pour les anticancéreux ou neuropathie et lipodystrophie pour les anti-vih). Du point de vue des mécanismes d action, des récepteurs 1 et/ou 2 sur lesquels des - bloquants peuvent agir sont présents sur les érythrocytes et sur les cellules cardiaques de la truite arc-en-ciel (Huggett et al., 2003). Des homologues des enzymes CX, que les AINS peuvent inhiber, ont été trouvés chez la truite arc-en-ciel. Des gènes codant pour des récepteurs PPAR ont été identifiés chez plusieurs espèces de poisson comme le saumon d Atlantique ou le poisson zèbre. Les hypolipémiants du groupe des fibrates se fixent sur ces récepteurs PPAR (Fent et al., 2006). La présence chez les poissons de récepteurs ou d enzyme similaire à celles présentes chez les humains laisse supposer que les effets biologiques ou les réactions indésirables des médicaments pourraient se produire chez les non-mammifères. D un point de vue toxicologique, les antibiotiques envers les cyanobactéries, les -bloquants et les antidépresseurs comme la fluoxétine ou encore les hypolipémiants comme les fibrates, envers les invertébrés, sont les composés les plus toxiques avec des EC 50 ou des NEC de l ordre du µg/l ou de la dizaine de µg/l (Figure 28 et Figure 29). D après les tests d évaluation du risque environnemental conduite par Ferrari et al. (2004) ou Gros et al. (2010), les antibiotiques constituent la classe thérapeutique qui représente le plus de risques avec le plus de composés possédant des rapports PEC / PNEC > 1. Par ailleurs les phénomènes d antibiorésistance accentuent les risques sanitaires et environnementaux représentés par les antibiotiques. Des bactéries résistantes aux 114

115 Chapitre 2 : Les composés étudiés antibiotiques de la famille des -lactames (pénicillines et céphalosporines) ont été mises en évidence dans des rejets de stations d épuration et les eaux de surface (Reinthaler et al., 2003). Ainsi, de par leurs effets secondaires, leurs mécanismes d action ou le niveau de leurs concentrations effectives, les antibiotiques, les anticancéreux, les anti-vih, les bloquants, les hypolipémiants de la catégorie des fibrates et les AINS sont identifiés comme des classes thérapeutiques pouvant avoir un effet toxique sur des organismes non ciblés. Les problèmes d antibiorésistance ajoutent un poids supplémentaire aux risques sanitaires et environnementaux représentés par les antibiotiques. I.3. Présence dans l environnement En se basant sur les résultats du projet KNAPPE (Figure 30, Schlüsener et al., 2007), les antibiotiques, les anti-inflammatoires, les -bloquants et les analgésiques sont les classes de médicaments les plus recherchés et les plus retrouvés dans les échantillons environnement. Selon Miège et al. (2009) (Tableau 23), les analgésiques et anti-inflammatoires, les antibiotiques, les hypolipémiants, les antiépileptiques et les -bloquants sont les classes thérapeutiques les plus étudiées avec des fréquences de recherche respectivement de 20 ; 8,7 ; 4,4 ; 4 et 2,8 %. D après les données collectées dans la littérature et présentées dans les tableaux en annexe (Annexe - tableau 2 à Annexe - tableau 7), les analgésiques et anti-inflammatoires, les antibiotiques, les antiépileptiques et antidépresseurs, les hypolipémiants et les -bloquants sont les composés les plus recherchés et les plus retrouvés dans les différentes matrices aqueuses. Les antibiotiques et certains antiépileptiques et antidépresseurs comme la carbamazépine ou la fluoxétine sont également retrouvés dans les boues de STEP (Annexe - tableau 8). Les antibiotiques sont en plus recherchés et retrouvés dans les déchets d élevage. Ainsi, 5 classes sont retenues comme étant les plus présentes dans le milieu naturel. Il s agit des analgésiques et anti-inflammatoires, des antibiotiques, des antiépileptiques et antidépresseurs, des -bloquants et des hypolipémiants. antiasthmatique hypolipémiant 6% métabolite 7% anxiolytique anti-convulsant 8% anticancéreux 3% 2% décongestionnant bronchodilatateur 1% antibiotique 30% agent de contraste 9% analgésique 10% b-bloquant 11% anti-inflammatoire 13% Figure 30: Répartition des classes de molécules pharmaceutiques en fonction de leur fréquence d analyse dans des échantillons environnementaux (traduit du projet KNAPPE). 115

116 Chapitre 2 : Les composés étudiés Tableau 23 : Classes thérapeutiques et molécules pharmaceutiques les plus recherchées dans les stations d'épuration (traduit de Miège et al., 2009). classes thérapeutiques hormones analgésiques et antiinflammatoires antibiotiques molécules œstrone, 17 -œstradiol, 17 -œstradiol, 17 -éthinylœstradiol, testostérone, progestérone ibuprofène, diclofénac, kétoprofène, naproxène, acide méfénamic sulfaméthoxazole, triméthoprime, ciprofloxacine, roxithromycine, norfloxacine, clarithromycine, érythromycine fréquence (%)* hypolipémiants bézafibrate, gemfibrozil 4,4 antiépileptique carbamazépine 4,0 métabolites acide clofibrique, acide salicylique 3,9 -bloquants métoprolol, propranolol, aténolol 2,8 produits de soin corporel galaxolide, tonalide 2,7 agents de contraste iopromide 1,1 désinfectant triclosan 0,8 vasodilatateurs pentoxifylline 0,7 antidépresseurs diazépam 0,6 total 80 * fréquence de citation dans la base de données de Miège et al., 2009 (117 articles, 6641 données, 184 molécules) ,7 I.4. Persistance D après la Figure 7 présentée dans la partie IV du chapitre 1, à l exception du diclofénac, les analgésiques comme le paracétamol ou l aspirine et les anti-inflammatoires comme l ibuprofène, le kétoprofène ou le naproxène sont relativement bien éliminés dans les STEP. En revanche, les antiépileptiques comme la carbamazépine, les hypolipémiants comme l acide clofibrique ou les -bloquants comme le métoprolol sont difficilement éliminés (abattement < 50 %). La persistance des antibiotiques durant le traitement dans les stations d épuration varie en fonction de la famille considérée. Les fluoroquinolones sont bien éliminés de la phase dissoute par exemple alors que les macrolides ou les imidazoles ne semblent pas être affectés par les traitements appliqués. Les anticancéreux sont également difficilement éliminés dans les STEP (Annexe - tableau 1). Ainsi, 5 classes sont retenues comme persistantes en dépit des processus de traitement appliqués dans les STEP, il s agit : des antiépileptiques, des hypolipémiants, des -bloquants, de certains antibiotiques et des anticancéreux. I.5. Manque de données A travers l ensemble des données de présence et de concentration collectées et présentées dans les figures 13 à 27 et les tableaux 14 et 15 ou encore de l Annexe - tableau 2 à l Annexe - tableau 8, il ressort que certaines classes comme les anesthésiques, les antihypertenseurs, les antidiabétiques, les vasodilatateurs, les antagonistes des récepteurs angiotensine II, les antagonistes des récepteurs calciques, les inhibiteurs de PDE 5 ou encore les anti-vih sont peu étudiées. Deux raisons peuvent expliquer ce constat. La première est liée au nombre de molécules qui constituent ces classes. Contrairement aux analgésiques ou aux antibiotiques 116

117 Chapitre 2 : Les composés étudiés dont plus d une douzaine et plus d une quarantaine de molécules respectivement ont été recherchées et retrouvées au moins une fois dans les eaux de surface ou les effluents de STEP, certaines classes comme les antihypertenseurs ou les antidiabétiques ont peu de représentants, 2 molécules recherchées et retrouvées. La deuxième raison est liée au peu d intérêt qui a été porté jusqu à présent à certaines classes comme les anti-vih ou les anticancéreux (en dehors des rejets hospitaliers). Ainsi, en dépit d un nombre suffisamment conséquent de représentants dans ces classes, peu d informations sont disponibles. Par exemple uniquement 2 articles scientifiques traitent des anti-vih dans l environnement à notre connaissance (Al- Rajab et al., 2010 ; Prasse et al., 2010). Enfin certaines classes comme les inhibiteurs de PDE 5 cumulent les 2 raisons. Elles sont constituées d un petit nombre de molécules et sont peu étudiées (un seul article scientifique traite des inhibiteurs de PDE 5 dans l environnement à notre connaissance Nieto et al., 2010a). Ainsi, 6 classes et sous classes sont retenues comme ne possédant pas beaucoup d informations relatives à leur présence dans l environnement. Il s agit des anti-vih, des inhibiteurs de PDE 5, des anticancéreux, des antihypertenseurs, des antidiabétiques et des anesthésiques. Par ailleurs aucune donnée n a été relevée sur la présence de médicament appartenant aux classes ATC A02 et A03 relatives aux médicaments des troubles gastrointestinaux ou de l acidité alors que d après les données de ventes de l AFSSAPS, ce sont des composés très consommés. I.6. Classes sélectionnées Le Tableau 24 reprend les classes de molécules retenues pour chacun des critères de sélection pris en compte. Les classes thérapeutiques les plus récurrentes dans le tableau, c est-à-dire celles correspondant au plus grand nombre de critère de sélection ont été choisies. Cependant, un autre critère relatif aux composés déjà étudiés au laboratoire a été pris en considération à ce niveau là de la sélection. En effet, une méthode initiale développée par Togola et Budzinski (2008) existait au laboratoire pour permettre le dosage de molécules pharmaceutiques appartenant aux classes thérapeutiques des AINS, des hypolipémiants, des anti-épileptiques et antidépresseurs, des bronchodilatateurs et des stimulants. Ainsi, bien que certaines de ces classes répondent à un grand nombre de critères de sélection, de façon délibérée, elles n ont pas été retenues. Les classes sélectionnées ont été choisies de façon à constituer une liste complémentaire à celle pré-existante. Les antibiotiques ont été retenus car ils répondent à 4 critères de sélection (présents dans 4 des 5 colonnes du Tableau 24). Ils sont fortement consommés, fréquemment recherchés et retrouvés dans l environnement et peu éliminés de la phase dissoute lors du traitement dans les STEP pour certaines familles. Ils représentent aussi un risque environnemental et sanitaire majeur de par leur toxicité envers les cyanobactéries et les phénomènes d antibiorésistance. De plus, contrairement à d autres classes thérapeutiques, ils sont également utilisés en médecine vétérinaire. Les anticancéreux correspondent également à 4 des 5 critères de sélections. Ils sont toxiques, persistants et fortement consommés, surtout à l hôpital. Par ailleurs, ils ont été peu recherchés dans l environnement à l exception des rejets hospitaliers. En conséquence, peu de données sont disponibles sur leur présence potentielle dans le milieu naturel. L ajout de cette classe de médicaments à la liste des composés à analyser permettra potentiellement de combler ces lacunes. 117

118 Chapitre 2 : Les composés étudiés Les -bloquants, les antiviraux, les antiépileptiques et les hypolipémiants répondent à 3 critères sur 5. Cependant, en considérant le critère relatif à la toxicité et à l écotoxicité comme prioritaire sur les autres, seuls les -bloquants et les anti-vih ont été sélectionnés. De plus les antiépileptiques et les hypolipémiants appartiennent à la liste pré-existante des composés précédemment analysés au laboratoire. Les antiépileptiques ne remplissent pas ce critère selon nos données et les hypolipémiants ne le remplissent que pour le sous-groupe des fibrates ce qui est insuffisant pour considérer la classe entière. En revanche, les anti-vih ont été choisis car peu d études ont été menées sur eux et ils apportent un coté innovant à ces travaux. Enfin, la classe des inhibiteurs de PDE 5 a été retenue pour deux raisons : i) à notre connaissance, une seule publication traite des inhibiteurs de PDE 5 à l heure actuelle (Nieto et al., 2010a) et la volonté d intégrer cette classe apporte un côté original à cette étude ; ii) aucune donnée précise de consommation n est disponible sur ces composés, or s ils sont détectés à de fortes concentrations dans les eaux usées, cela permettra d avoir une idée sur les pratiques de consommation (stratégie similaire à celle appliquée à l étude des drogues, Postigo et al., 2010). classes sélectionnées selon le critère consommation Tableau 24 : Synthèse des classes de médicaments retenues suivant les différents critères de choix. classes sélectionnées selon le critère toxicité / écotoxicité classes sélectionnées selon le critère présence classes sélectionnées selon le critère persistance classe sélectionnées selon le critère manque de données analgésiques antibiotiques analgésiques certains antibiotiques anticancéreux antibiotiques anticancéreux antibiotiques certains anticancéreux antidiabétiques anticancéreux anti-inflammatoires antidépresseurs antiépileptiques anesthésiques antihémorragiques anti-vih antiépileptiques -bloquants antihypertenseurs antiviraux -bloquants anti-inflammatoires hypolipémiants antiviraux dont anti-vih troubles gastrointestinaux (fibrates) hypolipémiants -bloquants inhibiteurs PDE 5 troubles de l acidité hypolipémiants troubles gastro-intestinaux psychoanaleptiques psycholeptiques plasma et perfusion II. Sélection des molécules Pour cibler les composés à analyser, une fois les classes thérapeutiques sélectionnées, le deuxième niveau de choix consistait à identifier les familles d antibiotiques ou sous-classes d anticancéreux et d anti-vih à étudier. Enfin le troisième niveau de choix concernait les molécules. Les critères et documents pris en compte pour effectuer ces choix sont détaillés classe par classe dans les paragraphes suivants. Dans un premier temps, 32 molécules ont été sélectionnées comme composés modèles d étude. Comme pour les classes thérapeutiques, le choix s est basé sur des données de consommation, de toxicité, de représentativité des classes et sous-classes de composés ainsi que sur des résultats d études antérieures révélant la présence de certaines molécules par rapport à d autres au sein d une même classe/famille. Il a également été pris en compte la disponibilité et le prix des composés étalons de référence. La liste a ensuite été étendue à 78 composés. Le choix s est basé sur les mêmes critères que ceux évoqués précédemment auxquels ont été ajoutées les informations obtenues suite à nos premiers résultats d analyse comme par exemple la présence plus importante de certaines classes ou familles. Le tableau 118

119 Chapitre 2 : Les composés étudiés présenté à la fin de cette partie liste les 78 molécules retenues accompagnées de leur critère de sélection. II.1. Les antibiotiques II.1.1. Consommation des antibiotiques Les antibiotiques sont utilisés à la fois en médicine humaine et en médecine vétérinaire dans le traitement d infections dues à des bactéries, des champignons, des parasites. Ils ont aussi pendant longtemps été employés dans les élevages (agricoles et aquacoles) comme additifs alimentaires pour prévenir une infection et favoriser la croissance des animaux (InVS, 2004). Mais les problèmes de résistances bactériennes aux antibiotiques ont amené les pouvoirs publics au niveau européen à limiter leurs usages dans de tels buts depuis l interdiction des glycopeptides comme l avoparcine en 1997 (http://www.admi.net/eur/loi/leg_euro/fr_397 L0006.html, 24/11/06) jusqu à l interdiction totale de tous les antibiotiques comme additifs alimentaires depuis le 1 er janvier 2006 (http://europa.eu/rapid/pressreleasesaction.do?reference=ip/05/1687&format=html&aged=0&language=fr&guilanguage=fr, 24/11/06). En fonction de leurs usages (médecine humaine ou vétérinaire), de leur spectre d action et de leur mode d action, les différentes classes d antibiotiques sont plus ou moins prescrites et donc plus ou moins consommées. II Consommation des antibiotiques en médecine humaine En raison des problèmes d antibiorésistance, la consommation des antibiotiques en France et en Europe est particulièrement suivie. Le projet ESAC, pour «European Surveillance of Antimicrobial Consumption», en est un parfait exemple. L'objectif principal de ce projet est de collecter les données de consommation des antibiotiques et de le mettre gratuitement à la disposition de la communauté scientifique et du grand public (http://app.esac.ua.ac.be/public /index.php/fr_fr /esac/what, 16/09/10). Il est donc aisé de trouver des données sur la consommation des différentes familles d antibiotiques. Celles-ci sont exprimées en DDD pour «Define Daily Dose». L ESAC définit la DDD comme «la dose moyenne journalière d un médicament (ou plus exactement de la molécule active qu il contient) dans son indication principale, pour un adulte de 70 kilogrammes». C est une unité de mesure de la consommation et un outil de comparaison qui a été mis au point par l MS. Afin de prendre en compte les différences importantes de population d un pays à l autre et de rendre ainsi possibles des comparaisons internationales, la consommation d'antibiotiques est communément exprimée en nombre de doses définies journalières pour 1000 habitants et par jour (defined daily doses per 1000 inhabitants per day, DID) (http://app.esac.ua.ac.be/public/index.php/fr_fr/antibiotic/defined-daily-dose, 16/09/10). La Figure 31 a été réalisée à partir des données disponibles sur le site de l ESAC. Elle met en évidence l évolution de la consommation des différentes familles d antibiotiques en France entre 1998 et 2008 en médecine ambulatoire et entre 2006 et 2008 en médecine hospitalière. La Figure 31a représente l évolution de la consommation des différentes familles d antibiotiques en France entre 1998 et 2008 en médecine ambulatoire. Il ressort très clairement que les pénicillines sont la famille d antibiotique la plus consommée. Depuis 2005, les familles d antibiotiques les plus consommées en médecine ambulatoire sont par ordre 119

120 DDD/1000hab-j DDD/1000hab-j Chapitre 2 : Les composés étudiés décroissant d importance : 1) les -lactames (pénicillines), 2) les macrolides et lincosamides, 3) les tétracyclines, 4) les autres -lactames (céphalosporines), 5) les quinolones et fluoroquinolones et enfin, 6) les sulfonamides et triméthoprime. En médecine hospitalière, les consommations sont moins importantes qu en médecine ambulatoire (Figure 31b) et les tendances ne sont pas tout à fait les mêmes. La famille des quinolones et fluoroquinolones arrive en deuxième position, derrière les pénicillines, des familles d antibiotiques les plus consommées. Les macrolides et lincosamides ainsi que les tétracyclines y sont peu consommés. consommation antibiotiques en France en médecine ambulatoire b-lactames (pénicillines) autres b-lactames quinolones et fluoroquinolones autres antibiotiques 20 macrolides, lincosamides et streptogramines tétracyclines sulfonamides et trimethoprime consommation antibiotiques en France à l'hopital b-lactames 0 (pénicillines) macrolides, lincosamides et streptogramines autres b-lactames tétracyclines quinolones et fluoroquinolones sulfonamides et trimethoprime autres antibiotiques 1,5 (a) 1,0 0,5 0, (b) Figure 31 : Evolution de la consommation des antibiotiques en France en médecine ambulatoire entre 1998 et 2008 (a) et à l hôpital entre 2006 et 2008 (b), exprimée en DDD pour 1000 habitants et par jour (à partir des données ESAC). La première sélection des familles d antibiotiques a été faite à partir de ces informations. Ainsi les pénicillines et céphalosporines, les macrolides et lincosamides, les tétracyclines, les quinolones et fluoroquinolones, les sulfonamides et les phénicolés ont été retenus. En se basant sur le classement ATC (Figure 32) et sur les données de consommation en médecine vétérinaire (cf. II Consommation des antibiotiques en médecine vétérinaire) et dans le but de représenter tous les sous-groupes (ATC niveau 4), 23 molécules ont été choisies au sein de ces familles (ATC niveau 3) de façon à alimenter une méthode de base. 120

121 Chapitre 2 : Les composés étudiés J01 antibactériens à usage systémique J01A tétracyclines J01AA tétracyclines (12 molécules différentes) J01B amphénicols J01BA amphénicols (2 molécules différentes) J01C beta-lactames, pénicillines J01CA pénicillines à spectre large (18 molécules différentes) J01CE pénicillines sensibles aux beta-lactamases (10 molécules différentes) J01CF pénicillines résistantes aux beta-lactamases (5 molécules différentes) J01CG inhibiteurs de beta-lactamase (2 molécules différentes) J01CR combinaisons de pénicillines, incl. inhibiteurs de beta-lactamase (1 molécule) J01D autres beta-lactames J01DB céphalosporines première génération (12 molécules différentes) J01DC céphalosporines seconde génération (11 molécules différentes) J01DD céphalosporines troisième génération (17 molécules différentes) J01DE céphalosporines quatrième génération (3 molécules différentes) J01DF monobactames (1 molécule) J01DH carbapenemes (6 molécules différentes) J01DI autres céphalosporines (1 molécule) J01E sulfonamides and triméthoprime J01EA triméthoprime and dérivés (3 molécules différentes) J01EB sulfonamides à courte vie (8 molécules différentes) J01EC sulfonamides à vie intermédiaire (3 molécules différentes) J01ED sulfonamides à longue vie (9 molécules différentes) J01EE combinaison de sulfonamides and triméthoprime, incl. dérivés J01F macrolides, lincosamides and streptogramines J01FA macrolides (14 molécules différentes) J01FF lincosamides (2 molécules différentes) J01FG streptogramines (2 molécules différentes) J01G aminoglycosides J01GA streptomycines (2 molécules différentes) J01GB autres aminoglycosides (11 molécules différentes) J01M quinolones J01MA fluoroquinolones (19 molécules différentes) J01MB autres quinolones (7 molécules différentes) J01R combinaison d antibactériens J01RA combinaison d antibactériens J01X autres antibactériens J01XA glycopeptides (5 molécules différentes) J01XB polymyxines (2 molécules différentes) J01XC antibactériens stéroïdes (1 molécules différentes) J01XD dérivés de l imidazole (3 molécules différentes) J01XE dérivés des nitrofuranes (2 molécules différentes) J01XX autres antibactériens (10 molécules différentes) Figure 32 : Recensement des classes ATC de niveau 3 et 4 pour le groupe des antibiotiques en médecine humaine (d après le site internet Ultérieurement, dans le but d agrandir et d optimiser la liste des molécules à étudier, il est apparu nécessaire de connaître le détail des consommations individuelles de chaque antibiotique. L «IMS Health» est une entreprise qui collecte les données des ventes de médicaments en officine. Elle possède donc les chiffres exacts des ventes de chaque spécialité pharmaceutique. En compilant les données de vente des différents médicaments contenant le même principe actif, elle est à même de fournir les données de ventes individuelles de chaque molécule. L IMS Health a alors été contacté dans le but d obtenir les chiffres des ventes individuelles de chaque antibiotique. Cette entreprise a ainsi pu nous donner le classement des 100 molécules les plus vendues en France en 2007 et en 2008 ainsi que les données des ventes 121

122 Chapitre 2 : Les composés étudiés d antibiotiques en officine, molécules par molécules (Tableau 25 et Tableau 26). En l absence de données plus précises sur les ventes d antibiotiques à l hôpital, ce sont les données sur les ventes en officines qui ont guidé le choix des antibiotiques à étudier. Les données de l'ims Health (Tableau 26) ont permis de confirmer les choix précédents comme par exemple celui de l amoxicilline, qui avec plus de 48,9 millions d unités vendues en 2008 ( seule et en association avec l acide clavulanique) est la cinquième molécule pharmaceutique et le premier antibiotique le plus vendu, ou encore celui du cefpodoxime proxétil qui est la trente-huitième molécule pharmaceutique et le troisième antibiotique le plus vendu. Elles ont également permis d étendre la sélection à des familles d antibiotiques qui n avaient pas été retenues dans la liste initiale de base comme les imidazoles par exemple. En effet, le métronidazole est le quatrième antibiotique le plus consommé avec unités vendues en Au total, en France, en 2008, plus de 127 millions d unités d antibiotiques à usage systémique ont été vendues en officines. Au final en incluant ces nouvelles informations aux précédentes, 52 antibiotiques ont été choisis pour être analysés. Tableau 25 : Nombre d unités vendues sur les 100 premières molécules du marché ambulatoire français en 2007 et 2008 (données IMS Health). Unités 2007 Unités 2008 paracétamol dextropropoxyphène / paracétamol ibuprofène acide acétylsalicylique amoxicilline lévothyroxine sodium metformine codéine / paracétamol diclofénac zolpidem paracétamol / tramadol caféine / dextropropoxyphène / paracétamol kétoprofène chlorhexidine / chlorobutanol oméprazole dompéridone amoxicilline / acide clavulanique macrogol(s) phloroglucinol furosémide alprazolam atorvastatine bétaméthasone zopiclone méthadone paroxétine acide alginique / sodium bromazépam glycine max / persea gratissima magnésium / pyridoxine trimétazidine lopéramide esoméprazole prednisolone phloroglucinol / triméthoxybenzène clopidogrel hélicine cefpodoxime proxétil

123 Chapitre 2 : Les composés étudiés Unités 2007 Unités 2008 pravastatine fénofibrate pantoprazole carbocistéine caféine / opium / paracétamol sodium (sous forme de chlorure, etc.) allopurinol buprénorphine bisoprolol oxomémazine trimébutine acétylcystéine lidocaïne / prilocaïne potassium (sous forme de chlorure, d iodure, du gluconate, de citrate, etc.) desloratadine acétylcystéine / tuaminoheptane éthinylestradiol / lévonorgestrel lorazépam glycérol / huile de paraffine calcium / colécalciférol simvastatine vaccine, grippe alvérine / siméthicone tramadol rosuvastatine salbutamol tétrazépam ramipril éconazole fluindione povidone-iodine amlodipine lansoprasole gliclazide acide borique venlafaxine ginkgo biloba (hétérosides de ginkgo ginkgolides bilobalide) magnésium (sous forme de chlorure, de sulfate, du gluconate, de citrate, etc) tixocortol cétirizine fluoxétine aténolol prednisone smectite oxazépam lactulose acide chondroitinsulfurique pholcodine lercanidipine perindopril hydroxyzine buflomédil ibuprofène / pseudoéphédrine trolamine benfluorex morphine acide folique alpha amylase fluticasone / salmeterol doxylamine naphazoline / prednisolone cétylpyridinium / chlorobutanol / eugen

124 Chapitre 2 : Les composés étudiés Tableau 26 : Nombre d'unités d'antibiotiques (classe ATC J01) vendues en France en 2007 et 2008 en officines (données IMS Health). Unités 2007 Unités 2008 J01 ANTIBACTERIENS amoxicilline amoxicilline / acide clavulanique cefpodoxime proxétil métronidazole / spiramycine pristinamycine ceftriaxone clarithromycine céfixime céfuroxime axétil doxycycline norfloxacine ofloxacine azithromycine sulfaméthoxazole / triméthoprime ciprofloxacine gentamicine josamycine nétilmicine roxithromycine cloxacilline oxacilline acide fusidique levofloxacine céfaclor colistine minocycline lymécycline pénicilline V spiramycine céfotiam hexétil telithromycine moxifloxacine tobramycine loméfloxacine céfadroxil ceftazidime érythromycine céfalexine clindamycine cilastatine / imipénème métacycline pénicilline G lysozyme / métacycline ampicilline pipéracilline / tazobactam péfloxacine céfuroxime ampicilline / sulbactam céfradine céfatrizine aztréonam dirithromycine fluméquine midécamycine pivampicilline céfépime acide clavulanique / ticarcilline thiamphénicol ticarcilline lincomycine céfapirine

125 phénicolés aminosides polymyxines tétracyclines sulfonamides et triméthoprime quinolones macrolides et apparentés b-lactames fluoroquinolones autres b-lactames nitrofurannes pourcentage des ventes Chapitre 2 : Les composés étudiés Unités 2007 Unités 2008 pivmécillinam spectinomycine déméclocycline céfazoline céfotaxime bacampicilline II Consommation des antibiotiques en médecine vétérinaire En France, en 2008, 1191 tonnes d'antibiotiques à usage vétérinaire ont été vendues (Chevance et al., 2009). Si certaines familles sont utilisées autant en médecine humaine que vétérinaire, d'autres en revanche sont majoritairement destinées à la consommation animale telle que les phénicolés, les aminosides (ou aminoglycosides), les polymyxines, les tétracyclines, les sulfonamides (ou sulfamides), les quinolones et dans une moindre mesure, les macrolides et apparentés (Figure 33). part 100% humain vétérinaire 80% 60% 40% 20% 0% Figure 33 : Répartitions entre usage humain et vétérinaire des ventes des différentes familles d antibiotiques (Source 350,19 ANMV-AFSSAPS 2002). Parmi les familles d antibiotiques utilisés en médecine vétérinaire, les tétracyclines arrivent largement en tête des antibiotiques les plus vendus suivies par les sulfonamides puis viennent les pénicillines, les macrolides, les aminosides et enfin les polypeptides (Figure 34). Les 4 premières familles citées représentent plus de 80% des ventes (Chevance et al., 2009). Sur l ensemble des ventes d antibiotiques à usage vétérinaire, 93 % du tonnage total est distribué aux animaux consommables, les porcs représentant à eux seuls plus de 50% de la consommation totale (Figure 35) (Chevance et al., 2009). 125

126 ventes (tonnes) tétracyclines sulfonamides pénicillines répartitions Chapitre des ventes 2 : Les d'antibiotiques composés étudiés par familles entre 1999 et macrolides aminosides polypeptides trimethoprimes divers quinolones céphalosporines phénicolés fluoroquinolones furanes Figure 34 : Evolution par familles des ventes d'antibiotiques familles à usage vétérinaire entre 1999 et 2008 (d après les données de Chevance et al,. 2009). répartion des ventes d'antibiotiques à usage vétériniare entre les différentes espèces CHIEN-CHAT; 1,69% LAPIN; 4,46% VIN-CAPRIN; 1,48% PISSN; 0,43% CHEVAL; 0,39% AUTRE; 0,01% BVIN; 15,22% PRC; 56,70% VLAILLE; 19,62% Figure 35 : Répartition de la consommation des antibiotiques vétérinaires en France en 2008 (graphique d'après les données du rapport de l'afssa-anmv, Chevance et al., 2009). Au sein des diverses espèces animales, la répartition de la consommation des antibiotiques par famille est différente (Figure 36). Ainsi chez les porcs, 2 familles sont majoritairement administrées: les tétracyclines et les polypeptides alors que chez les bovins il y a une plus grande diversité dans la consommation des différentes familles d'antibiotiques. Les pénicillines sont les plus utilisées puis viennent les aminosides, les macrolides et les tétracyclines et les polypeptides à part égale. Pour pouvoir comparer les données de consommation entre les espèces, ces dernières sont rapportées en tonnes de poids vif traité. Chez les poissons, seulement quatre familles d antibiotiques sont administrées, les quinolones, les tétracyclines, les sulfonamides et les triméthoprimes par ordre décroissant d importance (Chevance et al., 2007). Enfin d'une façon plus détaillée, les molécules les plus utilisées pour traiter les porcins sont : la chlortétracycline, l'oxytétracycline, la sulfadiazine, la sulfadiméthoxine, le triméthoprime, l'amoxicilline, la tylosine, les lincosamides, la marbofloxacine et la colistine. Et celles pour 126

127 Chapitre 2 : Les composés étudiés traiter les bovins sont par ordre décroissant d'utilisation: l'oxytétracycline, la sulfadiméthoxine, la pénicilline G, la sulfadiazine, la doxycycline, la dihydrostreptomycine, l'amoxicilline, la colistine, l'ampicilline, la néomycine, le triméthoprime, la tylosine, la chlortétracycline, la tétracycline, l'acide oxolinique, la fluméquine, la cloxacilline et la spiramycine (com. pers.) % 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% % 35% 30% 25% 20% 15% 10% 5% 0% a) b) Figure 36 : Evolution par familles des ventes d'antibiotiques à usage vétérinaire entre 1999 et 2008 a) pour les porcs et b) pour les bovins d'après les données de consommation exprimées en tonnes de poids vif traité (graphiques extrait du rapport de l AFSSA, Chevance et al., 2009). De l ensemble de ces informations, il faut retenir qu en médecine vétérinaire, ce sont majoritairement les mêmes familles d antibiotiques qu en médecine humaine qui sont administrées, seule leur importance relative varie. Deux familles spécifiques viennent s y ajouter, les polypeptides et les aminosides. Par ailleurs, les molécules administrées peuvent être les mêmes comme l amoxicilline par exemple ou à l inverse, très spécifique comme la marbofloxacine. Sur la base de ces nouvelles informations la sélection d antibiotique a pu être élargie. Il a aussi été ajouté deux molécules appartenant à la famille des polyéther/ionophores, la monensine et la salinomycine (groupe QP dans la classification ATCvet) qu il est normalement interdit d utiliser comme facteur de croissance (IP/05/1687 du 22/12/05, 0&language=FR&guiLanguage=en). Au final, parmi les 52 antibiotiques choisis, 6 sont exclusivement destinés à l usage vétérinaire : le ceftiofur, la tylosine, la marbofloxacine, l enrofloxacine, la monensine et la salinomycine. II.1.2. Toxicité, écotoxicité et antibiorésistance Comme pour la sélection des classes thérapeutiques, le choix des familles d'antibiotiques et des molécules s'est appuyé sur les données de toxicité et d'écotoxicité présentées dans la partie VI du chapitre 1. En se basant sur les effets secondaires, la famille des pénicillines est retenue. Les pénicillines (amoxicilline, ampicilline, pénicilline G, etc.) semblent être la seule famille responsable d'effets secondaires pouvant engager le pronostic vital en provoquant des réactions allergiques susceptibles d'évoluer jusqu'au choc anaphylactique. 127

128 Chapitre 2 : Les composés étudiés Du point de vue des mécanismes d'action, le sulfaméthizole inhiberait l'activité basale de l'erd, enzyme reflétant l'induction du cytochrome P450 responsable de l'élimination des xénobiotiques (Laville et al., 2004 dans Boxall, 2004). La pénicilline G, le sulfaméthoxazole, la sulfapyridine, l'oxytétracycline et la novobiocine provoqueraient le déclanchement du métabolisme oxydatif (Gagné et al., 2006). La ciprofloxacine serait génotoxique (Hartmann et al., 1998). Les tests de toxicité aigue pratiqués sur les cyanobactéries, les algues, les invertébrés et les poissons (figure 27 et tableau 13 chapitre 1) ont fait ressortir le caractère toxique des antibiotiques vis-à-vis des cyanobactéries et en particulier de l'amoxicilline (EC 50 = 3,7 µg/l, figure 27 et tableau 13), de la pénicilline G (figure 27), de la spiramycine (figure 27), de la streptomycine (figure 27), de la ciprofloxacine (EC 50 = 5 µg/l, figure 27 et tableau 13), de l'ofloxacine (EC 50 = 16 µg/l, tableau 13), de la sarafloxacine (EC 50 = 15 µg/l, tableau 13) et du sulfaméthoxazole (EC 50 = 26,8 µg/l, tableau 13). Les tests de toxicité chronique pratiqués sur les cyanobactéries, les algues, les invertébrés et les poissons (figure 28) ont confirmé le caractère toxique des antibiotiques vis-à-vis des cyanobactéries et en particulier de l'amoxicilline, de la pénicilline G, de la spiramycine, de l'érythromycine, du sulfaméthoxazole, de la streptomycine, de l'ofloxacine, de la levofloxacine et de la ciprofloxacine (EC50 ou NEC < 10 µg/l). Lors des ERA, Huschek et al. (2004) ont montré que la clarithromycine et la ciprofloxacine représentaient un risque pour les bactéries avec des rapports PEC / PNEC supérieurs à 1. Halling-Sorensen et al. (2000) ont mis en évidence le risque représenté par la ciprofloxacine pour les cyanobactéries. Ferrari et al. (2004) ont montré qu'une autre fluoroquinolone, l'ofloxacine, représentait également un risque pour les cyanobactéries. Gros et al. (2010) ont montré que l'érythromycine représentait un risque vis-à-vis des invertébrés (daphnies) et la tétracycline vis-à-vis des algues. Enfin, avec plusieurs valeurs de rapport PEC / PNEC supérieurs à 1, le sulfaméthoxazole représente un danger pour les cyanobactéries et les algues (Ferrari et al., 2004 ; Gros et al., 2010). Du point de vue de l'antibiorésistance, les résistances aux -lactames sembleraient être les plus courantes (activité -lactamase de certaines bactéries) (InVS). II.1.3. Présence dans le milieu La présence et le niveau de contamination des différentes familles d'antibiotiques dans les diverses matrices aqueuses sont présentés Figure 37. En se basant sur le nombre de données collectées (nombre de points sur le graphique), les familles d'antibiotiques les plus recherchées et les plus retrouvées sont les sulfonamides, les quinolones et fluoroquinolones et les macrolides et lincosamides. Les tétracyclines et quelques -lactames sont également recherchés et retrouvés mais à des fréquences moindres. Le groupe des autres antibiotiques (autre Ab) est essentiellement constitué par la famille des imidazoles. Quelques soit la famille considérée, les niveaux de contamination se situent entre la dizaine de ng/l et le µg/l mais peuvent être inférieurs dans les eaux souterraines ou les eaux de boisson, ou au contraire supérieurs dans les entrées de STEP et les effluents hospitaliers. 128

129 Chapitre 2 : Les composés étudiés b-lactames macrolides et lincosamides quinolones et fluoroquinolones sulfonamides tétracyclines autres Ab hopital entrée STEP sortie STEP surface souterraine potable hopital entrée STEP sortie STEP surface souterraine potable hopital entrée STEP sortie STEP surface souterraine potable hopital entrée STEP sortie STEP surface souterraine potable hopital entrée STEP sortie STEP surface souterraine potable hopital entrée STEP sortie STEP surface souterraine potable concentration (ng/l) Figure 37 : Présence et niveau de contamination des différentes familles d'antibiotiques dans les matrices aqueuses d après des données relevées dans la littérature (cf. Annexe - tableau 2 à Annexe - tableau 7). présence et niveau de contamination des antibiotiques dans les différentes matrices aqueuses 129

130 Chapitre 2 : Les composés étudiés Au sein de ces différentes familles, généralement 2 ou 3 composés sont davantage recherchés et retrouvés que les autres (Annexe - tableau 2 à Annexe - tableau 7). Dans la famille des sulfonamides, il s'agit du sulfaméthoxazole et du triméthoprime. Dans la famille des fluoroquinolones et quinolones, il s'agit de la ciprofloxacine, de la norfloxacine et de l'ofloxacine. Dans la famille des macrolides et lincosamides, il s'agit de l'érythromycine et de la roxithromycine. Miège et al. (2009) listent les mêmes molécules comme étant les antibiotiques les plus fréquemment recherchés mais remplacent l'ofloxacine (une fluoroquinolone) par la clarithromycine (un macrolide). Dans les boues de STEP (Figure 27), se sont les mêmes molécules qui sont les plus recherchées mais à la différence, ce sont surtout les fluoroquinolones (ciprofloxacine, norfloxacine et ofloxacine) et les tétracyclines (doxycyclines et tétracyclines) qui sont les plus retrouvées en raison de leur affinité la matière organique (Koc) ou des liaisons éléctrostatiques qu elles forment avec elle (pka). Néanmoins, la clarithromycine, le sulfaméthoxazole et le triméthoprime sont fréquemment détectés. Dans les déchets d'élevage, les antibiotiques de la famille des tétracyclines (tétracycline, oxytétracycline, chlortétracycline) sont les molécules les plus souvent analysées (recherchées et détectées), en particulier la chlortétracycline. Les molécules les plus fréquemment dosées sont les fluoroquinolones tels que la ciprofloxacine ou l'enrofloxacine, les macrolides et lincosamides tels que la tylosine et la lincomycine et les sulfonamides tels que la sulfaméthazine. II.1.4. Persistance Les différentes molécules d'une même famille d'antibiotiques ont des comportements similaires. Les comportements observés pour une ou deux molécules peuvent donc être étendus à l'ensemble de la famille. Les macrolides et lincosamides ainsi que les imidazoles sont faiblement éliminés dans les stations d'épurations (Figure 7). Leurs pourcentages d'élimination moyens sont inférieurs à 20 %. En revanche, les pénicillines et les fluoroquinolones sont bien éliminés de la phase dissoute avec des pourcentages d'élimination supérieurs à 60 %. II.1.5. Manque de données Relativement aux autres composés, les antibiotiques appartenant aux familles des polyéthers ionophores ou des polypeptides sont peu recherchés dans les matrices environnementales. En conséquence, peu de données sont disponibles pour les molécules comme la monensine ou la bacitracine. II.2. Les autres classes thérapeutiques : -bloquants, anticancéreux, anti-vih et inhibiteurs de la PDE 5. II.2.1. Consommation Contrairement aux antibiotiques, il est difficile d avoir accès à des données de consommation pour les sous-classes ou pour chaque molécule individuelle de ces 4 classes thérapeutiques. 130

131 Chapitre 2 : Les composés étudiés Dans les rapports de l AFSSAPS sur les analyses des ventes de médicaments aux officines et aux hôpitaux, les informations majoritaires qui peuvent en être extraites concernent l évolution du nombre d unités vendues ou de DDJ consommées pour la totalité de la classe. Par ailleurs, pour les antinéoplasiques ou les anti-vih par exemple, des informations concernant les ventes de certains médicaments sont disponibles dans le rapport de l AFSSAPS (AFSSAPS, 2009) mais elles sont exprimées en valeurs et non en quantité or vu le prix de tels traitements, cela ne reflète pas forcément la consommation de chaque molécule mais uniquement l importance générale de la classe. Par conséquent, initialement, les critères de sélection au sein de ces classes ont été uniquement les données de présence dans l environnement et d écotoxicité ainsi que la représentativité des sous-classes (cf. classement ATC Figure 38 pour les -bloquants, Figure 39 pour les anticancéreux et Figure 40 pour les anti-vih). C est ainsi que pour les -bloquants par exemple, un représentant des -bloquants sélectifs (métoprolol) et un autre des -bloquants non-sélectifs (propranolol) ont été choisis. De même, il a été décidé de choisir une molécule dans chacun des 3 groupes les plus importants d anti-vih (IP, INTI, INNTI ou les classes ATC J05AE, J05AF, J05AG Figure 40) en se basant sur les recommandations de traitement de l MS. Ce choix a ensuite été orienté en fonction de la disponibilité et du coût des composés étalons de référence. Ultérieurement, la sélection a pu être optimisée grâce aux données fournies par l IMS Health sur les ventes de molécules pharmaceutiques aux officines en 2008 (Tableau 25, Tableau 27, Tableau 28 et Tableau 29). C est ainsi qu ont été intégrés les -bloquants les plus consommés tels que le bisoprolol (quarante-septième molécule pharmaceutique et premier -bloquants le plus vendu avec quasiment 15 millions d unités vendues, seul ou en association) ou l aténolol (quatrevingtième molécule pharmaceutiques et deuxième -bloquants le plus vendu avec plus de 8 millions d unités vendues, seul ou en association) (Tableau 25 et Tableau 27). Au sein des antinéoplasiques (L01), le méthotréxate est le composé le plus consommé avec plus d un million d unités vendues. Le fluorouracile et le cyclophosphamide font partie des 15 antinéoplasiques les plus consommés en France en 2008 sur le marché ambulatoire. Avec et unités vendues, ils sont respectivement les huitièmes et quatorzièmes molécules les plus vendues. La doxorubicine et la daunorubicine sont des antinéoplasiques qui sont aussi vendus sur le marché ambulatoire. Le tamoxifène est le troisième cytostatique utilisé en hormonothérapie le plus vendu avec unités vendues en 2008 en France. Il n'appartient pas à la classe des antinéoplasiques (L01) mais est utilisé comme anticancéreux dans les traitements du cancer du sein. Au sein des anti-vih, la lamivudine ( unités vendues, en association avec l abacavir, en association avec la zidovudine, en association avec l abacavir et la zidovudine et seul) et le ritonavir ( unités vendues, en association avec le lopinavir et seule) sont respectivement le premier et le second anti-vih les plus vendus. L'abacavir et la zidovudine comptent également parmi les anti-vih les plus administrés avec plus de et unités vendues sur le marché ambulatoire (abacavir seul : unités vendues, abacavir en association avec zidovudine : unités vendues et abacavir en association avec lamivudine et zidovudine : unités vendues ; zidovudine seul : unités vendues, zidovudine en association avec lamivudine : unités vendues et zidovudine en association avec lamivudine et abacavir : unités vendues). 131

132 Chapitre 2 : Les composés étudiés C07 bétabloquants C07A bétabloquants C07AA bétabloquants, non-sélectif (14 molécules différentes) C07AB bétabloquants, sélectif (13 molécules différentes) C07AG alpha et bétabloquants (2 molécules différentes) C07B bétabloquants et thiazides C07BA bétabloquants, non-sélectif, et thiazides C07BB bétabloquants, sélectif, et thiazides C07BG alpha et bétabloquants et thiazides C07C bétabloquants et autres diurétiques C07CA bétabloquants, non-sélectif, et autres diurétiques C07CB bétabloquants, sélectif, et autres diurétiques C07CG alpha et beta bétabloquants et autres diurétiques C07D bétabloquants, thiazides et autres diurétiques C07DA bétabloquants, non-sélectif, thiazides et autres diurétiques C07DB bétabloquants, sélectif, thiazides et autres diurétiques C07E bétabloquants et vasodilatateurs C07EA bétabloquants, non-sélectif, et vasodilatateurs C07EB bétabloquants, sélectif, et vasodilatateurs C07F bétabloquants et autres antihypertenseur C07FA bétabloquants, non-sélectif, et autres antihypertenseur C07FB bétabloquants, sélectif, et autres antihypertenseur Figure 38: Recensement des classes ATC de niveau 3 et 4 pour le groupe des -bloquants en médecine humaine (d après le site internet L01 antinéoplasiques L01A agents alkylants L01AA moutardes azotées (8 molécules différentes) L01AB sulfonates alkylés (3 molécules différentes) L01AC imines éthylene (3 molécules différentes) L01AD nitrosourées (7 molécules différentes) L01AG époxides (1 molécule) L01AX autres agents alkylants (4 molécules différentes) L01B antimétabolites L01BA analogues de l acide folique (4 molécules différentes) L01BB analogues des purines (6 molécules différentes) L01BC analogues des pyrimidines (8 molécules différentes) L01C plantes alcaloïdes et autres produits naturels L01CA vinca alcaloïdes et analogues (5 molécules différentes) L01CB dérivés de la podophyllotoxine (2 molécules différentes) L01CC dérivés de la colchicine (1 molécule) L01CD taxanes (3 molécules différentes) L01CX autres plantes alcaloïdes et produits naturels (1 molécule) L01D antibiotiques cytotoxiques et autres substances apparentées L01DA actinomycines (1 molécule) L01DB anthracyclines et substances apparentées (9 molécules différentes) L01DC autres antibiotiques cytotoxiques (4 molécules différentes) L01X autres antinéoplasiques L01XA composés du platinium (4 molécules différentes) L01XB méthylhydrazines (1 molécule) L01XC anticorps monoclonaux (10 molécules différentes) L01XD sensibilisateurs utilisés en photodynamique et radiothérapie (5 molécules différentes) L01XE inhibiteurs de protéines kinases (11 molécules différentes) L01XX autres antinéoplasiques (27 molécules différentes) L01XY combinaison d antinéoplasiques Figure 39 : Recensement des classes ATC de niveau 3 et 4 pour le groupe des antinéoplasiques en médecine humaine (d après le site internet 132

133 Chapitre 2 : Les composés étudiés J05 antiviraux à usage systémique J05A antiviraux agissant directement J05AA thiosemicarbazones (1 molécule) J05AB nucléosides et nucléotides, exclu. inhibiteurs de la transcriptase inverse (11 molécules différentes) J05AC amines cycliques (2 molécules différentes) J05AD dérivés de l acide phosphonique (2 molécules différentes) J05AE inhibiteur de la protéase (10 molécules différentes) J05AF inhibiteurs nucléosidiques et nucléotidiques de la transcriptase inverse (12 molécules différentes) J05AG inhibiteurs non-nucléosidiques de la transcriptase inverse (4 molécules différentes) J05AH inhibiteurs de la neuraminidase (2 molécules différentes) J05AR antiviraux pour le traitement des infections au VIH, combinaison J05AX autres antiviraux (8 molécules différentes) Figure 40 : Recensement des classes ATC de niveau 3 et 4 pour le groupe des antiviraux en médecine humaine (d après le site internet Tableau 27 : Nombre d'unités de -bloquants (classe ATC C07) vendues en France en 2007 et 2008 en officines (données IMS Health). Unités 2007 Unités 2008 C07 BETA BLQUANTS bisoprolol aténolol acébutolol propranolol sotalol nébivolol bisoprolol / hydrochlorothiazide céliprolol métoprolol bétaxolol labétalol carvédilol nadolol aténolol / chlortalidone pindolol amiloride / hydrochlorothiazide / timolol tertatolol oxprénolol clopamide / pindolol chlortalidone / métoprolol cartéolol timolol chlortalidone / oxprénolol Tableau 28 : Nombre d'unités d'anticancéreux (classe ATC L01 et L02) vendues en France en 2007 et 2008 en officines (données IMS Health). Unités 2007 Unités 2008 L01 ANTINEPLASIQUES méthotréxate hydroxycarbamide vinorelbine capécitabine imatinib chlorambucil pipobroman fluorouracile mercaptopurine cytarabine erlotinib

134 Chapitre 2 : Les composés étudiés Unités 2007 Unités 2008 mitomycine estramustine cyclophosphamide sunitinib melphalan sorafenib fludarabine étoposide tegafur / uracile dasatinib vincristine vinblastine bléomycine procarbazine nilotinib asparaginase miltefosine acide aminolévulinique lapatinib busulfan cladribine idarubicine chlormethine topotécan fotémustine doxorubicine 2 7 pirarubicine 17 4 daunorubicine 2 3 L02 HRMNTHERAPIE CYTSTATIQUE anastrozole cyprotérone tamoxifen bicalutamide letrozole leuproréline exemestane triptoréline goserelin flutamide diéthylstilbestrol nilutamide fulvestrant megestrol médroxyprogestérone buséréline toremifène Tableau 29 : Nombre d'unités vendues d'anti-vih (classe ATC J05) en France en 2007 et 2008 en officines (données IMS Health). Unités 2007 Unités 2008 J05A ANTIVIRAUX DU VIH emtricitabine / ténofovir disoproxil lopinavir / ritonavir éfavirenz atazanavir ritonavir abacavir / lamivudine lamivudine / zidovudine névirapine ténofovir disoproxil

135 Chapitre 2 : Les composés étudiés Unités 2007 Unités 2008 lamivudine didanosine fosamprénavir abacavir abacavir / lamivudine / zidovudine saquinavir zidovudine darunavir stavudine emtricitabine indinavir enfuvirtide tipranavir amprénavir maraviroc raltegravir zalcitabine 44 3 nelfinavir Les données de vente des médicaments contenant du sildénafil n'ont pu être obtenues. Par ailleurs, le sildénafil est le principe actif du viagra or le viagra est en vente libre sur internet, il est donc très difficile d avoir un chiffre de vente reflétant une consommation réelle. Néanmoins, on peut supposer qu'il est fortement consommé puisque facilement accessible. Pour clore cette partie sur les données de consommation, à titre indicatif, en France, en 2008, plus de 51 millions d unités de -bloquants, plus de 7,5 millions d unités d anticancéreux et plus de 1,2 millions d unité d anti-vih ont été vendues en officines (données IMS Health). II.2.2. Ecotoxicité Les -bloquants sont des composés qui possèdent à la fois des effets secondaires indésirables (troubles cardiaques, constrictions des bronches), des mécanismes d'action susceptibles de les rendre nocifs pour des organismes non ciblés (présence de récepteurs 1 et 2 chez la truite arc-en-ciel), des effets reprotoxiques et aussi des données de toxicité (EC 50 NEC) les rendant potentiellement dangereux pour l'environnement (ERA, PEC / PNEC > 1). Selon Huggett et al. (2003), le métoprolol pourrait agir sur les récepteurs 1 des érythrocytes de truites. Selon ces travaux, le nadolol et le propranolol pourraient agir à la fois sur les récepteurs 1 des érythrocytes et sur les récepteurs 2 des cellules cardiaques de truites arcen-ciel. De plus, le propranolol affecterait la reproduction des invertébrés (amphipodes et cladocères) et des poissons comme le médaka (Huggett et al., 2002). Par ailleurs, les concentrations effectives (EC 50 ) provoquant des effets toxiques aigus sont relativement faibles (centaine de µg/l) pour le propranolol (figure 27 chapitre 1). En revanche, les EC 50 des autres -bloquants sont généralement autour du mg/l ce qui est éloigné des concentrations mesurées dans l'environnement. Les données de toxicité chroniques (figure 28 chapitre 1) viennent confirmer ces tendances avec des NEC pour le propranolol vis à vis des invertébrés proches du µg/l. Enfin, Ferrari et al. (2004) ont mis en évidence les risques écotoxicologiques que représentait le propranolol avec des rapports PEC / PNEC supérieurs à 1 vis-à-vis des algues (Cyclotella meneghiniana) et des poissons (ryzias latipes). Les anticancéreux sont responsables de nombreux effets secondaires. De plus, ce sont des cytotoxiques comme par exemple la doxorubicine (Caminada et al., 2006). La mitomycine et 135

136 Chapitre 2 : Les composés étudiés le cisplatine sont génotoxiques (Guiliana et al., 1996 dans Halling-Sorensen et al., 1997) alors que l'ifosfamide et le cyclophosphamide sont mutagènes et cancérigènes (Steger-Hartmann et al., 1996 et 1997). En revanche, d'après Huschek et al. (2004) l'ifosfamide ne représenterait pas un danger pour les invertébrés (rapport PEC / PNEC < 1). En ce qui concerne les anti-vih, ce sont des composés qui provoquent de nombreux effets secondaires, certains pouvant mettre en jeu le pronostic vital (MS, 2008). D'après des études de modélisation, le ritonavir représenterait un risque de toxicité pour les algues (Escher et al., 2010) et la stavudine un pour les poissons (Kar et Roy, 2010). II.2.3. Présence dans le milieu concentration (ng/l) b-bloquants anticancéreux anti-vih inhibiteurs PDE 5 hopital entrée STEP sortie STEP surface souterraine potable hopital entrée STEP sortie STEP surface souterraine potable hopital entrée STEP sortie STEP surface souterraine potable hopital entrée STEP sortie STEP surface souterraine potable présence et niveau de contamination des autres classes de médicaments étudiées dans les différentes matrices aqueuses Figure 41 : Présence et niveau de contamination des -bloquants, des anticancéreux, des anti-vih et des inhibiteurs de PDE 5 dans les matrices aqueuses d après des données relevées dans la littérature (cf. Annexe - tableau 2 à Annexe - tableau 7). 136

137 Chapitre 2 : Les composés étudiés La présence et le niveau de contamination des 4 classes thérapeutiques dans les diverses matrices aqueuses sont présentés Figure 41. En se basant sur le nombre de données collectées (nombre de points sur le graphique), parmi les 4 classes, les -bloquants sont les composés les plus recherchés et les plus retrouvés. Leurs concentrations varient entre le ng/l et le µg/l. Les anticancéreux ont principalement été recherchés dans les effluents hospitaliers et dans les rejets des STEP. Leur niveau de contamination varie entre la dizaine de ng/l et la centaine de µg/l dans les rejets hospitaliers et entre le ng/l et le µg/l dans les rejets de STEP. Les anti- VIH et les inhibiteurs de PDE 5 n ont été que très peu recherchés dans les échantillons environnementaux. Seules les eaux usées brutes (entrée de STEP) et les eaux usées traitées (sortie de STEP) ont été étudiées pour ces deux classes. Les eaux de surface ont aussi été analysées pour les anti-vih. Quand ils ont été recherchés, les composés de ces deux classes ont été retrouvés. Les niveaux de concentration des anti-vih varient entre le ng/l et le µg/l alors que les niveaux de concentration des inhibiteurs de PDE 5 sont plus faibles et varient entre le ng/l et quelques dizaines de ng/l. Au sein de ces différentes classes, généralement 3 ou 4 composés sont davantage recherchés et retrouvés que les autres (Annexe - tableau 2 à Annexe - tableau 7). Pour les -bloquants, ce sont l aténolol, le propranolol et le métoprolol qui sont les plus recherchés et les plus retrouvés. Dans la classe des anticancéreux, il s'agit du cyclophosphamide, du tamoxifène et du méthotréxate. Dans les rejets hospitaliers, le fluorouracile est également régulièrement détecté. A notre connaissance, uniquement 5 anti-vih ont été recherchés dans les matrices aqueuses (Prasse et al., 2010). Il s agit de l abacavir, de la lamivudine, de la névirapine, de la stavudine et de la zidovudine. Sur ces 5 molécules recherchées, la névirapine et la zidovudine sont celles les plus fréquemment retrouvées. A notre connaissance, une seule publication a recherché et retrouvé des inhibiteurs de PDE 5 (Nieto et al., 2010a). Les trois molécules étudiées au cours des travaux présentés dans cet article sont le sildénafil, le vardénafil et le tadalafil. Le sildénafil est le composé de cette classe qui a été le plus détecté (Nieto et al., 2010a). Dans les boues de STEP (Figure 27), 5 -bloquants ont été recherchés et retrouvés. Parmi les plus fréquemment détectés, il y a le propranolol et l aténolol, comme dans les matrices aqueuses. Les anticancéreux et les anti-vih n ont jamais été retrouvés dans les boues de STEP car à priori, ils n ont jamais été recherchés dans cette matrice. Le sildénafil a été retrouvé dans des échantillons de boues de STEP (Nieto et al., 2010a). II.2.4. Persistance Les pourcentages d élimination des -bloquants dans les STEP sont très variables en particulier pour le propranolol (Figure 7). Néanmoins les valeurs moyennes et médianes des taux d élimination de l aténolol, du métoprolol et du propranolol sont inférieures à 50 %. Le sotalol semble un peu mieux être éliminé avec une valeur moyenne d abattement autour de 60 %. Les données sur les taux d élimination des anticancéreux, des anti-vih et des inhibiteurs de PDE 5 sont disponibles dans l Annexe - tableau 1. Lorsqu elle a été étudiée, l élimination des anticancéreux dans les STEP a été qualifiée de faible. L ifosfamide par exemple n est pas éliminé pour Kümmerer et al. (1997) et il est éliminé à moins de 3 % pour Mahnik et al. (2007). 137

138 Chapitre 2 : Les composés étudiés Selon la molécule considérée au sein de la classe des anti-vih, son élimination dans les STEP peut être nulle ou au contraire très importante. Ainsi, d après Prasse et al. (2010), l abacavir, la lamivudine et la stavudine sont éliminés de la phase dissoute à plus de 65 % au cours des traitements appliqués dans les STEP. En revanche, la névirapine et la zidovudine ne sont pas toujours éliminés (taux d élimination atteignant 0 %). Avec des taux d abattement de 68, 69 et 80 % dans les STEP, les 3 inhibiteurs de PDE 5 sont bien éliminés de la phase dissoute dans les STEP (Nieto et al., 2010a). II.2.5. Manque de données Les manques de données de présence ou de toxicité sont relatives aux molécules appartenant aux classes les moins étudiées comme les anticancéreux, les anti-vih et les inhibiteurs de PDE 5. Alors qu il existe un grand nombre de molécules utilisées dans le traitement du cancer ou du VIH, moins d une dizaine ont été recherchées dans l environnement pour chacune de ces classes. Par ailleurs, à notre connaissance, la présence des anti-vih dans les eaux souterraines ou les eaux de boisson n a jamais été étudiée. De plus, bien qu ils soient supposés fortement toxiques, des ERA portant sur les anticancéreux ou les anti-vih sont rares ou inexistantes. Concernant les inhibiteurs de PDE 5 comme le sildénafil, il n existe pas de donnée relative à leur présence dans les eaux de surface, les eaux souterraines ou les eaux de boisson. Il n existe pas non plus d ERA pour le sildénafil. II.3. Listes des molécules sélectionnées A partir de l ensemble des critères évoqués dans les paragraphes précédents, initialement, 32 molécules, marquées d un astérisque dans le Tableau 30 (23 antibiotiques, 2 -bloquants, 5 anticancéreux et 2 anti-vih), ont été choisies. La liste a ensuite été complétée avec la prise en compte de nouvelles informations sur les données de consommation (données IMS Health) ou d écotoxicité (Fent et al., 2006 ; Jjemba, 2006), sur la disponibilité des composés étalons de références ou encore la pertinence d inclure certaines molécules par rapport à des projets de recherche spécifiques comme DIPERPHA qui nécessitait de prendre en compte des antibiotiques à usage vétérinaire exclusif tel que d anciens promoteurs de croissance. Au final 78 molécules ont été choisies dans 5 classes thérapeutiques différentes. Elles sont présentées dans le Tableau 30 accompagnées de leur code ATC, de leurs données de consommation et du critère de sélection. Leur structure chimique (Annexe 4) et un tableau plus complet comportant leurs données de pharmacocinétiques et leurs propriétés physico-chimique est présenté en annexe (Annexe - tableau 10). Il est rappelé que les molécules appartenant aux classes thérapeutiques des AINS, antiépileptiques et anti-dépresseurs, hypolipémiants, bronchodilatateurs et stimulants, incluses dans une méthode pré-existante au laboratoire à ces travaux de thèse, n ont pas été sélectionnées. Néanmoins, comme elles ont été analysées dans le cadre du projet Seine Aval FLASH et que ces résultats sont présentés dans le chapitre 5, elles sont nommées ci-après : - AINS : aspirine, paracétamol, ibuprofène, kétoprofène, naproxène, diclofénac - antiépileptiques et anti-dépresseurs : carbamazépine, fluoxétine, amitryptilline, imipramine, doxépine, alprazolam, bromazépam, diazépam, nordiazépam - hypolipémiants : gemfibrozil - bronchodilatateurs : salbutamol, terbutaline, clenbutérol - stimulants : caféine, théophylline 138

139 Chapitre 2 : Les composés étudiés Tableau 30 : Liste des composés sélectionnés avec les informations relatives à leur structure, leur consommation, leur pharmacocinétique, leurs propriétés physico-chimiques, et les critères de sélection. ( 1 : données de l IMS Health, 2 : données de Besse et Garric, 2007) Classe antibiotiques antibiotiques antibiotiques antibiotiques antibiotiques antibiotiques antibiotiques antibiotiques antibiotiques antibiotiques antibiotiques antibiotiques Famille -lactames pénicillines -lactames pénicillines -lactames pénicillines -lactames pénicillines -lactames pénicillines -lactames pénicillines -lactames pénicillines -lactames céphalosporines -lactames céphalosporines -lactames céphalosporines -lactames céphalosporines -lactames céphalosporines amoxicilline* (J01CA04) ampicilline* (J01CA01) Composé (code ATC) pénicilline G* (benzylpénicilline) (J01CE01) pénicilline V* (phénoxyméthyl pénicilline) (J01CE02) oxacilline* (J01CF04) cloxacilline (J01CF02) dicloxacilline (J01CF01) céfalexine (J01DB01) céfotaxime (J01DD01) cefpodoxime proxétil* (J01DD13) ceftiofur* (QJ01DD90) céfuroxime (J01DC02) antibiotiques macrolides azithromycine (J01FA10) antibiotiques macrolides clarithromycine* (J01FA09) antibiotiques macrolides érythromycine* (J01FA01) antibiotiques macrolides josamycine (J01FA07) antibiotiques macrolides roxithromycine* (J01FA06) antibiotiques macrolides spiramycine (J01FA02) antibiotiques macrolides tylosine (QJ01FA90) antibiotiques lincosamides clindamycine (J01FF01) antibiotiques lincosamides lincomycine* (J01FF02) antibiotiques fluoroquinolones ciprofloxacine* (J01MA02) antibiotiques fluoroquinolones enrofloxacine (QJ01MA90) antibiotiques fluoroquinolones marbofloxacine (QJ01MA93) antibiotiques fluoroquinolones norfloxacine (J01MA06) antibiotiques fluoroquinolones ofloxacine* (J01MA01) antibiotiques quinolones acide oxolinique* (J01MB05) antibiotiques quinolones acide pipémidique (J01MB04) Consommation Critère de sélection unités (2008) 1 consommation (1 er antibiotique le plus vendu) kg (2004) 2 toxicité unités (2008) 1 consommation + représentativité de la classe unités (2008) 1 toxicité + représentativité de la classe unités (2008) 1 consommation + représentativité de la classe unités (2008) 1 consommation (21 ème antibiotique le plus vendu) + représentativité de la classe unités (2008) 1 consommation (20 ème antibiotique le plus vendu) + représentativité de la classe représentativité de la classe unités (2008) 1 représentativité de la classe 17 unités (2008) 1 représentativité de la classe unités (2008) kg (2004) 2 consommation (2 ème antibiotique le plus vendu) représentativité de la classe + antibiotique vétérinaire exclusif unités (2008) 1 représentativité de la classe unités (2008) 1 consommation (13 ème antibiotique le plus vendu) kg (2004) 2 + persistance unités (2008) 1 consommation (7 ème antibiotique le plus vendu) kg (2004) 2 écotoxicité (ratio PEC / PNEC bactéries > 1) + présence + persistance unités (2008) 1 écotoxicité (ratio PEC / PNEC daphnies > 1) + présence + persistance unités (2008) 1 consommation (17 ème antibiotique le plus vendu) kg (2004) unités (2008) 1 consommation (19 ème antibiotique le plus vendu) kg (2004) 2 + présence + persistance unités (2008) 1 consommation + toxicité + persistance antibiotique vétérinaire exclusif + présence (déchets d élevage) unités (2008) 1 consommation + représentativité de la classe unités (2008) 1 consommation (médecine vétérinaire) + présence (déchets d élevage) + persistance STEP unités (2008) 1 consommation + toxicité + écotoxicité (ratio PEC kg (2004) 2 / PNEC bactéries et cyanobactéries > 1) + présence représentativité de la classe + antibiotique vétérinaire exclusif consommation (médecine vétérinaire) + représentativité de la classe + antibiotique vétérinaire exclusif unités (2008) 1 consommation (11 ème antibiotique le plus vendu) + présence unités (2008) 1 consommation + toxicité + écotoxicité (ratio PEC kg (2004) 2 / PNEC cyanobactéries > 1) + présence représentativité des antibiotiques administrés aux poissons représentativité de la classe 139

140 Chapitre 2 : Les composés étudiés Classe Famille Composé (code ATC) antibiotiques quinolones fluméquine* (J01MB07) antibiotiques tétracyclines tétracycline* (J01AA07) antibiotiques tétracyclines oxytétracycline* (J01AA06) antibiotiques tétracyclines chlortétracycline* (J01AA03) antibiotiques tétracyclines doxycycline* (J01AA02) antibiotiques sulfonamides sulfadiazine (J01EC02) antibiotiques sulfonamides sulfadiméthoxine (J01ED01) antibiotiques sulfonamides sulfamérazine (J01ED07) antibiotiques sulfonamides sulfaméthazine* (J01EB03) antibiotiques sulfonamides sulfaméthizole (J01EB02) antibiotiques sulfonamides sulfaméthoxazole* (J01EC01) antibiotiques sulfonamides sulfanilamide (J01EB06) antibiotiques sulfonamides sulfapyridine (J01EB04) antibiotiques sulfonamides sulfathiazole (J01EB07) antibiotiques sulfonamides triméthoprime* (J01EA01) antibiotiques phénicolés chloramphénicol* (J01BA01) antibiotiques phénicolés thiamphénicol (J01BA02) antibiotiques imidazole métronidazole (J01XD01) antibiotiques polyéthers / ionophores antibiotiques polyéthers / ionophores monensine sodium salt (QP51AH03) salinomycine sodium (QP51AH01) antibiotiques polypeptides bacitracine (J01XX10) antibiotiques polypeptides virginiamycine M1 (QJ01FG90 ou D06AX10) autres antibiotiques rifampicine (J04AB02) autres antibiotiques acide fusidique (J01XC01) -bloquants aténolol (C07AB03) -bloquants -bloquants -bloquants bisoprolol (C07AB07) métoprolol* (C07AB02) propranolol* (C07AA05) -bloquants sotalol (C07AA07) -bloquants timolol (C07AA06) anticancéreux anthracyclines daunorubicine* (L01DB01) Consommation Critère de sélection unités (2008) 1 représentativité de la classe écotoxicité (ratio PEC / PNEC algues > 1) + présence (déchets d élevage) consommation (médecine vétérinaire) + présence (déchets d élevage) consommation (médecine vétérinaire) + présence (déchets d élevage) unités (2008) 1 consommation (10 ème antibiotique le plus vendu) kg (2004) 2 consommation (médecine vétérinaire) représentativité de la classe + antibiotique utilisé en médecine vétérinaire représentativité de la classe présence (déchets d élevage) représentativité de la classe unités (2008) 1 consommation + toxicité + écotoxicité (ratio PEC kg (2004) 2 / PNEC cyanobactéries et algues > 1) + présence représentativité de la classe + antibiotique utilisé en médecine vétérinaire représentativité de la classe + antibiotique utilisé en médecine vétérinaire représentativité de la classe unités (2008) kg (2004) 2 consommation + présence représentativité de la classe unités (2008) 1 représentativité de la classe unités (2008) 1 consommation (4 ème antibiotique le plus vendu) kg (2004) 2 persistance représentativité de la classe + antibiotique vétérinaire exclusif + promoteur de croissance interdit représentativité de la classe + antibiotique vétérinaire exclusif + promoteur de croissance interdit représentativité de la classe + promoteur de croissance interdit représentativité de la classe kg (2004) 2 représentativité de la classe unités (2008) 1 consommation + représentativité de la classe unités (2008) 1 consommation (2 ème -bloquant le plus vendu) kg (2004) 2 présence + persistance unités (2008) 1 consommation (1 er -bloquant le plus vendu) kg (2004) unités (2008) 1 toxicité (peut agir sur les récepteurs 1 des kg (2004) 2 érythrocytes de truite) + présence + persistance unités (2008) 1 consommation + toxicité + reprotoxique kg (2004) 2 écotoxicité (ratio PEC / PNEC algues et poissons > 1) + présence + persistance unités (2008) 1 consommation + représentativité de la classe unités (2008) 1 représentativité de la classe 3 unités (2008) 1 anticancéreux antibiotique + consommation en 0.8 kg (2004) 2 médecine ambulatoire 140

141 Chapitre 2 : Les composés étudiés Classe Famille Composé (code ATC) anticancéreux anthracyclines doxorubicine* (L01DB02) anticancéreux anthracyclines épirubicine* (L01DB03) anticancéreux anticancéreux moutardes azotées moutardes azotées cyclophosphamide* (L01AA01) ifosfamide* (L01AA06) anticancéreux anti-métabolites 5-fluorouracil (L01BC02) anticancéreux anti-métabolites gemcitabine (L01BC05) anticancéreux antagoniste des folates méthotréxate (L01BA01) anticancéreux antihormones tamoxifen (L02BA01) autres anticancéreux docétaxel (L01CD02) anti-vih INTI abacavir (J05AF06) anti-vih INTI lamivudine (J05AF05) anti-vih INTI stavudine (J05AF04) anti-vih INTI zidovudine* (J05AF01) anti-vih INNTI névirapine (J05AG01) anti-vih anti-vih anti-vih anti-vih inhibiteur de protéase inhibiteur de protéase inhibiteur de protéase inhibiteur de protéase indinavir (J05AE02) nelfinavir (J05AE04) ritonavir* (J05AE03) saquinavir (J05AE01) Consommation Critère de sélection anticancéreux antibiotique + consommation en 7 unités (2008) 1 8 kg (2004) 2 médecine ambulatoire 19 kg (2004) 2 anticancéreux antibiotique unités (2008) 1 consommation + toxicité (mutagène, cancérigène, 282 kg (2004) 2 tératogène) + présence 121 kg (2004) 2 toxicité (mutagène, cancérigène, tératogène) + persistance unités (2008) 1 consommation + présence (effluents hospitaliers) kg (2004) kg (2004) 2 représentativité de la classe + manque de données consommation (1 er anticancéreux le plus vendu) unités (2008) kg (2004) 2 présence unités (2008) 1 consommation + présence 16 kg (2004) 2 représentativité de la classe + manque de données unités (2008) 1 consommation + manque de données unités (2008) 1 consommation (1 er anti-vih le plus vendu) + manque de données unités (2008) 1 écotoxicité + manque de données unités (2008) 1 consommation + présence + persistance unités (2008) 1 présence + persistance unités (2008) 1 manque de données unités (2007) 1 manque de données unités (2008) 1 consommation (2 ème anti-vih le plus vendu) + écotoxicité unités (2008) 1 manque de données inhibiteur de la PDE «viagra» sildénafil manque de données 5 (G04BE03) INTI : inhibiteur nucléosidiques de la transcriptase inverse, INNTI : inhibiteur non nucléosidiques de la transcriptase inverse III. Comparaison avec les molécules retenues dans d'autres études La liste des molécules sélectionnées a été comparée avec les listes de molécules médicamenteuses prioritaires à rechercher dans l environnement établies par d autres auteurs. Le Tableau 11 présente ces différentes listes uniquement pour les classes thérapeutiques communes à celles étudiées au cours de ces travaux de thèse. Les travaux de Capleton et al. (2006) ont été retenus car ils proposent une liste de molécules pharmaceutiques à usage vétérinaire prioritaires, classées selon leur toxicité et le risque pour les humains d y être exposés via l environnement. La liste établie par Schlüsener et al. (2007) dans le cadre du projet KNAPPE, a été utilisée car elle résulte de l analyse d un grand nombre de base de données et de publications internationales. Elle totalise 135 molécules pharmaceutiques d intérêt environnemental. Les listes d Algros et Jourdain (2007) ont été retenues car elles résultent de leurs propres résultats d analyse de 37 échantillons urbains (eau et boue de STEP) et de 10 échantillons agricoles français. Ils proposent une liste de «12 molécules antibiotiques à rechercher préférentiellement au niveau d échantillons d origine 141

142 Chapitre 2 : Les composés étudiés urbaine» et une liste de «13 molécules antibiotiques à rechercher préférentiellement au niveau d échantillons d origine agricole». La liste de molécules pharmaceutiques prioritaires de Besse et Garric (2007) est basée sur des données de consommation, les premières à être exprimées en masse de principe actif (kg) pour la France, de métabolisme et d écotoxicité. Ces mêmes auteurs proposent également une liste très similaire dans un article intitulé «Human pharmaceuticals in surface waters: Implementation of a prioritization methodology and application to the French situation» paru en Dans cette liste les composés natifs mais aussi les métabolites sont pris en compte. La sélection des composés s est basée sur des données d exposition (PEC calculées à partir de données de consommation et des données d excrétion sous forme inchangées des molécules parents), de toxicité et de pharmacologie (mécanismes d action, interaction avec des enzymes, effets secondaires) et sur les propriétés physico-chimiques. Les listes proposées par Besse et Garric (2007 et 2008) ont été retenues car ce sont les premières listes françaises. Enfin, la liste établie par l agence française de sécurité sanitaire des aliments (AFSSA) a été retenue. Trois critères de hiérarchisation ont été choisis pour la constituer : le tonnage, l activité et l affinité pour l eau. Les données de tonnage sont issues des travaux de Besse et Garric (2007). L affinité pour l eau est basée sur les propriétés physico-chimiques des molécules comme la solubilité. Pour les médicaments à usage humain, l activité est liée aux posologies minimales et maximales des médicaments et aux doses journalières admissibles (DJA). Pour les médicaments à usage vétérinaire, les DJA et les AJMT (Apport Journalier Maximum Théorique) ont été pris en considération. En intégrant ces données sous forme d équation ((quantité consommée / posologie minimale) x solubilité), un indice de criticité à pu être obtenu. Les molécules présentant les plus forts indices de criticité ont été sélectionnées. L analyse du Tableau 11 montre qu hormis pour la sous-classe des céphalosporines et des polypeptides, notre sélection d antibiotiques est cohérente avec celle des autres listes. Elle est généralement plus exhaustive. Deux molécules semblent cependant y manquer, il s agit de la fosfomycine et de la dihydrostreptomycine. La fosfomycine et la streptomycine, tout comme l amikacine, la gentamicine et la colistine, avaient initialement été intégrées à la liste des molécules à étudier au cours de ces travaux mais n ont pas été retenues au final pour des raisons analytiques. Les conditions chromatographiques nécessaires à leur analyse étant différentes de celles des 78 autres molécules retenues, ces 5 molécules ne pouvaient s intégrer dans le cadre d une démarche d analyse multi-résidus de la contamination de l environnement. En ce qui concerne les -bloquants, elle est bien en accord et même avec un nombre plus important de composés que les listes proposées par l AFSSA et par Besse et Garric. En revanche, certains -bloquants (bétaxolol, carazolol, nadolol, pindolol) y font défaut par rapport à la sélection de Schlüsener et al. (2007). Le cyclophosphamide, l ifosfamide et le fluorouracile sont les anticancéreux, les plus partagés entre toutes les listes. Ils sont également présents dans notre sélection. Le tamoxifen retenu par Besse et Garric est également présent dans notre liste. En ce qui concerne les autres anticancéreux, hormis l hydroxycarbamide qui apparaît dans les listes de l AFSSA et de Besse et Garric, leur sélection semble auteur-dépendant. Les antiviraux, quelque soit leur spécificité (VIH, herpès ou autre), ne font partie d aucune autre liste. De même le sildénafil n apparait dans aucune autre sélection. L intégration de ces 2 groupes à la liste de molécules à étudier dans le cadre de ces travaux de thèse lui confère un caractère original et innovant. Leur analyse et leur détection dans les échantillons environnementaux vont permettre de remonter aux pratiques d usages comme c est le cas pour les drogues illicites par exemple. 142

143 Chapitre 2 : Les composés étudiés Tableau 31 : Comparaison de la liste de molécules étudiées au cours de la thèse avec celles établies par d autres études française ou européenne. classe - famille familles ces travaux AFSSA, 2008 antibiotiques pénicillines antibiotiques céphalosporines antibiotiques macrolides antibiotiques lincosamides antibiotiques fluoroquinolones antibiotiques quinolones antibiotiques tétracyclines antibiotiques sulfonamides antibiotiques phénicolés antibiotiques polypeptides amoxicilline ampicilline pénicilline G pénicilline V oxacilline cloxacilline dicloxacilline flucloxacilline méthicilline mezlociline nafcilline pipéracilline acide clavulanique procaïne céfalexine céfotaxime cefpodoxime ceftiofur céfuroxime cefquinome sulfate ceftriaxone azithromycine clarithromycine 14-hydroxyclarithromycine érythromycine josamycine roxithromycine spiramycine tylosine clindamycine lincomycine ciprofloxacine danofloxacine enrofloxacine marbofloxacine norfloxacine ofloxacine sarafloxacine fluméquine acide oxolinique acide pipémidique chlortétracycline doxycycline oxytétracycline tétracycline sulfadiazine sulfadiméthoxine sulfamérazine sulfaméthazine sulfaméthizole sulfaméthoxazole acétylsulfamethoxazole sulfanilamide sulfapyridine sulfasalazine sulfathiazole baquiloprime triméthoprime chloramphénicol florfénicol thiamphénicol bacitracine colistine virginiamycine x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x Besse et Garric, 2007; Besse et Garric, 2008 x x x x x x x x x x x x Algros et Jourdain, 2007 x x x x x x x x x x x x x x x x x x Schlüsener et al., 2007 x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x Capleton et al., 2006 x x x x x x x x x x x x x 143

144 Chapitre 2 : Les composés étudiés classe - famille familles ces travaux AFSSA, 2008 antibiotiques imidazoles antibiotiques ionophores antibiotiques autres -bloquants anticancéreux anthracyclines anticancéreux moutardes azotées autres anticancéreux antiviraux INTI antiviraux INNTI antiviraux inhibiteurs de protéase métronidazole hydroxymétronidazole clotrimazole mébendazole oxfendazole parconazole monensine salinomycine acide fusidique rifampicine fosfomycine dihydrostreptomycine pristinamycine dapsone furazolidone vancomycine bronopol atenolol bisoprolol métoprolol propranolol sotalol timolol bétaxolol carazolol nadolol pindolol daunorubicine doxorubicine épirubicine cyclophosphamide moutarde phosphoramide acroléine ifosfamide moutarde isophosphoramide acroléine 5-fluorouracil docétaxel gemcitabine méthotréxate tamoxifène hydroxycarbamide carboplatine cytarabine bléomycine etoposide imatinib abacavir lamivudine stavudine zidovudine névirapine indinavir nelfinavir ritonavir saquinavir x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x x Besse et Garric, 2007; Besse et Garric, 2008 x x x x x x x x x x x x x x x Algros et Jourdain, 2007 Schlüsener et al., 2007 x x x x x x x x x x x x x x x x x x Capleton et al., 2006 inhibiteur PDE 5 sildénafil INTI : inhibiteur nucléosidiques de la transcriptase inverse, INNTI : inhibiteur non nucléosidiques de la transcriptase inverse x x x x x x 144

145 CHAPITRE 3 Matériel et Méthode 145

146 146

147 Chapitre 3 : Matériel et Méthode Chapitre 3 : Matériel et Méthode I. REVUE BIBLIGRAPHIQUE SUR LES TECHNIQUES ANALYTIQUES I.1. Echantillons et techniques d échantillonnage I.1.1. Type de prélèvement I.1.2. Matériaux contenant les prélèvements I.1.3. Conservation des prélèvements I.2. Conditionnement des échantillons I.3. Traitement des échantillons / extraction des composés d intérêt I.3.1. Extraction de la phase dissoute par SPE I.3.2. Extraction de la phase solide et particulaire par ASE I.3.3. Extraction des composés piégés dans les échantillonneurs passifs I.4. Techniques analytiques II. PRJETS ET SITES D ECHANTILLNNAGE II.1. Eaux usées et autres échantillons d eau II.2. FLASH II.2.1. Continuum hospitalier II.2.2. Continuum agricole II.3. DIPERPHA II.4. Capteurs passifs II.4.1. Expérience de calibration en laboratoire II.4.2. Application dans la Garonne II.5. Récapitulatif des projets III. TRAITEMENT DES ECHANTILLNS III.1. Échantillons «eau» III.2. Échantillons «lisiers» III.3. Échantillons «PCIS» La première partie du chapitre 3 est une synthèse bibliographique sur les différentes techniques existantes qui permettent d analyser les molécules pharmaceutiques dans diverses matrices environnementales. Elle traite des méthodes de prélèvement, du traitement des échantillons pour en extraire les composés d intérêt et des techniques d analyses. La deuxième partie du chapitre 3 s attache à décrire les sites d études et les stratégies d échantillonnage mis en œuvre au cours de ces travaux de thèse. Enfin, la troisième partie présente le traitement des échantillons depuis le prélèvement jusqu à l étape d évaporation/reconcentration, ultime étape avant l analyse à proprement parler. 147

148 Chapitre 3 : Matériel et Méthode I. Revue bibliographique sur les techniques analytiques I.1. Echantillons et techniques d échantillonnage Il existe différentes sortes d échantillons : - liquide : eau (douce, saumâtre, salée, usée, traitée, potable, minérale), biologique (sang, urine) - solide : boue, sol, sédiment, fumier/lisier, plante, biologique (muscles, organes, animal entier) Suivant le type d échantillon, le but de l analyse et le niveau supposé de contamination, le prélèvement (ponctuel, moyen), les techniques de prélèvement (seringues, sceaux, bouteilles, pelles, etc.), le volume prélevé (µl, l, kg), le contenant (verre, plastique, acier, aluminium), la technique de conservation (congélation, addition d un conservateur, lyophilisation) et la méthode d extraction (Extraction Assistée par Micro-ondes (MAE), Extraction Accélérée par Solvent (ASE), Extraction en Phase Solide (SPE), Micro-Extraction en Phase Solide (SPME)) ne sont pas les mêmes. En revanche les outils analytiques finaux sont souvent identiques (Chromatographie en phase Gazeuse (GC)/Chromatographie en phase Liquide (LC) Spectrométrie de Masse simple (MS) ou en tandem (MS/MS)). I.1.1. Type de prélèvement Il existe 3 façons différentes de procéder à l échantillonnage : l échantillonnage ponctuel, l échantillonnage moyenné et l échantillonnage passif. Dans le cas d un échantillonnage ponctuel, 1 élément unique est prélevé à un seul moment et un seul endroit (ex. : un certain volume d eau, une certaine masse de sol, un seul organisme). Ce type de prélèvement est le plus simple à mettre en œuvre et permet de réduire les coûts d échantillonnage. Néanmoins, les résultats issus de l analyse de tels prélèvements ne reflètent le niveau de contamination qu à un instant ou en un lieu donné. r dans le cas d analyse de molécules pharmaceutiques, il a été montré par Lindberg et al., en 2004 (Figure 15) que le niveau de contamination d effluents hospitaliers par exemple était très variable suivant le moment de la journée. Ainsi, selon la matrice considérée (eaux usées ou eaux souterraines) et les informations que l on souhaite obtenir, ce type de prélèvement n est pas le plus adéquate. Cependant, pour des raisons de coût ou d accessibilité au site d échantillonnage, c est le type de prélèvement qui est souvent mis en œuvre (Hirsch et al., 1998 ; Vieno et al., 2006 ; Ye et al., 2007 ; Tamtam et al., 2008 ; Nieto et al., 2010a). Pour s affranchir des problèmes de représentativité de la mesure obtenue dans le cas d un échantillonnage ponctuel, un échantillonnage moyenné peut être réalisé. Dans ce cas là, plusieurs prélèvements d une même entité, ou un pool, sont prélevés et mélangés. Les prélèvements peuvent se faire à un même endroit et à des moments différents (ex. : prélèvement d eau toutes les heures pendant 24h à la sortie d une station de traitement) ou à un même moment mais à des points différents (ex. : différentes profondeurs pour une même masse d eau ou en différentes zones d un même champ agricole). Cet échantillonnage peut se faire de façon manuelle ou à l aide d un préleveur automatique. Kolpin et al. (2002) ou Watkinson et al. (2009) composent leur échantillon moyen en mélangeant plusieurs prélèvements ponctuels réalisés manuellement alors que Coestier et al. (2009), Mullot (2009) 148

149 Chapitre 3 : Matériel et Méthode ou Gabet-Giraud et al. (2010) utilisent un préleveur automatique dont le prélèvement est fonction du débit de l eau à échantillonner. Enfin le troisième type d échantillonnage, l échantillonnage passif, consiste à déposer un échantillonneur spécifique au milieu étudié (eau, air) et aux contaminants recherchés. Ce dernier va intégrer la contamination tout le long de son temps de pose qui peut atteindre plusieurs semaines. Ces outils lissent les fluctuations liées à des évènements particuliers comme par exemple un relargage massif en rivière d eaux usées non traitées consécutif à une saturation des capacités de traitement lors d épisodes orageux lorsque les réseaux d eau pluviale et d eaux usées ne sont pas différenciés. I.1.2. Matériaux contenant les prélèvements Parmi les 42 références bibliographiques étudiées et rapportées dans l Annexe - tableau 11 relatif aux conditions de prélèvement et de conservation des échantillons, 28 précisent dans quel type de contenant les échantillons environnementaux sont recueillis. Quatre sortes de matériaux sont évoqués : le verre, le plastique (polypropylène), l acier et le polytétrafluoroéthylène (PTFE ou Téflon ) (Tableau 32). La majorité des échantillons (78,6 %) sont prélevés dans des contenants en verre et plus particulièrement dans des bouteilles en verre ambré (57,1 %) pour éviter la dégradation des composés par les UV. Le verre présente l avantage d être un matériau inerte, qui se nettoie bien (supporte la calcination) et qui peut donc être réutilisé mais il présente également l inconvénient d être fragile et de se rayer. Bien qu employé que de façon ponctuelle, le plastique, l acier et le téflon peuvent se révéler indispensables pour certaines applications ou pour certaines molécules comme les tétracyclines qui s adsorbent sur les parois des contenants en verre (Ciarlone et al., 1990). Tableau 32 : Répartition des 28 références bibliographique précisant dans quel type de contenant les échantillons sont recueillis (détails dans l Annexe - tableau 11). Matériaux utilisés pour le prélèvement verre (dont verre ambré) polypropylène (plastique) acier inoxydable polytétrafluoroéthylène (PTFE, Téflon ) Nb de réf. bibliographiques 22 (16) Fréquence (%) 78,6 (57,1) 10,7 7,1 3,6 I.1.3. Conservation des prélèvements Pour assurer la stabilité de l échantillon depuis le prélèvement jusqu à l analyse, diverses techniques de conservation sont employées : le refroidissement (4 C) ou la congélation (- 18 C ou -20 C), l ajout d acide ou d un agent de conservation comme le formol, le noir, le séchage ou la lyophilisation et enfin la combinaison de ces différents facteurs. La répartition entre ces différentes techniques des références bibliographiques indiquant le mode de conservation des échantillons est indiquée dans le Tableau 33. Le refroidissement des échantillons à 4 C ou leur congélation permet de ralentir l activité bactérienne et donc la dégradation des composés d intérêts. Le refroidissement à 4 C, seul ou associé à d autres techniques de conservation, est la méthode la plus fréquemment utilisée (28,6 %). En enlevant l eau tout en gardant l échantillon congelé, la lyophilisation est la technique qui permet le mieux de conserver les matrices solides comme les déchets d élevage 149

150 Chapitre 3 : Matériel et Méthode ou les sédiments. Une fois lyophilisées ou séchées, elles peuvent ensuite être conservées à température ambiante. La combinaison de plusieurs modes de conservation peut s avérer indispensable pour certaines molécules. Par exemple, Catastini et al. (2008) ont montré que pour éviter la dégradation du 5-fluorouracil, un anticancéreux, il était nécessaire d acidifier les échantillons en plus de les conserver à une température de 4 C. Kasprzyk-Horden et al. (2007) et Nieto et al. (2010a) conservent également leur échantillons acidifiés et refroidis ou congelés, respectivement à 4 C et -25 C. L ajout d acide (exemple : acide chlorhydrique, acide sulfurique) dans les échantillons inhibe l activité bactérienne et prévient ainsi toute dégradation microbienne. D autres auteurs combinent, la conservation à l abri de la lumière et à 4 C (Hamscher et al., 2002 ; Gagné et al., 2006 ; Martinez-Carballo et al., 2007 ; Garcia-Ac et al., 2009). La conservation dans le noir ou dans des bouteilles en verre ambré ou en acier permet de protéger les composés de la dégradation par les rayonnements UV. Enfin certains auteurs ajoutent du formaldéhyde (Tong et al., 2009) ou du thiosulfate de sodium (EPA, 2007) pour préserver leurs échantillons durant le prélèvement, le transport et en attendant l analyse. Le formaldéhyde tout comme l acide interrompt l activité bactérienne. Le thiosulfate de sodium permet de neutraliser le chlore empêchant alors certaines réactions chimiques de ce dernier avec les molécules ciblées. Tong et al. (2009) ajoutent également de l EDTA dans leurs échantillons directement après le prélèvement afin d éviter aux antibiotiques de se fixer sur les ions métalliques. D autres auteurs comme Cha et al. (2006) ou Martinez-Carballo et al. (2007) se contentent de rincer leur matériel en verre avec de l EDTA afin d éviter aux tétracyclines de se fixer sur les groupements silanol du verre ou aux ions métalliques de catalyser la réaction d hydrolyse du cycle -lactames des pénicillines. Tableau 33 : Répartition des références bibliographique précisant le mode de conservation des échantillons (détails dans l Annexe - tableau 11). Matériaux utilisés pour le T + 4 C congélation plusieurs séchage lyophilisation prélèvement ambiante (-18 C, -20 C, -25 C) critères Nb de réf. bibliographiques Fréquence (%) 4,7 28,6 14,3 7,1 7,1 35,7 I.2. Conditionnement des échantillons Une fois que les échantillons ont été prélevés, le conditionnement correspond à la première étape de leur traitement. Communément cette étape commence par la séparation des différentes phases qui constituent l échantillon (phase dissoute, phase particulaire et phase solide). Le conditionnement peut se faire soit immédiatement après le prélèvement puis l échantillon est conservé selon les différents modes de conservation évoqués dans le paragraphe précédent ; soit après conservation de l échantillon et avant l analyse. Pour séparer la phase liquide de la phase solide, les échantillons solides mais encore relativement liquides comme la vase, la boue ou les lisiers commencent par être centrifugés. Puis, les phases solides issues de cette centrifugation ou certains échantillons solides tels que des sédiments sont lyophilisés afin d éliminer toutes traces résiduelles d eau (Martinez- Carballo et al., 2007 ; Jelic et al., 2009 ; Nieto et al., 2010a ; Yang et al., 2010). D autres auteurs comme Golet et al. (2002b), Hamscher et al. (2002) ou Jacobsen et al. (2004) préfèrent faire sécher leurs échantillons à des températures variant entre 60 C et 100 C. Une 150

151 Chapitre 3 : Matériel et Méthode fois secs ou lyophilisés, les échantillons sont tamisés, ou broyés et tamisés, afin de les homogénéiser. La maille des tamis peut varier de 0,125 mm (Nieto et al., 2010a) à 2 mm (Jacobsen et al., 2004 ; Martinez-Carballo et al., 2007). Pour séparer la phase particulaire de la phase dissoute, les échantillons aqueux ou la phase liquide issue de la centrifugation d échantillons semi-solides sont filtrés. Afin de faciliter leur filtration, certaines eaux particulièrement chargées en particules, comme les eaux usées en entrée de STEP, peuvent préalablement être centrifugées (Bendz et al., 2005 ; Cha et al., 2006 ; Mahnik et al., 2007). La filtration est réalisée principalement sur des filtres en fibre de verre mais des filtres en nylon sont également employés (Hernando et al., 2004 ; Gros et al., 2006). Diverses porosités de filtres sont utilisées. La porosité varie entre 0,22 µm et 1,2 µm mais la majorité des échantillons sont filtrés avec des filtres d une porosité de 0,45 µm permettant d enlever à la fois les particules et les colloïdes (Tableau 34). De plus, la filtration des échantillons préalablement à leur extraction permet d éviter ou de limiter le colmatage des cartouches SPE. Tableau 34 : Répartition des références bibliographique en fonction de la porosité des filtres employés (détails dans l Annexe - tableau 11). Porosité des filtres (µm) 0,22 0,4 0,45 0,7 1 1,2 Nb de réf. bibliographiques Fréquence (%) 6,9 3,4 48,3 24,1 10,3 6,9 I.3. Traitement des échantillons / extraction des composés d intérêt Une fois les échantillons conditionnés, il faut ensuite en extraire les composés d intérêt et les reconcentrer. Dans le cas des échantillonneurs passifs, aucun conditionnement préalable n est nécessaire, les composés sont directement prélevés dans la phase dissoute et il ne reste plus qu à les extraire de l outil. Tableau 35 : Répartition des références bibliographique en fonction de la technique extractive employée (détails dans l Annexe - tableau 12). Technique d extraction Nb de références bibliographiques liquide solide Fréquence (%) SPE 46 93,9 LLE 2 4 lyophilisation 1 2 USE 1 10 USE + LLE USE + SPE 2 20 MAE + SPE 1 10 ASE ASE + SPE vortex + centrifugation 1 10 Pour les autres échantillons obtenus à partir de prélèvement ponctuels ou moyennés, diverses techniques d extraction sont possibles suivant si l échantillon est liquide (phase dissoute) ou solide (phase solide ou particulaire). Le Tableau 35 ci-dessus a été obtenu à partir des 151

152 Chapitre 3 : Matériel et Méthode informations détaillées présentées dans l Annexe - tableau 12. Il présente la répartition des références bibliographiques entre les différentes techniques extractives en fonction de la matrice considérée. Plus de 90 % des molécules contenues dans la phase dissoute sont extraites par extraction en phase solide ou SPE (Tableau 35). Cette technique moderne présente l avantage d être rapide, économique et automatisable. Elle est fiable et reproductible dans la mesure où le volume maximal qui peut être reconcentré sans affecter les rendements d'extraction, c est-à-dire le volume de fuite, n est pas dépassé. Richardson (2009) et Seifrtová et al. (2009a) soulignent également dans leur review l importance de cette technique et son usage massif. Néanmoins, quelques protocoles utilisent des techniques alternatives comme l extraction liquide-liquide (LLE, Kolpin et al., 2002 ; Hou et al., 2003 ; Martinez-Carballo et al., 2007) ou la lyophilisation (Hirsh et al., 1998). Ces procédés sont à la fois plus anciens, plus simples à mettre en œuvre et robustes. Cependant, la LLE est une méthode lente et très consommatrice de solvant. Les principes, les avantages et les inconvénients de ces 3 techniques sont expliqués dans le Tableau 36. La micro-extraction en phase solide ou SPME est une autre technique, entièrement automatique, qui permet d extraire les composés des matrices aqueuses (McClure et Wong 2007). Son principe, ses avantages et inconvénients sont également présentés dans le Tableau 36. Pour extraire les composés des phases particulaires et solides, plusieurs méthodes sont possibles : l extraction assistée par micro-ondes (MAE) pratiquée par Castiglioni et al. (2006) par exemple ; l extraction par ultrasons (USE) mis en œuvre par Hu et al. (2010) pour extraire les antibiotiques du sol et des végétaux ; ou l extraction par liquide pressurisé (PLE) encore appelée extraction accélérée par solvant (ASE). Les 2 premières techniques présentent les avantages d être rapides et faciles à mettre en œuvre mais l ASE présente en plus l avantage d être automatisable et de consommer peu de solvant. Les principes, les avantages et les inconvénients de ces différentes techniques sont expliqués dans le Tableau 36. L ASE et l USE sont les 2 techniques les plus utilisées avec 40 % d utilisation de chacune d elles en considérant tous les usages (simples ou combinés) (Tableau 35). La méthode privilégiée avec une fréquence d utilisation de 30% est la combinaison ASE + SPE. Elle utilise l ASE pour extraire les composés de la phase solide puis la SPE pour extraire et concentrer les composés contenus dans l extrait ASE. D autres protocoles n utilisant ni MAE, ni USE, ni ASE sont aussi proposés. Par exemple, Furusawa (2008) met en pratique une technique d extraction pour extraire les antibiotiques des crevettes qui n utilise aucun solvant organique seulement une étape de broyage et de centrifugation. Les conditions et les paramètres des 2 principales techniques d extraction, SPE pour la phase dissoute et ASE pour les phases solides, sont étudiés dans les 2 sous paragraphes suivants. I.3.1. Extraction de la phase dissoute par SPE Les cartouches et le ou les solvants d extraction sont les 2 principaux paramètres à définir pour mettre en œuvre une SPE. Le type et le volume de phase contenue dans les cartouches sont les 2 critères qui permettent de sélectionner la cartouche. L affinité des composés d intérêt avec la phase stationnaire et les interactions qui seront mises en œuvre guident le choix des cartouches. Ce choix dépend donc des propriétés physico-chimiques des molécules. Différentes phases ont été relevées dans la littérature et sont présentées dans le Tableau 37. La 152

153 Chapitre 3 : Matériel et Méthode Tableau 36 : Principe des différentes techniques extractives (T : température, P : pression). matrice acronyme nom (anglais) principe avantage inconvénient liquide SPE Solid Phase Extraction SPME LLE Solid Phase Micro-Extraction Liquid-Liquid Extraction solide MAE Microwave Assisted Extraction USE ASE UltraSonication Extraction Accelerated Solvent Extraction Les composés d intérêts sont extraits de la matrice aqueuse par adsorption sur une phase solide, spécifiquement choisie pour eux, contenue dans une cartouche. Les autres éléments ne sont pas retenus sur la phase adsorbante ou alors en sont décrochés lors d une étape de rinçage. Les composés d intérêt sont ensuite élués et récupérés dans un faible volume de solvant. Les composés d intérêts sont extraits de la matrice aqueuse par adsorption sur une fibre recouverte d une phase adsorbante spécifiquement choisie pour eux. La fibre est directement plongée dans l échantillon. Les composés sont désorbés dans l injecteur d un GC sous l effet de la température ou d un LC sous l effet d un solvant. L échantillon et un solvant organique sont mélangés dans une ampoule à décanter. Par affinité pour le solvant organique, les composés d intérêt vont migrer de l eau vers le solvant. En laissant décanter, le solvant organique contenant les analytes est ensuite récupéré indépendamment de l eau. L échantillon est immergé dans un solvant qui absorbe les micro-ondes. La durée et la puissance des micro-ondes vont permettre aux composés d intérêt de passer de l échantillon vers le solvant organique. L extrait organique est récupéré puis purifié sur des colonnes de silice ou par SPE. L échantillon est immergé dans un solvant. Les ultrasons vont faciliter la désorption des composés et leur permettre de passer de l échantillon vers le solvant. L extrait obtenu est récupéré, centrifugé puis le surnageant est purifié sur des colonnes de silice ou par SPE. L échantillon est emprisonné dans une cellule. Celle-ci se remplit ensuite de solvant. Puis la pression et la température à l intérieur de la cellule sont augmentées pour permettre l extraction des composés d intérêt. Le solvant est chassé hors de la cellule par un flux d azote et est collecté dans un flacon. Le cycle d extraction (solvant, T, P ) peut être répété plusieurs fois. Les extraits sont collectés dans un même flacon. La purification de l extrait peut être réalisée en même temps que l extraction si un adsorbant est placé dans la cellule avant d introduire l échantillon. Sinon l extrait est purifié par SPE. rapide (jusqu à 24 échantillons traités en parallèle), économique (consommation faible de solvant), automatisable automatique, économique, volume d échantillon nécessaire réduit, réduction des effets matriciels, pas d étape de reconcentration facile à mettre en œuvre, robuste facile à mettre en œuvre, rapide (plusieurs échantillons peuvent être traités en parallèle), automatisable facile à mettre en œuvre, plusieurs échantillons peuvent être traités en parallèle rapide, automatique, faible consommation de solvant, intégration possible de l étape de purification volume de fuite, étape de reconcentration nécessaire LD plutôt élevées très consommatrice de solvant, lente (un échantillon traité à la fois), étape de reconcentration nécessaire le solvant d extraction doit être compatible avec l usage des microondes, étape de purification et reconcentration souvent nécessaire consommatrice de solvant, étape de purification et reconcentration souvent nécessaire étape de reconcentration nécessaire, co-extraction d interférents 153

154 Chapitre 3 : Matériel et Méthode phase la plus utilisée, avec une fréquence d apparition dans la littérature étudiée de 42,3 %, est la phase asis HLB. Seifrtova et al. (2009) met aussi en évidence une forte utilisation de cette phase dans sa review sur les méthodologiques analytiques dédiées au dosage des antibiotiques dans l environnement. Cette phase «Hydrophile Lipophile Balance» est constituée de groupements N-vinyl-pyrolidone qui interagissent avec les groupements hydrophiles des molécules et de groupements divinyl-benzène qui interagissent avec les groupements hydrophobes des molécules. Ainsi ce type de phase permet de retenir un large spectre de molécules aux propriétés physico-chimiques variées. Elle est donc très utilisée, en particulier pour les analyses multi-résidus où les propriétés physico-chimiques des composés sont très différentes (Seifrtova et al., 2009). D autres phases polymériques comme les phases Isolute ENV+ ou Strata X permettent également de retenir des composés aux propriétés physico-chimiques diverses. De plus, les phases polymériques supportent une large gamme de ph ce qui les rend plus adaptées que d autres types de phase pour les analyses environnementales. Les phases asis MCX («Mixed Cation exchange») sont aussi fréquemment employées (7,7 % des cas seules et 5,8% des cas en association avec des asis HLB). Ces phases, également polymériques, mettent en jeu des interactions ioniques et retiennent les cations. A l inverse les phases SAX («Strong Anion exchange») retiennent les anions. Le choix de la taille des cartouches et donc du volume de phase qu elles contiennent dépend de l échantillon à extraire. Plus l échantillon sera potentiellement contaminé ou chargé en matière organique et plus il faudra une masse de phase importante pour être en mesure de retenir tous les composés d intérêt. La matière organique peut interagir avec les sites d accrochage de la phase adsorbante et ainsi réduire le nombre de sites libres disponibles pour retenir les composés ciblés. Par ailleurs, un des inconvénients de la SPE réside dans les problèmes de colmatage des cartouches ; les cartouches se colmatent d autant plus vite qu elles contiennent peu de phase ou que l échantillon qui percole est très riche en matière organique. Une fois la phase adsorbante sélectionnée, le solvant d élution est le deuxième paramètre à définir lors d une extraction par SPE. Le choix du solvant est basé sur l affinité des molécules Une fois la phase adsorbante sélectionnée, le solvant d élution est le deuxième paramètre à définir lors d une extraction par SPE. Le choix du solvant est basé sur l affinité des molécules ciblées pour celui-ci. Dans l idéal, le solvant doit permettre d éluer les composés d intérêt sans pour autant décrocher les interférents contenus dans la matrice et qui ont été retenus sur la cartouche. Pour les molécules pharmaceutiques, 5 solvants sont utilisés : le méthanol, l acétonitrile, l acétone, le dichlorométhane et l acétate d éthyle. En raison de sa polarité et de son groupement hydroxyle, le méthanol est celui qui est le plus couramment employé (Annexe - tableau 12 et Seifrtova et al., 2009). Il peut être utilisé seul, en mélange avec d autres solvants ou supplémenté avec des acides (exemple : acide trifluoroacétique, acide formique, acide phosphorique, acide oxalique), des bases (exemple : hydroxyde d ammonium) ou des sels (exemple : acétate d ammonium). En ajoutant de l acide ou une base au solvant d élution, la forme sous laquelle se trouvent les molécules retenues dans la cartouche est modifiée (protonée ou non) au contact du solvant. La modification de la forme des molécules permet de les décrocher de la phase et/ou de les éluer de façon plus spécifique par rapport aux interférents. Les sels peuvent créer des interactions avec les molécules retenues dans la phase et ainsi favoriser leur élution sans quoi, leur affinité pour la phase serait plus grande que celle pour le solvant d élution et elles ne seraient pas entrainées. 154

155 Chapitre 3 : Matériel et Méthode Tableau 37 : Répartition des références bibliographiques utilisant l extraction par SPE entre les différentes sortes de cartouches (détails dans l Annexe - tableau 12). phase des cartouches SPE Nb de références bibliographiques Fréquence (%) asis HLB 22 42,3 asis MCX 4 7,7 Isolute ENV+ 4 7,7 asis HLB + MCX 3 5,8 Lichrolut EN 3 5,8 Isolute C 2 /ENV+ 3 5,8 Isolute C ,8 C ,8 MPC 2 3,8 Strata X 1 1,9 Baker SDB 1 1 1,9 SAX + asis HLB 1 1,9 Lichrolut EN + C ,9 Chromabond HR-P 1 1,9 PPL Bond-Elut 1 1,9 C 8 1 1,9 I.3.2. Extraction de la phase solide et particulaire par ASE L ASE présente l avantage d être une technique rapide et automatique. Trois paramètres majeurs conditionnent la réussite de ce type d extraction : la température, la pression et surtout le solvant d extraction. Dans une synthèse bibliographique récente, Nieto et al. (2010c) recensent les valeurs de ces différents paramètres dans 11 publications. D après leur étude, le méthanol, l acétone et l acétonitrile, seul ou en mélange avec l eau, sont les solvants les plus utilisés en raison de leur polarité et de l affinité des molécules pharmaceutiques pour ces solvants. Ce constat est en accord avec nos propres relevés bibliographiques présentés dans l Annexe - tableau 12. L utilisation d eau comme solvant d extraction nécessite de faire attention à la valeur du ph en particulier, afin de s assurer de la reproductibilité de l extraction. La valeur à laquelle le ph de l eau est stabilisé pour rendre l extraction optimum dépend des propriétés physicochimiques des molécules sélectionnées. D après Nieto et al. (2010c), le mélange eau/méthanol est le solvant d extraction le plus souvent employé. L augmentation de la température permet de diminuer la viscosité des solvants et donc d augmenter leur pénétration dans la matrice mais une température trop élevée dégrade les composés. Un compromis entre ces deux éléments permet de choisir la meilleure température d extraction. A l exception de Jacobsen et al. (2004) qui pratiquent leur extraction à une température de 20 C, la plupart des extractions sont réalisées entre 80 et 100 C (Schlüsener et al., 2003 ; Göbel et al., 2005 ; Jelic et al., 2009 ; Wu et al., 2009 ; Nieto et al., 2010c). Le choix de la pression est lié à la température et au solvant d extraction utilisé puisqu il ne faut pas que le solvant passe à l état de vapeur. Les produits pharmaceutiques sont généralement extraits à une pression de 100 bars (Nieto et al., 2010c). D autres paramètres comme le temps de contact («static»), c'est-à-dire la durée pendant laquelle le solvant est au contact de l échantillon, et le nombre de cycle, c'est-à-dire le nombre fois où le solvant est ajouté puis purgé, peuvent influencer la réussite de l extraction par ASE mais ces paramètres sont matrice- et composé-dépendants. Leur détermination résulte d un 155

156 Chapitre 3 : Matériel et Méthode compromis entre un temps de contact suffisamment long pour permettre au solvant de bien pénétrer dans la matrice et un renouvellement régulier du solvant pour favoriser le passage des composés de la matrice vers le solvant. Un temps de contact trop long provoquerait la dégradation des composés et un nombre de cycle trop important conduirait à avoir des extraits volumineux qui prendraient plus de temps à reconcentrer. Dans leur revue bibliographique, Nieto et al. (2010c) conseillent de réduire la durée de contact mais de multiplier le nombre de cycles. Les extraits issus de l extraction par ASE sont ensuite purifiés principalement par SPE. Pour que les composés soient retenus sur la phase adsorbante, il faut qu ils soient contenus dans une phase aqueuse qui est percolée au travers des cartouches. r les extraits ASE sont majoritairement dans des solvants organiques. Les composés qu ils contiennent seraient entrainés par le solvant organique au fur et à mesure de leur dépôt sur la cartouche si les extraits étaient percolés directement sur la cartouche. Une étape intermédiaire visant à éliminer le solvant organique ou à en réduire sa proportion et à le diluer dans de l eau est alors nécessaire pour optimiser les rendements d extraction (Nieto et al., 2010c). Pour cela, une partie du solvant organique est évaporé soit sous flux d azote (Díaz-Cruz et al., 2006) soit à l aide d un évaporateur rotatif (Schlüsener et al., 2003). Le volume résiduel est ensuite dilué dans de l eau de façon à ce que sa proportion soit négligeable et que les composés ne soient pas élués au fur et à mesure de leur dépôt. D auteurs auteurs préfèrent diluer directement leurs extraits ASE dans de l eau sans évaporer une partie du solvant organique (Jacobsen et al., 2004 ; Jelic et al., 2009). I.3.3. Extraction des composés piégés dans les échantillonneurs passifs Les échantillonneurs passifs présentent l avantage d extraire les composés ciblés directement dans le milieu. Une fois retirés du milieu, il ne reste plus qu à éluer les composés. Dans le cas des molécules pharmaceutiques, l échantillonneur passif le plus utilisé est le PCIS (Polar rganic Chemical Integrative Sampler). La première étape de l extraction consiste alors à transférer la phase du PCIS vers un contenant comme par exemple des cartouches vides de même sorte que celles utilisées pour la SPE. Puis un solvant est percolé sur la phase pour éluer les composés d intérêt. Togola et Budzinski (2007b) préconisent le méthanol comme solvant d élution de la phase asis HLB contenue dans les PCIS. De nombreux auteurs utilisent aussi couramment ce solvant (MacLeod et al., 2007 ; Zhang et al., 2008 ; Bartelthunt et al., 2009 ; Li et al., 2010). Le volume de solvant utilisé est le paramètre qui diffère le plus d une étude à l autre. Togola et Budzinski (2007b) éluent leurs composés avec 10 ml de solvant, MacLeod et al. (2007) avec 20 ml, Alvarez et al. (2004) avec 2 fois 20 ml et Bartelthunt et al. (2009) ou Li et al. (2010) avec 50 ml. Les extraits obtenus sont ensuite traités de la même façon que les extraits SPE. I.4. Techniques analytiques Vu le faible niveau de contamination des échantillons environnementaux, les techniques analytiques utilisées doivent être particulièrement sensibles. Par ailleurs, les échantillons environnementaux sont des matrices complexes, donc les outils doivent en plus être sélectifs. Les techniques répondant à ces exigences, sont les couplages chromatographie-spectrométrie de masse. En fonction des propriétés physico-chimiques des composés, la chromatographie pourra être en phase gazeuse (GC), pour des composés volatils résistant à la chaleur par 156

157 Chapitre 3 : Matériel et Méthode exemple, ou en phase liquide (LC) pour des composés hydrophiles par exemple. La chromatographie est une technique séparative c'est-à-dire qu elle permet de séparer les différents éléments d un mélange. Les composés d un mélange sont retenus sur la phase stationnaire (colonne chromatographique) et sont entraînés au fur et mesure par la phase mobile (gaz en GC, solvant en LC) en fonction de leur affinité pour cette dernière. Durant l étape de chromatographie, le mélange est décomposé et les différentes molécules qui le constituent sont entraînées une à une vers le spectromètre de masse (MS). Les molécules sont alors ionisées dans la source du spectromètre avant d être triées en fonction de leur rapport masse / charge dans l analyseur et d être détectées au niveau d un détecteur. Ce dernier sert à amplifier le signal, il peut être un multiplicateur d éléctrons ou un photo-multiplicateur. Les analyseurs des spectromètres de masse peuvent être montés en série pour optimiser davantage la sélectivité. Selon le mode d acquisition, balayage (scan) ou suivi d un ion/transition (Single Ion Monitoring (SIM) ou Single Reaction Monitoring (SRM) / Multiple Reaction Monitoring (MRM)), un spectre de masse ou un signal sélectif sera obtenu. Le spectre de masse sert généralement à identifier un composé alors que le signal sélectif permet de réaliser des dosages quantitatifs. Une quarantaine de références bibliographiques concernant l analyse des molécules pharmaceutiques dans diverses matrices environnementales ont été étudiées pour réaliser cette revue bibliographique. Leur étude a amené à lister 62 protocoles analytiques employant 6 systèmes d analyse différents : LC/UV (ultraviolet), LC/ FD (fluorescence), LC/MS, LC/MS/MS (spectromètre de masse en tandem), GC/MS et GC/MS/MS (Annexe - tableau 13). La répartition de ces 62 protocoles entre les différentes techniques mises en œuvre est présentée dans le Tableau protocoles soit 88,7 % des méthodes étudiées utilisent la chromatographie en phase liquide et 58 protocoles soit 93,6 % des méthodes étudiées utilisent la spectrométrie de masse comme moyen de détection. La LC/MS et plus spécialement la LC/MS/MS en combinant ces 2 techniques sont les systèmes les plus employés. La LC/MS/MS, technique plus sensible et plus spécifique que la LC/MS, représente 69,4 % des techniques analytiques mises en œuvre dans les articles scientifiques étudiés. Hirsch et al., et Ternes et al., en 1998 sont parmi les premiers à utiliser cette technologie. Depuis, les constructeurs ont encore amélioré les techniques chromatographiques pour aboutir à de nouvelles génération de chromatographie en phase liquide : UPLC (Ultra Performance Liquid Chromatography), RRLC (Rapid Resolution Liquid Chromatography) ou l UHPLC (Ultra Haute Pression Liquid Chomatography). Ces techniques emploient des colonnes plus courtes et de diamètre de particules plus petit de façon à réduire le temps d analyse, augmenter la résolution et diminuer les volumes morts ce qui permet aussi de diminuer la consommation de solvant. Tableau 38 : Répartition des références bibliographiques entre les différentes systèmes d analyse ( détails dans l Annexe - tableau 13). Technique analytique LC/UV LC/FD LC/MS LC/MS/MS GC/MS GC/MS/MS Nb de références bibliographique Fréquence (%) 1,6 4,8 12,9 69,4 6,5 4,8 Quel que soit le type de chaîne chromatographique liquide considérée, les colonnes employées sont principalement des colonnes utilisant des phases gréffées C 18 (69 % des colonnes LC répertoriées dans l Annexe - tableau 13) souvent précédées d une pré-colonne de même type (Andreozzi et al., 2003 ; Gómez et al., 2006 ; Gros et al., 2006 ; Hernando et al., 2004). Dans leur revue bibliographique, Hao et al. (2007) et Seifrtová et al. (2009b) mettent également en évidence l utilisation de phase C 8 ou de phase HILIC («Hydrophilic Interaction 157

158 Chapitre 3 : Matériel et Méthode Chromatography»). Les phases C 18 et C 8 sont des phases inverses donc plutôt apolaires qui nécessitent l utilisation de phases mobiles polaires. Les colonnes HILIC sont des phases normales donc polaires mais qui permettent également l utilisation de phases mobiles polaires traditionnellement utilisées avec les phases inverses (Peru et al., 2006). L eau, l acétonitrile et le méthanol représentent les 3 solvants de base fréquemment employés pour la constitution des phases mobiles (Annexe - tableau 13). Ils peuvent être utilisés seuls ou en mélange mais des acides (formique, acétique) ou des sels (acétate d ammonium) y sont régulièrement ajoutés. L ajout d acide modifie le ph des phases mobiles qui influe sur la forme des molécules selon le pka de ces dernières (Dolan, 2006). Comme pour la SPE, en stabilisant les molécules sous une de leur forme, l ajout d acide permet de rendre les analyses plus reproductibles. En plus d améliorer la séparation chromatographique, l ajout d acide, en favorisant la forme protonée des molécules, permet d améliorer l ionisation des composés en particulier lorsque celle-ci se fait en mode positif. L acétate d ammonium sert de tampon ce qui permet de stabiliser le ph de la phase mobile (Dolan, 2006). Mais l ajout d acétate d ammonium permet également de détecter certaines molécules en formant des adduits sur ces molécules. Certains composés forment naturellement des adduits avec des cations comme le sodium. Ce sont ces adduits qui sont détectés en spectrométrie de masse. r le quantité de sodium peut varier d une eau à une autre ou d un jour sur l autre rendant les analyses non reproductibles. Afin de remédier à ce problème, des ions ammoniums sont ajoutés en quantité fixe et connue à la phase mobile pour entrer en compétition avec les ions sodium pour se fixer sur les composés d intérêt. Lorsque que la chromatographie en phase liquide est couplée à un spectromètre de masse, l ionisation des composés est réalisée à pression atmosphérique principalement par «éléctrospray» (Annexe - tableau 13) mais elle peut aussi se faire par APCI (Ionisation Chimique à Pression Atmosphérique) (Catastini et al., 2009). Certaines analyses se font aussi par GC/MS (chromatographie en phase gazeuse couplée à un spectromètre de masse) (Hao et al., 2007) bien que cette méthode nécessite souvent une étape supplémentaire de dérivation (Huggett et al., 2003 ; Steger-Hartmann et al., 1996 ; Ternes et al., 1998, Togola et Budzinski, 2007a). Quelque soit la technique séparative choisie (LC ou GC), trois analyseurs sont couramment employés pour les analyses environnementales : le quadrupôle (Q), le temps de vol (TF) et la trappe à ions (IT). Dans les couplages MS/MS, on retrouve souvent deux quadrupôles montés en séries (QQQ) ou un quadrupôle suivi d un temps de vol (QTF). Le TF est une technique spectrométrique dite de haute résolution qui permet l identification de composés. Les critères retenus pour valider une méthode analytique sont les suivants : précision (variation de la réponse entre plusieurs injections d un même échantillon), justesse (accord de la réponse mesurée avec la réponse théorique attendue), gamme de linéarité (proportionnalité entre la quantité injectée et la réponse obtenue), limites de détection et de quantification (quantité ou concentration la plus petite qui puisse être détectée ou quantifiée). Il existe différentes sortes de limites de détection (LD) : les limites instrumentales (IDL/IQL) qui prennent en compte les limites techniques de l'appareil utilisé pour faire les analyses et les limites méthodologiques (MDL/MQL) qui tiennent compte à la fois des limites instrumentales mais aussi des limites apportées par le protocole de préparation des échantillons ou par la matrice (Capdeville et Budzinski, 2011). 158

159 Chapitre 3 : Matériel et Méthode Les limites instrumentales de détection (IDL) et de quantification (IQL) sont définies à partir de l'injection de solutions de référence. Elles sont exprimées en picogrammes ou nanogrammes injectés. Elles sont directement liées à la sensibilité et aux performances des instruments analytiques. Les limites méthodologiques de détection tiennent compte à la fois de la sensibilité instrumentale et des impacts du protocole de préparation des échantillons. Elles sont exprimées en ng/l pour les matrice liquide et en ng/g pour les matrices solides. Une première façon de les calculer, consiste à extrapoler les IDL en tenant compte du volume de la prise d'essai et du facteur de reconcentration mais ce calcul suppose qu'il n'y ait pas de biais méthodologique c'est-à-dire de pertes lors de la préparation des échantillons ni d effet matriciel au moment de l analyse. Une autre possibilité pour les déterminer consiste à appliquer l'ensemble du protocole (extraction, reconcentration et analyse) à une matrice de référence assez simple, dépourvue des composés ciblés et contenant le moins de matière organique possible, enrichie avec de très faibles quantités de composés. Ces MDL sont alors mesurées en tenant compte de l'ensemble des impacts possibles du protocole tout en ayant réduit au minimum les risques d interférence causés par la matrice au moment de l'extraction et de l analyse. Enfin, les MDL peuvent être mesurées à partir de l'analyse de différents types de matrices enrichies avec les composés d intérêt. Dans ce cas, en plus de tenir compte des problèmes potentiels amenés par l étape de préparation des échantillons, ceux liés à la nature de l échantillon sont pris en considération. Les effets que peut avoir la matrice sur les rendements d extraction ou sur la sensibilité analytique sont intégrés dans les calculs. Ce sont les MDL les plus complètes. Dans la plupart des cas, les limites de détection sont de l ordre du ng/l ou de la dizaine de ng/l (Gómez et al., 2006 ; Gros et al., 2006 ; Huschek et al., 2004 ; Sacher et al., 2001) et celles de quantification sont de l ordre de la dizaine ou de la centaine de ng/l (Gómez et al., 2006 ; Gros et al., 2006 ; Huschek et al., 2004 ; Sacher et al., 2001 ; Vieno et al., 2006). La LC/MS/MS présente donc une bonne sensibilité. Cependant, cette approche, par chromatographie en phase liquide couplée à un spectromètre de masse, simple ou en tandem, a deux problèmes majeurs : la présence d interférents et l extinction matricielle (Furlong et al., 2008). Les interférents peuvent modifier la rétention des composés d intérêts (décalage des temps de rétention, empêcher les composés d être retenus sur la colonne, empêcher la séparation chromatographique de composés proches, déformation des pics chromatographiques) (Furlong et al., 2008). Lors de l étape de détection par spectrométrie de masse, les interférents, qui n ont pas été séparés des composés recherchés lors de l étape de chromatographie, peuvent être ionisés et donner un des ions du composé recherché et modifier le ratio entre les ions utilisés pour l identification (Furlong et al., 2008). Lors de l étape de détection par spectrométrie de masse, il peut aussi y avoir une compétition entre l interférent et les composés d intérêt pour l ionisation lorsque celle-ci se fait par électrospray ce qui amène à de l extinction ou de l augmentation de signal. Les interférences matricielles sont échantillons- et composés-dépendantes (Watkinson et al., 2009). Les étapes d extraction et de purification permettent de diminuer ces problèmes d interférence. L analyse en LC/MS/MS réduit encore ce problème par rapport à la LC/MS car elle est plus sélective. Par ailleurs, pour s assurer de l identité d un composé, quatre critères d identification doivent être remplis au minimum : le temps de rétention chromatographique, deux signaux ioniques (deux ions en MS et deux transitions en MS/MS), 159

160 Chapitre 3 : Matériel et Méthode et le rapport entre ces 2 signaux. n peut suivre au cours d une même analyse plusieurs transitions «ions précurseurs ions produits» en utilisant le mode MRM (multiple réaction monitoring). L identification par au moins 4 points est recommandée par l Union Européenne dans la commission de 2002 (European Commission, 2002). échantillon centrifugation liquide filtration solide particulaire dissout lyophilisation ultra-sons MAE ASE capteur passif SPE LLE SPME élution reconcentration dérivation injection LC GC UV fluorescence MS MS/MS Figure 42 : Les différentes étapes dans le traitement d un échantillon depuis le prélèvement jusqu à l analyse. Le deuxième problème de la LC concerne l extinction matricielle c'est-à-dire le fait de diminuer le signal de réponse du spectromètre de masse. La suppression du signal peut être due à plusieurs phénomènes : i) les molécules pharmaceutiques s adsorbent sur la matière 160

161 Chapitre 3 : Matériel et Méthode organique provoquant une diminution des composés libres qui sont dosés ; et ii) les interférents contenus dans la matrice peuvent masquer les pics en augmentant le niveau de la ligne de base du signal chromatographique (Gomez et al., 2006). Ce problème peut être en partie résolu par l ajout d étalons internes qui se comportent exactement de la même façon que les composés recherchés mais qui n existent pas dans le milieu et qui sont rajoutés en début de traitement de l échantillon. Une autre façon de résoudre les problèmes d effet matriciel est de diluer l échantillon avant injection. L inconvénient de la dilution est de perdre en sensibilité (Petrovic et al., 2005 ; Gómez et al., 2006 ; Gros et al., 2006 ; Vieno et al., 2006). Enfin la méthode des ajouts dosés qui consiste à ajouter une quantité connue de composés dans un duplicat de l échantillon avant l analyse est une autre alternative pour contourner les problèmes d effets matriciels. Pour conclure sur cette partie analytique, la Figure 42 reprend la chronologie de l ensemble des étapes du traitement d un échantillon, depuis le prélèvement jusqu à l analyse. Par ailleurs, certains organismes de référence publient des guides avec les méthodes qu ils ont mis au point. Ainsi l US EPA a publié en décembre 2007 une méthode pour l analyse des molécules pharmaceutiques et des produits de soin corporel dans l eau, le sol et les sédiments. Cette méthode décrit les protocoles d extraction et d analyse par HPLC/MS/MS (US EPA 2007). L US GS a également publié une méthode qui décrit les protocoles d extraction par SPE et d analyse par HPLC/MS des molécules pharmaceutiques dans les eaux filtrées (Furlong et al., 2008). II. Projets et sites d échantillonnage Dans cette partie, sont présentés les projets de recherche, les sites d échantillonnage et les modalités de prélèvement lié au travail de thèse. Quelques informations générales sur la prise en charge des échantillons sont indiquées mais les détails relatifs au traitement des échantillons (nettoyage du matériel, filtration, extraction, re-concentration) sont présentés dans la partie suivante III. Traitement des échantillons. II.1. Eaux usées et autres échantillons d eau Les premiers échantillons environnementaux analysés ont servi de tests pour vérifier l applicabilité d une nouvelle méthode développée. La première étape dans cette démarche de vérification consiste à choisir les échantillons tests. Cette sélection s effectue selon divers critères : - les échantillons doivent très probablement contenir au moins quelques une des molécules recherchées sinon, il ne sera pas possible de définir si l absence de détection de composés est liée à un problème méthodologique ou seulement au fait qu ils ne sont pas présents. - les échantillons doivent pouvoir être facilement prélevés. - la matrice ne doit pas être trop complexe de façon à limiter les problèmes d interférence et éviter ainsi, d une part, de masquer les composés recherchés au moment de l analyse et d autre part, d empêcher l extraction des composés (colmatage des cartouches SPE, compétition pour les sites d adsorption sur la phase). Du fait de l origine des molécules pharmaceutiques dans l environnement aquatique et des résultats d études antérieures, les effluents de station d épuration sont connus généralement pour être contaminés par les molécules pharmaceutiques recherchées, notamment les antibiotiques. Ils sont facilement prélevables car dans la plupart des STEP les rejets sont 161

162 Chapitre 3 : Matériel et Méthode régulièrement surveillés par les épurateurs ; on peut donc y accéder facilement. De plus, suite aux traitements appliqués dans les stations, ils sont moins chargés en matière organique que les eaux usées brutes. De cette façon, ils permettent d éprouver la méthode sans pour autant être confronté à la situation la plus complexe. Les effluents de station d épuration semblaient donc recommandés dans un premier temps comme échantillons tests pour essayer une méthode nouvellement développée. La première méthode testée concernait le dosage de 32 molécules pharmaceutiques (23 antibiotiques, 2 -bloquants, 2 anti-vih et 5 anticancéreux) appartenant à la première liste de molécules sélectionnées pour être étudiées. Dix effluents provenant de 9 stations d épuration différentes ont été analysés. Les stations d épuration ont été choisies pour représenter les différentes sortes de processus de traitement existant en France. Les prélèvements ont été réalisés dans le cadre du projet AMPERES (Analyse des Micropolluants Prioritaires et Emergents dans les Rejets et les Eaux de surface). Les caractéristiques des STEP sont présentées dans le Tableau 39 et les informations relatives au prélèvement et au traitement des échantillons dans le Tableau 40. Les prélèvements ont été réalisés à l aide de préleveurs automatiques équipés de tuyaux en Teflon, dans des bouteilles en verre pendant 24 heures de façon à obtenir un échantillon journalier moyen (proportionnel au débit). Ils ont été transportés et conservés à 4 C avant d être filtrés au maximum dans les 48 heures après le prélèvement. Une fois la phase dissoute et la phase particulaire séparées, ils ont été conservés à -20 C avant extraction par SPE (cf III.1 Échantillons «eau»). Les analyses par LC/MS/MS ont été réalisées dans la semaine qui a suivi l extraction. code échantillon Tableau 39: Caractéristiques des stations d'épuration où les échantillons ont été prélevés. code STEP capacité (éq. hab) origine des eaux usées débit (m 3 /j) 1 CA PA urbain SE PA urbain SE PA urbain CA urbain et 6 CA rural 15 type de traitement boue activée aération prolongée (C + N + DN) + filtre à sable + ozone (10 mg 2 /L) boue activée aération prolongée (C + N + DN) + décantation rapide (Al 2 (S 4 ) 3 ) + filtre à sable boue activée aération prolongée (C + N + DN) + filtre à sable + microfiltration + osmose inverse décantation primaire physico-chimique + filtre biologique immergé aéré (C) prétraitement + filtre planté de roseaux vertical + filtre horizontal conventionnel (C + N + DN) 7 SE urbain prétraitement + boue activée aération prolongée(c + N + DN) 8 SE urbain prétraitement + bioréacteur à membranes (C + N + DN) 9 SE urbain prétraitement + décantation primaire physico-chimique + filtre biologique immergé aéré (C + N) 10 SE rural 135 lit bactérien + filtre planté de roseaux (C + N) Éq. hab = équivalent habitant, C : élimination du carbone, N : élimination aérobie de l azote (nitrification), DN : élimination anoxique de l azote (dénitrification) 162

163 Chapitre 3 : Matériel et Méthode Tableau 40 : Informations relatives au prélèvement et au traitement des échantillons. code échantillon lieu de prélèvement date de prélèvement date de filtration 1 sortie de STEP 26/03/ /03/ sortie de STEP 18/05/ /05/ sortie de STEP 26/05/ /05/ sortie de STEP 11-12/02/ /02/ sortie filtre horizontal tertiaire 10-11/03/ /03/ sortie filtre horizontal conventionnel 10-11/03/ /03/ sortie de STEP 11/09/ /09/ sortie de STEP 09/10/ /10/ sortie de STEP 17/10/ /10/ sortie de STEP 08/04/ /04/2008 date SPE 12/06/2008 date analyse 18/06/2008 (ESI+) 20/06/2008 (ESI-) Une fois l applicabilité du protocole vérifiée au travers de l analyse des effluents de STEP, ce dernier a pu être appliqué à un spectre plus large d échantillons. Ainsi des eaux usées prélevées en entrée et sortie de 4 STEP différentes, mais aussi des eaux de surface, prélevées en amont et en aval de ces rejets, et des eaux de captage ont été analysées. Les points de prélèvements sont schématiquement représentés sur la Figure 43. Les prélèvements ponctuels ont été réalisés en juin et en décembre 2008 (conditions été et hiver). Les échantillons, contenus dans des flacons en plastique (HDPE), ont été transportés dans des glacières (4 C) puis filtrés dans les 24 heures suivant le prélèvement (cf III.1 Échantillons «eau»). La phase dissoute a été congelée à -20 C en attendant d être analysée. Les caractéristiques des stations d épuration sont présentées dans le Tableau 41. En raison des difficultés rencontrées pour analyser de façon satisfaisante l amoxicilline et l ampicilline (rendement d extraction très faible < 10 %), un protocole spécifique à leur dosage a été développé au cours de ces travaux de thèse. Dans le but de vérifier son applicabilité, il a été testé sur des échantillons prélevés en entrée et en sortie de la station d épuration bordelaise Louis Fargues. Cette station a une capacité de équivalents habitants et possède un prétraitement, un traitement primaire par décantation et un traitement secondaire par boue activée à aération prolongée. Les échantillons ont été collectés le 4 et le 6 août Ils ont été reconstitués à partir de prélèvements automatiques d eau asservis au débit et collectés toutes les heures pendant 24 heures de façon à obtenir un échantillon journalier moyen. Ils ont été filtrés puis congelés le jour du prélèvement (cf III.1 Échantillons «eau»). initiale STEP CL capacité (éq. hab) Tableau 41 : Caractéristiques des quatre stations d'épuration étudiées. débit* (m 3 /j) origine des eaux usées entrée - sortie ,6-1960,7 activité domestique, hospitalière et rurale (cave coopérative de vinification) type de traitement TP, BA, AP, DN / N L ,5-2638,5 activité domestique et hospitalière TP, BA, AP, DN / N P ,3-343,7 activité domestique TP, BA, AP B activité domestique filtres plantés roseaux, UV débit* : débits moyens annuels TP : traitement physique, BA : boues activées, AP : aération prolongée, DN / N: dénitrification / nitrification 163

164 Chapitre 3 : Matériel et Méthode France Montpellier Lergue L1 L Hérault CL B1 H1 STEP eau de surface eau captage B L2 P P1 Figure 43: Cartographie des points de prélèvement (STEP, eau de surface, eau de captage). H2 II.2. FLASH Le projet FLASH (programme Seine Aval 4) vise à observer la relation entre la consommation de médicaments (en particulier les antibiotiques), les quantités de principes actifs dosés dans les échantillons d eaux usées afférentes et la présence de bactéries résistantes aux antibiotiques dans ces mêmes échantillons d eau. Les analyses chimiques ont été réalisées en appliquant le protocole développé pour permettre le dosage de la liste étendue à 78 composés pharmaceutiques (32 molécules de la première liste + 46 nouvelles molécules sélectionnées cf. chp 2 «Sélection des molécules»). Pour étudier à la fois les origines humaines et vétérinaires de la contamination des eaux par les molécules pharmaceutiques, deux continuums ont été suivis. Ils sont décrits dans les deux paragraphes suivants. II.2.1. Continuum hospitalier Le continuum hospitalier comprend un centre de soin situé en Haute Normandie (Eure) qui regroupe un hôpital de 87 lits, ne possédant pas de service d oncologie, et une maison de retraite de 180 lits. Les eaux usées de ces 2 bâtiments viennent se déverser dans le réseau collectif d assainissement en amont d une station d épuration d une capacité de

165 Chapitre 3 : Matériel et Méthode équivalents habitants. Les traitements appliqués dans la STEP sont les suivants : prétraitement (dégrillage, dessablage), traitement biologique (bassin aération séquencée et boue activée), traitement UV. Les débits dans la STEP sont de m 3 /j en période sèche et de m 3 /j en période humide. Les eaux traitées sont ensuite rejetées dans un petit cours d eau (noté rivière). Le continuum hospitalier et les points de prélèvement sont représentés sur la Figure 44. Estuaire de la Seine France Effluent hospitalier Effluent maison de retraite STEP Effluent urbain : prélèvement Figure 44 : Représentation schématique du continuum hospitalier et des points de prélèvement. Une première campagne de prélèvement a eu lieu le 30 juin 2009 (condition été, période épidémiologique de faible ampleur). Au cours de cette campagne, les effluents de l hôpital et de la maison de retraite ont été prélevés manuellement de façon ponctuelle dans des flacons Nalgene en polyéthylène haute densité (HDPE). La station d épuration est équipée d un échantillonneur automatique asservi au débit en entrée et en sortie. Un bidon de récupération d un volume de 25 litres est conservé dans un compartiment réfrigéré. Le jour de la mission ce bidon était rempli à hauteur de 15 litres. Les échantillons ont été récupérés à partir du contenu de ce bidon. L eau du cours d eau a été prélevée manuellement de façon ponctuelle dans des flacons Nalgene en HDPE. Une deuxième campagne a eu lieu le 8 décembre 2009 (condition hiver, période épidémiologique de forte ampleur). Au cours de cette campagne, les effluents du centre de soin ainsi que le cours d eau ont été équipés d un préleveur automatique. Tous les échantillons sont donc des échantillons moyens, reconstitués à partir de prélèvements réguliers (1 l par heure) pendant 24 heures ou 21 heures et 16 heures en cas de défaillance du système de prélèvement. Les échantillons ont été reconstitués dans des bouteilles en verre à partir de 250 ml de chacun des prélèvements. Les caractéristiques des prélèvements sont résumées dans le Tableau

166 Chapitre 3 : Matériel et Méthode Tableau 42 : Caractéristiques des prélèvements le long du continuum hospitalier au cours des 2 campagnes. hôpital maison de retraite entrée STEP sortie STEP influencé par : 87 lits 180 lits éq. hab prélèvements juin 2009 (été) ponctuel ponctuel prélèvements décembre 2009 (hiver) moyenné 24h moyenné 21h moyenné 24h moyenné 24h moyenné 24h moyenné 24h rivière (5) rejet STEP ponctuel moyenné 16h Quelle que soit la campagne, les échantillons ont été ramenés au laboratoire dans les 24 heures qui ont suivi le prélèvement et ont été filtrés dans les 24 heures suivantes. Les échantillons de la campagne estivale ont été extraits et analysés les jours suivants (pas de congélation). Pour les échantillons de la campagne hivernale, une fois la phase dissoute et particulaire séparées, ils ont été conservés au congélateur à -20 C et ont été extraits et analysés le mois suivant (7 janvier 2010). II.2.2. Continuum agricole Le continuum agricole, situé dans le département de l Eure, comprend 4 sites d échantillonnage qui sont représentés sur la Figure 45. Le premier site (1) est situé en amont et correspond, à priori, à un point de référence car il n est pas impacté par des activités urbaines ou agricoles (zone forestière, absence de pâturages et de cultures). Le deuxième site (2) est impacté par les eaux de ruissellements d une parcelle agricole servant de pâturage pour 450 bovins (usages d antibiotiques et de vermifuges). Le troisième site (3) est impacté par le bassin versant agricole situé en amont. Enfin, le quatrième site (4) est situé à la confluence de deux ruisseaux pour quantifier les apports du premier au second. Comme pour le continuum hospitalier, une campagne hivernale (24/11/09) et une autre estivale (08/06/10) ont été menées. Dans les deux cas, des préleveurs automatiques ont été posés sur chacun des sites de prélèvement de façon à obtenir des échantillons moyens sur 24 heures. En novembre, 1 litre a été prélevé toutes les heures et les échantillons moyens ont été constitués en mélangeant 250 ml de chaque prélèvement (6 litres moyennés). En juin, 300 ml ont été prélevés par heure et les échantillons moyens ont été constitués en mélangeant 210 ml de chaque prélèvement (5 litres moyennés). Par malchance, les préleveurs ont dysfonctionné au niveau des points 3 et 4 lors de la campagne du mois de novembre. Pour le point numéro 3, 2 litres ont été prélevés automatiquement le 23/11/09 et 1 litre a été prélevé manuellement le 24/11/09. Les 3 litres ont ensuite été mélangés de façon à créer un échantillon moyen. Pour le point 4, 11 litres ont été prélevés automatiquement et ont été mélangés pour créer un échantillon moyen. Les caractéristiques des prélèvements sont résumées dans le Tableau 43. Tableau 43 : Caractéristiques des prélèvements le long du continuum agricole au cours des 2 campagnes. site 1 site 2 site 3 site 4 environnement forêt pâturage agricole cours d eau divers 1, 2 et 3 prélèvements novembre 2009 moyenné moyenné moyenne moyenné 24h 24h sur 3 L 11h prélèvements juin 2010 moyenné moyenné moyenné moyenné 24h 24h 24h 24h 166

167 Chapitre 3 : Matériel et Méthode Estuaire de la Seine France Figure 45 : Représentation du continuum agricole et des sites de prélèvement (le point 5 correspond à l eau de surface échantillonnée dans le continuum hospitalier). Les échantillons de la campagne hivernale sont arrivés au laboratoire le jour même de leur collecte et ont été filtrés le lendemain. Les échantillons de la campagne estivale ont été prélevés le 8 juin et sont arrivées au laboratoire le 11 juin (conservés réfrigérer à 4 C pendant le transport). Ils ont été filtrés immédiatement. Les phases dissoutes, comme les phases particulaires, ont ensuite été conservées au congélateur à -20 C. Dans les deux cas, les phases dissoutes ont été extraites et analysées dans le mois suivant. II.3. DIPERPHA L ANR DIPERPHA avait pour objectif principal l étude du devenir des perturbateurs endocriniens (hormones) et des molécules pharmaceutiques (antibiotiques) dans les déchets d élevage. Pour atteindre cet objectif et étudier l origine vétérinaire quant à la présence des antibiotiques dans le milieu naturel, des effluents d élevage ont été analysés. Cinq élevages porcins ont été choisis pour cette étude. La filière porcine a été préférée aux filières bovines ou avicoles car : i) c est la première source de viande, ii) la France est le troisième producteur européen, iii) les lisiers représentent 30 % à 40 % des déchets d élevage, iv) 28 millions de tonnes de lisiers sont épandus sur les sols agricoles français chaque année, et surtout v) plus 167

168 Chapitre 3 : Matériel et Méthode de 50 % des antibiotiques à usage vétérinaire sont administrés aux cochons. Les élevages sélectionnés sont de type naisseurs-engraisseurs c est-à-dire que tous les stades physiologiques sont présents sur chacun des sites. Les cochons sont répartis par bâtiment en fonction de leur stade physiologique. Un bâtiment abrite les truies gestantes ou venant de mettre bas (maternité, MATER), un autre les porcelets juste sevrés (post-sevrage, PS) et un troisième les porcs ou truies à l engraissement (engraissement, ENG). Les animaux sont disposés sur caillebotis de façon à ne pas être en contact avec le sol et leurs déjections. Les bâtiments sont nettoyés toutes les trois à quatre semaines. truies gestantes porcelets post-sevrage porcs engraissement lisier brut (LB MATER) lisier brut (LB PS) lisier brut (LB ENG) lisier stocké (LS) épandage point de prélèvement Figure 46 : Filière simple de traitement du lisier dans un élevage de type naisseur-engraisseur. Trois des cinq élevages ont des systèmes simples de traitement du lisier c'est-à-dire que le lisier est collecté dans une grande fosse avant d être épandu comme engrais sur les sols agricoles (Figure 46). La fosse est généralement vidée deux fois par an, à l automne et au printemps. Ces trois élevages ont été choisis car leurs fosses à lisier sont équipées d un système permanent de brassage qui permet, lorsqu il est activé, d agiter le lisier et donc d homogénéiser les futurs prélèvements. Les caractéristiques de ces trois élevages sont répertoriées dans le Tableau 44. Tableau 44 : Caractéristiques des élevages étudiés possédant un système de traitement simple du lisier. élevage 1 élevage 2 élevage 3 localisation (département) Plouguin (29) Plouguin (29) Plouzané (29) nombre de truies 200 à 400 < 200 < 200 nombre animaux / an volume fosse stockage (m 3 ) durée du stockage (mois) Deux études ont été menées dans ces trois élevages (système simple). La première consistait à savoir si le niveau de contamination du lisier était liée au stade physiologique de l animal et donc au bâtiment d origine du lisier. Pour cela, du lisier brut (LB) a été prélevé directement à la sortie de chacun des trois bâtiments d élevage (maternité, post-sevrage et engraissement) ainsi que du lisier stocké (LS), prélevé dans la fosse de stockage. Les dates de ces 168

169 Chapitre 3 : Matériel et Méthode prélèvements sont données dans le Tableau 45. Cependant, le site 2 n a pas fait l objet de campagne d échantillonnage spécifique à cette étude aussi le lisier brut n a été prélevé qu à la sortie de 2 des 3 bâtiments (MATER et PS). Les lisiers bruts LB ENG et stockés LS ont été prélevés à la même période mais un an auparavant. La deuxième étude avait pour objectif d observer le devenir des antibiotiques dans les fosses de stockage. Pour cela un suivi sur 5 mois consécutifs a été réalisé dans chacun des trois élevages. Les dates de collecte mensuelle du lisier stocké sont indiquées dans le Tableau 46. Les points de prélèvement de ces 2 études sont représentés Figure 46. Tableau 45 : Dates de prélèvement du lisier stocké et des lisiers bruts en fonction du bâtiment d élevage d origine type de lisier LB ENG LB MATER LB PS LS élevage 1 19/10/09 27/10/09 27/10/09 19/10/09 élevage 2 30/09/08 12/10/09 12/10/09 30/09/08 élevage 3 18/08/09 11/08/09 11/08/09 18/08/09 Tableau 46 : Dates de prélèvement dans la fosse de stockage du lisier sur les élevages possédant un système simple de traitement. date de prélèvement 08/07/08 28/07/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 08/12/08 19/01/09 élevage 1 x x x x x élevage 2 x x x x x élevage 3 x x x x x Les deux élevages restants possèdent des systèmes complexes de traitement du lisier. Ces systèmes de traitement ressemblent à des mini-stations d épuration. Initialement, ils ont été installés pour favoriser l élimination de l azote. En effet, dans certaines zones, quand le lisier contient trop d azote, il ne peut être utilisé comme engrais pour enrichir les sols agricoles. Les systèmes de traitement ne sont pas exactement les mêmes sur les deux sites. arrosage (été) lagune (Lag) lisier brut liquid centrifugation lisier stocké (LS) reflux solide de séparation liquide bassin aération (BA) bassin décantation (BE) boue compost (RSS) point de prélèvement épandage (printemps automne) Figure 47 : Filière complexe de traitement du lisier avec séparation par centrifugation du solide et du liquide en sortie de la fosse de stockage (élevage 4). 169

170 Chapitre 3 : Matériel et Méthode Sur le premier site (élevage 4) (Figure 47), à la sortie de la fosse de stockage, le lisier est centrifugé pour séparer le liquide du solide. Le reflux solide de séparation (RSS) est entassé pour former du compost. Le liquide est dirigé vers un bassin d aération (BA) où des périodes d aération, produites par agitation, sont alternées avec des périodes d anoxie pour permettre aux réactions de nitrification / dénitrification de se réaliser. Le lisier est ensuite guidé vers un bassin de décantation où les boues sont stockées. Elles sont ensuite épandues (boues épandues, BE). Le surnageant est déversé dans une lagune (Lag) et sert à arroser les cultures en été. Le deuxième site (élevage 5) ne possède pas de centrifugeuse (Figure 48), aussi le liquide et le solide vont tous les deux dans le bassin d aération en sortie de la fosse de stockage. La suite du traitement est la même que sur le premier site. Les caractéristiques de ces deux élevages sont listées dans le Tableau 47. arrosage (été) lagune (Lag) lisier brut liquid lisier stocké (LS) bassin aération (BA) bassin décantation (BE) boue point de prélèvement épandage (printemps automne) Figure 48 : Filière complexe de traitement du lisier sans séparation des phases solide et liquide (site 2). Tableau 47 : Caractéristiques des élevages étudiés possédant un système complexe de traitement du lisier. élevage 4 élevage 5 localisation (département) Meslin (29) Plestan (22) nombre de truies nombre animaux / an volume fosse «stockage» (m 3 ) centrifugeuse oui non volume bassin d aération (m 3 ) volume bassin de décantation (m 3 ) 2 x volume lagune (m 3 )

171 Chapitre 3 : Matériel et Méthode Un autre objectif du projet DIPERPHA était de savoir si les processus de traitement permettent d éliminer les antibiotiques. Pour répondre à cette interrogation, des prélèvements ont été effectués le long des filières complexes sur chacun des deux élevages 4 et 5. Les points de prélèvements sont visibles sur la Figure 47 et la Figure 48. Les campagnes printanières ont eu lieu le 20 avril et le 4 mai 2009 pour les élevages 4 et 5 respectivement et les campagnes automnales ont eu lieu les 16 novembre et 30 octobre 2009 respectivement pour les élevages 4 et 5. Sur l ensemble des 5 sites étudiés, tous les lisiers sous forme liquide ont été prélevés à l aide d un seau préalablement rincé avec l échantillon lui-même. Un seul endroit permettait l accès au lisier brut à la sortie des bâtiments d élevage et aux boues stockées dans le bassin de décantation (BE), ces prélèvements ont donc été effectués plusieurs fois successivement au même endroit dans le but d avoir un échantillon le plus représentatif possible du bâtiment ou du bassin. Les fosses de stockage et les bassins d aération (BA) ne possédaient également qu un seul point d accès mais la mise en route des systèmes d agitation, 15 à 60 minutes avant le prélèvement, permettait de rendre l échantillon plus homogène et donc plus représentatif. Des prélèvements ont été réalisés à différents points autour de la lagune. Ils ont ensuite été mélangés pour tenter de produire un échantillon moyen. Le reflux solide de séparation a été prélevé à la pelle et transporté dans des sacs en plastique. Plusieurs pelletées ont été réalisées à divers endroits du tas de compost de façon à obtenir un échantillon moyen représentatif du tas. De retour au laboratoire, les échantillons de compost ont été transférés dans des barquettes rectangulaires en aluminium et conservés au congélateur à -20 C. Les échantillons liquides ont été centrifugés dans les 24-48h après le prélèvement et filtrés dans les 48-72h après le prélèvement (cf. III.2 Échantillons «lisiers»). Une fois séparées, les différentes phases ont été conservées au congélateur à -20 C. L ensemble des prélèvements ainsi que le conditionnement des lisiers ont été réalisés par le CEMAGREF de Rennes. Les échantillons ont ensuite été expédiés dans de la carboglace jusqu au laboratoire où ils ont été conservés à - 20 C en attendant d être traités. Pour compléter ces études «terrain», des expérimentations de dégradation en laboratoire en conditions contrôlées «mésophiles» (bactéries supportant des températures comprises entre 15 et 45 C) et «thermophiles» (bactéries supportant des températures supérieures à 50 C) ont été menées. Au cours d une première expérience, du lisier provenant de la fosse de stockage d un des élevages précédemment décrit (Meslin, élevage complexe 1) est conservé dans une cuve à 4 C de façon à alimenter en semi-continu (toutes le 12 heures) un digesteur. Dans ce dernier, les conditions sont anaérobies et la température est de 38 C. Sa capacité est de 120 litres et le temps de séjour moyen est de 26.7 jours. Une homogénéisation est pratiquée pendant 10 minutes toutes les 3 heures. A la sortie du digesteur, le lisier rejoint un réacteur dans lequel des réactions de nitrification et dénitrification sont provoquées par l alternance de conditions aérobies et anoxiques (aération de 4 à 6 heures par jour). La capacité du réacteur est de 125 litres et le temps de séjour moyen est de 27.8 jours. L homogénéisation y est permanente. Du lisier a été prélevé à l entrée du digesteur (réacteur lisier brut, RLB), à la sortie du digesteur (réacteur lisier digéré, RLdig) et à la sortie du réacteur de nitrification/dénitrification (réacteur lisier sortie, RLsort). L ensemble des caractéristiques du montage ainsi que les points de prélèvement sont représentés Figure 49. Au cours d une deuxième expérimentation, l étape intermédiaire anaérobie (digesteur) a été supprimée. Le réacteur est alimenté directement et en semi-continu (toujours toutes les

172 Chapitre 3 : Matériel et Méthode heures) par du lisier conservé à 4 C. Le temps de séjour est de 20,8 jours. La température est comprise entre 25 et 30 C. Le temps d aération est de 12h/j (6 heures toutes les 12 heures). Du lisier a été prélevé en entrée (alimentation) et en sortie (sortie) du réacteur (Figure 50). Enfin, au cours d une troisième expérimentation, deux réacteurs fonctionnant en conditions thermophiles (55 C) anaérobies sont alimentés manuellement et quotidiennement par du lisier conservé à 4 C. Les 2 réacteurs ont une capacité de 4 L et les temps de séjour sont de 15 jours. Afin d homogénéiser les contenus, ils sont placés sur des tables d agitation. De plus, pour éviter les pertes par évaporation, ils sont surmontés chacun d un réfrigérant qui permet de recondenser le biogaz sortant du système. Les 2 réacteurs se différencient par les inocula. L inoculum du premier réacteur (R1) provient de boues de STEP alors que celui du deuxième réacteur (R2) provient de fumier équin. Dans les 2 cas, ils sont adaptés aux conditions thermophiles. Le lisier a été prélevé en entrée (alim.) et en sortie de chacun des réacteurs (R1 sortie et R2 sortie). L ensemble des caractéristiques du montage ainsi que les points de prélèvement sont représentés Figure 51. Comme pour les échantillons «terrain», les lisiers ont été centrifugés puis filtrés avant que les différentes phases ne soient congelées séparément (cf. III.2 Échantillons «lisiers»). cuve de stockage (4 C) permet l alimentation continue réacteur lisier brut (RLB) digesteur (38 C) anaérobie 120 L temps de séjour : 26,7 j homogénéisation : 10 min/3 heures réacteur lisier digéré (RLdig) réacteur N / DN anaérobie aéré 4-6 h/j 125 L temps de séjour : 27,8 j homogénéisation : continue réacteur lisier sortie (RLsort) Figure 49 : Caractéristiques et points de prélèvement lors de la première expérience en réacteur mésophile. cuve de stockage (4 C) réacteur lisier alimentation réacteur N / DN anaérobie aéré 12h/j 125 L réacteur lisier sortie permet l alimentation continue (alimentation) temps de séjour : 20,8 j homogénéisation : continue (sortie) Figure 50 : Caractéristiques et points de prélèvement lors de la seconde expérience en réacteur mésophile. 172

173 Chapitre 3 : Matériel et Méthode Réacteur 1 (55 C) anaérobie 4 L réacteur lisier sortie stockage (4 C) réacteur lisier alimentation temps de séjour : 15 j inoculum : boues de STEP (R1 sortie) alimentation manuelle quotidienne (alim.) Réacteur 2 (55 C) anaérobie 4 L réacteur lisier sortie temps de séjour : 15 j inoculum : fumier équin (R2 sortie) Figure 51 : Caractéristiques et points de prélèvement lors de la troisième expérience en réacteurs thermophile. II.4. Capteurs passifs Les PCIS (Polar rganic Chemical Integrative Sampler) utilisés pour la calibration en laboratoire ou pour les expositions terrains sont faits au laboratoire. Les différents éléments sont assemblés au laboratoire. Avant le montage, la phase adsorbante (asis HLB) et les membranes en polyéther sulfone sont nettoyées par 3 lavages successifs avec du méthanol. Les membranes sont ensuite mises à sécher dans une étuve pendant 2 heures à 50 C. Le solvant est éliminé de la phase adsorbante lors d une étape de filtration sous vide puis la phase adsorbante est mise à sécher à température ambiante pendant une nuit. Les anneaux, vis et écrous sont lavés manuellement avec du détergent (RBS) puis sont passés au lave-vaisselle. Deux cent milligrammes de phase adsorbante sont ensuite pesés puis emprisonnés entre 2 membranes maintenues par deux anneaux en acier. Chaque PCIS est ensuite individuellement identifié, emballé dans de l aluminium et conservé au congélateur avant d être utilisé dans les jours suivants. II.4.1. Expérience de calibration en laboratoire Préalablement à l expérience de calibration des PCIS en aquarium, un essai sans PCIS a été réalisé dans des conditions similaires afin de s assurer que la concentration des composés dans l eau pouvait être maintenue constante. Cette manipulation permet de vérifier qu il n y a pas de perte (adsorption sur les parois par exemple) ou de gains (pollution par le matériel utilisé par exemple) des composés durant toute la durée de l exposition. Elle a été réalisée sur une sélection réduite de 12 molécules choisies d après le coût des composés (prix des cristaux), leur toxicité et la facilité d analyse. Pour ces raisons, ce ne sont pas forcément les mêmes molécules que celles utilisées dans l expérience de calibration qui ont été retenues mais des molécules ayant des comportements similaires car appartenant à la même famille 173

174 Chapitre 3 : Matériel et Méthode (exemple : lincomycine/clindamycine, roxithromycine/clarithromycine et acide oxolinique /acide pipémidique). Cette expérience ainsi que celle de calibration des PCIS se sont déroulées dans les mêmes conditions. Elles ont utilisé un aquarium de 27 L (dimensions : 30 x 30 x 30 cm) dont l eau a été renouvelée en continu par un apport d eau du robinet (débit 13,5 L/j) et de solution méthanolique de contamination (débit 200 ml/j) et un débordement constant. Le système a été maintenu sous agitation par une pale métallique (80 rpm) (Figure 52). L eau contaminée a été évacuée vers un autre aquarium où elle a été nettoyée par passage sur charbon actif pendant au minimum une semaine avant d être rejetée à l évier. La bouteille contenant la solution de contamination a été remplacée quotidiennement par une nouvelle. Les solutions de contamination, conservées au congélateur, ont été issues de la dilution d une solution mère fortement concentrée (environ 135 µg/l) ayant servi au dopage initial de l aquarium. Le dopage initial a consisté à verser directement 95,2 ml de la solution mère dans l aquarium. Le volume a été défini d après le débit mesuré des pompes péristaltiques (eau et MeH) et la valeur de la concentration finale désirée. La solution mère a été réalisée à partir de la pesée de cristaux de composés purs dilués dans 1 litre de méthanol. Le niveau de contamination visé était compris entre 500 et 1000 ng/l d eau suivant les composés. Pour suivre la contamination de l eau de l aquarium et vérifier la stabilité de sa concentration dans l expérience préliminaire, 200 ml d eau ont été prélevés dans des flacons Nalgene (HDPE) 6h après le dopage initial, puis tous les jours les 4 premiers jours de l expérience et enfin tous les 2 jours jusqu à la fin de l expérimentation. Pour l expérience de calibration des PCIS, afin de s assurer la stabilité du montage (débit stable des pompes péristaltiques, homogénéité de la contamination), le dopage initial a été réalisé trois jours avant l exposition des PCIS puis le système de flux continu a été équilibré pendant 3 jours en renouvelant quotidiennement l eau et la solution de contamination. Comme pour la manipulation préliminaire, le suivi de la concentration de l eau de l aquarium a été assuré par un prélèvement de 200 ml d eau, dans des bouteilles Nalgene (HDPE), tous les jours les 4 premiers jours où sont exposés les PCIS puis tous les 2 jours jusqu à la fin de l expérimentation. Les 12 PCIS exposés ont été retirés progressivement de l aquarium : 3 ont été retirés après 5 et 15 jours d exposition, 2 après 10 et un après 7, 8, 12 et 13 jours (Figure 53). A l exception des trois derniers PCIS, prélevés à T15, qui ont été démontés aussitôt après avoir été sortis de l aquarium, les PCIS sont conservés à -20 C une fois retirés de l eau. Ils ont été ensuite tous démontés dans les 15 jours suivants. Figure 52: Photos du montage ayant servi aux expériences de calibration des PCIS. 174

175 Chapitre 3 : Matériel et Méthode nombre number de PCIS of PCIS collectés collected jours days Figure 53: Prélèvement des PCIS au cours de l expérience de calibration réalisée en laboratoire. II.4.2. Application dans la Garonne Une fois les PCIS calibrés en laboratoire, ces outils ont été déployés pendant 15 jours dans la Garonne en amont et en aval de l agglomération Bordelaise (Figure 54). Trois PCIS ont été posés au niveau de la ville de Cadaujac (amont) et trois autres au niveau du port autonome de Bordeaux (aval) en juin Entre les deux points d échantillonnage, deux stations d épuration, Clos de Hilde d une capacité de et Louis Fargues d une capacité de équivalents habitants, rejettent leurs eaux traitées dans la Garonne. En parallèle des échantillonneurs passifs, des prélèvements ponctuels d eau ont été réalisés au moment du dépôt et du retrait des PCIS dans le but de comparer les résultats obtenus par les deux méthodes. Les PCIS sont montés sur des supports métalliques et sont enfermés dans une cage en acier afin de les protéger et d éviter que les membranes ne se percent. Les cages sont attachées à un point fixe (pilier de ponton, échelle) et immergées à environ 1 m de la surface. Les eaux des prélèvements ponctuels sont collectées aux mêmes endroits que là où les cages ont été fixées et à la même profondeur. Les eaux sont filtrées le jour de leur prélèvement puis sont conservées à -20 C en attendant d être analysées. La phase des PCIS est transférée dans les cartouches en verre le jour où les PCIS sont récupérés. Elle est séchée sous vide puis conservée à -20 C en attendant d en extraire les composés trois jours plus tard. FRANCE Bordeaux rejet de STEP points de prélèvement Figure 54: Localisation des points de prélèvement. II.5. Récapitulatif des projets La Figure 55 synthétise l ensemble des programmes présentés précédemment. Elle permet de visualiser l ensemble des matrices étudiées dans le cadre de ce travail et le nombre de molécules recherchées dans chaque cas. 175

176 Chapitre 3 : Matériel et Méthode matrices lisier DIPERPHA eau souterraine continuum Hérault eau surface PCIS sortie STEP entrée STEP a m o x AMPERES rejets hospitaliers FLASH nb molécules analysées Figure 55 : Schéma récapitulatif de l'ensemble des études réalisées au cours de ces travaux de thèse. Le projet FLASH est celui qui couvre le plus grand nombre de composés analysés. Lui et le «continuum Hérault» ont permi d étudier 5 sortes différentes de matrices aqueuses. Ainsi à l exception des eaux souterraines et des eaux de boisson, l ensemble des matrices aqueuses qu il est possible d étudier a été analysé pour un panel réduit mais représentatif de l ensemble des classes thérapeutiques suivies. Bien que le nombre de molécules recherchées soit moindre, l ANR DIPERPHA a permis d étudier le volet vétérinaire de la contamination de l environnement. Même si cela n est pas clairement mis en évidence sur la Figure 55, une démarche de continuum (le long des filières de traitement complexe) a également été appliquée dans ce cadre là. III. Traitement des échantillons III.1. Échantillons «eau» Tous les échantillons d eau traités au laboratoire subissent le même protocole général : filtration sur filtres en fibre de verre préalablement calcinés à 450 C, extraction de la phase dissoute par SPE, évaporation sous flux d azote et analyse par LC/MS/MS. La filtration permet d enlever les matières en suspension et ainsi de séparer la phase particulaire de la phase dissoute. La SPE permet d extraire sélectivement les composés ciblés de l échantillon. L évaporation permet de concentrer les extraits et ainsi de favoriser la détection des composés. Les phases d extraction et d évaporation des échantillons ont fait l objet de développements spécifiques qui sont détaillés dans la publication : Development of a method for the simultaneous extraction of antibiotics, -blockers, antineoplastics and antivirals by solid-phase extraction followed by liquid chromatography tandem mass spectrometry analysis application to sewage treatment plant effluents. Capdeville M.J., Pardon P., Coquery M., Martin S., Choubert J.M. and Budzinski H. (publication 2). 176

177 Chapitre 3 : Matériel et Méthode L ensemble de la verrerie utilisée pour les étapes de filtration, d extraction et d analyse a été préalablement nettoyé au lave vaisselle avec des détergents adaptés (RBS) puis calciné à 450 C pendant 5 h. Filtration : Pour les échantillons peu chargés en matière en suspension, comme les eaux de surface du continuum agricole du projet FLASH ou les eaux de captage, les eaux sont filtrées directement sur des filtres en fibre de verre d une porosité de 0,7 µm (GF/F). Pour les autres échantillons, les eaux subissent une double filtration. Elles sont filtrées une première fois sur des filtres en fibre de verre d une porosité de 1,6 µm (GF/A) puis le filtrat obtenu est filtré une seconde fois sur des filtres en fibre de verre d une porosité de 0,7 µm (GF/F). La première filtration sur GF/A permet d éviter le colmatage trop rapide des filtres GF/F et ainsi de réduire leur fréquence de changement. La gestion en parallèle de plusieurs échantillons devient alors plus facile et la consommation de filtres, et donc le coût de la filtration, sont réduits. Extraction : Le volume précis d échantillon à extraire est mesuré soit à l éprouvette soit par gravimétrie. Les prises d essais sont indiquées dans le Tableau 48. Dans le cas des méthodes multi-résidus (32 et 78 composés), l extraction par SPE est pratiquée sur des cartouches asis HLB (200 mg, 6 ml). Avant l extraction, le ph des échantillons est ajusté à 7 0,1 à l aide d acide chlorhydrique (0,33 M) ou de soude (1 M). Puis 4,16 ; 8,32 et 12,48 ml d une solution de Na 2 -EDTA (sel de disodium acide éthylènediaminetétraacétique) à 250 mm sont ajoutés respectivement dans des échantillons de 100, 200 et 300 ml pour atteindre une concentration finale à 10 mm/échantillon. La solution d EDTA est préalablement préparée par dissolution de cristaux d EDTA dans de l eau ultra-pure (eau milliq). L EDTA est un chélateur, il empêche les tétracyclines de se fixer sur les groupements silanols des parois des contenants en verre et de former des complexes avec les cations divalents comme le calcium ou le magnésium. L ajout d EDTA provoque une baisse du ph. Ce dernier se retrouve alors compris entre 4 et 5. Il est mesuré mais non remodifié. Les étalons internes sont ensuite ajoutés à chacun des échantillons. Les cartouches sont conditionnées en laissant percoler par gravité 5 ml d acétonitrile (ACN) puis 5 ml d eau minérale naturelle (EMN, Vittel) dont le ph a été ajusté à 7 0,1 de la même façon que pour les échantillons. Les échantillons passent ensuite à travers la phase adsorbante contenue dans la cartouche sous un léger vide. Une fois la totalité de l échantillon percolé, les bouteilles les contenant sont rincées avec 5 ml d EMN à ph 7 et ces 5 ml sont également passés sur les cartouches. Ils permettent de rincer aussi la phase adsorbante. Cette dernière est ensuite laissée à sécher pendant 60 minutes sous vide. Enfin, les composés sont élués avec 5 ml d un mélange EMN ph 7 / ACN, 40/60 (v/v). L eau utilisée pour l élution a été conditionnée en même temps et de la même façon que l eau utilisée pour le conditionnement des cartouches. Tableau 48 : Volumes (ml) des prises d'essai pour les différents projets traités. projet eaux usées brutes eaux usées traitées eau de surface eau de captage (entrée de STEP) (sortie de STEP) "10 effluents STEP" 200 continuum "STEP-surface-captage" "amoxicilline-ampicilline" FLASH

178 Chapitre 3 : Matériel et Méthode Dans le cas de la méthode spécifique pour l amoxicilline et l ampicilline, l extraction par SPE est pratiquée sur des cartouches asis MCX (60 mg, 3 ml). Avant l extraction, le ph des échantillons est ajusté à 3 0,1 à l aide d acide chlorhydrique. Puis 4,16 ml d une solution de Na 2 -EDTA à 250 mm sont ajoutés aux 100 ml d échantillon pour atteindre une concentration finale à 10 mm/échantillon. L EDTA empêche les ions métalliques de catalyser la réaction de dégradation du cycle -lactame. L ajout d EDTA ne modifie pas le ph. La suite de la méthode est identique à celle utilisée pour les analyses multi-résidus, seul le ph de l eau minérale naturelle change et est stabilisé à 3 au lieu de 7 par ajout d acide chlorhydrique (0,33 M). Le protocole permettant l analyse des molécules pharmaceutiques appartenant aux classes thérapeutiques des AINS, antiépileptiques et anti-dépresseurs, hypolipémiants, stimulants et bronchodilatateurs, utilisé dans le cadre du projet FLASH, est décrit dans la publication de Togola et Budzinski (2008). Brièvement, le ph des échantillons est ajusté à 2 puis l extraction par SPE est pratiquée à l aide de cartouches asis MCX (60 mg, 3 ml) et les composés sont élués avec 3 ml d éthyl acétate puis 3 ml d éthyl acétate/acétone (50/50; v/v) et enfin 3 ml d éthyl acétate/acétone/ hydroxide d ammonium (48/48/2; v/v/v). Evaporation : Quelque soit la méthodologie extractive appliquée, l étape d évaporation est pratiquée de la même façon. Les extraits obtenus par SPE sont évaporés le jour même ou au plus tard 72h après l extraction en ayant été conservés au congélateur à -20 C. L évaporation se fait sous flux d azote à une température de 40 C. Il est impératif de ne pas évaporer la totalité de l échantillon au moment de cette étape sous peine de perdre les fluoroquinolones et quinolones. Les quelques microlitres restants sont ensuite transférés dans un insert en verre de 300 µl placé dans un flacon d injection. Le flacon initial ayant contenu l extrait est alors rincé successivement 3 fois à l acétonitrile et ces rinçages sont également transférés dans l insert avec l échantillon. Les extraits reconcentrés peuvent ainsi rester quelques jours au congélateur avant d être analysés (maximum 15 jours). L élution des cartouches SPE étant pratiquée avec un mélange de solvant contenant de l eau, l EDTA retenu par la phase est entrainé lors de l élution et se retrouve dans l extrait. Comme, au cours de l étape d évaporation, la totalité de l extrait n est pas évaporé, il y a toujours de l EDTA dans les quelques microlitres restant. Par conséquent, ce dernier est également transféré dans l insert de 300 µl prévenant ainsi l adsorption des tétracyclines sur les parois en verre de l insert. Une deuxième évaporation est pratiquée dans les mêmes conditions, juste avant l analyse. Les résidus sont ensuite dissous dans un mélange eau ultra-pure milliq / acétonitrile 90/10 (v/v). Le volume de ce mélange ajouté aux échantillons dépend de la nature des échantillons et du facteur de concentration désiré, par exemple 50 µl sont ajoutés pour les dosages d eau de captage alors que 100 µl et 200 µl sont ajoutés respectivement pour les sorties et les entrées de STEP. III.2. Échantillons «lisiers» Quelle que soit l origine des échantillons (élevage ou réacteur), ils sont traités de la même façon. Ils sont centrifugés une première fois pendant 20 minutes à 4 C et à rotations par minute. Le culot de centrifugation est récupéré. Le surnageant est centrifugé une deuxième fois dans les mêmes conditions. Le nouveau culot de centrifugation obtenu est ajouté au premier. Ils sont conservés dans une barquette en aluminium au congélateur à -20 C en attendant d être lyophilisés puis conservés à température ambiante. Le surnageant est 178

179 Chapitre 3 : Matériel et Méthode ensuite filtré une première fois sur des filtres en fibre de verre d une porosité de 1,6 µm (GF/A) puis le filtrat obtenu est filtré une seconde fois sur des filtres en fibre de verre d une porosité de 0,7 µm (GF/F). Les filtres recouverts des particules sont conservés dans des barquettes en aluminium au congélateur à -20 C en attendant d être lyophilisés. La phase dissoute est conservée dans des flacons Nalgene (HDPE) au congélateur à -20 C. Traitement de la phase dissoute : Les extractions de la phase dissoute des lisiers sont réalisées par SPE de façon très similaire à celle pratiquée pour les analyses multi-résidus des eaux. La prise d essai est de 30 ml et est mesurée par gravimétrie. Le ph des échantillons est ajusté à 7 à l'aide d'acide chlorhydrique et de soude. Environ 2,1 ml d'une solution concentrée de Na 2 -EDTA sont ajoutés à chacun des échantillons afin d'avoir une concentration finale de 10 mm. L ajout d EDTA n entraîne pas de modification du ph des lisiers en raison de leur forte teneur en ammoniaque. Plusieurs dizaines de microlitres d'une solution mélange d'étalon interne sont ajoutés aux échantillons. Préalablement au passage des échantillons sur les cartouches, ces dernières sont conditionnées successivement avec 5 ml d'acétonitrile puis 5 ml d'eau minérale naturelle à ph 7. Une fois les échantillons passés, 5 ml d'eau Vittel à ph 7 sont versés dans les bouteilles ayant contenu les échantillons puis passés sur les cartouches dans le double but de rincer à la fois les bouteilles et les cartouches. Celles-ci sont ensuite séchées 1 heure sous vide. Enfin l'élution est pratiquée avec 5 ml d'un mélange eau Vittel ph 7 et acétonitrile à 40/60 en volume. Les extraits sont ensuite évaporés une première fois au Rapidvap (40 C, 100 mbar) pendant 3 heures dans le but de les concentrer, puis une deuxième fois sous flux d'azote pour changer de solvant. Les résidus finaux sont repris dans 300 µl d'un mélange 90/10 eau pure milliq / ACN (v/v). Traitement de la phase solide : Une fois les culots de centrifugation lyophilisés, les antibiotiques en sont extraits par ASE (Accelerated Solvant Extraction). Ainsi, 0,2 g de matrice sont disposés dans une cellule ASE de 11 ml. Les étalons internes sont ajoutés dans la cellule. Dans la cellule, la matrice est entourée de billes de verre recouvertes de Na 2 -EDTA. L EDTA permet d optimiser l extraction des tétracyclines. Les conditions d extraction sont indiquées dans le Tableau 49. Le solvant d extraction est constitué d un mélange d eau ultra-pure (milliq) et d acétonitrile (30/70, v/v). Les extraits obtenus sont ensuite évaporés au Rapidvap à 40 C et 300 mbar pendant 30 minutes puis à 40 C et 220 mbar pendant 40 minutes et enfin à 40 C et 200 mbar jusqu à ce qu il reste moins de 5 ml d eau dans les flacons. Trente millilitres d eau minérale naturelle dont le ph a été fixé à 7 sont ensuite ajoutés à chaque extrait de façon à diluer totalement les quelques gouttes d acétonitrile qui resteraient. Ces extraits sont ensuite purifiés par SPE puis reconcentrés en suivant le même protocole que celui décrit pour la phase dissoute. Tableau 49 : Conditions d'extraction de la phase solide des lisiers porcins par ASE. paramètres ASE protocole preheat (min) 5 heat (min) 5 static (min) 5 flush (%) 80 purge (sec) 60 nombre de cycles 3 pression (bar) 100 température ( C) 70 solvant 30/70 eau/acn (v/v) 179

180 particule solide particule solide particule solide particule solide particule solide particule solide particule solide teneur (%) Chapitre 3 : Matériel et Méthode Un test d extraction et d analyse de la phase particulaire a montré qu elle était qualitativement et quantitativement contaminée de la même façon que la phase solide (culot de centrifugation). Les mêmes antibiotiques sont retrouvés dans les mêmes proportions (Figure 56). Par conséquent, il a été choisi de ne pas analyser la phase particulaire et d extrapoler les dosages de la phase solide à la phase particulaire pour connaître la contamination totale d un échantillon de lisier. Cette extrapolation permet d économiser le temps et le coût de traitement d un échantillon pour un même point de prélèvements. 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% monensine sulfadiazine oxytétracycline tétracycline marbofloxacine lincomycine tylosine LS LS LS Ls BA BE Lag Figure 56 : Comparaison de la composition et des teneurs en antibiotiques de la phase particulaire et de la phase solide de mêmes échantillons de lisier (LS1 : lisier stocké site simple 1, LS2 : lisier stocké site simple 2, LS3 : lisier stocké site simple 3, Ls5 : lisier stocké site complexe 5, BA5 : bassin d aération site complexe 5, BE5 : bassin de décantation site complexe 5, Lag5 : lagune site complexe 5). III.3. Échantillons «PCIS» Les PCIS ayant servi aux calibrations en laboratoire n ont été en contact qu avec de l eau du robinet et aucun nettoyage préliminaire n est nécessaire. En revanche, sur les PCIS exposés dans le milieu naturel, du biofouling a eu le temps de se former à la surface des membranes et un nettoyage à l eau osmosée est nécessaire. Une fois nettoyés, les PCIS exposés dans l environnement et les PCIS de calibration sont traités de la même façon. Les PCIS sont démontés et les membranes sont rincées avec 5 ml d eau minérale naturelle (ph non fixé, proche de 7) de façon à décoller la phase adsorbante. Celle-ci est récupérée dans des cartouches en verre dont le fond a été recouvert préalablement par un fritté en Téflon. Un nouveau fritté en Téflon est déposé au-dessus de la phase. La phase est ensuite séchée sous vide puis les cartouches, étiquetées et emballées individuellement dans une feuille d aluminium, sont conservées dans une bouteille contenant du desséchant (billes de silice) et placées au congélateur. Avant d éluer les composés adsorbés sur la phase, les cartouches sont mises à décongeler pendant une nuit et la masse de phase exacte contenue dans chacune d elle est déterminée par pesée différentielle entre la cartouche pleine et la cartouche vide, préalablement étiquetée et pesée avec les deux frittés. Les étalons internes sont ajoutés dans les flacons de récupération des éluats. La phase adsorbante est éluée avec 20 ml de méthanol. Les extraits sont ensuite reconcentrés au Rapidvap à 60 C et 550 mbar pendant 30 min. Quand il reste environ 1 ml dans chaque flacon, 1 ml d eau milliq contenant 5 mm de Na 2 - EDTA est ajouté. L évaporation est ensuite prolongée pendant 10 minutes à 60 C et 250 mbar 180

181 Chapitre 3 : Matériel et Méthode puis à 150 mbar jusqu à ce qu il ne reste que quelques microlitres. Comme pour les extraits de SPE, les résidus sont transférés dans un insert en verre de 300 µl placé dans un flacon d injection. Le flacon initial ayant contenu l extrait est alors rincé successivement 3 fois à l acétonitrile et ces rinçages sont également transférés dans l insert avec l échantillon. Une deuxième évaporation est pratiquée sous flux d azote à 40 C juste avant l analyse et les résidus sont dissouts dans 300 µl et 100 µl d un mélange eau pure milliq / acétonitrile 90/10 (v/v) respectivement pour les extraits des PCIS de calibration et pour les extraits de PCIS exposés dans le milieu naturel. 181

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183 CHAPITRE 4 Développements analytiques 183

184 184

185 Chapitre 4 : Développements analytiques Chapitre 4 : Développements analytiques I. DEVELPPEMENT DES METHDES D ANALYSE PAR CHRMATGRAPHIE EN PHASE LIQUIDE CUPLEE A LA SPECTRMETRIE DE MASSE EN TANDEM (LC/MS/MS) I.1. Développement de la méthode d analyse pour 32 molécules pharmaceutiques I.2. Extension de la méthode d analyse à 78 molécules pharmaceutiques I.3. Méthode spécifique à l amoxicilline et à l ampicilline I.4. Bilan méthodes analytiques I.4.1. Mode d'ionisation positif (ESI+) I.4.2. Mode d'ionisation négatif (ESI-) I.5. Validation des protocoles II. DEVELPPEMENT DU PRTCLE D EXTRACTIN DES CMPSES CNTENUS DANS LA PHASE LIQUIDE DES ECHANTILLNS PAR SPE II.1. Les échantillons d eau II.2. Le cas particulier de l amoxicilline et de l ampicilline II.3. Les échantillons de lisiers II.4. Bilan protocole extraction phase dissoute III. DEVELPPEMENT DU PRTCLE D EXTRACTIN DES CMPSES CNTENUS DANS LA PHASE SLIDE DES ECHANTILLNS PAR ASE III.1. Développement du protocole III.2. Bilan protocole extraction phase solide IV. CNTRLE QUALITE ET QUANTIFICATIN IV.1. Contrôle qualité IV.2. Méthodes de quantification IV.2.1. Etalonnage externe IV.2.2. Etalonnage interne Dans le cadre d analyses chimiques quantitatives de micropolluants organiques dans des échantillons environnementaux, la méthodologie classiquement appliquée est divisée en trois phases majeures : le prélèvement de l échantillon, l extraction et la concentration des composés d intérêt et l analyse finale. Les développements analytiques regroupent les développements des phases d extraction, de concentration et d analyse. Ils se font par étapes. La première étape consiste à sélectionner les outils qui seront utilisés en s appuyant sur la littérature scientifique. La deuxième étape consiste à les adapter aux exigences imposées par les propriétés physico-chimiques des analytes (hydrophile/lipophile, acide/basique/neutre), la nature des échantillons (matrice plus ou moins complexe, riche en matière organique), la quantité d échantillons à traiter et la sensibilité souhaitée. La troisième étape consiste à valider le protocole développé selon différents critères de qualité. Les différentes étapes du développement de chacune des 3 phases (extraction, analyse, validation) sont présentées dans les paragraphes suivants. 185

186 Chapitre 4 : Développements analytiques I. Développement des méthodes d analyse par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC/MS/MS) Un des objectifs de ces travaux de thèse a été de mettre au point des protocoles qui permettent de doser des molécules pharmaceutiques, non encore analysées au laboratoire, dans différents types d échantillons aqueux. Pour atteindre cet objectif le premier point a été de choisir les molécules pharmaceutiques étudiées (cf. Chapitre 2). En se basant sur des données de consommation (rapport AFSSAPS et AFSSA, données ESAC et IMS Health, rapport de Besse et Garric, 2007), de toxicité (effet secondaire des médicaments), d écotoxicité (Holten Lützhøft et al., 1999 ; Halling-Sørensen et al., 2000 ; Huggett et al., 2002 ; Ferrari et al., 2004 ; Fent et al., 2006 ; Jjemba, 2006), de présence dans l environnement (Ternes, 1998 ; Daughton et Ternes, 1999 ; Hirsch et al., 1999 ; Sacher et al., 2001 ; Kolpin et al., 2002 ; Boxall, 2004 ; Algros et Jourdain, 2007) et d innovation, 5 classes thérapeutiques ont été retenues : les antibiotiques, les -bloquants, les anticancéreux, les anti-vih et les inhibiteurs de phosphodiestérase de type 5. La disponibilité et le coût des composés standards de référence ont ensuite été pris en compte pour aboutir à une première liste de 32 puis ultérieurement à une seconde liste de 78 molécules à étudier au sein de ces classes. Une fois les molécules sélectionnées, la technique analytique a pu être choisie. Le choix de la chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem comme instrument d analyse s est appuyé sur la littérature scientifique (Hirsch et al., 1998 ; Sacher et al., 2001 ; Petrovic et al., 2005 ; Gomez et al., 2006 ; Gros et al., 2006 ; Hao et al., 2006 ; Vieno et al., 2006 ; Kasprzyk-Hordern et al., 2007). La chaine chromatographique utilisée est une chaîne Rapid Resolution 1200 de chez Agilent. Comme l'uplc (Ultra Performance Liquid Chromatography), cette chaîne fait partie de la nouvelle génération des chaînes chromatographiques. Elle supporte des pressions plus élevées, jusqu'à 600 bars, ce qui permet de travailler avec des colonnes plus petites (diamètre et longueur) remplies de phase stationnaire très fine (1,8 µm). De par leurs caractéristiques, ces colonnes permettent de réduire le temps d'analyse et la consommation de solvant et d'améliorer la résolution des pics chromatographiques. La RRLC (Rapid Resolution Liquid Chromatography) est donc plus avantageuse que l HPLC classique. L étape de chromatographie permet de séparer les différentes molécules entre elles et de les séparer des éléments constitutifs de la matrice (Figure 57a). En sortie de colonne chromatographique, une fois séparées, les molécules sont dirigées vers la source d ionisation. La source d'ionisation est une source électrospray (ESI) qui permet l'ionisation à pression atmosphérique d'une large gamme de molécules. Les ions formés dans la source sont entrainés vers le spectromètre de masse. Le spectromètre de masse est le triple quadrupôle 6410A de chez Agilent. La spectrométrie de masse en tandem est plus sélective que la spectrométrie simple masse c'est pourquoi elle a été choisie. Par ailleurs, la combinaison triple quadrupôle (QqQ) est plus sensible et l'appareillage est moins coûteux que des technologies hybrides comme le quadrupôle- temps de vol (Q TF) (López-Roldán et al., 2010), c'est pourquoi elle a été préférée dans le cas d'analyse de contaminants organiques présents à l'état de traces. Le premier quadrupôle ne laisse passer que les ions précurseurs définis pour chaque molécule. Les ions arrivent ensuite dans la cellule de collision où ils sont dissociés par suite de collision avec des molécules de gaz. Les fragments obtenus sont alors dirigés vers le deuxième quadrupôle qui ne laisse passer sélectivement que les ions produits définis pour chaque molécule (Figure 57b). Ainsi chaque composé est suivi par une ou 186

187 Chapitre 4 : Développements analytiques plusieurs transitions "ion précurseur ion produit". En mode MRM (Multiple Reaction Monitoring), les transitions sont balayées les unes après les autres de façon cyclique tout au long de l analyse. séparation détection (http://www.waters.com) (http://www.chem.agilent.com) (a) (b) Figure 57 : Schéma explicant le principe de l analyse par chromatographie en phase liquide couplé à un spectromètre de masse en tandem comportant 2 quadrupôles et fonctionnant en mode MRM (Multi- Reaction Monitoring). Une fois l outil et les analytes sélectionnés, plusieurs méthodes ont pu être développées. I.1. Développement de la méthode d analyse pour 32 molécules pharmaceutiques phases mobiles source électrospray octopôle (guide les ions) 1 er quadrupôle 2 ème quadrupôle capillaire lentilles hexapôle cellule de collision détecteur phase stationnaire Figure 58 : Localisation des différentes parties du LC/MS/MS correspondant aux paramètres à optimiser. (1 er quadrupôle ion précurseur, 2 ème quadrupôle ions produits, capillaire énergie du capillaire et du fragmentor, héxapôle cellule de collision énergie de collision, source électrospray température et débit du gaz séchant et pression du gaz de nébulisation). Le développement de la méthode d analyse a été la première étape dans l élaboration d un protocole permettant l étude de molécules pharmaceutiques dans l environnement. Initialement, le développement a été réalisé pour la sélection des 32 molécules réparties en 23 antibiotiques, 5 anticancéreux, 2 -bloquants et 2 anti-vih. La partie analytique a été optimisée à partir de solutions individuelles préparées avec les cristaux des composés de référence. L optimisation consistait d une part à sélectionner les paramètres de masse de 187

188 Chapitre 4 : Développements analytiques chaque molécule afin de les détecter (ion précurseur, ions produits, énergie du capillaire et du fragmentor, énergie de collision, température et débit du gaz séchant, pression du gaz de nébulisation) et d autre part à choisir les phases mobiles (solvants et additifs tels que des sels ou des acides) et la phase stationnaire (dimension et type de greffage de la colonne) afin de les séparer. Les différentes parties de l appareil correspondant aux paramètres à optimiser sont visibles sur la Figure 58. La partie spectrométrique a été développée en premier. Les molécules ont été injectées individuellement dans des mélanges de solvants (eau/acn ou eau/meh, 50/50) de façon à identifier le mode d ionisation (positif : ESI+ ou négatif : ESI-), l ion précurseur et les meilleures conditions pour l obtenir (mode d ionisation, solvant, énergie du capillaire et du fragmentor). Sur les 32 molécules, 27 sont analysées en mode positif et 5 en mode négatif. L ion précurseur s est révélé être l ion pseudo-moléculaire pour la totalité de ces 32 composés ([M + H] + en ESI+ et [M H] - en ESI-). Le méthanol permettait d améliorer l ionisation de certaines molécules mais la méthanolyse non reproductible des pénicillines a orienté la sélection du solvant organique vers l acétonitrile. De plus, la viscosité du mélange eau/acn est inférieure à celle du mélange eau/meh ce qui permet de réduire les problèmes de pression qui sont fréquents en chromatographie en phase liquide. Les ions produits ont ensuite été sélectionnés pour chaque composé ainsi que les conditions pour les obtenir (énergie de collision). Une fois les ions précurseurs et les ions produits identifiés, les 2 transitions MRM les plus intenses ont été choisies comme transition de quantification et de confirmation. Ces transitions MRM ont ensuite été comparées avec celles des autres méthodes publiées dans des articles scientifiques. Au moins une des 2 transitions sélectionnées dans ces travaux est la même que celles publiées dans ces articles (Castiglioni et al., 2005 ; Gomez et al., 2006 ; Gros et al., 2006 ; Vieno et al., 2006). Cependant, dans la méthode développée ici comme dans celle proposée par Gros et al. (2006), le sulfaméthoxazole est ionisé en mode positif alors que pour Castiglioni et al. (2005) cette molécule est ionisée en mode négatif. De la même façon, hormis l amoxicilline et l ampicilline, les molécules de la famille des pénicillines sont ionisées en mode négatif dans ces travaux alors qu elles sont ionisées en mode positif pour Sacher et al. (2001). Les méthodes chromatographiques ont ensuite été développées. La chaine chromatographique employée est une chaine RRLC. La RRLC supporte des pressions plus élevées qu une chaine HPLC classique ce qui permet de réduire la taille de la colonne et le diamètre des particules tout en diminuant le temps d analyse et en augmentant la résolution. D après la littérature, la phase stationnaire classiquement employée pour analyser les molécules pharmaceutiques est une phase C 18. C est ainsi qu une colonne Zorbax-SB C 18 avec des particules de 1,8 µm et une longueur de 5 cm a été choisie. Une fois la colonne sélectionnée, des acides (acide formique HCH et acide acétique CH 3 CH), à différentes proportions, ont été ajoutés aux phases mobiles dans le but d améliorer l ionisation de certains composés et surtout d optimiser la séparation, la résolution et la stabilité. En mode positif, il a été testé l ajout de 0,1 % d acide acétique, 0,3 % d acide formique et 2,5 % d acide acétique. Les 2 dernières conditions stabilisent le ph de la phase mobile aqueuse à une même valeur de 2 et permettent de distinguer l impact du ph de l impact de l acide testé sur la résolution et l intensité des pics chromatographiques. De façon à réduire la largeur des pics des tétracyclines, des quinolones et des fluoroquinolones sans pour autant perdre en sensibilité, il s avère nécessaire d ajouter 0,3 % d acide formique dans chacun des solvants constituant les phases (Figure 59). En mode négatif, les 3 mêmes conditions plus une condition sans acide ont été testées. En l absence d acide les intensités sont meilleures (Figure 60) mais les temps de rétention varient et les pics chromatographiques se déforment au cours d une séquence d analyse (Figure 61). Aussi, 188

189 abondance abondance abondance abondance abondance abondance abondance Chapitre 4 : Développements analytiques bien que l intensité soit un peu plus faible, il a été choisi d ajouter 0,1% d acide acétique à chacune des deux phases mobiles de façon à corriger ces problèmes. Finalement les gradients et les débits des solvants ont été optimisés de façon à maximiser la séparation des composés et à minimiser la durée de l analyse. Enfin les paramètres de température et de débit du gaz séchant ainsi que la pression du gaz de nébulisation ont été réglés chromatogramme ESI+ phases mobiles + 0,1% CH3CH oxytc acide oxolinique chromatogramme ESI+ phases mobiles + 0,3% HCH oxytc acide oxolinique chromatogramme ESI+ phases mobiles + 2,5% CH3CH oxytc acide oxolinique temps (minutes) 0 (a) 4 5 temps (minutes) (b) Figure 59 : Chromatogrammes obtenus pour les 27 molécules ionisées en ESI+ en fonction de la constitution des phases mobiles, (a) eau/acn + 0,1 % CH 3 CH dans chaque solvant, (b) eau/acn + 0,3 % HCH dans chaque solvant, (c) eau/acn + 2,5 % CH 3 CH dans chaque solvant. Exemple de l acide oxolinique en rouge et de l oxytétracycline (oxytc) en bleu temps (minutes) (c) chromatogramme ESI- phases mobiles sans acide chromatogramme ESI- phases temps mobiles (minutes) avec 0,3% HCH 2 1,8 1,6 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0, temps (minutes) (a) chromatogramme ESI- phases mobiles avec 0,1% CH3CH 5 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0, chromatogramme ESI- phases temps mobiles (minutes) avec 2,5% CH3CH 0,45 0,4 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0, temps (minutes) (c) Figure 60 : Chromatogrammes obtenus pour les 5 molécules ionisées en ESI- en fonction de la constitution des phases mobiles (abondance normalisée par la quantité injectée), (a) eau/acn sans acide, (b) eau/acn + 0,1 % CH 3 CH dans chaque solvant, (c) eau/acn + 0,3 % HCH dans chaque solvant, (d) eau/acn + 2,5 % CH 3 CH dans chaque solvant. (b) (d) 189

190 Chapitre 4 : Développements analytiques (a) (b) Figure 61 : Chromatogrammes d analyses successives de pénicilline G sans acide dans la phase mobile (a) et avec 0,1 % d acide acétique dans chaque solvant de la phase mobile (b). Le protocole a ensuite été validé à travers l évaluation de paramètres tels que les limites instrumentales de détection (IDL) et de quantification (IQL), les limites méthodologiques de détection (MDL), la linéarité, la précision et la justesse. La définition de ces paramètres ainsi que leur mode de calcul sont décrits dans la partie I.5 Validation des protocoles. Les valeurs de ces paramètres pour chacun des composés sont détaillées dans l article «Development of a method for the simultaneous extraction of antibiotics, -blockers, antineoplastics and antivirals by solid phase extraction followed by liquid chromatography tandem mass spectrometry analysis application to sewage treatment plant effluents» (publication 2). Brièvement, les IDLs varient entre 2 pg injectés pour la pénicilline G ou la pénicilline V et 28 pg injectés pour l épirubicine. Les IQLs varient entre 3 pg injectés pour la lincomycine et 138 pg injectés pour l épirubicine. Les MDLs ont été déterminées à partir de l extraction et l analyse d eau minérale enrichie à différentes concentrations (5, 10 20, 50 et 100 ng/l) avec les composés d intérêt. Elles varient entre moins de 5 ng/l pour les antibiotiques de la famille des sulfonamides ou les -bloquants et 100 ng/l pour les antibiotiques de la famille des céphalosporines ou des pénicillines analysées en mode positif (amoxicilline et ampicilline). A l exception de ces -lactames, d après les MDLs, le protocole est donc adapté à des études de traces au niveau environnemental. Entre 60 et 3000 pg injectés, la linéarité est bonne (R² > 0,998) pour 25 des 32 composés étudiés. Pour les 7 composés restant, des gammes plus petites de concentration sont utilisées. La précision est évaluée au travers des variations intraet inter-jour. Les variations intra-jours moyennes sont inférieures à 15 % et les variations inter-jours moyennes sont de 24 % en ESI+ et de 19 % ESI-. Ces variations sont suffisamment faibles pour que le protocole soit considéré comme précis. Enfin, la justesse moyenne de la méthode est de 97 %, elle varie entre 81 ± 14 % pour la ciprofloxacine et 144 ± 27 % pour l oxacilline. En plus d être précise, la méthode est donc juste. En conséquent, elle est valide pour permettre des analyses de molécules pharmaceutiques présentes à l état de traces dans des matrices environnementales. En plus des paramètres de validation, les effets matriciels ont été évalués au cours de ces phases de développement (cf. I.5 Validation des protocoles). De façon synthétique, 3 190

191 Chapitre 4 : Développements analytiques phénomènes résultant de la présence de matière organique et d interférents ont été observés : i) le décalage des temps de rétention des antibiotiques de la famille des macrolides (érythromycine, clarithromycine et roxithromycine) dans les eaux usées brutes en entrée de STEP ; ii) la diminution ou l extinction du signal chromatographique d anticancéreux appartenant à la famille des anthracyclines et d antibiotiques appartenant aux familles des quinolones et fluoroquinolones ou des sulfonamides par exemple; et iii) l augmentation du signal chromatographique pour les macrolides et lincosamides par exemple. Les détails des résultats obtenus sont présentés dans l article «Development of a method for the simultaneous extraction of antibiotics, -blockers, antineoplastics and antivirals by solid phase extraction followed by liquid chromatography tandem mass spectrometry analysis application to sewage treatment plant effluents» (publication 2). I.2. Extension de la méthode d analyse à 78 molécules pharmaceutiques Dans le but d augmenter le nombre de molécules pharmaceutiques analysées dans chacune des classes thérapeutiques étudiées, la liste des molécules sélectionnées a été agrandie et étendue à 78 composés. L ajout de ces nouveaux composés a alors nécessité une modification du protocole analytique. Comme pour la précédente sélection, la partie spectrométrique a été optimisée en premier à partir de solutions individuelles préparées avec les cristaux des composés de référence. Cette optimisation a conduit à sélectionner les paramètres de masse individuels des nouvelles molécules (ion précurseur, ions produits, énergie du fragmentor et énergie de collision) et à vérifier que les conditions spectrométriques communes leur correspondaient (énergie du capillaire, température et débit du gaz séchant, pression du gaz de nébulisation). Comme précédemment, les molécules ont été injectées individuellement en ESI+ et en ESI- dans les mélanges de solvants constituant les phases mobiles (eau/acn + 0,3 % HCH dans chaque solvant en ESI+ et eau/acn + 0,1 % CH 3 CH dans chacun des solvants en ESI-) pour identifier l ion précurseur et les meilleures conditions pour l obtenir (mode d ionisation, énergies du capillaire et du fragmentor). Sur l ensemble des 78 molécules, l ion précurseur s est révélé être majoritairement l ion pseudo-moléculaire portant une ou deux charges. Seul le docétaxel et le stavudine font exception avec des ions précurseurs qui correspondent à des ions issus de la fragmentaion de leurs ions pseudo-moléculaires (Corona et al., 2011 ; Huang et al., 2004). Au final, 66 et 12 molécules sont analysées respectivement en mode positif et négatif. Les ions produits puis les 2 transitions MRM donnant les signaux les plus intenses ont ensuite été choisis. Au moins une des 2 transitions sélectionnées sont en adéquation avec celles établies par Sacher et al. (2001), Castiglioni et al. (2005), Gomez et al. (2006), Gros et al. (2006) et Vieno et al. (2006). Néanmoins, dans ces travaux se sont les ions doublement chargés ([M + 2H] 2+ ) qui ont été choisis comme ions précurseurs pour l azithromycine et la spiramycine par exemple alors que pour Gros et al. (2006) ou pour Sacher et al. (2001) et Castiglioni et al. (2005), ce sont les ions moléculaires portant une seule charge qui ont été retenus (([M + H] + ). Par conséquent, les transitions MRM de ces composés ne sont pas les mêmes entre ces travaux et les articles publiés. Concernant le développement de la partie chromatographique, en ESI +, au vu du plus grand nombre de composés à séparer (66), la dimension de la colonne a été changée. Une colonne plus longue, de 10 cm, a alors été choisie mais la phase stationnaire est restée une phase C 18 avec des particules de 1,8 µm de diamètre. L augmentation de la longueur de la colonne, 191

192 Chapitre 4 : Développements analytiques passant de 5 à 10 cm, a demandé des ajustements au niveau du débit de la phase mobile et au niveau du gradient chromatographique mais la constitution des phases mobiles n a pas été modifiée. De même, les paramètres de température et de débit du gaz séchant ainsi que la pression du gaz de nébulisation n ont pas été modifiés. En ESI-, aucun changement n a été opéré sur les caractéristiques de la colonne. Les chromatogrammes obtenus sont présentés Figure 62 et Figure 63. Figure 62: Chromatogramme des 66 composés pharmaceutiques analysés en ESI +. Figure 63: Chromatogramme d une solution standard analysée en ESI -. L ensemble de ces développements sont repris dans l article intitulé «Multi-residus simultaneous analysis of 78 pharmaceutical compounds in aqueous samples: development and application» (publication 3). Comme pour l analyse des 32 composés, le protocole a ensuite été validé à travers l évaluation de paramètres tels que les limites instrumentales de détection, les limites 192

193 abondance Chapitre 4 : Développements analytiques méthodologiques de détection et de quantification, la précision (variation intra- et inter-jours) et la justesse. La définition de ces paramètres, leur mode de calcul et leurs valeurs pour chacun des 78 composés sont détaillées dans la partie I.5 Validation des protocoles. I.3. Méthode spécifique à l amoxicilline et à l ampicilline Le développement d une méthode analytique spécifique pour l amoxicilline et l ampicilline a été décidé en raison des difficultés à doser correctement ces 2 molécules avec les protocoles multi-résidus et en raison de l importance de l amoxicilline d après les données de consommation et de toxicité. Ce nouveau protocole est basé sur le protocole de routine d analyse des 32 molécules pharmaceutiques. Les transitions MRM et les énergies appliquées, le type de colonne et les phases mobiles sont restées les mêmes. Seuls le gradient et la proportion initiale des solvants des phases mobiles ont été modifiés de façon à réduire le temps total d analyse et à retarder l élution de l amoxicilline qui sortait à la limite du volume mort avec la méthode précédente. La nouvelle méthode d analyse dure ainsi 10 minutes contre 21 minutes avec le gradient précédent (Figure 64). Pour parfaire la validation, les limites instrumentales et méthodologiques de détection et de quantification, la linéarité, la répétabilité et la justesse ont été évaluées (Tableau 50). Comparativement aux méthodes multi-résidus (32 et 78 molécules), les IDLs des 2 pénicillines sont équivalentes ou moins bonnes avec la nouvelle méthode d'analyse. Néanmoins, elles sont suffisantes pour les futures analyses environnementales. En revanche, les limites méthodologiques (MDL et MQL) sont nettement meilleures avec la nouvelle méthodologie grâce à l'optimisation de l'étape de SPE (cf. II.2 Le cas particulier de l amoxicilline et de l ampicilline). De la même façon qu avec les autres méthodes multirésidus, les réponses de l'amoxicilline et de l'ampicilline sont parfaitement linéaires. Entre 15 et 1200 pg injectés, leurs coefficients de régression linéaire sont supérieurs à 0,999. De même, la répétabilité et la justesse de quantification, évaluée par étalonnage externe ou interne, sont bonnes avec des écart-type faibles. La répétabilité est supérieure à 90 % avec une variation intra-jour inférieure à 10 % et la justesse est comprise entre 80 % et 130 % ampicilline amoxicilline temps (minutes) Figure 64 : Chromatogramme de l'amoxicilline et de l'ampicilline ainsi que des 3 autres -lactames analysés en ESI+. 193

194 Chapitre 4 : Développements analytiques Tableau 50 : Valeurs des paramètres de validation du protocole analytique spécifique au dosage de l'amoxicilline et de l'ampicilline. linéarité R 2 répétabilité justesse (%) (n=3) IDL / IQL MDL / MQL ( pg (variation étalonnage étalonnage (pg injectés) (ng/l) injectés) intra-jour, %) externe interne amoxicilline 10 / / 120 0, ampicilline 3 / 9 10 / 35 0, I.4. Bilan méthodes analytiques Les différentes méthodes d'analyses sont détaillées dans les paragraphes suivants, elles sont regroupées en fonction du mode d'ionisation. I.4.1. Mode d'ionisation positif (ESI+) Plusieurs méthodes d'analyse en ESI+ ont été développées et améliorées au cours de ces travaux. La première méthode permet l'analyse de 27 molécules pharmaceutiques (issues de la sélection des 32 premières molécules), plus les étalons internes qui leur sont associées, en 21 minutes. La deuxième méthode permet l'analyse de 85 composés dont 19 étalons internes, soit 66 composés natifs issus de la seconde sélection (78 composés), en 50 minutes. La troisième méthode est spécifique au projet DIPERPHA. Elle permet l'analyse de 21 antibiotiques natifs et de 13 étalons internes. Elle est basée sur la première méthode. Enfin la dernière méthode est spécifique à l'amoxicilline et à l'ampicilline mais les autres -lactames ionisés en mode positif peuvent aussi être analysés par cette méthode. Elle dure 10 minutes. Toutes ces méthodes partagent certains points communs comme la constitution de la phase mobile, le volume d injection, le type de phase de la colonne (phase stationnaire) ou le voltage du capillaire dans la source d'ionisation. En revanche d'autres paramètres comme les dimensions de la colonne, le débit ou le gradient chromatographique sont différents. L'ensemble des paramètres communs à tous les composés analysés dans chacune des méthodes est résumé dans le Tableau 51. Les composés sont analysés en mode MRM (Multi-Reaction Monitoring) c'est-à-dire que les transitions définies sont balayées les unes après les autres de façon cyclique tout au long de l analyse. Pour correspondre aux critères de la directive européenne 96/23/CE, il faut que les composés analysés en LC/MS/MS soient identifiés par 4 points d'identification. Ainsi pour s'assurer de l'identification des composés, ceux-ci sont reconnus d'après leur temps de rétention, deux transitions et le rapport d'intensité entre ces deux transitions. Par conséquent quand de nombreux composés sont analysés simultanément, cela génère un grand nombre de transitions à acquérir. Pour éviter que les «dwell time» et le temps de cycle ne soient trop courts ou ne nuisent à la sensibilité de la méthode, le mode «MRM dynamic» a été adopté. Dans cette configuration, les transitions ne sont pas suivies sur toute la durée d'une analyse mais uniquement pendant quelques minutes autour du temps de rétention théorique du composé correspondant. Le temps de cycle est fixé par l utilisateur et le logiciel calcul et applique alors les meilleurs «dwell time» possibles. Bien que les méthodes d'analyses soient différentes, les transitions et les énergies du fragmentor et de collision nécessaires à leur obtention sont identiques. Elles sont récapitulées dans le Tableau 52. Comme les étalons internes sont des composés volontairement ajoutés en 194

195 Chapitre 4 : Développements analytiques début de manipulation, aucun doute n'est possible sur leur présence, aussi ils n ont pas besoin des 4 points d identification et ils ne sont suivis que par une seule transition. Tableau 51 : Paramètres communs à l'ensemble des composés analysés en ESI+. Sélection (nb de composés) nombre de composés analysés : natifs (étalons internes) phases mobiles (A / B) (18) (19) 7 5 (2) eau milliq + 0,3 % HCH / acétonitrile + 0,3 % HCH proportion solvant gradient départ (v/v) 90 / / 5 95 / 5 débit de la phase mobile (ml/min) 0,6 0,4 0,6 gradient (temps en minutes) temps 0 8 8,5 11, ,3 21 % B temps , ,5 40, % B temps , volume d injection (µl) temps de rinçage de l aiguille d injection (sec) phase stationnaire (diamètre des particules) colonne Zorbax-SB C 18 (1,8 µm) dimension de la colonne (mm) longueur x diamètre interne 50 x 2,1 100 x 2,1 50 x 2,1 énergie du capillaire d'ionisation (kv) température du gaz séchant ( C) débit du gaz séchant (L/min) pression du gaz de nébulisation (psi) mode d'acquisition MRM dynamic MRM dynamic MRM temps de cycle (ms) dwell time (ms) 10 durée de l'analyse (min) HCH : acide formique Baker analyzed, pureté 98 % Acétonitrile : Baker ultra gradient HPLC grade % B Tableau 52 : Transitions de quantification (TQ) et de confirmation (TC), ainsi que les valeurs des énergies du fragmentor et des énergies de collision (E.C), de l'ensemble des composés pharmaceutiques analysés en mode d'ionisation positif. composés fragmentor transition de E.C transition de E.C rapport (V) quantification (v) confirmation (v) TQ / TC stavudine ,0 54, ,0 84,0 18 1,9 métronidazole ,0 128, ,0 82,0 26 1,8 sulfanilamide ,0 93, ,0 76, lamivudine ,0 112, ,0 95,0 46 5,6 sulfapyridine ,0 155, ,0 92,0 32 1,4 sulfadiazine ,1 156, ,1 108,0 22 1,6 sulfadiazine- 13 C ,1 162,0 8 sulfaméthoxazole 100 / ,1 92, ,1 156, sulfaméthoxazole- 13 C ,1 98, sulfathiazole ,0 156, ,0 108, propranolol 120 / ,1 116, ,1 56,1 32 1,6 propranolol-d ,1 56, ifosfamide ,1 92, ,1 63,1 52 1,4 195

196 Chapitre 4 : Développements analytiques composés fragmentor transition de E.C transition de E.C rapport (V) quantification (v) confirmation (v) TQ / TC cyclophosphamide 140 / ,1 140, ,1 106,1 18 1,9 acide oxolinique ,1 244, ,1 216, fluméquine ,1 244, ,1 202,1 36 1,7 gemcitabine ,0 112, ,0 95, sulfamérazine ,2 156, ,2 108,0 28 1,1 aténolol ,1 145, ,1 74,1 22 1,6 aténolol-d ,2 145, névirapine ,1 226, ,1 80,0 42 2,9 métoprolol ,1 116, ,1 74, sulfaméthizole ,0 156, ,0 108,0 26 2,2 sotalol ,1 255, ,1 133,0 30 1,5 sulfaméthazine 130 / ,1 186, ,1 92, sulfaméthazine- 13 C ,1 98, abacavir ,1 191, ,1 150,0 32 6,4 triméthoprime 140 / ,1 230, ,1 261,1 26 1,5 triméthoprime- 13 C ,0 233,1 22 acide pipémidique ,2 217, ,2 286,3 18 4,3 indinavir ,7 133, ,7 97,0 34 2,7 sulfadiméthoxine ,1 156, ,1 108,0 26 3,1 sulfadiméthoxine-d ,1 162, timolol ,1 261, ,1 74, norfloxacine ,2 276, ,2 302,2 18 1,3 norfloxacine-d ,2 281, bisoprolol ,2 116, ,2 74,0 24 3,3 ciprofloxacine ,1 288, ,1 245,1 24 1,4 ciprofloxacine- 13 C 2-15 N ,1 291, saquinavir ,3 285, ,3 128,0 46 1,3 ampicilline 110 / ,1 106, ,1 192,0 12 2,6 ampicilline- 15 N ,1 107,0 21 enrofloxacine ,3 316, ,3 245,0 28 1,5 ofloxacine 120 / ,1 318, ,1 261,2 30 1,3 ofloxacine-d ,0 321,2 18 marbofloxacine ,1 72, ,1 320,1 14 3,5 amoxicilline 70 / ,1 349, ,1 114,0 20 1,3 amoxicilline- 13 C ,0 355,1 2 tamoxifen ,2 72, ,2 129, tamoxifen-d ,2 72, azithromycine ,4 158, ,4 116,3 24 1,2 lincomycine 120 / ,2 126, ,2 359, lincomycine-d ,2 129,1 29 spiramycine ,4 174, ,4 101, clindamycine ,3 126, ,3 377, ,9 tétracycline 130 / ,1 410, ,1 154,1 28 1,8 tétracycline-d ,2 416,1 17 doxycycline 130 / ,1 428, ,1 410, méthotréxate ,1 308, ,1 175,0 42 1,8 céfotaxime ,2 324, ,2 396,2 8 1,1 oxytétracycline 110 / ,1 426, ,1 444,1 16 8,7 sildénafil 210 / ,1 58, ,1 58,1 20 1,3 sildénafil-d ,2 61, chlortétracycline ,1 444, ,1 462, ceftiofur 140 / ,0 241, ,0 125,9 46 3,6 virginiamycine ,2 508, ,2 355,1 14 1,5 docétaxel ,1 105, ,3 327,

197 Chapitre 4 : Développements analytiques composés fragmentor transition de E.C transition de E.C rapport (V) quantification (v) confirmation (v) TQ / TC daunorubicine ,1 321, ,1 363,1 10 1,5 doxorubicine 100 / ,1 396, ,1 361, épirubicine 100 / ,1 396, ,1 130,1 14 1,1 cefpodoxime 120 / ,1 410, ,1 241,1 20 2,5 nelfinavir ,2 330, ,2 467,2 30 2,1 monensine ,3 675, ,3 461,2 62 1,5 bacitracine ,0 86, ,0 199,0 44 1,4 ritonavir 130 / ,2 296, ,2 268,1 32 1,6 érythromycine ,5 157, ,5 576,3 18 1,3 érythromycine- 13 C ,4 159, clarithromycine ,5 157, ,5 590,3 18 4,2 clarithromycine-d ,5 161,1 29 salinomycine ,4 431, ,4 531, rifampicine ,4 791, ,4 399,0 20 4,9 josamycine ,4 109, ,4 173,8 34 1,7 roxithromycine 130 / ,5 157, ,5 679,3 22 1,2 tylosine ,5 174, ,5 772,4 30 5,3 I.4.2. Mode d'ionisation négatif (ESI-) Contrairement au mode positif, peu de composés, parmi ceux étudiés, sont ionisés en mode négatif. Par conséquent une seule méthode a été développée dans ce mode-là et les nouveaux composés ont été ajoutés au fur et à mesure. La colonne chromatographique est une colonne Zorbax-SB C 18 de 5 cm de long, de 2,1 mm de diamètre interne et rempli avec une phase de 1,8 µm. Elle permet la séparation des 12 composés en moins de 8 minutes. La durée totale de la méthode en considérant le temps de rinçage et de conditionnement est de 18 minutes. La phase mobile est constituée avec les mêmes solvants (eau milliq / ACN) qu'en mode positif mais le type et les proportions d'acide ajoutées sont différents. En mode positif, en plus de favoriser l'ionisation des composés, l'acide formique (HCH) permet d'améliorer la séparation chromatographique des composés et de réduire la largeur des pics des tétracyclines et fluoroquinolones. En mode négatif, l'ajout d'acide n'est pas nécessaire pour favoriser l'ionisation des composés mais permet de stabiliser les temps de rétention en fixant le ph de la phase mobile et donc la forme, acide ou basique, des molécules. C'est pour cette raison, que 0,1 % d'acide acétique est ajouté dans chacun des deux solvants. Le gradient chromatographique est le suivant : augmentation de 10 % à 48 % du solvant B entre 0 et 5 minutes, puis augmentation à 95 % en 30 secondes et stabilisation pendant 3 minutes, pendant les 3 minutes suivantes la colonne est rincée avec 100 % de la voie A puis la colonne est remise à conditionner pendant 5 minutes avec 10 % de la voie B. Contrairement aux phases mobiles, certains paramètres sont communs entre les deux modes d'ionisation. L'énergie du capillaire, le débit et la température du gaz séchant ainsi que la pression de nébulisation sont les mêmes dans les deux modes. Les transitions et les paramètres nécessaires à leur obtention sont indiqués dans le Tableau 53. Comme en mode positif, les étalons internes ne sont identifiés que par une seule transition. Les acquisitions se font aussi en mode MRM mais le mode «MRM dynamic» n'est pas nécessaire en raison du petit nombre de transitions à suivre. Le «dwell time» est ainsi fixé à 10 ms par transition induisant un temps de cycle de 270 ms. 197

198 Chapitre 4 : Développements analytiques Tableau 53 : Transitions de quantification (TQ) et de confirmation (TC), ainsi que les valeurs des énergies du fragmentor et des énergies de collision (E.C), de l'ensemble des composés pharmaceutiques analysés en mode d'ionisation négatif. composés fragmentor transition de E.C transition de E.C ratio (V) quantification (v) confirmation (v) TQ / TC 5-fluorouracil ,0 42, ,0 58, fluorouracil- 15 N ,0 43,0 16 zidovudine 90 / ,0 223, ,0 193, chloramphénicol ,0 152, ,0 257,0 6 1,4 chloramphénicol-d ,0 157,0 14 pénicilline G 80 / ,0 192, ,0 74,0 24 2,8 pénicilline G-d ,0 199,1 2 céfalexine ,2 233, ,2 268,1 10 1,7 pénicilline V ,0 208, ,0 93,0 24 1,2 thiamphénicol ,0 185, ,0 290,2 10 2,2 oxacilline 100 / ,0 259, ,0 356,1 2 2,1 céfuroxime ,0 207, ,0 318,0 4 1 cloxacilline ,0 293, ,0 257, dicloxacilline ,0 327, ,0 424,0 4 2,8 acide fusidique ,4 393, ,4 455,5 18 1,1 I.5. Validation des protocoles Pour valider une méthode analytique, il faut s assurer que diverses conditions et paramètres soient remplis. Ces éléments ainsi que leur définition et leur mode de calcul sont listés cidessous. Les limites instrumentales de détection (IDL) et de quantification : il s agit de la plus petite quantité injecté qui peut être détectée par le système analytique utilisé. Elles sont déterminées à partir de l injection de solution étalon et sont exprimées en picogrammes injectés. Dans notre méthodologie, les limites de détection et de quantification correspondent à une hauteur de pic chromatographique égale respectivement à 10 et 30 sachant que le bruit de fond est lissé. En effet tout signal inférieur à une hauteur absolue de 40 est non visible sur un chromatogramme et donc un signal ayant une hauteur indiqué de 10 ou 30 vaut en réalité une hauteur absolue de 50 ou 70. Les limites méthodologiques de détection (MDL) et de quantification : il s agit des plus petites quantités contenues dans un échantillon ayant subi l ensemble du protocole analytique qui puissent être détectées et quantifiées. Ces limites prennent en compte les performances de la méthodologie dans sa totalité. Elles peuvent être déterminées de façon théorique ou elles peuvent être mesurées. Dans le premier cas, elles sont extrapolées à partir des IDL et IQL en tenant compte du facteur de reconcentration (volume de la prise d essai et volume de l extrait reconcentré avant injection). Dans le deuxième cas, elles sont mesurées à partir d échantillons dopés à des concentrations environementalement pertinentes (quelques ng/l) subissant l ensemble du protocole (extraction, reconcentration et analyse). Comme les limites instrumentales, elles correspondent à une hauteur de pic chromatographique égale respectivement à 10 et 30. Les différences entre les IDL et MDL ainsi que les différentes façons de calculer ces dernières sont détaillées dans la publication «Trace-level analysis of organic contaminants in drinking waters and groundwaters» (Capdeville et Budzinski, 2011) (publication 1). La linéarité : elle correspond au fait que le signal varie dans les mêmes proportions que la quantité injectée. Lorsque que la réponse est linéaire, une droite de la forme y = ax + b, 198

199 Chapitre 4 : Développements analytiques idéalement passant par zéro, est obtenue en traçant le graphique : "intensité de la réponse en fonction de la quantité injectée". La linéarité est évaluée sur une gamme de concentration soit par l'intermédiaire du coefficient de corrélation (R²) soit par l'intermédiaire du rapport "intensité de la réponse / quantité injectée" qui doit toujours donner une même valeur pour une même molécule. Le graphique : "intensité de la réponse / quantité injectée en fonction de la quantité injectée" donne une droite horizontale sur la gamme de concentration où la réponse est linéaire. La précision : elle correspond à la variation intra-jour et inter-jour de la réponse analytique d une même solution ou d un même échantillon injectés dans les mêmes conditions avec la même méthode. Elle est calculée à partir de l écart-type relatif entre les réponses et est exprimée en pourcentage de variation. La justesse : elle correspond au rendement de quantification c'est-à-dire l adéquation entre la quantité injectée calculée et la quantité injectée théorique d une solution étalon. Elle est exprimée en pourcentage. Elle peut être calculée par étalonnage interne ou externe (cf. IV.2 Méthodes de quantification). La performance de la méthode : elle est évaluée au travers des rendements d extraction. Ceux-ci sont calculés à partir des échantillons dopés qui subissent l ensemble du protocole analytique (cf. II.4 Bilan protocole extraction phase dissoute et Bilan protocole extraction phase solide). Elle est exprimée en pourcentage d adéquation entre la quantité calculée et la quantité théorique. Les effets matriciels : ce sont des phénomènes dus à la matrice de l échantillon. Au niveau chromatographique, ils peuvent jouer sur les temps de rétention des composés et les décaler parce qu ils empêchent soit leur élution par la phase mobile soit leur adsorption sur la phase stationnaire. Au niveau spectrométrique, ils peuvent atténuer le signal, et plus rarement l augmenter. Ceci peut être dû soit à l ionisation des composés de la matrice, ce qui provoque une augmentation du niveau de la ligne de base et les composés ciblés sont masqués, soit à une compétition entre les analytes et les interférents dans la source au moment de l ionisation ce qui réduit l efficacité d ionisation des analytes. Ils sont évalués en ajoutant les composés ciblés en quantité connue dans une partie aliquote de l échantillon et en comparant les réponses entre la partie aliquote dopée et la partie aliquote non dopée. Ils sont exprimés en pourcentage d extinction et ils sont calculés selon l équation suivante : ( Aem ( AES AENS )) où A em est l aire du composé dans de l eau minérale 100 effet matriciel A ES est l aire du composé dans la partie aliquote dopée Aem A ENS est l aire du composé dans la partie aliquote non dopée A l exception des effets matriciels et des rendements d extraction, les valeurs de ces différents paramètres sont reportées pour chacun des 78 composés dans le Tableau 54. Les valeurs indiquées pour l amoxicilline et l ampicilline sont celles obtenues avec leur protocole spécifique. Les limites instrumentales de détection varient entre 0,1 et 450 pg injectés à l exception de la salinomycine pour qui 1400 pg injectés sont nécessaires. Les limites méthodologiques de quantification varient entre 0,1 et 120 ng/l (sauf bacitracine 425 ng/l) ce qui est satisfaisant pour permettre des analyses environnementales. Pour l ensemble des composés, la précision est bonne avec une variabilité intra-jour moyenne de 7 % en ESI+ et de 5 % en ESI- et une variabilité inter-jour moyenne de 54 % en ESI+ et de 29 % en ESI-. La justesse est bonne avec un rendement de quantification moyen de 109 %. La linéarité n est pas représentée dans le tableau mais, entre 30 et 1200 pg injectés, elle est bonne pour 50 composés (R² > 0,999). Lorsque celle-ci est insuffisante sur l ensemble de la gamme (R² < 0,999), des gammes plus 199

200 Chapitre 4 : Développements analytiques petites sont utilisées (technique des «brackets»). L ensemble des paramètres étant respecté, la méthode est considérée comme validée. Tableau 54 : Paramètres analytiques de validation de la méthode multi-résidus pour 78 molécules à l'exception de l'amoxicilline et de l'ampicilline qui ont leur propre protocole. composés ESI IDL 1 (pg injectés) MDL 2 (ng/l) MQL 2 (ng/l) variabilité intra-jour (%) variabilité inter-jour (%) justesse 3 (n=19) (%) pénicilline G - 0,5 0, pénicilline V - 0,5 0, oxacilline - 0,4 0, cloxacilline - 0,4 0, dicloxacilline - 0, céfalexine céfuroxime - 2 2, chloramphénicol thiamphénicol acide fusidique fluorouracil n.d n.d zidovudine amoxicilline ampicilline céfotaxime cefpodoxime ceftiofur azithromycine , clarithromycine + 0,4 0,1 0, érythromycine + 3 0, josamycine + 2 0, roxithromycine + 1 0,1 0, spiramycine , tylosine + 3 0, lincomycine + 0,3 0,1 0, clindamycine + 0,2 0,1 0, ciprofloxacine + 3 0, enrofloxacine + 2 0,2 0, marbofloxacine + 1 0,1 0, norfloxacine + 2 0, ofloxacine + 0,8 0,1 0, acide oxolinique + 0,1 0,04 0, acide pipémidique + 2 0, fluméquine + 0,1 0,1 0, tétracycline + 0,7 0, oxytétracycline + 1 0, chlortétracycline doxycycline + 0,9 0, sulfadiazine + 0,4 0,1 0, sulfadiméthoxine + 0,1 0,04 0, sulfamérazine + 0,5 0,1 0, sulfaméthazine + 0,2 0,1 0, sulfaméthizole + 0,4 0,1 0, sulfaméthoxazole + 1 0, sulfanilamide sulfapyridine + 0,5 0,1 0,

201 Chapitre 4 : Développements analytiques composés ESI IDL 1 (pg injectés) MDL 2 (ng/l) MQL 2 (ng/l) variabilité intra-jour (%) variabilité inter-jour (%) justesse 3 (n=19) (%) sulfathiazole + 0,4 0,2 0, triméthoprime + 0,7 0,1 0, métronidazole + 0,4 0,1 0, monensine , salinomycine bacitracine virginiamycine rifampicine aténolol + 1 0, bisoprolol + 0,2 0,03 0, métoprolol + 0,9 0,1 0, propranolol + 0,5 0,1 0, sotalol + 0,3 0,1 0, timolol + 0,4 0,1 0, docétaxel daunorubicine + 2 0, doxorubicine épirubicine gemcitabine tamoxifen + 8 0, méthotréxate + 2 0, cyclophosphamide + 1 0, ifosfamide + 1 0, indinavir , nelfinavir + 0,5 0, ritonavir + 7 0, saquinavir + 1 0,2 0, névirapine + 0,5 0,1 0, abacavir + 0,5 0,1 0, lamivudine + 0,6 0, stavudine sildénafil + 3 0, : limites instrumentales de détection obtenues par extrapolation suite à l injection directe d une solution standard de référence. 2 : limites méthodologiques de détection et de quantification obtenues suite à l extrapolation des résultats obtenues pour l extraction et l analyse de 200 ml d eau minérale naturelle enrichie à 200 ng/l (facteur de concentration = 1000). n.d : non déterminées car rendements d extraction nuls. 3 : justesse quantifiée par étalonnage interne ou externe selon la disponibilité des étalons internes. En plus de ces paramètres, pour valider et assurer la qualité de nos méthodes analytiques, il a été choisi de réaliser des cartes de contrôle. Une carte de contrôle pour chaque méthode analytique créée a été mise en place. Une carte de contrôle est une solution étalon préparée toujours de la même façon et injectée trois fois successivement au début de chaque séquence d analyse. L intensité de la réponse (hauteur du pic chromatographique) de chaque composé est reportée dans un tableau de suivi afin de se rendre compte des évolutions. La carte de contrôle permet d évaluer la répétabilité des analyses entre les différentes séquences lancées à des moments différents (jour, semaine, mois) et au sein d une même séquence. Ainsi, il peut être assuré qu un même échantillon donnera toujours la même réponse quelque soit la date où il a été analysé, s il n a pas subi de dégradation intrinsèque. Par ailleurs, en s assurant que la réponse est répétable au cours d une même séquence d analyse, cela permet de n injecter qu une seule fois chaque échantillon de la séquence. A titre d exemple, le graphique obtenu à 201

202 intensité de la réponse (hauteur) Chapitre 4 : Développements analytiques partir des valeurs enregistrées dans le tableau de suivi de la méthode d analyse pour le projet DIPERPHA est présenté ci-après (Figure 65). Le suivi de la carte de contrôle a permis de mettre en évidence un problème d'encrassement du spectromètre de masse affectant la sensibilité de l'appareil (début août 2010) /06/10 (n=3) 14/06/10 (n=3) encrassement capillaire et octopole du spectromètre de masse 15/06/10 (n=3) 16/06/10 (n=3) 17/06/10 (n=3) 21/06/10 (n=3) 16/07/10 (n=3) 29/07/10 (n=3) 02/08/10 (n=3) 03/08/10 (n=3) 04/08/10 (n=3) date d'injection nettoyage du spectromètre de masse 25/08/10 (n=3) 26/08/10 (n=3) 29/09/10 (n=3) 11/10/10 (n=3) 20/10/10 (n=3) 21/10/10 (n=3) 02/11/10 (n=3) 03/11/10 (n=3) tylosine érythromycine monensine chlortétracycline oxytétracycline doxycycline tétracycline spiramycine lincomycine marbofloxacine enrofloxacine ciprofloxacine norfloxacine sulfadiméthoxine triméthoprime sulfaméthazine sulfamérazine fluméquine acide oxolinique sulfadiazine sulfanilamide Figure 65 : Suivi de la carte de contrôle de la méthode d'analyse de 21 antibiotiques en ESI + pour DIPERPHA. II. Développement du protocole d extraction des composés contenus dans la phase liquide des échantillons par SPE II.1. Les échantillons d eau Bien que la LC/MS/MS permette d atteindre les niveaux de sensibilité et de sélectivité nécessaire aux analyses d échantillons environnementaux complexes, il faut cependant, préalablement à l analyse, extraire et concentrer les composés d intérêt. D après la littérature, la méthodologie couramment employée pour cela est la SPE ou extraction en phase solide. Un protocole permettant d extraire les 32 puis les 78 molécules sélectionnées au cours de ces travaux a alors été développé à partir d eau minérale enrichie avec les composés ciblés. Le premier test a consisté à choisir la phase adsorbante et le solvant d élution. Il a été réalisé avec une sélection réduite de 15 molécules. En s appuyant sur les phases SPE et les solvants les plus couramment employés d après la littérature scientifique, 3 types de cartouches contenant des phases adsorbantes polymériques (asis HLB, Strata X et Isolute ENV+) et 4 solvants et mélange de solvants (MeH, ACN, MeH/ACN 50/50, eau/acn 30/70) ont été testés. Les meilleurs rendements et les moins variables ont été obtenus avec les cartouches asis HLB et les solvants MeH ou mélange eau/acn (Figure 66). Les rendements entre les deux types de solvant étant similaires et le méthanol ne pouvant être utilisé à cause des pénicillines, c est le mélange eau/acn qui a été adopté. Différentes proportions entre les 2 solvants ont ensuite été essayées pour conclure que le meilleur mélange était 40/60 eau/acn (v/v). Dans de nombreuses publications (Seifrtová et al., 2009) ce sont également les 202

203 Chapitre 4 : Développements analytiques cartouches asis HLB qui sont utilisées dans des méthodes multi-résidus pour le dosage de molécules pharmaceutiques. Figure 66 : Rendement d'extraction moyen pour 15 antibiotiques en fonction du type de cartouche et du solvant employé. Le conditionnement des échantillons a ensuite été étudié pour l ensemble des 32 composés appartenant à la première liste de molécules sélectionnées. Un premier essai, testant différents ph et une condition avec de l EDTA, a permis d établir l EDTA comme un paramètre important pour l extraction des composés étudiés. Par ailleurs, l EDTA, de par sa fonction acide, s est révélé modifier le ph des échantillons. Une deuxième expérience a alors été réalisée pour tester l influence du ph dans des échantillons où de l EDTA avait préalablement été ajouté. Les résultats combinés de ces deux tests sont présentés Figure 67. Les meilleurs rendements d extraction, et les moins variables, sont obtenus en présence d EDTA quand le ph des échantillons est stabilisé à 5, soit directement, soit après modification suite à l ajout de l EDTA. Un dernier test a alors consisté à définir la concentration d EDTA nécessaire en essayant 4 concentrations différentes (2, 5, 10 et 20 mm d EDTA). Les rendements obtenus n ont pas été suffisamment différents selon la condition testée pour permettre de définir quelle concentration était la meilleure. Comme les premiers tests avaient été effectués à une concentration de 10 mm et que les rendements obtenus au cours de ces essais étaient bons, une concentration finale en EDTA à 10 mm a été retenue. Le protocole d extraction optimisé est donc le suivant : cartouches asis HLB (200 mg, 6 ml), mélange eau/acn 40/60 (v/v) comme solvant d élution, ajout d EDTA pour obtenir une concentration finale à 10 mm dans les échantillons et ph final des échantillons stabilisé entre 4 et 5. Figure 67 : Rendement d'extraction moyen pour les 32 molécules pharmaceutiques en fonction du ph de l'échantillon et de l'ajout ou non d'edta. 203

204 Chapitre 4 : Développements analytiques Après le développement analytique et le développement de l étape d extraction, l étape de reconcentration a été optimisée. Trois conditions de solvant de reprise ont été évaluées (ACN, eau/acn 10/90, eau/acn 30/70). Les résultats n étant pas significativement différents, c est la méthode la plus facile à mettre en œuvre qui a été choisie. Les résidus sont donc repris avec de l acétonitrile. Finalement le niveau d évaporation qui pouvait être atteint sans perte des composés a été évalué. Les résultats de cet essai sont présentés Figure 68. a) b) Figure 68 : Rendements d évaporation moyens en fonction du niveau d évaporation pour les 32 molécules pharmaceutiques (a) et pour quelques molécules spécifiques (b) (FQ : fluoroquinolones, Q : quinolones, S : sulfonamides, b-b : -bloquants). En moyenne (Figure 68a), plus les extraits sont évaporés, plus les rendements d évaporation sont faibles (< 50 %). Cette tendance est liée à certaines familles de molécules comme les quinolones et fluoroquinolones. D autres classes ou d autres familles de molécules pharmaceutiques telles que les sulfonamides ou les -bloquants ne semblent pas être impactées par le niveau d évaporation (Figure 68b). En conséquence, afin d éviter la perte des fluoroquinolones et des quinolones, il s avère indispensable de ne pas évaporer totalement les échantillons. Pour valider le protocole, les rendements d extraction obtenus sur 16 séries ont été moyennés. Ils ont permis d obtenir le graphique présenté Figure 69. Les résultats peuvent se répartir en 3 groupes : i) ceux qui ont de bons rendements d extraction ( 70 %) avec une variabilité modérée (25 %) ; ii) ceux qui ont des rendements moyens ( 50 %) avec une variabilité importante (30 % ) ; et iii) ceux qui ont des rendements faibles ( 35 %) avec une variabilité proportionnellement forte (25 %). Les antibiotiques de la famille des sulfonamides (sulfaméthazine, sulfaméthoxazole, triméthoprime), le chloramphénicol, les -bloquants (métoprolol, propranolol), les anticancéreux de la famille des moutardes azotées (cyclophosphamide, ifosfamide) et les anti-vih (ritonavir, zidovudine) appartiennent au premier groupe. Les antibiotiques de la famille des quinolones et fluoroquinolones (acide oxolinique, fluméquine, ciprofloxacine, ofloxacine) et ceux de la famille des macrolides et lincosamides (clarithromycine, érythromycine, roxithromycine, lincomycine) appartiennent au deuxième groupe. Enfin, les antibiotiques de la famille des -lactames (amoxicilline, ampicilline, pénicilline G, pénicilline V, oxacilline, ceftiofur, cefpodoxime), ceux de la famille des tétracyclines (tétracycline, oxytétracycline, chlortétracycline, doxycycline) et les anticancéreux de la famille des anthracyclines (daunorubicine, doxorubicine, épirubicine) appartiennent au troisième groupe. 204

205 Chapitre 4 : Développements analytiques Figure 69 : Rendements d'extraction moyens (n=16) pour chacun des 32 composés de la première liste de molécules sélectionnées. Avant de valider définitivement le protocole développé, une dernière expérience a été effectuée pour évaluer les volumes de fuites. Le volume de fuite correspond au volume maximum qui peut être percolé sur une cartouche SPE sans modifier les rendements d extraction. Au-delà de ce volume de fuite, les composés ne sont plus retenus sur la cartouche SPE et sont élués au fur et à mesure que l échantillon percole. C est un paramètre spécifique à chaque composé. Pour l évaluer, différents volumes d eau minérale (50, 100, 200, 500, 1000 et 2000 ml) contaminée à un même niveau (300 ng/l) ont été extraits. Les résultats sont présentés dans le Tableau 55. La molécule possédant le plus petit volume de fuite est le facteur limitant et impose ce volume à l ensemble des autres composés dans le cas d une analyse multi-résidus. Parmi les 32 premières molécules étudiées, c est la roxithromycine qui possède le plus faible volume de fuite, 200 ml. Par conséquent le volume de fuite de la méthode d analyse des 32 composés pharmaceutiques est 200 ml. Tableau 55 : Volume de fuite déterminés pour l ensemble des 32 composés (n.d : non determiné car rendements d extraction trop faibles ou nuls). composés volume de volume de volume de composés composés fuite (ml) fuite (ml) fuite (ml) amoxicilline n.d ciprofloxacine chloramphénicol 500 ampicilline n.d ofloxacine métoprolol pénicilline G acide oxolinique propranolol pénicilline V fluméquine daunorubicine oxacilline tétracycline doxorubicine 500 cefpodoxime oxytétracycline épirubicine 500 ceftiofur chlortétracycline ifosfamide clarithromycine doxycycline cyclophosphamide érythromycine sulfaméthoxazole ritonavir roxithromycine 200 sulfaméthazine zidovudine lincomycine triméthoprime

206 Chapitre 4 : Développements analytiques Ces tests qui ont permis la mise au point du protocole d extraction des 32 premiers composés choisis sont détaillés dans la publication «Development of a method for the simultaneous extraction of antibiotics, -blockers, antineoplastics and antivirals by solid-phase extraction followed by liquid chromatography tandem mass spectrometry analysis application to sewage treatment plant effluents» (publication 2). Initialement, le protocole d extraction et de concentration a été développé pour les 32 molécules pharmaceutiques de la première liste. Par la suite, il a été appliqué à la sélection étendue sans modification particulière. A l exception des -lactames et en particulier de l amoxicilline qui avaient déjà des taux de récupérations faibles, les rendements d extraction étant satisfaisants, le protocole n a pas subi de changement et a été utilisé de la même façon pour les 32 ou les 78 molécules. L étude des volumes de fuite a cependant révélé le besoin d être attentif aux volumes percolés en particulier pour l aténolol (volume de fuite < 50 ml). L ajout de l étalon interne spécifique à ce composé (aténolo-d 7 ) a permis d éviter que son volume de fuite ne soit le volume limitant pour l ensemble des composés. Le volume de fuite pour l ensemble de la méthodologie multi-résidus est alors resté à 200 ml. II.2. Le cas particulier de l amoxicilline et de l ampicilline Si ce protocole d extraction et d évaporation est bon dans son ensemble (rendement moyen pour les 78 composés de %), il s avère n être pas adapté ni aux -lactames et en particulier à l amoxicilline ni au 5-fluorouracil. En raison de l importance de l amoxicilline d après les données de consommation et de toxicité, il a été décidé de développer une méthode analytique spécifique pour elle et l ampicilline. Les -lactames en général et l amoxicilline en particulier sont les antibiotiques les plus consommés. r, en dépit de leur fortes consommations, ils ne sont que très peu, voir pas, retrouvés dans les systèmes aquatiques contrairement à d autres antibiotiques moins consommés mais très souvent détectés comme le sulfaméthoxazole. Selon les protocoles développés et présentés précédemment, les -lactames (pénicillines et céphalosporines) répondent parfaitement aux critères de validation analytique comme les limites instrumentales de détection et de quantification, la justesse, la précision et la linéarité mais présentent de grosses lacunes au niveau des rendements d extraction. L application de protocoles d extraction publiés dans la littérature scientifique (Christian et al., 2003 ; Cha et al., 2006) n ont pas permis d améliorer ce point. La question de savoir si l absence d amoxicilline dans les échantillons environnementaux était liée à des difficultés analytiques ou à sa dégradation rapide par hydrolyse (Hirsch et al., 1999 ; Christian et al., 2003 ; Cha et al., 2006 ; Seifrtova et al., 2009) comme cela est souvent suggéré, s est alors posée. Kümmerer soulève aussi cette interrogation dans sa synthèse bibliographique parue en 2009 et intitulée «Antibiotics in the aquatic environment, a review, part I» (Kümmerer, 2009a). Pour y répondre, une méthodologie spécifique à l amoxicilline a été développée et à laquelle, une autre pénicilline structurellement très proche, l ampicilline, a été associée. Comme pour les méthodes précédentes, les développements ont été réalisés à partir de solutions standards individuelles et d eau minérale dopée avec les composés d intérêt. Ils sont basés sur le protocole de routine d analyse des 32 molécules pharmaceutiques. Lors des tous premiers tests de développement de la SPE, ceux pour la sélection des 32 produits pharmaceutiques, le mélange eau/acn (40/60, v/v) avait été choisi comme solvant d élution en alternative au méthanol parce que les pénicillines réagissaient de façon non 206

207 Chapitre 4 : Développements analytiques reproductible avec ce dernier. Au cours de ces développements, le choix du solvant n a donc pas été remis en question. Les premiers paramètres qui ont été testés concernés le ph des échantillons et la phase adsorbante. L'amoxicilline et l'ampicilline possédant plusieurs pk A, il était judicieux de tester la combinaison de ces 2 paramètres simultanément. Ainsi, 5 phases adsorbantes (asis HLB, asis MCX, asis MAX, Strata X et Strata XC) ont été testées à 3 ph différents (3, 7 et 9) au cours d'une première expérience. L EDTA était ajouté dans les protocoles précédents pour prévenir une adsorption des tétracyclines sur les parois en verre des contenants. En l absence de tétracyclines, dans ce premier essai, il n a donc pas été ajouté. Un test a été mené en parallèle en utilisant le protocole extraction des 32 produits pharmaceutiques pour lequel uniquement le ph des échantillons a été modifié, ph 2 au lieu de 5. Cette valeur de ph a été choisie car elle est inférieure à tous les pk A des 2 pénicillines et permet ainsi de s assurer de la forme protonée des molécules. Les résultats obtenus à ph 7 et ph 9 sont mauvais et ne sont donc pas représentés ici. L'amoxicilline n'a pu être extraite avec aucune des cartouches testées à aucun de ces deux ph. Les autres résultats sont présentés Figure 70. Les meilleurs rendements d extraction sont obtenus avec les cartouches asis HLB et MCX avec un ph de 3. Figure 70 : Rendements d'extraction obtenus au cours du premier test d'optimisation d'un protocole SPE spécifique à l'amoxicilline et à l'ampicilline. Ce constat a conduit à une deuxième expérience qui visait à conforter le résultat précédent en comparant les rendements d extraction obtenus dans différentes conditions pour une eau minérale enrichie avec de fortes concentrations en -lactames (10 µg/l). Ces tests cherchaient également à évaluer l influence de l EDTA sur l extraction des pénicillines. Pour parfaire cette expérience, un triplicat a été extrait avec l ancien protocole. Ainsi 5 conditions ont été testées : cartouches asis MCX avec des échantillons à ph 3 avec et sans EDTA, cartouches asis HLB avec des échantillons à ph 3 avec et sans EDTA et cartouches asis HLB avec des échantillons à ph 5 avec EDTA (ancien protocole). Il ressort de ce test qu uniquement 2 conditions permettent d extraire l amoxicilline et l ampicilline, les cartouches asis MCX à ph 3 avec EDTA et les cartouches asis HLB à ph 5 avec EDTA c'est-à-dire l ancien protocole (Figure 71). Aucun des triplicats des autres conditions testées n ont permis d extraire les 2 pénicillines. De plus, les rendements d extraction obtenus avec les nouvelles conditions (MCX, ph 3, EDTA) sont meilleurs, de l ordre de 60%, que ceux obtenus avec l ancien protocole (9 2 % pour l amoxicilline et 21 6 % pour l ampicilline) ce qui confirme les résultats du premier test (Figure 70). 207

208 Chapitre 4 : Développements analytiques Figure 71 : Rendements d'extraction obtenus au cours du second test d'optimisation du protocole SPE de l amoxicilline et de l ampicilline. Pour valider ce nouveau mode opératoire, une dernière expérience a été réalisée en triplicat sur une eau minérale enrichie à des concentrations environnementalement pertinentes (100 ng/l). Les étalons internes des 2 molécules ont été ajoutés au cours de cet essai pour finaliser la validation du protocole. Les résultats sont présentés Figure 72. Avec des rendements d extraction de l ordre de 46 3 % pour l amoxicilline et de 45 2 % pour l ampicilline en étalonnage externe et des rendements de l ordre de % pour l amoxicilline et % pour l ampicilline en étalonnage interne, le protocole d'extraction est validé. Les rendements d'extraction sont donc meilleurs avec le nouveau protocole par rapport à l'ancien et ceci en étalonnage externe comme en étalonnage interne. De plus la variabilité est faible, inférieure ou égale à 10%. Figure 72 : Validation du nouveau protocole d'extraction de l'amoxicilline et de l'ampicilline Par ailleurs, pour tester l hypothèse d une dégradation rapide de l amoxicilline par hydrolyse, une solution de ce composé a été préparée et a été analysée durant plusieurs jours. Pour cela, des cristaux d amoxicilline ont été dissouts dans de l eau ultra-pure et la solution ainsi obtenue a été analysée à plusieurs reprises par LC/MS/MS pendant 6 jours. Entre les injections, le flacon contenant 1 ml de la solution a été laissé sur le portoir de la machine sans précaution particulière. Du point de vu analytique, aucune différence n est apparue entre la première injection et la dernière injection réalisée 140 heures plus tard. En conséquence, il ne semble pas que l amoxicilline soit hydrolysée. La même expérience a été réalisée avec les autres -lactames et il s avère que seul le cefpodoxime est particulièrement affecté. L intensité de sa réponse diminue d un facteur 2 en 9 h, d un facteur 5 en 20 h et il n est quasiment plus détectable en 48 h. L ajout de 2% de méthanol semble en revanche permettre de préserver sa dégradation pendant au moins 90 h soit un peu plus de 3 jours. Ainsi dans 208

209 Chapitre 4 : Développements analytiques l environnement, l absence des -lactames est peut-être due à une dégradation bactérienne mais pas à une hydrolyse. II.3. Les échantillons de lisiers A partir des protocoles analytiques multi-résidus développés pour étudier la contamination de l eau par les molécules pharmaceutiques, un protocole très similaire a été adapté pour permettre l analyse de la phase dissoute de lisiers porcins. Seuls 2 points diffèrent entre ces protocoles : i) l ajout d EDTA n entraine pas de baisse du ph, les extractions sont donc pratiquées à ph 7 ; et ii) la première évaporation/reconcentration n a pas lieu sous flux d azote mais sous vide et agitation au Rapidvap (Labconco) afin d accélérer le processus et d éviter la formation d un film opaque à la surface de l extrait. II.4. Bilan protocole extraction phase dissoute Les protocoles finaux résultant de ces différents développements sont schématisés Figure 73. Cette figure permet de visualiser clairement les diverses étapes des protocoles et de mettre en évidence les points communs et les différences entre eux. Les performances de ces méthodes sont évaluées au travers des rendements d extraction. Les valeurs des rendements sont récapitulées dans le Tableau 56. Elles correspondent aux moyennes de valeur de rendement obtenues pour 12 séries d extraction d eau minérale enrichie avec les composés d intérêt et réalisées avec le protocole multi-résidus, excepté pour l amoxicilline et l ampicilline. Les valeurs indiquées pour l amoxicilline et l ampicilline sont celles obtenues avec leur protocole spécifique et correspondent au triplicat ayant servi à valider la méthode (II.2 Le cas particulier de l amoxicilline et de l ampicilline). Grâce à l optimisation du protocole d extraction pour l amoxicilline et l ampicilline, les performances des méthodes sont bonnes avec un rendement moyen de %. Cependant, les composés peuvent être répartis en 3 groupes : i) ceux qui ont un bon rendement avec une variabilité faible comme les sulfonamides ou les -bloquants par exemple, ii) ceux qui ont un bon rendement mais une variabilité relativement forte comme certains macrolides, certaines tétracyclines ou certains anti-vih et iii) ceux qui ont des rendements faibles comme les céphalosporines, certains antibiotiques (exemple : chlortétracycline, bacitracine, salinomycine, virginiamycine et rifampicine) et certains anticancéreux (exemple : 5- fluorouracil, doxorubicine, épirubicine, gemcitabine). 209

210 Chapitre 4 : Développements analytiques FILTRATIN PHASE DISSUTE SPE multi-résidus Cartouches ASIS HLB 200 mg, 6 ml SPE spécifique amoxicilline Cartouches ASIS MCX 60 mg, 3 ml SPE lisiers Cartouches ASIS HLB 200 mg, 6 ml Préparation échantillons prise d'essai : 100 ml entrée STEP, 200 ml tout le reste ajuster ph 7 ajout 4,16 ml d'une solution d'edta à 0,25 M / 100 ml d'échantillon eau baisse du ph (entre 4 et 5) ajout étalons internes Préparation échantillons prise d'essai : 100 ml entrée STEP, 200 ml tout le reste ajuster ph 3 ajout 4,16 ml d'une solution d'edta à 0,25 M / 100 ml d'échantillon ajout étalons internes Préparation échantillons prise d'essai : 50 ml sortie de réacteur, 30 ml tout le reste ajuster ph 7 ajout 4,16 ml d'une solution d'edta à 0,25 M / 100 ml d'échantillon (ph stable) ajout étalons internes Conditionnement cartouche 5 ml ACN puis 5 ml eau Vittel ph 7 Dépôt échantillon rinçage bouteilles 5 ml eau Vittel ph 7 Séchage 1 h sous vide Elution 5 ml eau/acn 40/60 v/v (eau Vittel ph 7) Conditionnement cartouche 5 ml ACN puis 5 ml eau Vittel ph 3 Dépôt échantillon rinçage bouteilles 5 ml eau Vittel ph 3 Séchage 1 h sous vide Elution 5 ml eau/acn 40/60 v/v (eau Vittel ph 3) Conditionnement cartouche 5 ml ACN puis 5 ml eau Vittel ph 7 Dépôt échantillon rinçage bouteilles 5 ml eau Vittel ph 7 Séchage 1 h sous vide Elution 5 ml eau/acn 40/60 v/v (eau Vittel ph 7) 1 ère reconcentration sous flux d azote reprise résidus : 3 rinçages ACN 1 ère reconcentration sous flux d azote reprise résidus : 3 rinçages ACN 1 ère reconcentration RapidVap 80%, 40 C, 150 mbar, 30 min 80%, 40 C, 100 mbar, 30 min 80%, 40 C, 70 mbar, 30 min et + reprise résidus : 3 rinçages ACN 2 ème reconcentration flux d'azote ajout 50 µl eau/acn 90/10 v/v (eau milliq) pour eau de surface (volume final 100 µl) ajout 100 µl eau/acn 90/10 v/v (eau milliq) pour sortie de STEP (volume final 150 µl) ajout 200 µl eau/acn 90/10 v/v (eau milliq) pour entrée de STEP (volume final 250 µl) ajout 250 µl eau/acn 90/10 v/v (eau milliq) pour lisier (volume final 300 µl) Analyse Injection RRLC/MS/MS Figure 73 : Protocoles d extractions multi-résidus (32 et 78 composés) et spécifiques (amoxicilline et ampicilline) de la phase dissoute d échantillons aqueux (eau et lisiers). 210

211 Chapitre 4 : Développements analytiques Tableau 56 : Paramètres expérimentaux de validation de la méthode de dosage des 78 molécules à l'exception de l'amoxicilline et de l'ampicilline qui ont leur propre protocole. Rendements calculés par étalonnage interne ou externe. composés étalons internes rendement (n=12) (%) composés étalons internes * sulfadiazine initialement quantifiée par rapport à la sulfaméthazine- 13 C 6 en attendant de disposer de son propre étalon interne. rendement (n=12) (%) pénicilline G pénicilline G-d sulfadiméthoxine sulfadiméthoxine-d pénicilline V pénicilline G-d sulfamérazine sulfaméthazine- 13 C oxacilline pénicilline G-d sulfaméthazine sulfaméthazine- 13 C cloxacilline pénicilline G-d sulfaméthizole sulfaméthoxazole- 13 C dicloxacilline pénicilline G-d sulfaméthoxazole sulfaméthoxazole- 13 C céfalexine sulfanilamide sulfaméthazine- 13 C céfuroxime pénicilline G-d sulfapyridine sulfadiméthoxine-d chloramphénicol chloramphénicol-d sulfathiazole sulfaméthazine- 13 C thiamphénicol chloramphénicol-d triméthoprime triméthoprime- 13 C acide fusidique métronidazole fluorouracil 5-fluorouracil- 15 N 0 monensine zidovudine salinomycine amoxicilline amoxicilline 13 C bacitracine ampicilline ampicilline 15 N virginiamycine 8 11 céfotaxime rifampicine cefpodoxime 3 4 aténolol aténolol-d ceftiofur bisoprolol propranolol-d ± 14 azithromycine clarithromycine-d métoprolol propranolol-d clarithromycine clarithromycine-d propranolol propranolol-d érythromycine érythromycine- 13 C sotalol propranolol-d josamycine clarithromycine-d timolol propranolol-d roxithromycine clarithromycine-d docétaxel spiramycine daunorubicine tylosine clarithromycine-d doxorubicine 7 9 lincomycine lincomycine-d épirubicine 9 9 clindamycine lincomycine-d gemcitabine 6 2 ciprofloxacine ciprofloxacine- 13 C 2-15 N tamoxifen tamoxifen-d enrofloxacine méthotréxate marbofloxacine ofloxacine-d cyclophosphamide propranolol-d norfloxacine norfloxacine-d ifosfamide propranolol-d ofloxacine ofloxacine-d indinavir acide oxolinique nelfinavir 15 9 acide pipémidique ritonavir fluméquine saquinavir tétracycline tétracycline-d névirapine oxytétracycline abacavir chlortétracycline 8 5 lamivudine doxycycline stavudine sulfadiazine* sulfaméthazine- 13 C sildénafil sildénafil-d

212 Chapitre 4 : Développements analytiques III. Développement du protocole d extraction des composés contenus dans la phase solide des échantillons par ASE III.1. Développement du protocole Les résultats des analyses préliminaires de la phase dissoute d'une grande partie des échantillons ont conduit à réduire la liste des antibiotiques recherchés dans le cadre du projet DIPERPHA à 7 molécules. Les développements concernant l'extraction de la phase solide ont donc initialement été réalisés sur cette liste réduite. Parmi les différentes techniques d extraction possibles pour les matrices solides (micro-ondes, ultra-sons, vortex puis centrifugation), c est la méthode ASE (Accelerated Solvent Extraction) qui a été choisie car cette technique permet d extraire successivement et automatiquement 24 échantillons. Les extraits obtenus sont ensuite purifiés par SPE en appliquant le protocole mis au point pour l'extraction de la phase dissoute. La première partie de l optimisation a consisté à sélectionner les solvants d extraction et les proportions de ces solvants. La présélection des solvants à tester (eau, MeH, ACN) s est faite à partir de données publiées. Les paramètres de température et de pression ont également été choisis d après des données publiées en se basant sur les valeurs les plus fréquemment retrouvées (Schlüsener et al., 2003 ; Göbel et al., 2005 ; Carretero et al., 2008 ; Blasco et al., 2009 ; Jelic et al., 2009 ; Wu et al., 2009). Au final, deux protocole ont été établis et testés sur du sédiment dopé avec les composés ciblés. Ils sont présentés dans le Tableau 57 et se différencient par les solvants et proportions de solvant utilisés. Afin d'évaluer l'impact de la lyophilisation, ils ont été appliqués sur du sédiment lyophilisé ou non. Dans le but d extraire au mieux les tétracyclines, les billes de verre servant à homogénéiser la matrice ont été enrobées d EDTA. Tableau 57 : Protocoles ASE testés pour l'extraction des antibiotiques dans la phase solide des lisiers. paramètres ASE protocole 1 protocole 2 taille des cellules (ml) preheat (min) 5 5 heat (min) 5 5 static (min) 5 5 flush (%) purge (sec) nombre de cycles 3 3 pression (bar) température ( C) solvant 50/50 eau/meh 30/70 eau/acn Les résultats de ce premier test ont conduit à choisir le protocole n 2 mais n'ont pas permis de trancher sur la nécessité ou non de lyophiliser les échantillons avant extraction. Dans le cas de l'analyse des hormones (dosages réalisés en parallèle des antibiotiques sur les mêmes échantillons de lisiers dans le cadre du projet DIPERPHA), il s'avère nécessaire de lyophiliser les échantillons avant extraction afin de réduire la variabilité de l'analyse. Par extrapolation, la lyophilisation a été choisie pour le dosage des antibiotiques. Un deuxième test, réalisé initialement dans le but de valider le protocole ASE, a été pratiqué en triplicat sur du sédiment lyophilisé puis dopé avec 5 des 7 molécules majoritaires (une 212

213 Chapitre 4 : Développements analytiques molécule par famille d'antibiotiques). Les résultats sont satisfaisants à l'exception de ceux obtenus pour la marbofloxacine pourtant dosée par étalonnage interne (Figure 74). La comparaison des rendements d extraction entre SPE et ASE+SPE pour l oxytétracycline montre que les pertes ont d'avantage lieu pendant l étape de SPE et donc que le protocole ASE est validé pour ce composé. Figure 74 : Rendements de quantification (n=3) et d extraction (SPE et ASE+SPE noté ASE, n=3) pour 5 des 7 molécules majoritaires (lincomycine, marbofloxacine et sulfadiazine quantifiées par étalonnage interne avec les étalons dans le flacon de récupération, oxytétracycline et monensine quantifiées par étalonnage externe). Ce protocole a été utilisé pour analyser la phase solide des échantillons de lisier provenant du suivi des cinétiques de dégradations en condition mésophiles au cours du couplage anaérobieaérobie/anoxie. (cf. chapitre 5). Ultérieurement, dans le but d'améliorer les rendements d'extraction, en particulier ceux de la marbofloxacine et de l oxytétracycline, un troisième test a été réalisé au cours duquel le moment de l'ajout des étalons internes a été évalué. En effet lors des premiers essais, les étalons étaient ajoutés dans les flacons collecteurs des extraits. Ce dernier test devait permettre de comparer les rendements d'extraction obtenus quand les étalons internes sont ajoutés dans les cellules ASE avant extraction avec ceux obtenus quand l'ajout se fait dans les flacons collecteurs. Les résultats, présentés Figure 75, montrent l avantage d ajouter les étalons internes dans la cellule avant extraction pour obtenir un meilleur dosage, bien que dans certains cas cela conduise à un surdosage (exemple : marbofloxacine). Figure 75: Comparaison des rendements d'extraction en fonction du moment où les étalons internes (ei) sont ajoutés, dans le flacon collecteur des extraits ou dans la cellule ASE. 213

214 Chapitre 4 : Développements analytiques Ce protocole ainsi validé a été appliqué à l analyse de la phase solide de tous les échantillons prélevés dans les élevages. Les rendements d extraction (SPE et ASE+SPE), évalués au travers d eau minérale et de sédiments dopés, obtenus au cours de ces différentes séries de manipulation sont présentés dans le Tableau 58. Ces rendements sont bons, proches de 100% avec une variabilité faible, à l exception de la tylosine et de la marbofloxacine qui ont respectivement des rendements élevés ou variables lors des extractions par ASE. Pour compenser les rendements élevés de la tylosine, les quantités déterminées dans les échantillons de lisiers sont divisées par 2. Néanmoins, au vu de ces résultats, les protocoles d extraction liquide (SPE) et solide (ASE) sont considérés comme valides et suffisament robustes. Tableau 58 : Rendements de quantification (justesse analytique) et d'extraction obtenus lors des différentes séries d analyses des échantillons de lisier provenant des élevages. composés Quantification (n=12) SPE (n=14) ASE (n=7) tylosine 94 ± ± ± 38 lincomycine 129 ± ± ± 6 marbofloxacine 95 ± 6 83 ± ± 61 tétracycline 102 ± 8 98 ± ± 17 oxytétracycline 104 ± ± ± 18 sulfadiazine 96 ± ± ± 10 monensine 103 ± ± ± 26 III.2. Bilan protocole extraction phase solide Le protocole final résultant de ces différents développements est schématisé Figure 76. Cette figure permet de visualiser clairement les diverses étapes du protocole. 214

215 Chapitre 4 : Développements analytiques Centrifugation 2 x (20 min, rpm, 4 c) (1 ère fois tout l'échantillon, 2 ème fois que le surnageant issu de la première centrifugation) SLIDE Lyophilisation 0,2 gr de matrice ASE Cellules 11 ml contaminées (complétées avec billes enrobées d'edta) pre-heat : 5 min heat : 5 min static : 5 min pression : 100 bar flush : 80 % purge : 60 sec nombre de cycles : 3 température : 70 C solvant : eau milliq/acn, 30/70, v/v Evaporation Rapidvap 60%, 40 C, 300 mbar, 30 min 65%, 40 C, 220 mbar, 40 min 70%, 40 C, 205 mbar, 50 min PARTICULAIRE Lyophilisation LIQUIDE Filtration GF/A (1,6 µm) puis GF/F (0,7 µm) DISSUT SPE Cartouches ASIS HLB 200 mg, 6 ml Préparation échantillons prise d'essai : 30 ml ajuster ph 7 ajout 2,08 ml d'une solution d'edta à 0,25 M ajout étalons internes Conditionnement cartouche 5 ml ACN puis 5 ml eau Vittel ph 7 Dépôt échantillon rinçage bouteilles 5 ml eau Vittel ph 7 Séchage 1 h sous vide Elution 5 ml eau/acn 40/60 v/v (eau Vittel ph 7) SPE Cartouches ASIS HLB 200 mg, 6 ml Préparation échantillons ajout 30 ml eau Vittel ph 7 ajout 1,25 ml d'une solution d'edta à 0,25 M baisse du ph (entre 4 et 5) Reconcentration Rapidvap 80%, 40 C, 150 mbar, 30 min 80%, 40 C, 100 mbar, 30 min 80%, 40 C, 70 mbar, 30 min et + reprise résidus : 3 rinçages ACN Reconcentration sous flux d'azote ajout 250 µl eau/acn 90/10 v/v (eau milliq) Analyse Injection RRLC/MS/MS Figure 76 : Protocoles d extractions de la phase solide d échantillons de lisiers porcins. IV. Contrôle qualité et quantification IV.1. Contrôle qualité Pour assurer la fiabilité d un résultat, deux éléments importants sont à vérifier : i) que les composés détectés proviennent bien de l échantillon en lui-même et non d une pollution apportée au cours du traitement de l échantillon, et ii) que les composés non détectés sont bien absents de l échantillon et non qu ils aient été perdus au cours du traitement de l échantillon. Plus le niveau de contamination est faible et plus il est important de vérifier ces 215

216 Chapitre 4 : Développements analytiques deux paramètres. Ces contrôles qualité appliqués dans le cas d analyse d eau souterraine ou d eau de boisson ont fait l objet d une publication «Trace-level analysis of organic contaminants in drinking waters and groundwaters» (Capdeville et Budzinski, 2011) (publication 1). Pour éviter le premier problème, c'est-à-dire le risque de faux positifs, des «blancs» sont réalisés en parallèle du traitement de chaque échantillon. Suivant le point de la méthodologie que l on veut contrôler (prélèvement, extraction ou analyse), les blancs peuvent être constitués d eau, de sédiments ou de solvant organique. Les étalons internes peuvent ou non y être ajoutés. Dans notre méthodologie, un blanc de manipulation est réalisé en parallèle de chaque série d extraction SPE et ASE. Ces blancs sont des cellules ASE ou des cartouches SPE dans lesquels aucun échantillon n est déposé mais qui subissent l ensemble du protocole d extraction/reconcentration. Ils servent à évaluer la pollution potentiellement apportée par les solvants, les réactifs, la verrerie, l atmosphère de travail, le matériel utilisé, le manipulateur. Ces blancs de manipulation contiennent les étalons internes sauf quand la pollution est amenée par les impuretés de ces étalons internes. Les quantités de composés détectés dans les blancs sont retranchées aux quantités mesurées dans les échantillons. De plus des blancs dits «blancs d injection» sont insérés régulièrement dans les séquences d analyse afin de contrôler que le système analytique n est pas responsable d une pollution de l échantillon. Cette pollution peut provenir des phases mobiles, du système d injection ou de la colonne si ces derniers ne sont pas correctement rincés entre 2 analyses successives. Pour évaluer les pertes de composés, des «dopages» sont réalisés en parallèle de chaque série d analyse. Ces dopages sont des matrices de constitution proche de celle des échantillons et dépourvues des composés recherchés. Elles sont enrichies avec les composés d intérêt. Pour cela, une quantité connue de composés est ajoutée au début du traitement. Dans nos méthodologies, de l eau minérale naturelle (Vittel) et du sédiment vaseux prélevé dans le bassin d Arcachon, lyophilisé, sont utilisés respectivement comme matrices en parallèle des extractions SPE et ASE. Une fois enrichis, ces échantillons subissent l ensemble des protocoles d extraction, reconcentration et analyse. Les taux de récupérations sont ensuite évalués par comparaison entre les quantités calculées et les quantités théoriques. Ils doivent être proches de 100 %. Pour compenser le problème des pertes lorsque la quantification est réalisée par étalonnage externe, les rendements calculés pour le dopage sont appliqués pour corriger les quantités déterminées dans les échantillons environnementaux. Ceci est vrai en partant du principe que le dopage mime parfaitement l échantillon, mais dans le cas où des effets matriciels interviendraient, comme ils sont échantillon-dépendants, un biais demeure. L étalonnage interne prend ici l avantage sur l étalonnage externe car les étalons internes ayant le même comportement que les composés qu ils servent à doser, les pertes et les effets matriciels seront identiques et les pertes des uns compenseront celles des autres au moment du calcul de quantification. IV.2. Méthodes de quantification Il existe 2 façons de déterminer la quantité de composé présente dans un échantillon. Soit l'intensité de la réponse analytique d'un composé de l'échantillon est comparée avec celle de ce même composé dans une solution étalon, dont la concentration en ce composé est connue. C'est l'étalonnage externe. Soit l'intensité de la réponse analytique d'un composé de l'échantillon est comparée avec celle d'un autre composé, appelé étalon interne et ajouté 216

217 Chapitre 4 : Développements analytiques volontairement en quantité connue dans ce même échantillon. C'est l'étalonnage interne. Les deux modes de quantification sont détaillés dans les paragraphes suivants. IV.2.1. Etalonnage externe La réalisation d'une gamme d'étalonnage est la technique communément employée pour quantifier les échantillons par étalonnage externe. La gamme est effectuée à partir de la dilution en série d'une solution de référence contenant en quantité connue l'ensemble des composés recherchés. Les différents points de la gamme sont ensuite injectés et un graphique : "intensité de la réponse en fonction de la quantité injectée" peut être tracé pour chaque composé. Si la réponse est linéaire sur l'ensemble des points, une droite est ainsi obtenue. A partir de la réponse analytique du composé et l'équation de cette droite, la quantité de composé, dans l'échantillon que l'on cherche à doser, peut être déterminée. Au cours de ces travaux de thèse, les gammes étaient constituées de 6 points correspondant à des quantités injectées allant d'environ 30 à picogrammes injectés. La linéarité pouvait être évaluée soit par l'intermédiaire du coefficient de corrélation, avec R² 0,999, soit par l'intermédiaire du ratio "intensité de la réponse / quantité injectée" qui doit toujours donner une même valeur pour une même molécule. Dans le cas où la réponse n'était pas linéaire sur la totalité de la gamme (6 points) des gammes plus petites de 3 points étaient utilisées. C'est ce qui est appelé la technique des "brackets". Afin de vérifier la justesse de la méthode d étalonnage externe, une gamme plus petite de 3 points était préparée en parallèle. Cette deuxième gamme était effectuée à partir de la dilution en série d'une autre solution de référence contenant en quantité connue l'ensemble des composés recherchés. Les dosages de ces 3 échantillons étaient ensuite réalisés et les quantités déterminées étaient alors comparées avec les quantités théoriques. Les rendements de quantification ainsi obtenus devaient être proches de 100%. Dans certain cas, la justesse était préférée à la linéarité. Dans ces cas-là, quand la linéarité sur l'ensemble des 6 points de la gamme était bonne mais que les rendements de quantification étaient meilleurs en utilisant la technique des "brackets", les échantillons environnementaux ont été quantifiés par la technique des "brackets" et non avec la totalité de la gamme. IV.2.2. Etalonnage interne L étalonnage interne repose sur la possibilité de quantifier un composé dans un échantillon à partir d un autre composé, l étalon interne, ajouté en quantité connue au début du traitement de l échantillon. Pour que cette technique fonctionne correctement, il faut que le composé et son étalon interne se comportent de la même façon aussi bien au moment de l'extraction (ex. : adsorption, rétention et élution identique sur la phase des cartouches SPE) que de l'évaporation (ex. : dégradation, volatilité, etc.) ou encore de l'analyse chromatographique (ex. : même temps de rétention). Pour cela, il faut que leurs propriétés physico-chimiques soient similaires. De plus, l étalon interne ne doit pas être initialement présent dans l échantillon à doser de façon à ce que sa quantité corresponde uniquement à ce qui a été ajouté et qu elle soit ainsi parfaitement connue. Pour satisfaire ces conditions, dans l idéal, l étalon interne est un analogue isotopique du composé étudié. Les hydrogènes, les 12 C ou les 14 N du composé étudié sont remplacés respectivement par des deutériums, des 13 C ou des 15 N sur l étalon interne. Cependant,il n existe pas d analogues isotopiques pour tous les composés étudiés et quand ils existent, ces composés sont très onéreux. Ainsi, pour des raisons pratiques 217

218 Chapitre 4 : Développements analytiques ou de coût, un même étalon interne peut être utilisé pour différents composés appartenant à une même classe ou famille et possédant des propriétés physico-chimiques proches. Une fois l étalon interne adéquate sélectionné pour chaque composé, il faut déterminer la valeur du facteur de réponse, K, de chaque composé par rapport à son propre étalon interne. Cela est réalisé à partir de l'injection d'une solution étalon de concentration connue contenant l'ensemble des composés et des étalons internes. La formule (1), basée sur le principe que la réponse analytique d'un composé est proportionnelle à la quantité injectée à un facteur de réponse près (k), est ensuite appliquée. K k k ei c Aei. Q A. Q c c ei (1) avec K facteur de réponse du composé C par rapport à l étalon interne ei A ei la réponse analytique de l'étalon interne ei en aire Q ei la quantité injectée de l'étalon interne ei k ei le facteur de réponse de l'étalon interne ei A c la réponse analytique du composé C en aire Q c la quantité de composé C injectée k c le facteur de réponse du composé C Si le composé et son étalon interne se comportent de la même façon, le facteur K est proche de 1. Pour vérifier l'adéquation entre le composé et son étalon interne, les rendements de quantification ou d'extraction des étalons internes peuvent être quantifiés par étalonnage externe. Une fois K défini, dans un échantillon environnemental auquel on a ajouté l'étalon interne ei, la quantité du composé C peut alors être déterminée d'après : Q K. Q. c ei A A c ei (2) avec K facteur de réponse du composé C par rapport à l étalon interne ei A ei la réponse analytique de l'étalon interne ei en aire Q ei la quantité injectée de l'étalon interne ei A c la réponse analytique du composé C en aire Q c la quantité de composé C injectée Pour vérifier la justesse de cette technique, une deuxième solution étalon de concentration connue, indépendante de la première, et contenant également l'ensemble des composés et des étalons internes doit être injectée. Elle est ensuite dosée comme un échantillon environnemental. La quantité calculée est alors comparée avec la quantité théorique. Le rendement de quantification doit être proche de 100 %. Le mode de quantification adopté pour chacun des composés étudiés est présenté dans le Tableau 59. Pour certains composés comme l ofloxacine par exemple, la quantification par étalonnage interne donne des résultats identiques à la quantification par étalonnage externe lorsque le protocle est appliqué à des échantillons d eau minérale dopés. En revanche, pour certaines molécules comme l érythromycine, un facteur qui n a pu être identifié est responsable, dans certaines séries d extraction, de la chute des rendements lorsque la quantification est faite par étalonnage externe. L ajout de l étalon interne (érythromycine- 13 C 2 ) a permis de corriger ce problème et de rendre l analyse fiable et reproductible. De même, les faibles rendements de l aténolol, lorsqu elle est quantitifée par étalonnage externe, en raison de son volume de fuite, sont corrigés lorsque le dosage est réalisé par étalonnage interne (Tableau 60). 218

219 Chapitre 4 : Développements analytiques Tableau 59 : Mode de quantification de chacun des composés étudiés. composé mode d'étalonnage mode d'étalonnage composé (étalon interne) (étalon interne) amoxicilline interne (amoxicilline- 13 C 6 ) sulfanilamide interne (sulfaméthazine- 13 C 6 ) ampicilline interne (ampicilline 15 N) sulfapyridine interne (sulfadiméthoxine-d 6 ) pénicilline G interne (pénicilline G-d 7 ) sulfathiazole interne (sulfaméthazine- 13 C 6 ) pénicilline V interne (pénicilline G-d 7 ) triméthoprime interne (triméthoprime- 13 C 3 ) oxacilline interne (pénicilline G-d 7 ) chloramphénicol interne (chloramphénicol -d 5 ) cloxacilline interne (pénicilline G-d 7 ) thiamphénicol interne (chloramphénicol -d 5 ) dicloxacilline interne (pénicilline G-d 7 ) métronidazole externe céfalexine externe monensine externe céfotaxime externe salinomycine externe cefpodoxime externe bacitracine externe ceftiofur externe virginiamycine externe céfuroxime interne (pénicilline G-d 7 ) rifampicine externe azithromycine interne (clarithromycine -d 3 ) acide fusidique externe clarithromycine interne (clarithromycine -d 3 ) aténolol interne (aténolol-d 7 ) érythromycine interne (érythromycine- 13 C 2 ) bisoprolol interne (propranolol-d 7 ) josamycine interne (clarithromycine -d 3 ) métoprolol interne (propranolol-d 7 ) roxithromycine interne (clarithromycine -d 3 ) propranolol interne (propranolol-d 7 ) spiramycine externe sotalol interne (propranolol-d 7 ) tylosine interne (clarithromycine -d 3 ) timolol interne (propranolol-d 7 ) lincomycine interne (lincomycine -d 3 ) 5-fluorouracil interne (5-fluorouracil- 15 N) clindamycine interne (lincomycine -d 3 ) cyclophosphamide externe et interne (propranolol-d 7 ) ciprofloxacine interne (ciprofloxacine- 13 C 2-15 N) daunorubicine externe enrofloxacine externe docétaxel externe marbofloxacine interne (ofloxacine-d 3 ) doxorubicine externe norfloxacine interne (norfloxacine-d 5 ) épirubicine externe ofloxacine interne (ofloxacine-d 3 ) gemcitabine externe acide oxolinique externe ifosfamide externe et interne (propranolol-d 7 ) acide pipémidique externe méthotréxate externe fluméquine externe tamoxifen interne (tamoxifen-d 5 ) tétracycline interne (tétracycline-d 6 ) abacavir externe oxytétracycline externe et interne indinavir externe (tétracycline-d 6 ) chlortétracycline externe lamivudine externe doxycycline externe et interne nelfinavir externe (tétracycline-d 6 ) sulfadiazine interne (sulfadiazine - 13 C 6 ) névirapine externe sulfadiméthoxine interne (sulfadiméthoxine-d 6 ) ritonavir externe sulfamérazine interne (sulfaméthazine- 13 C 6 ) saquinavir externe sulfaméthazine interne (sulfaméthazine- 13 C 6 ) stavudine externe sulfaméthizole interne (sulfaméthoxazole- 13 C 6 ) zidovudine externe sulfaméthoxazole interne (sulfaméthoxazole- 13 C 6 ) sildénafil interne (sildénafil-d 3 ) Tableau 60 : Exemple de rendements de manipulation (extraction + analyse) obtenus pour 3 molécules différentes au cours d une même expérience en fonction du mode d étalonnage utilisé. rendements (%) érythromycine ofloxacine aténolol étalonnage interne étalonnage externe

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221 CHAPITRE 5 Applications environnementales 221

222 222

223 Chapitre 5 : Applications environnementales Chapitre 5 : Applications environnementales I. APPLICATIN AUX MATRICES «EAUX» I.1. Tests d applicabilité des protocoles I.2. Continuum Hérault : STEP surface - captage I.2.1. Résultats de la campagne estivale I.2.2. Résultats de la campagne hivernale I.2.3. Comparaison saisonnière des résultats I.3. Projet FLASH I.3.1. Continuum hospitalier I Etude des classes thérapeutiques spécifiques à ces travaux I Etudes des autres classes thérapeutiques I Bilan toutes classes thérapeutiques confondues I.3.2. Continuum agricole I Etude des classes thérapeutiques spécifiques à ces travaux I Etude des autres classes thérapeutiques I Bilan toutes classes thérapeutiques confondues I.4. Conclusion sur la contamination des eaux II. APPLICATIN AUX MATRICES «LISIERS» II.1. Choix des molécules les plus pertinentes à étudier II.2. Conditionnement des échantillons II.3. rigine de la contamination du lisier stocké II.3.1. rigine du lisier brut et niveau de contamination II.3.2. Niveau de contamination du lisier stocké par rapport aux lisiers bruts II.3.3. Distribution des antibiotiques en fonction du stade physiologique et de l élevage considéré II.4. Devenir des antibiotiques dans les filières de traitement du lisier II.4.1. Filières traditionnelles de stockage du lisier II.4.2. Filières complexes avec traitement du lisier II.5. Devenir des antibiotiques en conditions contrôlées II.5.1. Dégradation en condition mésophile anaérobie et aérobie/anoxique II.5.2. Dégradation en condition mésophile aérobie/anoxique II.5.3. Dégradation en condition thermophile anaérobie II.5.4. Bilan sur le devenir des antibiotiques II.6. Conclusion sur la contamination des lisiers Le deuxième objectif de ces travaux de thèse était d utiliser les méthodologies développées pour des analyses environnementales. Dans un premier temps, il était nécessaire de vérifier l applicabilité des protocoles. Ainsi, le premier protocole multi-résidus, celui développé pour l analyse de 32 molécules pharmaceutiques (nommé «multi-résidus 32»), a été testé sur une dizaine d effluents de station d épuration. De la même façon, ultérieurement, le protocole spécifique au dosage de l amoxicilline et de l ampicilline a été testé sur des eaux usées brutes et traitées, respectivement en entrée et sortie de STEP. Une fois leur applicabilité confirmée, les méthodologies, optimisées pour des analyses d eau, ont été employées pour des suivis environnementaux dans les cadres du projet «continuum Hérault» et dans le cadre du projet FLASH. En parallèle, le protocole développé pour l analyse des antibiotiques dans les lisiers porcins a été utilisé dans un premier temps pour déterminer les meilleures modalités de conditionnement des échantillons entre le prélèvement et l analyse. Une fois le protocole d extraction de la phase solide développé et les conditions de stockage définies, 3 thèmes ont été étudiés : l origine de la contamination des lisiers en fonction du stade physiologique des cochons, le devenir des antibiotiques dans les filières de traitement du lisier (stockage simple ou filières complexes de traitement) et le devenir des antibiotiques en conditions contrôlées. Les valeurs brutes des résultats présentés dans ce chapitre sont récapitulées dans l annexe

224 concentrations (ng/l) Chapitre 5 : Applications environnementales I. Application aux matrices «eaux» I.1. Tests d applicabilité des protocoles Les effluents de STEP ont été choisis pour tester l applicabilité des protocoles en raison de leurs contaminations par les molécules pharmaceutiques, de la facilité d accès à leurs sites de prélèvement et de leurs faibles charges en matière organique (cf. Chapitre 3). Ainsi, 10 échantillons provenant d effluents de 9 STEP mettant en œuvre des procédés de traitement différents (cf. descriptif dans le chapitre 3, II.1. Eaux usées et autres échantillons d eau), prélevés dans le cadre du projet AMPERES, ont fait l objet d analyse en utilisant le protocole «multi-résidus 32». En plus de vérifier l applicabilité du protocole, ces tests devaient permettre d estimer les niveaux de contamination des composés sélectionnés, en particulier des anti-vih pour lesquels aucune donnée sur leur niveau de contamination en France n a été publiée à notre connaissance. Les résultats de ce screening sont présentés Figure 77. A titre d information, les dosages de cette première étude ont été quantifiés par étalonnage externe. concentration (ng/l) en antibiotiques, b-bloquants et anti-rétroviraux dans diverses échantillons d'effluents de STEP concentration (ng/l) en antibiotiques, b-bloquants et anti-rétroviraux dans diverses échantillons d'effluents de STEP clarithromycine érythromycine roxithromycine lincomycine ciprofloxacine ofloxacine clarithromycine érythromycine roxithromycine lincomycine ciprofloxacine ofloxacine acide oxolinique fluméquine tétracycline oxytétracycline doxycycline sulfaméthoxazole acide oxolinique fluméquine tétracycline oxytétracycline doxycycline sulfaméthoxazole triméthoprime métoprolol propranolol ritonavir zidovudine triméthoprime métoprolol propranolol ritonavir zidovudine CA PA 1 SE PA 1 SE PA 2 CA 5 CA 6-1 CA 6-2 SE 4 SE 5 SE 6 SE 9 STEP Figure 77 : Niveau de contamination et concentrations individuelles en antibiotiques, -bloquants et anti- VIH dans 10 effluents de STEP. (traitements appliqués dans les STEP (détails cf. chapitre 3 II.1. Eaux usées et autres échantillons d'eau) : CAPA1 = boues activées + filtres à sable + ozone, SEPA1 = boues activées + décantation rapide + filtres à sable, CA PA SEPA2 1 SE = boues PA 1 activées SE PA + filtres 2 à CA sable 5 + microfiltration CA CA osmose 6-2 inverse, SE CA5 4 = décantation SE 5 primaire SE 6+ filtre SE 9 biologique immergé aéré, CA6-1 = pré-traitement STEP + filtre planté de roseaux horizontal tertiaire, CA6-2 = prétraitement + filtre planté de roseaux horizontal conventionel, SE4 = pré-traitement + boues activées, SE5 = prétraitement + bioréacteur à membrane, SE6 = pré-traitement + décantation primaire + filtre biologique immergé aéré, SE9 = lit bactérien + filtre planté de roseaux) Au cours de l étude de ces 10 effluents de STEP, les molécules les plus souvent retrouvées ont été la clarithromycine et l érythromycine, identifiées dans 100 % des échantillons, ainsi 224

225 Chapitre 5 : Applications environnementales que l ofloxacine, le triméthoprime et le propranolol, identifiés dans 9 échantillons sur 10. La roxithromycine, le sulfaméthoxazole, le métoprolol, le ritonavir, la ciprofloxacine et la zidovudine ont également été fréquemment détectés. Ils ont été retrouvés dans plus de 50 % des échantillons. Du point de vue quantitatif, les molécules les plus abondantes sont l ofloxacine, la clarithromycine, la ciprofloxacine et la roxithromycine avec respectivement des concentrations maximales de 1077, 992, 542 et 402 ng/l. En conséquence, les antibiotiques de la famille des macrolides et des fluoroquinolones sont à la fois les plus fréquents et les plus abondants. Enfin, les deux anti-vih ont été détectés dans 60 % et 80 % des échantillons avec des concentrations maximales atteignant 142 et 134 ng/l pour la zidovudine et le ritonavir respectivement. Tableau 61 : Liste des 32 molécules pharmaceutiques recherchées au cours de cette première étude et leurs résultats d'analyse (concentration ng/l) en comparaison avec d'autres études françaises ayant recherchées et retrouvées, ou non, ces mêmes molécules dans dans des rejets de STEP (cases blanches : composés non recherchés, n.d : composés recherchés mais non détectés, valeurs : concentrations mesurées en ng/l pour les composés détectés). composés cette étude AFSSA 2009 Andreozzi et al., 2003 Coestier et al., 2009 Gabet-Giraud et al., 2010 Mullot, 2009 Piram et al., 2008 amoxicilline n.d ampicilline n.d pénicilline G n.d pénicilline V n.d oxacilline n.d cefpodoxime n.d ceftiofur n.d clarithromycine érythromycine roxithromycine lincomycine 63 n.d ciprofloxacine < cip < 1700 ofloxacine acide oxolinique 1 n.d fluméquine 1-8 n.d tétracycline chlortétracycline n.d oxytétracycline 40 doxycycline sulfaméthazine n.d n.d sulfaméthoxazole triméthoprime chloramphénicol n.d métoprolol propranolol cyclophosphamide n.d n.d 300 ifosfamide n.d n.d 4 n.d daunorubicine n.d doxorubicine n.d épirubicine n.d ritonavir zidovudine Il ressort donc de ce screening que 13 des 23 antibiotiques sélectionnés et que les 2 - bloquants et les 2 anti-vih ont été dosés dans les effluents de STEP. La capacité à identifier et à quantifier des composés à des concentrations proches de celles rapportées dans d autres études françaises a prouvé que le protocole développé était applicable (Tableau 61). Par exemple, dans cette étude l érythromycine, un antibiotique, a été détectée dans tous les rejets à des concentrations variant entre 17 et 182 ng/l. Dans son rapport sur les résidus de 225

226 flux (mg/j) débits (m 3 /j) Chapitre 5 : Applications environnementales médicaments dans les eaux de bassins versant français, l AFSSA (2009) a également identifié cette molécule dans des rejets de STEP à des concentrations légèrement plus fortes, variant entre 109 et 562 ng/l. De même, le métoprolol, un -bloquant, a été détecté dans 8 des 10 effluents de STEP analysés au cours de cette étude à des concentrations variants entre 3 et 168 ng/l et l AFSSA (2009) l a dosé à des concentrations similaires variant entre 29 et 190 ng/l. Gabet-Giraud et al. (2010) l ont également retrouvé dans ces mêmes rejets de STEP et dans d autres rejets de STEP à des concentrations similaires variant entre 16 et 435 ng/l (moyenne 156 ng/l). De plus, le sulfaméthoxazole, un antibiotique, et le propranolol, un -bloquant, ont été retrouvés à chaque fois dans les autres études de rejets de STEP françaises où ils ont été recherchés et les concentrations aux quelles ils ont été mesurés sont du même ordre de grandeur. En revanche, aucun des 5 anticancéreux recherchés (cyclophosphamide, ifosfamide, daunorubicine, doxorubicine, épirubicine) n a été détecté au cours de cette étude alors que Mullot (2009) a dosé du cyclophosphamide dans un rejet de STEP français, recevant des effluents hospitaliers, à une concentration de 300 ng/l et Coestier et al. (2009) ont détecté de l ifosfamide dans un rejet de STEP français, recevant aussi des effluents hospitaliers, à une valeur médiane de 4 ng/l. Les résultats d analyse d autres rejets de STEP européens, canadiens, nord-américains ou australiens sont présentés dans la partie V.3. Les eaux traitées (effluent / sortie de STEP) du chapitre 1 et dans l Annexe - tableau 4. Ainsi, par exemple, la zidovudine, un anti-vih, a été quantifiée dans 6 des 10 rejets de STEP analysés au cours de cette étude à des concentrations variant entre 15 et 142 ng/l et Prasse et al. (2010) l ont dosé en Allemagne à des concentrations du même ordre de grandeur ( ng/l). Pour compléter cette étude, en utilisant la valeur des débits de chacune des STEP (cf. Tableau 39), les flux des 17 molécules détectées ont pu être calculés (Tableau 62). Les STEP qui ont les plus gros débits sont celles qui émettent les plus gros flux de médicaments (Figure 78). Les 3 STEP qui rejettent journalièrement le plus de médicaments sont par ordre décroissant SE-PA 1, SE 4 et CA 5 avec des flux totaux de 59, 22 et 16 g/j respectivement. Les molécules les plus rejetées avec des flux souvent supérieurs au g/j sont l ofloxacine (max. : 30,8 g/j SE- PA 1), la cicprofloxacine (max. : 15,5 g/j SE-PA 1) et la clarithromycine (max. : 5,6 g/j CA 5). En plus de ces 3 antibiotiques, l érythromycine et le triméthoprime, 2 autres antibiotiques, mais aussi le propranolol, un -bloquant, et le ritonavir, un anti-vih, peuvent également être rejetés à des fortes quantités pouvant atteindre un ou plusieurs g/j (Tableau 62) CA PA 1 SE PA 1 SE PA 2 CA 5 CA 6-1 CA 6-2 SE 4 SE 5 SE 6 SE 9 STEP Figure 78 : Flux totaux, en mg/j (histogramme), de molécules pharmaceutiques émis par les STEP et débits, en m 3 /j (courbe), des STEP

227 Chapitre 5 : Applications environnementales Tableau 62 : Flux de molécules pharmaceutiques en sorties de STEP exprimés en mg/j. composés CA PA 1 SE PA 1 SE PA 2 CA 5 CA 6-1 CA 6-2 SE 4 SE 5 SE 6 SE 9 clarithromycine érythromycine ,3 0, roxithromycine ciprofloxacine ofloxacine lincomycine 916 acide oxolinique 0,01 0,01 fluméquine ,2 tétracycline oxytétracycline 586 doxycycline sulfaméthoxazole , ,3 triméthoprime ,02 0, ,5 métoprolol propranolol ,2 0, ritonavir zidovudine Ultérieurement, au cours d une autre étude, afin de vérifier l applicabilité du protocole développé spécifiquement pour le dosage de l amoxicilline et de l ampicilline, des eaux usées brutes et traitées prélevées respectivement en entrée et sortie de STEP ont été analysées. L'amoxicilline n'a été identifiée dans aucun des échantillons (MDL = 40 ng/l). L'ampicilline a été détectée dans tous les échantillons mais à des valeurs inférieures à la limite de quantification (< 35 ng/l). Les échantillons qui ont servi de tests ont été prélevés en été donc à une période où ces molécules pharmaceutiques ne sont pratiquement pas consommées. Afin de conclure de manière définitive sur l absence ou la dégradation de ces pénicillines, il sera nécessaire de renouveler ces analyses sur des échantillons prélevés en hiver quand l'utilisation des antibiotiques est maximale. I.2. Continuum Hérault : STEP surface - captage Une fois validé et applicable, le protocole «multi-résidus 32» a été utilisé pour l étude de quatre stations d épuration, de deux rivières impactées par ces rejets de STEP et d eaux de captage. Les résultats des échantillons prélevés en été sont présentés dans la Figure 79 et ceux des échantillons prélevés en hiver dans la Figure 81. A titre informatif, aux cours de ces 2 campagnes, des premiers tests de quantitifaction par étalonnage interne ont été réalisés avec l ajout de 4 étalons internes dans les échantillons. Cependant les résulats présentés ci-après sont issus de calcul par étalonnage externe car l étalonnage interne n a pu être appliqué en raison de différences trop fortes entre les concentrations des étalons internes et celles des composés à dosés (problème de linérarité des réponses). I.2.1. Résultats de la campagne estivale En été, à l exception de la STEP B, plusieurs molécules ont été retrouvées dans toutes les stations : 3 macrolides (clarithromycine, érythromycine, roxithromycine), 2 fluoroquinolones (ciprofloxacine et ofloxacine), 1 tétracycline (doxycycline), 2 sulfonamides (sulfaméthoxazole, triméthoprime) et 2 -bloquants. A l exception de la doxycycline, ce sont les mêmes molécules majoritaires que celles détectées dans l étude des 10 effluents de STEP présentée dans le paragraphe I.1. Dans leur review, Miège et al. (2009) listent les classes 227

228 entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie concentration (ng/l) concentration (ng/l) entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie concentration (ng/l) Chapitre 5 : Applications environnementales thérapeutiques les plus étudiées mais aussi les molécules les plus souvent analysées (Tableau 23). Au sein des antibiotiques, parmi les 8 composés indiqués précédement, 6 sont communs avec la liste de Miège et al. (clarithromycine, érythromycine, roxithromycine, ciprofloxacine, sulfaméthoxazole et triméthoprime). En revanche, l ofloxacine et la doxycyline n apparaissent pas dans cette liste mais elles ont toutes les 2 été régulièrement dosées dans des eaux usées en entrée ou en sortie de STEP (Andreozzi et al., 2003 ; Zuccato et al., 2005 ; Vieno et al., 2006 ; Thomas et al., 2007 ; Gros et al., 2009 ; Watkinson et al., 2009). Parmi les composés majoritairement retrouvés,les 2 -bloquants, le métoprolol et le propranolol, apparaissent aussi dans la liste de Miège et al. (2009). L anti-vih ritonavir a été dosé dans les 2 plus grosses stations (STEP L éq. hab. et STEP CL éq. hab.) qui, de plus, perçoivent des effluents hospitaliers. Les sulfonamides et les anti-vih n ont pas été identifiés dans la STEP B mais comme dans les autres STEP, les -bloquants et les macrolides y ont été détectés ritonavir propranolol metoprolol zidovudine triméthoprime 6000 ritonavir sulfaméthoxazole 5000 propranolol doxycycline metoprolol 4000 triméthoprime tétracycline sulfaméthoxazole ofloxacine doxycycline 2000 ciprofloxacine 900 entrée sortie entrée sortie entrée sortie entréetétracycline roxithromycine sortie ofloxacine 700 L CL P ciprofloxacine Bérythromycine roxithromycine clarithromycine L 500 CL P B érythromycine 400 clarithromycine 300 L CL P B entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie L CL P B zidovudine clarithromycine ofloxacine sulfaméthoxazole ritonavir amont aval amont aval P1 B1 rivière L rivière H captage roxithromycine fluméquine daunorubicine Figure 79 : Présence et niveau de contamination des molécules pharmaceutiques en entrée et en sortie de 4 stations d'épuration, en amont et en aval de ces rejets dans des eaux de surface et dans des eaux de captage souterraines en été. Dans certains cas, la contamination totale est apparue plus importante en sortie de STEP qu en entrée (STEP L et STEP B). De même, certaines molécules ont été dosées à des concentrations plus fortes en sortie qu en entrée (exemples : érythromycine STEP P ou ofloxacine et propranolol STEP L). Gros et al. (2006) rapportent aussi des concentrations en propranolol plus fortes en sortie de STEP (entre 100 et 470 ng/l) qu en entrée (entre 80 et 290 ng/l). Ces mesures de concentrations plus élevées en sortie pourraient être dues aux problèmes d effet matriciel qui provoquent des diminutions de signal dans des matrices très chargées comme les entrées de STEP. Le signal étant diminué en entrée, la contamination semble plus forte en sortie. Cette hypothèse est corroborée par les rendements d extraction et d analyse calculés sur les étalons internes. Ainsi par exemple, les rendements calculés pour l étalon interne de l érythromycine, l érythromycine- 13 C 2, sont de 1 ± 0,8 % en entrée de STEP et de 59 ± 37 % en sortie de STEP. Pour contourner ces problèmes d effet matriciel, 228

229 Chapitre 5 : Applications environnementales Gomez et al. (2006) suggèrent par exemple de diluer les échantillons avant de les analyser (cf. chapitre 3 partie I.4 Techniques analytiques). Une autre hypothèse, pour expliquer les concentrations plus fortes en sortie qu en entrée, concerne la déconjugaison des molécules. Certaines molécules, comme le propranolol par exemple, sont excrétées sous forme conjuguée (dictionnaire Vidal, 2006) et ne sont donc pas dosées dans les eaux en entrée de STEP. Les traitements appliqués dans les STEP peuvent provoquer la déconjugaison des molécules qui se retrouvent alors sous forme libre et donc analysable dans les effluents de sortie. Cela a été proposé par Vieno et al. (2006) pour expliquer des concentrations en carbamazépine plus forte en sortie qu en entrée de STEP par exemple. Enfin, une dernière hypothèse provient des mesures effectuées sur des prélèvements ponctuels combinés à une élimination faible ou nulle des composés dans les STEP comme c est par exemple le cas pour l érythromycine ou le propranolol. En effet, Castiglioni et al. (2006) et Kasprzyk-Hordern et al. (2009) ont montré que l érythromycine n était pas ou que faiblement (50 %) dégradé dans les STEP et Bendez et al. (2005), Kasprzyk-Hordern et al. (2009) et Gabet-Giraud et al. (2010) ont montré que le propranolol n était que faiblement dégradée (22-32 %) dans des STEP mettant en œuvre des procédés de traitement par boues activées comme c est le cas des STEP L et P. L analyse des eaux de surface a clairement mis en évidence l impact des rejets de STEP sur la contamination du milieu, d une part car la concentration totale en aval est supérieure à celle en amont, respectivement 5 et 60 ng/l dans la rivière L et 0 et 23 ng/l dans la rivière H ; et d autre part car ce sont les mêmes molécules qui ont été dosées dans les eaux de surface et dans les rejets de STEP (exemple : ritonavir) (Figure 79). Bendz et al. (2005) en Suède, Castiglioni et al. (2006) en Italie ou encore Gabet-Giraud en France dans sa thèse (2009) mettent aussi en évidence l impact des rejets de STEP sur la contamination des eaux de surface avec des concentrations mesurées en aval des rejets nettement supérieures à celles mesurées en amont. En se focalisant sur 5 molécules représentant chacune les familles d antibiotiques ou classes thérapeutiques majoritaires détectées (érythromycine pour les marcolides, ofloxacine pour les fluoroquinolones, sulfaméthoxazole pour les sulfonamides, propranolol pour les -bloquants et ritonavir pour les anti-vih), la Figure 80 appuie et illustre ces conclusions. Par ailleurs, elle permet de préciser : i) que ce sont les 2 plus grosses STEP (STEP L et STEP CL) qui sont responsables de la contamination de la rivière L, et ii) que c est la rivière L qui contamine la rivière H. En effet, dans le premier cas, le sulfaméthoxazole et le ritonavir ne sont pas présents ni en amont de la rivière L ni dans le rejet de la STEP B mais uniquement dans les rejets des STEP L et CL or ils sont détectés dans la rivière L en aval de ces rejets. Dans le deuxième cas, le ritonavir n est pas présent ni en amont de la rivière H ni dans le rejet de la STEP P mais il est détecté dans la rivière L et dans la rivière H en aval de la confluence de ces 2 rivières. Et à l inverse, l érythromycine, détectée dans le rejet de la STEP P, n est pas retrouvée en aval dans la rivière H. Le sulfaméthoxazole est la seule molécule qui a été dosée dans les eaux de captage (B1). Deux hypothèses peuvent expliquer ce résultat, d une part le sulfaméthoxazole est une molécule particulièrement résistante (Avisar et al., 2009), elle peut donc provenir des eaux de la rivière L qui alimente en partie la nappe souterraine (Figure 80), et d autre part l analyser est une chose relativement aisée et fiable, d autres molécules auraient donc pu potentiellement être présentes mais n ont pas été détectées. C est certainement pour ces mêmes raisons que le sulfaméthoxazole a également été identifié dans des eaux souterraines par Sacher et al. (2001) en Allemagne, par Barnes et al. (2008) aux USA et par Avisar et al. (2009) en Israël ou dans des eaux de boisson par Chen et al. (2006) au Canada, Ye et al. (2007) aux USA et Vulliet et al. (2009) en France. 229

230 concnetration (ng/l) concnetration (ng/l) concnetration (ng/l) Chapitre 5 : Applications environnementales amont rivière L amont rivière L amont rivière L sortie STEP L sortie STEP L sortie STEP L été été été sortie STEP CL sortie STEP CL sortie STEP CL sortie STEP B sortie STEP B sortie STEP B ritonavir propranolol sulfaméthoxazole ofloxacine ritonavir érythromycine propranolol sulfaméthoxazole ofloxacine érythromycine aval rivière L aval rivière L aval rivière L captage B1 captage B1 captage B amont rivière L amont rivière H sortie STEP L été aval rivière L été sortie STEP CL sortie STEP B sortie STEP P ritonavir propranolol sulfaméthoxazole ofloxacine érythromycine aval rivière L aval rivière H Figure 80 : Influence des rejets de STEP sur la contamination des rivières et des eaux de surface étudiées le long du continuum Hérault en été. captage B1 captage P1 I.2.2. Résultats de la campagne hivernale Au cours des analyses des échantillons prélevés en hiver, l amoxicilline a été détectée dans tous les échantillons d eaux usées en entrée et en sortie des 4 STEP à l exception des eaux usées brutes en entrée de la STEP B. Cependant, considérant les difficultés analytiques liées à ce composé lorsqu il est analysé avec le protocole global et le manque de fiabilité sur les valeurs de concentrations que cela engendre, les concentrations en amoxicilline n ont pas été retenues et ce composé n apparait pas sur la Figure 81. Seule la présence d amoxicilline dans les eaux usées en hiver et son absence dans ces mêmes eaux en été pourra être retenue. Au moment où ces analyses ont été pratiquées, le protocole spécifique à l amoxicilline n avait pas encore été optimisé. En hiver, comme en été, les mêmes molécules et les mêmes tendances ont été observées dans les deux plus grosses STEP, L et CL. Les 3 macrolides, les 2 fluoroquinolones, les 2 sulfonamides, les 2 -bloquants et l anti-vih ritonavir ont été analysés à la fois dans les eaux usées brutes et dans les eaux usées traitées. Les eaux usées traitées rejetées par la STEP L sont globalement plus contaminées que les eaux brutes prélevées en entrée de la station. En revanche, dans les 2 autres petites stations, les tendances et la composition des eaux ne sont pas les mêmes entre les 2 saisons. En effet, dans ces 2 petites stations, les tendances se sont inversées. En hiver, les eaux traitées de la STEP P sont plus contaminées en sortie qu en entrée de station alors qu en été, une diminution de la contamination totale a été observée en sortie de la STEP. Les eaux usées et traitées de la STEP B sont contaminées à un niveau équivalent en hiver, proche de 930 ng/l, alors qu en été, les eaux rejetées par la STEP sont plus polluées que les eaux usées brutes. La composition des eaux a aussi changé entre les 2 saisons. En été, le sulfaméthoxazole est la molécule la plus abondante mesurée en entrée de la STEP P alors qu en hiver, la molécule majoritaire est la ciprofloxacine. De même, en été, l érythromycine était la molécule la plus abondante dosée dans les eaux usées traitées en sortie de cette même station alors qu en hiver, le métoprolol est majoritaire. De la même façon, en été, le propranolol et la clarithromycine sont les molécules qui ont les plus fortes concentrations respectivement en entrée et en sortie de STEP B alors qu en hiver, il s agit de 230

231 entrée sortie entrée entrée sortie sortie entrée entrée sortie sortie entrée entrée sortie sortie entrée sortie concentration (ng/l) concentration (ng/l) concentration (ng/l) Chapitre 5 : Applications environnementales la ciprofloxacine et du métoprolol. Cependant, il faut rappeller que ces résultats sont issus d analyses pratiquées sur des échantillons prélevés de façon ponctuelle. Aussi ils renseignent sur l état de la contamination à un moment donné mais les conclusions sur l abondance et le niveau de concentration de certaines molécules par rapport à d autres auraient pu être différents si l échantillonnage avait été réalisé quelques heures ou quelques jours plus tôt ou plus tard. Il faut également tenir compte de la variabilté analytique dans l interprétation de ces informations (cf. le critère «précision» évalué au travers des variations intra- et inter-jours Tableau 54) clarithromycine clarithromycine érythromycine érythromycine roxithromycine roxithromycine ciprofloxacine ciprofloxacine ofloxacine ofloxacine fluméquine fluméquine tétracycline tétracycline doxycycline doxycycline sulfaméthoxazole sulfaméthoxazole triméthoprime triméthoprime metoprolol metoprolol propranolol propranolol ritonavir ritonavirzidovudine zidovudine amont aval amont aval P1 B1 L LCL CLP PB B rivière L rivière H captage Figure 81 : Présence et niveau de contamination des molécules pharmaceutiques en entrée et en sortie de 4 stations d'épuration, en amont et en aval de ces rejets dans des eaux de surface et dans des eaux de captage souterraines en hiver (concentration et présence de l amoxicilline non présenté). En hiver, l influence des rejets de STEP sur les niveaux de contamination des eaux de surface est moins marquée qu en été (Figure 82). Ainsi, les eaux de la rivière L sont plus contaminées en amont qu en aval des rejets de STEP et les eaux de la rivière H, qui n étaient pas contaminées en amont des rejets en été, le sont en hiver. De plus, contrairement à la saison estivale, le ritonavir, qui est toujours détécté dans les rejets des STEP L et CL ne l est plus dans la rivière L. En plus du sulfaméthoxazole, seule molécule détectée dans les eaux de captage en B1 en été, de l érythromycine a été retrouvée en hiver dans les 2 eaux de captages. La présence d érythromycine dans les eaux de la rivière H, à proximité du point de captage P1, et dans les eaux de la rivière L, à proximité du point de captage B1, peut expliquer la présence de ce composé dans les eaux de captage (Figure 82). En revanche, le sulfaméthoxazole n a été quantifié que dans les eaux de capatge en B1 alors qu il a été détecté, mais n a pu être quantifié, dans les eaux des 2 rivières. La persistance de ce composé dans la nappe souterraine, déjà détecté en B1 en été, pourrait expliquer cette observation. Avisar et al. (2009) expliquent aussi la présence de ce composé dans les aquifères qu ils ont analysés par sa résistance à la dégradation. 231

232 concentration (ng/l) concentration (ng/l) concnetration (ng/l) concnetration (ng/l) concnetration (ng/l) Chapitre 5 : Applications environnementales amont rivière L amont rivière L amont rivière L sortie STEP L sortie STEP L été sortie STEP L hiver été sortie STEP CL sortie STEP CL sortie STEP CL sortie STEP B sortie STEP B sortie STEP B ofloxacine ritonavir érythromycine propranolol sulfaméthoxazole ofloxacine érythromycine aval rivière L aval rivière L aval rivière L ritonavir propranolol sulfaméthoxazole captage B1 captage B1 captage B amont rivière L amont rivière H sortie STEP L aval rivière L été hiver sortie STEP CL sortie STEP B sortie STEP P ritonavir propranolol sulfaméthoxazole ofloxacine érythromycine aval rivière L aval rivière H Figure 82 : Influence des rejets de STEP sur la contamination des rivières et des eaux de surface étudiées le long du continuum Hérault en hiver. captage B1 captage P1 I.2.3. Comparaison saisonnière des résultats Pour compléter cette étude, les concentrations, totales (Figure 83) et individuelles (Figure 84 et Figure 85) de chaque molécule, mesurées en été et en hiver ont été comparées été hiver - amox entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie été hiver amont aval amont aval P1 B1 L CL P B rivière L rivière H captage Figure 83 : Comparaison saisonnière de la contamination totale des eaux usées en entrée et sortie de STEP, des eaux de surface en amont et en aval de ces rejets et des eaux de captage. Du point de vue global, il ressort qu à l exception de la station P, les eaux usées sont plus contaminées en hiver qu en été avec respectivement des concentrations moyennes proches de 1,6 µg/l et 0,5 µg/l. A l inverse, en aval des rejets de STEP, les eaux de surfaces sont contaminées de façon plus abondante en été qu en hiver. Ces résultats peuvent s expliquer d une part, par une plus forte consommation de médicaments, tels que les antibiotiques, en hiver et donc une plus forte contamination des eaux usées à cette saison ; et d autre part, par la dilution plus faible des rejets de STEP dans les rivières en période estival en raison du manque de précipitation et donc du débit et du volume plus faible des rivières. Dans leur étude saisonnière de la STEP de Varese lona, Casiglioni et al. (2006) mettent aussi en évidence une contamination plus forte des eaux usées en hiver qu en été pour des composés 232

233 Chapitre 5 : Applications environnementales comme les antibiotiques ou les anti-inflammatoires dont les modes de consommation sont saisonniers. Aucune conclusion n a pu être tirée sur l impact de la saison sur les eaux de captage puisqu en P1 l eau est plus contaminée en hiver qu en été et que la tendance inverse a été observée en B1. Du point de vue individuel, le comportement de chacune des 14 molécules quantifiées dans les eaux usées et des 7 molécules quantifiées dans les eaux de surface et de captage est présenté respectivement dans les Figure 84 et Figure 85. Les flux des molécules, en entrée et en sortie de STEP, calculés à partir des débits moyens annuels de chaque STEP sont présentés dans le Tableau 63. Ils ont été utilisés pour calculer les abattements dans les STEP (Tableau 64) à partir de la formule suivante : flux entrée flux sortie abattement 100 flux entrée Les 3 macrolides, la clarithromycine, l érythromycine et la roxithromycine, présentent des comportements similaires dans les STEP (Figure 84). A l exception de la sortie de STEP P, les concentrations sont systématiquement plus importantes, ou équivalentes dans le cas de la STEP B, en hiver qu en été. De plus, quelle que soit la saison, les concentrations sont équivalentes, si on considère la variabilité analytique, ou plus fortes en sortie qu en entrée de STEP ce qui se traduit par des abattements négatifs ou faibles (< 40%) (Tableau 64). Ceci est en accord avec les conclusions de Castiglioni et al. (2006), qui estiment les rendements médians de la clarithromycine comme nuls par exemple, ou avec les conclusions de Gros et al. (2009), de Miège et al. (2009) et les valeurs relevées dans la littérature et présentées Figure 7 (élimination des macrolides variant entre 0 % et 50 % avec une moyenne < 20 %) ou dans l Annexe - tableau 1. Les valeurs des flux de ces 3 molécules sont notables mais ne sont pas toujours les plus importants par rapport aux autres molécules. Parmi ces 3 antibiotiques, les flux les plus importants sont ceux de la clarithromycine qui peuvent atteindre 2,2 g/j en hiver en sortie de la STEP L. Enfin, la clarithromycine et l érythromycine, mais pas la roxithromycine, sont présents en hiver dans les 2 rivières, en amont et en aval des rejets, à des concentrations proches ou inférieures à 10 ng/l (Figure 85). La clarithromycine et la roxithromycine sont présentes en été en aval dans les 2 rivières. Gros et al. (2006) ont aussi détecté de l érythromycine dans le bassin de la rivière Ebre, en Espagne, à une concentration moyenne de 17 ng/l. Les 2 fluoroquinolones, la ciprofloxacine et l ofloxacine, ont des concentrations équivalentes ou plus fortes en hiver qu en été (Figure 84). Leurs flux sont également plus importants en hiver (plusieurs centaines de mg/j) qu en été (une centaine de mg/j) (Tableau 63). Les flux les plus importants sont émis par la STEP CL en hiver (1,4 g/j pour la ciprofloxacine et 2 g/j pour l ofloxacine). Castiglioni et al. (2006) remarquent aussi une charge plus importante de ces 2 composés en hiver qu en été dans la STEP de Varese lona (ex. : 490 mg/j/1000 habitants en hiver et 259 mg/j/1000 habitants en été pour la ciprofloxacine). Comme pour les macrolides, ces observations sont en lien avec les modes d usage de ces médicaments. A l exception de la STEP L en été et de la STEP P en hiver pour l ofloxacine, quelle que soit la saison, leurs concentrations sont équivalentes ou plus faibles en sortie de STEP qu en entrée ce qui se traduit par des bons abattements variants entre 41 % et 91 % pour la ciprofloxacine et entre 4 % et 95 % pour l ofloxacine (Tableau 64). Gros et al. (2009) notent aussi des rendements variants entre 37 % et 99 % pour la ciprofloxacine et entre 20 % et 99 % pour la l ofloxacine. Comme pour Castiglioni et al. (2006), l influence de la 233

234 concentration (ng/l) concentration (ng/l) concentration (ng/l) concentration (ng/l) concentration (ng/l) concentration (ng/l) concentration (ng/l) concentration (ng/l) concentration (ng/l) concentration (ng/l) concentration (ng/l) concentration (ng/l) concentration (ng/l) Chapitre 5 : Applications environnementales clarithromycine été hiver entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie érithromycine 1724 été hiver entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie roxithromycine été hiver entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie STEP L STEP CL STEP P STEP B STEP L STEP CL STEP P STEP B STEP L STEP CL STEP P STEP B ciprofloxacine ofloxacine été hiver été hiver entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie 0 entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie STEP L STEP CL STEP P STEP B STEP L STEP CL STEP P STEP B tétracycline doxycyline été hiver été hiver entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie 0 entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie STEP L STEP CL STEP P STEP B STEP L STEP CL STEP P STEP B sulfaméthoxazole 5088 été hiver triméthoprime été hiver 0 entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie 0 entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie STEP L STEP CL STEP P STEP B STEP L STEP CL STEP P STEP B métoprolol propranolol été hiver été hiver entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie 0 entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie STEP L STEP CL STEP P STEP B STEP L STEP CL STEP P STEP B ritonavir zidovudine été hiver entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie été hiver entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie STEP L STEP CL STEP P STEP B STEP L STEP CL STEP P STEP B Figure 84 : Comparaison saisonnière de la contamination des eaux usées en entrée et sortie de STEP pour chacune des 14 molécules détectées dans ces eaux. 234

235 Chapitre 5 : Applications environnementales saison sur les abattements n est pas significative (Tableau 65). Quelque soit la saison, la ciprofloxacine n a jamais été détectée dans les eaux de surface. En revanche, Tamtam et al. (2008) ont détecté de la ciprofloxacine dans les eaux de la Seine mais n ont pu mesurer sa concentration qui était inférieure à leurs limites de quantitifcation (10 ng/l). Bien que non identifiée en été dans les eaux en amont de la rivière H, l ofloxacine a été quantifiée en été et en hiver, dans les 2 rivières, à des concentrations équivalentes, comprises entre 5 et 7 ng/l (Figure 85). Tamtam et al. (2008) ont dosé de l ofloxacine dans la Seine à une concentration moyenne de 30 ng/l au niveau du barrage de Pose. Les 2 tétracyclines, la tétracycline et la doxycycline, ont été mesurées à de faibles concentrations dans les eaux usées, comparativement aux autres composés détectés dans ces échantillons (Figure 84) et n ont pas été quantifiées dans les eaux de surface. La plus forte concentration relevée pour la tétracycline est de 21 ng/l en entrée de la STEP B et elle est de 13 ng/l en entrée de la STEP P pour la doxycycline. Du fait de leurs faibles concentrations, elles contribuent peu aux flux de molécules pharmaceutiques dans les STEP. Leurs flux sont de l ordre de quelques mg/j (Tableau 63). Ces 2 antibiotiques ont des comportements saisonniers différents dans les STEP (Figure 84). La tétracycline est majoritairement retrouvée en hiver, avec une fréquence de détection de 75 % contre 37,5 % en été, alors que la doxycycline est plus retrouvée en été avec une fréquence de détection de 87,5 % contre 62,5 % en hiver. En revanche, elles semblent avoir le même comportement vis-à-vis de leur dégradation dans les STEP avec des concentrations mesurées en sortie équivalentes ou plus faibles que celles mesurées en entrée. Les abattements calculés pour la tétracycline varient entre - 29 % et 78 % et ceux pour la doxycycline entre - 15 % et 71 % (Tableau 64). Gros et al. (2010) ont calculé des meilleurs abattements pour la tétracycline avec des taux d élimination variant entre 40 % et 89 %. Les 2 sulfonamides, le sulfaméthoxazole et le triméthoprime, ont des comportements et des tendances très similaires (Figure 84). Ceci est cohérent avec les pratiques médicales qui leurs sont associées puisqu ils sont généralement administrés en même temps (ex. : Bactrim, dictionnaire Vidal, 2006). A l exception de l entrée de la STEP P, où des concentrations particulièrement élévées ont été mesurées (5 088 ng/l pour le sulfaméthoxazole et 574 ng/l pour le triméthoprime), leurs concentrations estivales sont légèrement plus faibles (12-84 ng/l pour le sulfaméthoxazole et ng/l pour le triméthoprime) que leurs concentrations hivernales (3-212 ng/l pour le sulfaméthoxazole et ng/l pour le triméthoprime). Avec des flux de l ordre de la centaine de mg/j à quelques centaines de mg/j, en été comme en hiver, ces 2 antibiotiques contribuent de façon importante aux flux totaux des molécules pharmaceutiques dans les STEP (Tableau 63). En revanche, Castiglioni et al. (2006) ont observés une différence importante entre les flux selon la saison. Pour eux, les flux en entrée de STEP sont plus importants en hiver (209 mg/j/1000 habitants) qu en été (0 mg/j/1000 habitants). La valeur de flux qu ils ont relevés pour le sulfaméthoxazole en hiver dans les eaux usées en entrée de la STEP de Varese lona (209 mg/j/1000 habitants) est du même ordre de grandeur que celles relevées dans cette étude (moyenne flux sulfaméthoxazole en entrée de STEP en hiver : 152 mg/j). Les tendances de ces 2 molécules dans les STEP semblent aléatoires. Les concentrations sont plus fortes dans les eaux usées brutes que dans les eaux usées traitées pour la STEP CL en hiver et en été pour la STEP P. Ce qui se traduit par des abattements variants entre 65 % et 98 % pour le sulfaméthoxazole et entre 15% et 69 % pour le triméthoprime (Tableau 64). Ce qui est en accord avec les rendements d élimination relevés par Gros et al. (2010) qui sont compris entre 30 % et 92 % pour le sulfaméthoxazole et celui relevé par Bendz et al. (2005) de 49 % pour le triméthoprime. A l inverse, les concentrations sont plus fortes dans les eaux usées traitées que dans les eaux 235

236 Chapitre 5 : Applications environnementales usées brutes en été et en hiver dans la STEP L et en hiver dans la STEP P (Figure 84). Ce qui se traduit par des abattements négatifs variants entre % et % pour le sulfaméthoxazole et entre -247 % et % pour le triméthoprime (Tableau 64). Comme précédemment justifié (cf. 210), ces valeurs impressionnantes peuvent en partie s'expliquer par le type d'échantillonnage pratiqué (échantillonnage ponctuel). Gobel et al. (2007) notent également des rendement d élimination très variable pour ces 2 molécules, entre -138 % et 60 % pour le sulfamthéxazole et entre - 40 % et 20 % pour le triméthoprime, dans des STEP mettant en œuvre des procédés de traitement par boues activées comme c est le cas des STEP L et P. Le triméthorpime et le sulfaméthoxazole ont été détectés en hiver dans les eaux de surface mais n ont pu être quantitifés. Le sulfaméthoxazole a en revanche pu être quantifié en été dans les eaux de la rivière L, en aval des rejets de STEP à une concentration de 12 ng/l (Figure 85). Dans la littérature, Gros et al. (2006) l ont détecté mais ne peuvent pas non plus le quantifier dans des eaux de surface et Bendz et al. (2005) l ont quantifié une fois, sur 3 analyses, à une concentration de 10 ng/l proche de celle mesurée dans cette étude. Le sulfaméthoxazole est identifié en hiver et en été dans les eaux souterraine de captage en B1 (cf. paragraphe I.2.1 et I.2.2 précédents). Dans l ensemble des 4 STEP, les concentrations en métoprolol sont plus élevées en hiver qu en été alors qu elles sont relativement similaires entre les 2 saisons pour le propranolol (Figure 84). En conséquence, les flux du métoprolol sont également plus importants en hiver, en moyenne 284 mg/j conte 46 mg/j en été alors que ceux du propranolol sont proches, en moyenne 117 mg/j en hiver et 92 mg/j en été (Tableau 63). Les concentrations du métoprolol sont soit similaires soit plus fortes dans les eaux usées traitées (hiver : ng/l, été : ng/l) que dans les eaux brutes (hiver : ng/l, été : ng/l) (Figure 84). En conséquence, les abattements sont négatifs ou très faibles. Ils varient entre % pour la STEP B en hiver et 9 % pour la STEP CL en hiver (Tableau 64). Comme pour le sulfaméthoxazole ou le triméthoprime, la valeur de " %" peut s expliquer par la variabilité de la mesure consécutif un échantillonnage de type ponctuel. Des concentrations en entrée (4,6-473 ng/l) et en sortie (15,8-435 ng/l) de STEP, proches de celles relevées en hiver dans cette étude, ont été rapportées par Gabet-Giraud et al. (2010). De même, ces auteurs soulignent la variabilté de l élimination de ce composé dans les STEP (abattement variant entre - 40 % et environ 90 %). Bendz et al. (2005) trouvent également des concentrations en sortie de STEP (190 ng/l) plus fortes qu en entrée (160 ng/l). Bien que les niveaux de concentrations soient différents, les mêmes tendances peuvent être observées pour le propranolol. Aussi, à l exception des STEP P et B en été, les concentrations du propranolol sont plus fortes dans les eaux usées traitées (hiver : ng/l, été : ng/l) que dans les eaux brutes (hiver : ng/l, été : ng/l) (Figure 84). Les abattements sont donc également très variables, entre % et - 34 % ou de 34 % et 51 % respectivement dans les STEP P et B en été. Gabet-Giraud et al. (2010) constatent aussi des éliminations très variables du propranolol dans les 14 STEP qu ils ont étudié, entre - 50 % et presque 90 %, avec une moyenne d élimination de 22%. Bendz et al. (2005) et Ternes (1998) trouvent des meilleurs taux d élimination pour le propranolol avec abattements de 32 % et 96 % respectivement. Par ailleurs, Gabet-Giraud et al. (2010) ont montré que quel que soit le procédé de traitement mis en œuvre, l abattement du propranolol est très variable. En été, aucun des 2 -bloquants n a été détecté dans les eaux de surface. En hiver, le métoprolol a été détecté mais non quantifié dans les eaux de la rivière L et le propranolol a été détecté dans toutes les eaux de surface mais il n a pu être quantifié qu en amont dans la rivière L à une concentration de 1,2 ng/l (Figure 85). Gros et al. (2006) n ont détecté aucun de ces 2 - bloquants dans les 10 échantillons d eaux du bassin de la rivière Ebre qu ils ont analysé. A 236

237 concentration (ng/l) concentration (ng/l) concentration (ng/l) concentration (ng/l) concentration (ng/l) concentration (ng/l) concentration (ng/l) Chapitre 5 : Applications environnementales l inverse, Bendz et al. (2005) ont retrouvé du métoprolol dans la rivière Höje à des concentrations variant entre 60 et 70 ng/l et du propranolol à des concentrations de 10 ng/l. L anti-vih ritonavir n a été détecté que dans les 2 plus grosses STEP L et CL, en été comme en hiver. L autre anti-vih étudié, la zidovudine, n a été détectée que dans la STEP CL, en été comme en hiver (Figure 84). De façon, surprenante par rapport au mode de consommation de ces 2 médicaments, les concentrations mesurées sont plus fortes en hiver qu en été. Par exemple, les concentrations du ritonavir en hiver varient entre 87 ng/l et 115 ng/l et en été, entre 21 ng/l et 39 ng/l. Par rapport aux concentrations mesurées par Prasse et al. (2010) en entrée et en sortie de STEP (de la centaine à plusieurs centaines de ng/l), les concentrations de zidovudine dosées dans cette étude sont faibles (< 45 ng/l). Les flux de ritonavir sont relativement importants puisqu ils sont en moyenne de 222 mg/j en hiver ce qui est du même ordre de grandeur que les flux moyens de la roxithromycine (172 mg/j) ou du sulfaméthoxazole (186 mg/j) dans les 2 mêmes STEP. Avec des abattements compris entre - 15 % et 38 %, le ritonavir ne semble pas être bien éliminé dans des STEP possédant un traitement par boues activées (Tableau 64). A partir des valeurs mesurées dans la STEP CL, la zidovudine ne semble pas être éliminée dans les STEP. Prasse et al. (2010) observent de fortes variations dans les taux d élimination de la zidovudine, 68 % dans une STEP et 0 % dans une autre, bien qu elles possèdent toutes les 2 un système de traitement par boues activées. Le ritonavir est le seul anti-vih à être détecté dans les eaux de surface des 2 rivières L et H en été, en aval des rejets de STEP (Figure 85). Il permet de mettre en évidence l impact des rejets de STEP sur la contamination des eaux de surface (cf. paragraphe I.2.1 et I.2.2 de ce chapitre). clarithromycine érithromycine roxithromycine été hiver été hiver été hiver amont aval amont aval P1 B1 amont aval amont aval P1 B1 amont aval amont aval P1 B1 rivière L rivière H captage rivière L rivière H captage rivière L rivière H captage ofloxacine sulfaméthoxazole été hiver amont aval amont aval P1 B été hiver amont aval amont aval P1 B1 rivière L rivière H captage rivière L rivière H captage propranolol ritonavir 1,4 1,2 1 0,8 0,6 0,4 0,2 0 été hiver amont aval amont aval P1 B été hiver amont aval amont aval P1 B1 rivière L rivière H captage rivière L rivière H captage Figure 85 : Comparaison saisonnière de la contamination des eaux de surface en amont et en aval des rejets de STEP et des eaux de captage pour chacune des 7 molécules détectées dans ces eaux. 237

238 Chapitre 5 : Applications environnementales Tableau 63: Flux des molécules pharmaceutiques en entrée et en sortie de STEP en été, calculés à partir des débits moyens annuels de chacune des STEP, exprimés en mg/j. été hiver STEP L STEP CL STEP P STEP B STEP L STEP CL STEP P STEP B entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie entrée sortie clarithromycine érythromycine roxithromycine ciprofloxacine ofloxacine tétracycline doxycycline sulfaméthoxazole triméthoprime metoprolol propranolol ritonavir zidovudine Tableau 64 : Abattement (%) des molécules pharmaceutiques dans les 4 STEP étudiées (calculé quand les molécules ont été quantifiées en entrée et en sortie de STEP). STEP L STEP CL STEP P STEP B été hiver été hiver été hiver été hiver clarithromycine roxithromycine ciprofloxacine ofloxacine tétracycline doxycycline sulfaméthoxazole triméthoprime metoprolol propranolol ritonavir zidovudine -458 Tableau 65 : Comparaison des abattements dans les STEP pour 2 fluoroquinolones, la ciprofloxacine et l ofloxacine, entre cette étude et celle de Castiglioni et al., abattements (%) cette étude Castiglioni et al., 2006 ciprofloxacine hiver ciprofloxacine été ofloxacine hiver ofloxacine été I.3. Projet FLASH Une fois validé, le protocole «multi-résidus 78» a été utilisé dans le cadre du projet FLASH pour réaliser le suivi d un continuum hospitalier et d un continuum agricole. Les prélèvements ont été réalisés une fois en été et une fois en hiver de façon à voir l influence de la saison. L étude de ces 2 continuums a permis d enrichir les connaissances sur les sources de contamination et le devenir des molécules pharmaceutiques. 238

239 A-b b-b A-c A-VIH sildénafil A-b b-b A-c A-VIH sildénafil A-b b-b A-c A-VIH sildénafil A-b b-b A-c A-VIH sildénafil A-b b-b A-c A-VIH sildénafil A-b concentration (ng/l) b-b A-c A-VIH A-b b-b viagra A-c A-b A-VIH b-b viagra A-c A-b A-VIH b-b viagra A-c A-b A-VIH b-b viagra A-c A-b A-VIH b-b viagra A-c A-VIH A-b viagra b-b A-b A-c b-b A-VIH A-c viagra A-VIH A-b viagra b-b A-b A-c b-b A-VIH A-c viagra A-VIH viagra concentration (ng/l) concentration (ng/l) A-b b-b A-c A-VIH viagra A-b b-b A-c A-VIH viagra A-b b-b A-c A-VIH viagra A-b b-b A-c A-VIH viagra A-b b-b A-c A-VIH viagra concentration (ng/l) A-b b-b A-c A-VIH sildénafil Chapitre 5 : Applications environnementales I.3.1. Continuum hospitalier I Etude des classes thérapeutiques spécifiques à ces travaux L analyse des échantillons provenant du continuum hospitalier fait ressortir une contamination importante par les antibiotiques et les -bloquants. Les anti-vih sont également retrouvés mais essentiellement en entrée de station d épuration (Figure 86 et Figure 87). Dans un premier temps, la contamination par les 5 classes thérapeutiques de chacune des matrices du continuum a été étudiée (Figure 86). Les échantillons provenant des effluents hospitaliers sont majoritairement contaminés par les antibiotiques, été comme hiver. En effet, la concentration totale en antibiotiques des effluents hospitaliers est de 48,7 µg/l en été et de 343,4 µg/l en hiver alors que celles des -bloquants sont respectivement de 0,7 µg/l et de 1,5 µg/l et celles des autres classes thérapeutiques sont inférieures à la centaine de ng/l. Les échantillons provenant des effluents de la maison de retraite sont majoritairement contaminés par les antibiotiques en hiver (81,3 µg/l) et par les -bloquants en été (8,8 µg/l). L entrée de STEP est fortement marquée par une contamination en -bloquants (11,7 µg/l en été et 7,1 µg/l en hiver) mais les antibiotiques (5,7 µg/l en été et 5,9 µg/l en hiver) et les anti-vih (2,1 µg/l en été et 0,3 µg/l en hiver) sont également très présents. La sortie de STEP et l eau de surface impactée par ce rejet sont contaminées principalement par les antibiotiques (ex. : sortie de STEP 2,5 µg/l) et les -bloquants (ex. : sortie de STEP 3,8 µg/l) bien que les anti-vih (ex. : sortie de STEP 0,2 µg/l) soient également détectés dans ces matrices évolution de la concentration le long du continuum hospitalier par classes évolution de la concentration le long du continuum hospitalier 100 par classes thérapeutiques et en fonction de la saison évolution de la concentration le long du continuum hospitalier par classes évolution thérapeutiques de la concentration et et fonction le long du de de la continuum la saison saison hospitalier par classes thérapeutiques et en fonction de la saison été hiver été hiver été hiver été hiver hopital maison retraite entrée STEP sortie STEP rivière rivière hopital hopital maison retraite maison retraite entrée STEP entrée STEP sortie STEP sortie STEP rivière rivière hopital maison retraite entrée STEP sortie STEP rivière Figure 86 : Présence des différentes classes thérapeutiques dans les 5 matrices analysées dans le continuum hospitalier (A-b : antibiotiques, b-b : -bloquants, A-c : anticancéreux, A-VIH : anti-vih). Dans un second temps, l évolution de la contamination le long du continuum au sein de chacune des classes thérapeutiques a été étudiée (Figure 87). De plus, en comparant les niveaux de contamination de l effluent hospitalier, de l effluent de la maison de retraite avec celui de l entrée de la station d épuration, l origine de la contamination peut être identifiée. Au sein des antibiotiques, l effluent hospitalier est plus contaminé que celui de la maison de retraite et est plus contaminé que les eaux usées en entrée de STEP, en été comme en hiver (Figure 87). En conséquence, la contamination de l eau par les antibiotiques provient majoritairement des rejets hospitaliers. Les concentrations hivernales dans les effluents de 239

240 Chapitre 5 : Applications environnementales l hopital (343,4 µg/l) et de la maison de retraite (81,3 µg/l) sont nettement plus importantes que les concentrations estivales (hopital : 48,7 µg/l, maison de retraite : 2,7 µg/l). Comme dans le cas de l étude du continuum Hérault, cette observation semble logique au regard du mode d utilisation de ces médicaments. En revanche, la différence saisonnière est inversée dans les eaux de la rivière (été : 180 ng/l, hiver : 24 ng/l) probablement à cause d une dilution moins importante en été en raison des précipitations plus faibles. Dans les eaux usées en entrée et en sortie de STEP, la différence saisonnière n est pas marquée. La concentration moyenne en antibiotiques est de 5,8 µg/l en entrée et de 2,5 µg/l en sortie de STEP. Une diminution de la contamination globale en antibiotiques des eaux usées suite à leurs passages dans la STEP est donc observée. Cependant, tous les antibiotiques et par conséquent toutes les familles d antibiotiques ne sont pas éliminés de la même façon dans la STEP étudiée (Figure 88). Les -lactames, les tétracyclines et le métronidazole (autres Ab) sont bien éliminés (abattements > 75 %). Contrairement aux résultats obtenus lors de l étude du continuum Hérault et à ceux obtenus par Castiglioni et al. (2006), les fluoroquinolones sont mieux éliminés en hiver (abattement > 65 %) qu en été (abattement < 35 %). Quelle que soit la saison, l élimination des macrolides et des sulfonamides dans la STEP est très variable avec des abattements respectifs compris entre -74 % et 91% et entre % et 71%. La valeur de " %" correspond à l'abattement de la sulfapyridine en été. Deux hypothèses peuvent expliquer ce chiffre : i) le type d'échantillonnage mis en œuvre puisqu'en été le bidon collecteur n'était pas rempli en entier (15 litres pour une contenance de 25 litres); et ii) la variabilité analytique de la mesure car d'un point de vue général, les concentrations mesurées en entrée (0,4 ng/l) et en sortie (9 ng/l) sont du même ordre de grandeur. De fortes variations avaient également été observées pour les sulfonamides lors de l étude du continuum Hérault et par Castiglioni et al. (2006) ou Gobel et al. (2007). Pour les macrolides, des abattements proches de 90 % ont été calculés au cours de cette étude. Ces résultats sont différents de ceux obtenus lors de l étude du continuum Hérault ou de ceux obtenus dans d autres études (Figure 7). Dans le cas des -bloquants, la contamination des effluents de la maison de retraite est plus importante que celle des effluents hospitaliers (Figure 87). Néanmoins, les -bloquants sont d avantage présents en entrée de STEP que partout ailleurs ce qui signifie que la maison de retraite est la principale source de contamination de l eau mais que les eaux usées d origine urbaine y contribuent aussi. Comme pour les antibiotiques, les concentrations sont plus faibles en sortie de STEP qu en entrée. Les -bloquants sont donc en partie éliminés par les traitements appliqués dans la STEP étudiée (Figure 88). Cependant, l élimination est variable avec des taux d abattement compris entre -197 % et 88 %. Comme dans l étude du continuum Hérault ou dans les résultats de Gabet-Giraud et al. (2010), l abatttement du propranolol est faible, 13 % en été et 28 % en hiver et celui du métoprolol est variable (-197 % été, 58 % hiver). Comme pour la sulfapyridine, la valeur de "-197 %" pour le métoprolol en été peut s'expliquer par l'échantillonnnage pratiqué en cette saison. Les différences saisonnières de concentrations sont moins marquées que pour les antibiotiques, ce qui semble cohérants avec les modes d usages de ces composés. Néanmoins, l eau du point «rivière» est plus contaminée en été (240 ng/l) qu en hiver (37 ng/l), probablement pour la même raison que pour les antibiotiques. Contrairement aux antibiotiques et aux -bloquants, les concentrations en anticancéreux et anti-vih sont plus fortes en entrée de STEP que dans les effluents des établissements de soin (Figure 87). La contamination provient donc majoritairement des eaux usées d origine urbaine. De plus, l hôpital ne dispose pas d un service de cancérologie ce qui explique les faibles concentrations en anticancéreux dans les effluents des établissements de soin. Le méthotréxate et le tamoxifen sont les 2 anticancéreux qui ont été détectés en entrée de STEP à des concentrations respectivement de 22 ng/l et 4 ng/l. Le tamoxifen a également été 240

241 hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière concentration (ng/l) hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière concentration (ng/l) hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière concentration (ng/l) concentration (ng/l) Chapitre 5 : Applications environnementales détecté en sortie de STEP à une concentration de 2 ng/l. Ces 2 molécules semblent donc éliminées par les traitements appliqués dans la STEP. Les anti-vih ont été analysés à des concentrations plus fortes en été (2138 ng/l) qu en hiver (302 ng/l) en entrée de STEP mais à des concentrations équivalentes en sortie (205 ng/l été, 188 ng/l hiver). Ils ont également été détectés dans les eaux du cours d eau mais les concentrations hivernales (30 ng/l) sont plus fortes que celles estivales (15 ng/l). L élimination des anti-vih dans la STEP est bonne avec des abattements compris entre 57 % et 100 % selon les composés (Figure 88). Par exemple, l abacavir et la lamivudine sont éliminées respectivement 97 % et 98 % en été. Ces résultats sont en accord avec ceux de Prasse et al. (2010) qui trouvent des taux d élimination supérieurs à 99 % et à 76 % pour ces 2 mêmes molécules. Par ailleurs, Prasse et al. (2010) ont mesurés des concentrations en névirapine plus fortes en sortie qu en entrée de STEP et dans cette étude, la névirapine n a été dosée qu en sortie de STEP. Ces 2 résultats vont dans le même sens. Le sildénafil a majoritairement été dosé en été et à un niveau équivalent entre les effluents des établissements de soin et les eaux usées en entrée de STEP (Figure 87). Il semblerait donc que le sildénafil provienne des eaux usées d origine urbaine mais aussi des eaux usées des centres de soin. Il n a été retrouvé qu à de faibles concentrations (< 5 ng/l) en sortie de STEP. Son élimination a été estimée à 83 % (Figure 88). Le sildénafil est donc bien éliminé dans les STEP ce qui est en accord avec Nieto et al. (2010a) qui ont estimé son élimination à 68 %. Les résultats de cette étude sont également disponibles dans la publication «Multi-residus simultaneous analysis of 78 pharmaceuticals compounds in aqueous samples : development and application» (publication 3) été hiver antibiotiques bétabloquants anticancéreux anti-vih viagra anticancéreux anti-vih sildénafil anticancéreux anti-vih viagra antibiotiques bétabloquants anticancéreux anti-vih sildénafil Figure 87 : Présence et niveau de contamination des antibiotiques, -bloquants, anticancéreux, anti-vih et sildénafil, en été et en hiver le long d'un continuum hospitalier. Les résultats d analyses globales du continuum hospitalier (Figure 89) montrent que la contamination des effluents des centres de soins (hôpital et maison de retraite) est bien plus 241

242 concentration (µg/l) b-lactames macro. & linco. FQ & Q tétracyclines sulfonamides autres Ab b-bloquants anticancéreux anti-vih sildénafil abattement (%) Chapitre 5 : Applications environnementales importante en hiver qu en été. Ce sont majoritairement les antibiotiques qui sont responsables de cette tendance. A l inverse, la contamination des eaux usées en entrée de STEP est plus importante en été qu en hiver. C est la dilution des eaux usées en hiver par les eaux de pluies qui explique ce constat. En été comme en hiver, bien que les tendances individuelles soient variables, de façon globale, les eaux en entrée de STEP sont plus contaminées qu en sortie. Il y a donc une bonne efficacité du traitement. La contamination des eaux de surface est faible. Cependant, elle est plus forte en été qu en hiver en raison de la plus faible dilution du rejet de STEP dans la rivière en été. En conclusion, une diminution globale de la contamination est observée le long du continuum hospitalier. été été été été été été hiver hiver hiver hiver hiver hiver hiver Figure 88 : Abattements estivaux et hivernaux des différentes molécules au sein des différentes classes thérapeutiques et famille d antibiotiques (les abattements inférieurs à % apparaissent sur le graphique au niveau de la ligne -100 %) (macro. & linco : macrolides et lincosamides, FQ & Q : fluoroquinolones et quinolones, autres Ab : autres antibiotiques) été hiver hopital retraite entrée sortie STEP rivière STEP Figure 89 : Concentration totale ( 78) en molécules pharmaceutiques le long du continuum hospitalier, comparaison été/hiver. I Etudes des autres classes thérapeutiques Au cours de ce projet «FLASH», 21 molécules appartenant à 5 autres classes thérapeutiques (analgésiques et AINS, antiépileptiques et antidépresseurs, bronchodilatateurs, hypolipémiants et stimulants) ont été analysées. Comme ces classes ne font pas l objet directement de ces travaux de thèse, les résultats de leurs analyses ne sont présentés que très brièvement dans les 3 paragraphes suivants. 242

243 AINS A-épi & A-dép broncho hypolip stimulants AINS A-épi & A-dép broncho hypolip stimulants AINS A-épi & A-dép broncho hypolip stimulants AINS A-épi & A-dép broncho hypolip stimulants AINS A-épi & A-dép broncho hypolip stimulants AINS A-épi & A-dép broncho hypolip stimulants AINS A-épi & A-dép broncho hypolip stimulants AINS A-épi & A-dép broncho hypolip stimulants AINS A-épi & A-dép broncho hypolip stimulants AINS A-épi & A-dép broncho hypolip stimulants concentration (ng/l) AINS A-épi & A-dép broncho hypolip stimulants AINS A-épi & A-dép broncho hypolip stimulants AINS A-épi & A-dép broncho hypolip stimulants AINS A-épi & A-dép broncho hypolip stimulants AINS A-épi & A-dép broncho hypolip stimulants concentration (ng/l) concentration (ng/l) Chapitre 5 : Applications environnementales Dans les divers échantillons prélevés le long du continuum hospitalier, la classe des analgésiques et AINS est la plus abondante avec des concentrations qui peuvent atteindrent les 2,7 mg/l dans les rejets des établissements de soin en été (Figure 90). Hiver comme été, les stimulants (caféine et théophylline) représentent la deuxième classe la plus abondante dans les effluents hospitaliers, dans les eaux usées en entrée de STEP et dans les eaux de la rivière. En hiver, c est également la deuxième classe la plus abondante dans les effluents de la maison de retraite alors qu en été, ce sont les antiépileptiques et les antidépresseurs. Les bronchodilatateurs apparaissent aussi comme des composés participant à la contamination des eaux usées en sortie de maison de retraite, particulièrement en été. En sortie de STEP, les antiépileptiques et les antidépresseurs participent presque autant à la contamination des eaux que les analgésiques et AINS. Dans la rivière, les antiépileptiques et les antidépresseurs constituent la troisième classe qui contribue à la contamination de l eau hopital hopital été maison retraite été maison retraite hiver hiver entrée STEP sortie STEP entrée STEP sortie STEP été hiver AINS A-épi & A-dép broncho hypolip stimulants rivière rivière rivière hopital maison retraite entrée STEP sortie STEP rivière Figure 90 : Présence des différentes classes thérapeutiques dans les 5 matrices analysées dans le continuum hospitalier (AINS : analgésiques et AINS, A-épi. & A-dép. : antiépileptiques et antidépresseurs, broncho. : bronchodilatateurs, hypolip. : hypolipémiants). L évolution de la contamination le long du continuum au sein de chacune des classes thérapeutiques a ensuite été étudiée (Figure 91). Comme pour les premières classes thérapeutiques étudiées, en comparant les niveaux de contamination de l effluent hospitalier, de l effluent de la maison de retraite avec celui de l entrée de la station d épuration, l origine de la contamination peut être identifiée. Avec des niveaux de concentration plus élevés dans les effluents hospitaliers (été : 2710,6 µg/l, hiver : 353,5 µg/l) et dans les effluents de la maison de retraite (été : 2733,5 µg/l, hiver : 394,6 µg/l) que dans les eaux usées en entrée de STEP (été : 287,5 µg/l, 194,9 µg/l), la contamination des eaux par les analgésiques et les AINS provient majoritairement des centres de soin. Les concentrations en sortie de STEP sont beaucoup plus faibles, quelques µg/l, qu en entrée de STEP, quelques centaines de µg/l, traduisant ainsi une bonne élimination de ces composés dans les STEP. Ce qui est en accord avec les valeurs relevées dans la littérature (Figure 7 et Annexe - tableau 1). Dans la rivière, les analgésiques et AINS sont détectrés à une concentration plus forte en été (2,9 µg/l) qu en hiver (0,2 µg/l). 243

244 Chapitre 5 : Applications environnementales Avec des concentrations plus fortes dans les effluents de la maison de retraite que dans les effluents hospitaliers ou dans les eaux usées en entrée de STEP, il peut être conclu que la contamination des eaux usées par les antiépileptiques et les antidépresseurs provient de la maison de retraite. En été la concentration en antiépileptiques et antidépresseurs est sensiblement égale entre l entrée (1,1 µg/l) et la sortie (1,2 µg/l) de STEP et en hiver, la concentration mesurée en sortie (0,8 µg/l) est plus forte que celle mesurée en entrée (0,3 µg/l). Ceci traduit une mauvaise élimination de ces composés dans la STEP, en particulier de la carbamazépine ce qui est en accord avec de nombreuses autres études (Ternes, 1998 ; Bendz et al., 2005 ; Castiglioni et al., 2006 ; Vieno et al., 2007 ; Kasprzyk-Hordern et al., 2009 ; Miège et al., 2009). Ces composés ont été retrouvés eux aussi à une concentration plus forte en été (97 ng/l) qu en hiver (24 ng/l) dans les eaux de la rivière. Les bronchodilatateurs sont dosés à une concentration élevée (3 µg/l) dans les eaux usées de la maison de retraite alors qu ils sont dosés à moins de 50 ng/l dans les effluent hospitaliers et en entrée de la STEP en été. En hiver, ils sont dosés à une concentrations plus élevée dans les effluents hospitaliers (163 ng/l) que dans les effluents de la maison de retraite ou dans les eaux usées en entrée de STEP. Ceci traduit une origine par les centres de soin majoritaire et la différence été/hiver semble cohérente avec les modes d usage de ces médicaments. En effet, en été, avec la chaleur, les difficultés respiratoires sont plus importantes, en particulier pour les personnes agées, ce qui explique un usage plus grand des bronchodilatateurs en cette saison à la maison de retraite. En été, leurs concentrations sont plus importantes en entrée (49 ng/l) qu en sortie (22 ng/l) de STEP ce qui signifie que ces composés sont bien éliminés. Ceci est en accord avec les résultats de Kasprzyk-Hordern et al. (2009). En revanche, en hiver, les concentrations sont plus fortes en sortie (172 ng/l) qu en entrée de STEP (25 ng/l) ce qui signifie que les composés ne sont pas éliminés dans la STEP ce qui est en accord avec les résultats de Castiglioni et al. (2006). En effet, ces auteurs trouvent que le salbutamol n est pas éliminé dans les STEP en hiver alors qu il est un peu éliminé en été (abattement : 12 %). Le gemfibrozil (hypolipémiant) n a pas été dosé ni en été ni en hiver dans les eaux usées provenant des centres de soin. Sa présence en entrée de STEP provient donc uniquement des eaux usées urbaines. Ce composé est analysé à des concentrations similiaires entre l été et l hiver et à des concentrations plus fortes en entrée ( 130 ng/l) qu en sortie ( 20 ng/l) de STEP. Il est donc relativement bien éliminé dans la STEP ce qui est en accord avec les résultats de Ternes (1998), de Bendz et al. (2005), de Miège et al. (2009) et de Gros et al. (2010) (cf. Annexe - tableau 1). Bien qu ils soient dosés à des concentrations plus fortes dans les effluents hospitaliers que dans les effluents de la maison de retraite ou dans les eaux usées en entrée de STEP en été ; en hiver, les stimulants sont dosés à des concentrations équivalentes entre les 3 matrices. Leur origine est donc variée et ces composés proviennent des 3 sources évoquées. Leurs concentrations en sorties (0,1-0,5 µg/l) de STEP sont plus faibles qu en entrée (7-13 µg/l) ce qui traduit une bonne élimination dans les STEP. Néanmoins ils sont dosés à des concentrations relativement importantes dans les eaux de surface (été : 151 ng/l, hiver : 198 ng/l). Les résultats d analyses globales du continuum hospitalier (Figure 89) montrent que la contamination des effluents des centres de soins (hôpital et maison de retraite) est plus importante en été qu en hiver contrairement à ce qui avait été observé pour les premières classes thérapeutiques étudiées (Figure 89). Ce sont majoritairement les analgésiques et les AINS qui sont responsables de cette tendance. La différence de concentration entre l été et l hiver n est presque plus marquée dans les eaux usées en entrée de STEP et elle disparait en sortie de STEP ou dans les eaux de la rivière. Comme pour les autres classes thérapeutiques 244

245 concentration (µg/l) hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière concentration (ng/l) concentration (ng/l) sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière hopital retraite entrée STEP sortie STEP rivière Chapitre 5 : Applications environnementales étudiées, en été comme en hiver, de façon globale, les eaux en entrée de STEP sont plus contaminées qu en sortie, il y a donc une bonne efficacité générale du traitement bien qu individuellement certaines molécules soient moins bien ou mal éliminées. La contamination des eaux de surface est faible. En conclusion, une diminution globale de la contamination est observée le long du continuum hospitalier été hiver été hiver A-épi & A-dép broncho. hypolip. stimulants 0 AINS A-épi & A-dép broncho. hypolip. stimulants AINS A-épi & A-dép broncho. hypolip. stimulants Figure 91 : Présence et niveau de contamination des analgésiques et AINS (AINS), des antiépileptiques et antidépresseurs (A-épi. & A-dép.), des bronchodilatateurs (broncho.), des hypolipémiants (hypolip.) et des stimulants, en été et en hiver le long d'un continuum hospitalier (retraite : maison de retraite) sortie hopital été sortie maison de retraite entrée STEP sortie STEP Figure 92 : Concentration totale ( 21) en molécules pharmaceutiques le long du continuum hospitalier, comparaison été/hiver. hiver rivière I Bilan toutes classes thérapeutiques confondues En additionnant les concentrations mesurées pour l ensemble des 99 composés analysés, la Figure 93 a été obtenue. Les concentrations estivales sont plus fortes que celles hivernales, particulièrement dans le cas des effluents des centres de soin. Néanmoins, quelle que soit la saison, les concentrations mesurées dans les effluents des centres de soin sont supérieures à celles mesurées en entrée de STEP, elles-mêmes supérieures aux concentrations totales mesurées en sortie de STEP. Les concentrations mesurées en sortie de STEP sont aussi plus 245

246 répartition (%) répartition (%) concentration (µg/l) Chapitre 5 : Applications environnementales fortes que celles mesurées dans les eaux de surface. En conslusion, une diminution de la contamination le long du continuum hospitalier a été observée été sortie hopital sortie maison de retraite hiver entrée STEP sortie STEP sortie STEP rivière rivière Figure 93 : Concentration totale ( 99) en molécules pharmaceutiques le long du continuum hospitalier, comparaison été/hiver. Par ailleurs, la contribution de chacune des 10 classes thérapeutiques à la contamination des eaux a été étudiée (Figure 94). 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% sortie hopital sortie maison de retraite entrée STEP été sortie STEP rivière 100% 90% 80% stimulants 70% hypolipémiants 60% bronchodilatateurs 50% antiép. et antidép. 40% 30% analgésiques et AINS 20% viagra 10% anti-vih 0% anticancéreux sortie sortie b-bloquants hopital maison antibiotics de retraite entrée STEP hiver sortie STEP rivière stimulants hypolipémiants bronchodilatateurs antiép. et antidép. analgésiques et AINS sildénafil anti-vih anticancéreux b-bloquants antibiotics Figure 94 : Contribution des 10 classes thérapeutiques étudiées à la contamination totales des eaux le long du continuum hospitalier. En été, à l exception des effluents de la station d épuration, les analgésiques et AINS sont responsables de la contamination des eaux à plus de 80 %. Les antibiotiques, les - bloquants, les anti-vih et les stimulants contribuent légèrement ( 10 %) à la contamination des eaux usées en entrée de STEP. En sortie de STEP, la contamination des eaux se répartie entre les -bloquants (37 %), les antibiotiques (23 %), les analgésiques et AINS (21 %) et les antiépileptiques et antidépresseurs (12 %). Enfin, les antibiotiques et les -bloquants participent respectivement à hauteur de 5 % et 7 % à la contamination des eaux de surface. En hiver, les analgésiques et AINS se partagent la contamination des eaux usées en sortie des établissements de soin (hopital et maison de retraite) avec les antibiotiques. Ces derniers representent alors respectivement 48 % et 17 % de la contamination des effluents 246

247 concentration (ng/l) concentration (ng/l) Chapitre 5 : Applications environnementales hospitaliers et de la maison de retraite. Le profil de contamination des eaux usées en entrée de STEP est le même en hiver qu en été. En sortie de STEP, la contamination des eaux se répartie entre les -bloquants (43 %), les antibiotiques (29 %), les analgésiques et AINS (14 %) et les antiépileptiques et antidépresseurs (9 %). En dehors des anticancéreux, du sildénafil et du gemfibrozil (hypolipémiant), la contamination des eaux de surface se répartie entre toutes les classes thérapeutiques étudiées avec une majorité d analgésiques et AINS et de stimulants (36 % chacun). I.3.2. Continuum agricole I Etude des classes thérapeutiques spécifiques à ces travaux Le long du continuum agricole, les antibiotiques et les -bloquants sont également les composés les plus présents et les plus abondants (Figure 95). Le point numéro 5, qui correspond au point «rivière» du continuum hospitalier, est le plus contaminé et révèle l impact du rejet de la STEP sur la contamination de la rivière, en particulier avec les anti- VIH. Les points 1 et 2 sont contaminés majoritairement (> 80 %) par des antibiotiques (ex. : érythromycine, lincomycine, enrofloxacine) ce qui met en avant une influence agricole de la contamination, probablement lié à de l élevage. En effet ces antibiotiques sont administrés aux animaux et ils ont déjà été dosés par Hu et al. (2010) ou Martinez-Carballo et al. (2007) dans des déchets d élevage. De plus, l enrofloxacine par exemple n est utilisé qu en médecine vétérinaire (cf. chapitre 2) été hiver anticancéreux anti-vih sildénafil antibiotiques bétabloquants anticancéreux anti-vih sildénafil Figure 95 : Présence et niveau de contamination des antibiotiques, -bloquants, anticancéreux, anti-vih et sildénafil le long d'un continuum agricole, en été et en hiver. La contamination des eaux de surface est faible (total < 100 ng/l sauf point 5 en été, 435 ng/l). Cependant, elle est plus forte en été qu en hiver en particulier au niveau du point 5 en raison de la plus faible dilution du rejet de STEP dans la rivière en été (Figure 96). Contrairement au continuum hospitalier, une augmentation globale de la contamination est observée le long du continuum agricole. Celle-ci est certainement due à l influence croissante de paramètres externes comme les zones agricoles et les rejets de STEP. 247

248 concentration (ng/l) concentration (ng/l) Chapitre 5 : Applications environnementales été hiver Figure 96 : Concentration totale ( 78) en molécules pharmaceutiques le long du continuum agricole, comparaison été/hiver. I Etude des autres classes thérapeutiques Comme pour le continuum hospitalier, au cours de ce projet «FLASH», 21 molécules appartenant à 5 autres classes thérapeutiques (analgésiques et AINS, antiépileptiques et antidépresseurs, bronchodilatateurs, hypolipémiants et stimulants) ont été analysées. Comme ces classes ne font pas l objet directement de ces travaux de thèse, les résultats de leurs analyses ne sont présentés que très brièvement dans le paragraphe suivant été hiver A-épi & A- dép broncho. hypolip AINS A-épi & A- dép broncho. hypolip. stimulants Figure 97 : Présence et niveau de contamination des analgésiques et AINS (AINS), des antiépileptiques et antidépresseurs (A-épi. & A-dép.), des bronchodilatateurs (broncho.), des hypolipémiants (hypolip.) et des stimulants, en été et en hiver le long d'un continuum agricole. Comme pour le continuum hospitalier, les analgésiques et AINS ainsi que les stimulants sont les plus abondants et les plus présents le long du continuum agricole (Figure 97). Comme pour les autres classes thérapeutiques étudiées dans la partie précédente (cf. I.3.2.1), le point numéro 5 est le plus contaminé et révèle l impact du rejet de la STEP sur la contamination de la rivière, en particulier avec les analgésiques et AINS. Les niveaux de contamination des eaux de surface par ces classes thérapeutiques sont plus élevés qu avec les 5 autres classes étudiées (cf. I.3.2.1). En effet, les concentrations des analgésiques et AINS varient entre 23 et 2885 ng/l et celles des stimulants entre 2 et 285 ng/l alors que celles des antibiotiques et des -bloquants varient respectivement entre 5 et 180 ng/l et 0 et 240 ng/l. L évolution globale de la contamination le long du continuum sera donc influencée par les tendances de ces 248

249 répartition (%) répartition (%) concentration (ng/l) Chapitre 5 : Applications environnementales classes thérapeutiques. Pour cette raison, elle ne sera pas détaillée dans ce paragraphe et l évolution globale pour l ensemble des 10 classes sera présentée dans la partie I I Bilan toutes classes thérapeutiques confondues En additionnant les concentrations mesurées pour l ensemble des 99 composés analysés, la Figure 98 a été obtenue. Au niveau des points 1 et 2, les moins impactés par les activités anthropiques, les concentrations estivales et hivernales sont équivalentes et sont faibles (< 150 ng/l). Au niveau des points 3 et 4, les concentrations hivernales sont un peu plus élevées que les concentrations estivales et sont comprises entre 266 ng/l et 874 ng/l. Ces concentrations sont donc plus importantes que celles des points 1 et 2. Enfin, au niveau du point 5, les concentrations mesurées sont plus fortes en été (3571 ng/l) qu en hiver (548 ng/l). En été, la concentration en molécules pharmaceutiques au niveau du point 5 (3571 ng/l) est supérieure à celle du point 4 (319 ng/l). En hiver, la concentration au niveau du point 5 (548 ng/l) est équivalente à celle du point 3 (562 ng/l) et est un peu plus faible qu au niveau du point 4 (874 ng/l). En conclusion, une augmentation de la contamination a été observée le long du continuum agricole été Figure 98 : Concentration totale ( 99) en molécules pharmaceutiques le long du continuum agricole, comparaison été/hiver. hiver 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% été % 90% stimulants 80% hypolipémiants 70% bronchodilatateurs 60% antiép. et antidép. 50% analgésiques et AINS 40% viagra 30% anti-vih 20% anticancéreux 10% b-bloquants hiver 0% antibiotics stimulants hypolipémiants bronchodilatateurs antiép. et antidép. analgésiques et AINS sildénafil anti-vih anticancéreux b-bloquants antibiotics Figure 99 : Contribution des 10 classes thérapeutiques étudiées à la contamination totales des eaux le long du continuum agricole. 249

250 Chapitre 5 : Applications environnementales Comme pour le continuum hospitalier, la contribution de chacune des 10 classes thérapeutiques à la contamination des eaux a été étudiée (Figure 99). En été, ce sont principalement les analgésiques et les AINS qui contribuent à la contamination des eaux mais les stimulants, les antibiotiques et les -bloquants dans une moindre mesure sont également présents. En hiver, au niveau des points 1 et 2, ce sont les stimulants qui contribuent le plus à la contamination des eaux alors qu au niveau des points 3 et 4, ce sont les analgésiques et les AINS. Au niveau du point 5, 7 des 10 classes thérapeutiques participent à la contamination de l eau or les anti-vih et les bronchodilatateurs par exemple n apparraissent pas en amont de ce point ce qui met en évidence l impact du rejet de la STEP sur la contamination. I.4. Conclusion sur la contamination des eaux De l ensemble de toutes ces analyses environnementales (tests d applicabilité des protocoles, continuum Hérault et FLASH), il ressort que les -bloquants, les anti-vih et les antibiotiques appartenant aux familles des macrolides, des fluoroquinolones et des sulfonamides, sont les molécules responsables de la contamination des eaux parmi les 5 classes étudiées au cours de cette thèse (Figure 100). Tableau 66 : Fréquences (F) de détection des 32 molécules communes recherchées dans l ensemble de tous les effluents de STEP analysés au cours de ces travaux de thèse. 10 effluents AMPERES Hérault F FLASH CA PA 1 SE PA 1 SE PA 2 CA 5 CA 6 SE 4 SE 5 SE 6 SE 9 L CL P B (%) amoxicilline x x x x 29 ampicilline 0 pénicilline G 0 pénicilline V x 7 oxacilline x x x 21 ceftiofur 0 cefpodoxime 0 clarithromycine x x x x x x x x x x x x x x 100 érythromycine x x x x x x x x x x x x x x 100 roxithromycine x x x x x x x x x x x x 86 lincomycine x x 14 chloramphénicole 0 ciprofloxacine x x x x x x x x x x x 79 ofloxacine x x x x x x x x x x x x x 93 acide oxolinique x 7 fluméquine x x x x x x x 50 tétracycline x x x x x x x 50 oxytétracycline x 7 chlortétracycline 0 doxycycline x x x x x 36 sulfaméthazine 0 sulfaméthoxazole x x x x x x x x x x x x x 93 triméthoprime x x x x x x x x x x x x 86 metoprolol x x x x x x x x x x x x x 93 propranolol x x x x x x x x x x x x x 93 daunorubicine 0 doxorubicine 0 épirubicine 0 ifosfamide 0 cyclophosphamide 0 ritonavir x x x x x x x x x x x 79 zidovudine x x x x x x x x

251 Chapitre 5 : Applications environnementales Figure 100 : Contribution des familles d antibiotiques et des classes thérapeutiques à la contamination des différents échantillons d eau analysés au cours de ces travaux de thèse. 251

252 CA PA 1 SE PA 1 SE PA 2 CA 5 CA 6 SE 4 SE 5 SE 6 SE 9 L été L hiver CL été CL hiver P été P hiver B été B hiver été hiver CA PA 1 SE PA 1 SE PA 2 CA 5 CA 6 SE 4 SE 5 SE 6 SE 9 L été L hiver CL été CL hiver P été P hiver B été B hiver été hiver concentrations (ng/l) flux (mg/j) débit (m 3 /j) Chapitre 5 : Applications environnementales A partir des analyses des effluents de STEP (AMPERES, continuum Hérault et FLASH), il ressort que parmi les 32 molécules communes à toutes les analyses, la clarithromycine et l érythromycine sont retrouvées dans tous les échantillons (Tableau 66). L ofloxacine, le sulfaméthoxazole et les 2 -bloquants (métoprolol, propranolol) sont également souvent dosés avec une fréquence de détection de 93 % (Tableau 66). Au total, 10 composés sont détectés dans plus de 75 % des échantillons. En plus de ceux évoqués précédement, il s agit de la roxithromycine (86 %), du triméthoprime (86 %), de la ciprofloxacine (79 %) et du ritonavir (79 %). Avec une fréquence de détection de 57 %, le deuxième anti-vih, la zidovudine, est aussi mesurée dans plus de la moitié des échantillons. La fluméquine et la tétracycline sont identifiées dans 50 % des rejets de STEP. Les autres composés comme l acide oxolinique, la lincomycine ou certaines pénicillines sont détectées dans moins de 30 % des échantillons. Enfin, l amoxicilline et la pénicilline G, les 2 céphalosporines, les 5 anticancéreux, la sulfaméthazine, la chlortétracycline et le chloramphénicole n ont jamais été identifiés. D après les résultats des études saisonnières du continuum Hérault et du projet FLASH, il a été mis en évidence une contamination des eaux usées plus importante en hiver qu en été (Figure 83 et Figure 89) et inversement, une contamination des eaux de surface plus importante en été qu en hiver (Figure 83 et Figure 96). Il a également été mis en évidence que les rejets de STEP contribuent à la contamination des systèmes aquatiques (Figure 80, Figure 82 et Figure 99). En conséquence, pour comparer l impact des différentes STEP étudiées, les flux de molécules pharmaceutiques qu elles rejettent ont été calculés à partir de leurs débits et des concentrations totales en molécules pharmaceutiques et sont présentés Figure 101A. Il en résulte : i) que le flux de molécules pharmaceutiques rejetées n est pas proportionnel au nombre de composés qui ont été analysés et retrouvés dans les échantillons correspondant, et ii) que plus le débit de la STEP est important et plus la quantité de molécules pharmaceutiques émise est élevée. Ainsi, bien qu un plus grand nombre de composés aient été recherchés et aient été retrouvés dans les effluents de la STEP du projet FLASH, ce n est pas la station qui rejette la plus grande quantité de molécules (STEP FLASH été = 13,3 g/j, SE- PA1 = 59,2 g/j, SE 4 = 22,5 g/j et CA 5= 16,4 g/j). Par ailleurs, ce n est pas parce qu une STEP présente les plus fortes concentrations en composés pharmceutiques (Figure 101B) que c est elle qui émet les plus gros flux. Le débit de la STEP est en fait le paramètre qui explique les tendances observées. Ainsi plus le débit de la station est important et plus la quantité de médicaments rejetés est forte A B 10 effluents AMPERE Hérault FLASH 10 effluents AMPERE Hérault FLASH Figure 101 : A) Flux totaux, en mg/j (histogramme), de molécules pharmaceutiques émis par les STEP étudiées au cours des différents projets et débits, en m 3 /j (courbe) (remarque : flux du continuum Hérault calculé à partir des débits moyens annuels des STEP), B) concentrations totales, en ng/l, en molécules pharmaceutiques émises par les STEP. 252

253 Chapitre 5 : Applications environnementales II. Application aux matrices «lisiers» Une fois les méthodologies adaptées et optimisées, elles ont pu être appliquées pour évaluer la présence et le devenir des antibiotiques dans les lisiers porcins dans le cadre de l ANR DIPERPHA. II.1. Choix des molécules les plus pertinentes à étudier Dans le cadre de l analyse de lisiers porcins, seuls les antibiotiques ont été recherchés. Parmi les 32 molécules pharmaceutiques retenues dans la première liste des molécules à étudier, 23 sont des antibiotiques. Une fois le protocole «multi-résidus 32» adapté pour l analyse des lisiers porcins, ces 23 antibiotiques ont pu être dosés dans cette matrice. Ce premier protocole a été utilisé pour les tests sur le mode de conservation des échantillons (cf. II.2. Conditionnnement des échantillons). Dans un second temps, la liste des molécules sélectionnées a été étendue à 78 composés parmi lesquels 52 antibiotiques. De la même façon qu avec le protocole «multi-résidus 32», une fois que le protocole «multi-résidus 78» a été adapté à l étude des lisiers porcins, les 52 antibiotiques ont pu être analysés dans cette matrice. Ce deuxième protocole a été appliqué à l étude de la phase dissoute de 32 échantillons de lisier provenant des différents élevages (filière simple et filière complexe) ou prélevés en différents points des filières de traitement. Ces premières analyses ont été réalisées en triplicat et ont permis de mettre en évidence une bonne répétabilité du protocole avec une variabilité moyenne de 35 % (médiane = 22 %). En raison de cette bonne répétabilité, il a été décidé par la suite que les analyses ne seraient plus faites en triplicat. De plus, ces premières analyses ont permis d identifier les antibiotiques les plus fréquemment détectés dans la phase dissoute et d estimer les niveaux de contamination. Parmi les 52 antibiotiques recherchés, 18 ont été trouvés au moins une fois (Figure 102). L enrofloxacine, régulièrement analysée dans la littérature (Pierini et al., 2004 ; Al Gros et Jourdain, 2007 ; Martinez-Carballo et al., 2007) ou encore l amoxicilline, connue pour être administrée dans les élevages français, n ont jamais été retrouvées. Ceci peut être du, soit au fait que ces molécules ne sont pas administrées dans les élevages étudiés, soit à des faiblesses analytiques, notamment dans le cas de l amoxicilline. Suite à ces analyses, une liste réduite de 21 antibiotiques a été retenue pour le dosage en routine de lisiers porcins. Elle comprend les 18 antibiotiques retrouvés au moins une fois lors des premières analyses de la phase dissoute (Figure 102) auxquels 3 fluoroquinolones (l enrofloxacine, la norfloxacine et la ciprofloxacine) ont été ajoutés car ils sont rapportés comme régulièrement détectés dans les études publiées. Cependant, pour pouvoir comparer l efficacité des filières de traitement du lisier, stockage simple et traitement, il est nécessaire d avoir les mêmes molécules dans les 2 types d échantillons. De même pour étudier l influence du stade physiologique des porcs sur la concentration en antibiotiques du lisier ou l efficacité du traitement tout au long de la filière, il est intéressant d avoir des molécules présentes dans la quasi-totalité des échantillons. En conséquence, pour réduire les efforts et les coûts analytiques, tout en optimisant les études d impact du traitement du lisier ou du stade physiologique des porcs, une liste plus réduite a été établie en se basant sur les fréquences de détection (Figure 102). Les 7 composés retrouvés dans plus de 50% des échantillons ont ainsi été retenus et ont été analysés dans la totalité des échantillons prélevés dans les élevages et lors des suivis en conditions contrôlées. Il s agit de la lincomycine, de la sulfadiazine, de l oxytétracycline, de la tétracycline, de la marbofloxacine, de la tylosine et de la monensine. Par ailleurs, cette sélection présente 253

254 fréquence (%) Chapitre 5 : Applications environnementales l avantage d avoir un composé par famille d antibiotique les plus importantes (tétracyclines, lincosamides, sulfonamides, macrolides, polyéthers et fluoroquinolones). fréquence de détection des antibiotiques Figure 102 : Fréquence de détection des 18 antibiotiques retrouvés au moins une fois à l issus des premières analyses de la phase dissoute d échantillons de lisier provenant à la fois des filières simples et complexes. II.2. Conditionnement des échantillons Le mode de conservation des échantillons entre l étape de prélèvement et celle de traitement a été étudié de façon à éviter toute perte d information consécutive à une détérioration des échantillons. Deux paramètres ont été testés: la congélation et l'ajout d'un agent de conservation tel que le formaldéhyde. La combinaison de ces 2 paramètres a également été évaluée conduisant ainsi à comparer le dosage d'un même échantillon dans 4 conditions : frais (conservé à 4 C), frais + formaldéhyde, congelé (conservé à -20 C), congelé + formaldéhyde. Les résultats de ce test sont présentés dans la Figure 103. Il en résulte, qu à l'exception de la lincomycine, les concentrations quantifiées dans les échantillons contenant du formaldéhyde sont plus faibles que celles trouvées dans ceux sans agent de conservation. Deux hypothèses peuvent expliquer ce résultat : soit l'ajout de formaldéhyde ne permet pas une bonne conservation soit le formaldéhyde provoque une élution des composés lors du passage des échantillons sur les cartouches durant l'étape de SPE. En conséquence, le formaldéhyde a été éliminé comme moyen de conservation. Par ailleurs les concentrations trouvées dans les lisiers traités après congélation se sont révélées être plus fortes que celles trouvées dans les lisiers conservés à 4 C et traités dans les 48h après le prélèvement. Deux hypothèses ont été émises pour expliquer cette remarque : i) dans les échantillons frais, les antibiotiques ont été dégradés avant d être analysés, ou ii) dans les échantillons congelés, certains colloïdes ou micro-organismes renfermant les composés, ont éclaté à la congélation libérant ainsi les molécules dans la phase dissoute. Lors du dosage de la phase dissoute des échantillons frais, ces dernières étaient retenues dans la phase solide ou particulaire et n'étaient pas prise en compte. 254

255 concentration (ng/l) concentration (ng/l) concentration (ng/l) Chapitre 5 : Applications environnementales frais (n=4) F + F (n=4) congelé (n=3) C + F (n=3) frais (n=4) 22 F F (n=4) congelé (n=3) C + F (n=3) Figure 103 : Concentration moyenne en antibiotiques d'un même lisier de porc en fonction des différentes conditions de conservation (F + F : frais + formaldéhyde; C + F : congelé + formaldéhyde). Pour trancher entre ces 2 possibilités, la meilleure solution aurait été de doser les molécules dans les 3 phases ; de vérifier qu'au final la concentration totale pour une molécule est bien la même pour un même échantillon traité frais ou congelé et, de s'assurer qu'après congélation, si la concentration dans la phase dissoute augmente alors celle dans la phase solide et/ou particulaire diminue. Comme les analyses des phases solides et particulaires n'ont pu être effectuées par manque de protocole adéquat à l époque de ces tests, une alternative a alors été de séparer les phases avant la congélation pour éviter tout transfert des molécules d'une phase vers l'autre. Par conséquent, une deuxième expérience a été réalisée. Au cours de celle-ci, 3 conditions ont été comparées : i) lisier frais c'est-à-dire prélevé puis préparé dans les 24h, ii) lisier frais centrifugé puis filtré puis congelé, noté lisier CF C, où les 3 phases sont séparées avant la congélation pour éviter tout transfert de l une vers l autre et enfin, iii) lisier congelé puis traité, noté lisier C CF. Les résultats de cette seconde expérience sont présentés dans la Figure 104. Le premier résultat confirme celui de la première expérience : les concentrations dans la phase dissoute sont toujours supérieures dans le lisier traité après congélation que dans celui conservé à 4 C (frais) et traité 48h après le prélèvement. Si ce phénomène était du à une dégradation des composés dans les échantillons frais, les concentrations entre le lisier CF C et le lisier C CF devraient être les mêmes ce qui n'est pas le cas. Dans le cas d'un changement de spéciation, le fait d'avoir séparé les phases avant la congélation doit éviter ce phénomène et les concentrations trouvées dans le lisier CF C devraient être proches de celles du lisier frais. Comme pour la plus part des composés, et en particulier pour les composés les plus abondants tels que l'oxytétracycline et la doxycycline ou encore la lincomycine, la tendance suivante est observée : frais < CF C < C CF. Il y a donc très certainement un phénomène de changement de spéciation qui se produit lors de la congélation. En conséquence, pour éviter les phénomènes de dégradation tout en limitant ceux liés au changement de spéciation, le mode opératoire suivant a été choisi : prélèvement des échantillons, centrifugation dans les 12h puis filtration dans les 24-48h et enfin congélation à -20 C jusqu à extraction. Les différentes phases sont donc séparées avant la congélation pour préserver l intégrité de l échantillon. 255

256 concentration (ng/l) concentration (ng/l) concentration (ng/l) Chapitre 5 : Applications environnementales lisier frais lisier CF C lisiers C CF lisier frais lisier CF C lisiers C CF Figure 104 : Concentration moyenne (n=3) en antibiotiques d'un même échantillon de lisier porcin en fonction des différentes conditions de traitement (C : congelé; CF : centrifugé/filtré). II.3. rigine de la contamination du lisier stocké Dans les élevages étudiés, les porcs sont répartis par bâtiment en fonction de leur stade de développement : porcelets juste sevrés (notés PS pour post-sevrage), truies gestantes ou venant de mettre-bas (notés MATER pour maternité) et porcs/truies à l engraissement (noté ENG). Chacun des trois bâtiments est relié à la fosse de stockage du lisier. Lors des tous premiers prélèvements, du lisier brut (LB) a été prélevé directement à la sortie d un des bâtiments d élevage et du lisier stocké (LS) a été prélevé dans la fosse. Lors des analyses de la phase dissoute de ces premiers échantillons, il est apparu que dans l élevage 1, le lisier brut était toujours plus contaminé par les antibiotiques que le lisier stocké alors qu à l inverse, dans l élevage 2, il l était moins. La contamination du lisier stocké était quant à elle du même ordre de grandeur entre les 2 élevages. Dans l élevage 1, le lisier brut provenait systématiquement du bâtiment post-sevrage et dans l élevage 2, du bâtiment engraissement. Aussi, une première étude a été conduite pour analyser la contamination du lisier brut provenant des différents bâtiments d élevage et celle du lisier stocké. Elle a été mise en œuvre afin : 1. de déterminer si l origine du lisier brut, et donc le stade physiologique des porcs, pouvaient avoir une influence sur le niveau de contamination du lisier par les antibiotiques. 2. de savoir si le niveau de contamination du lisier stocké représentait une moyenne ou une somme de la contamination des lisiers bruts. Dans le premier cas, lors du mélange dans la fosse de stockage, il pourrait y avoir une dilution des lisiers bruts fortement contaminés (ex. : élevage 1) ou un enrichissement des lisiers peu pollués (ex. : élevage 2). La deuxième hypothèse expliquerait pourquoi, dans l élevage 2, le lisier stocké est plus contaminé que le lisier brut. Dans ce cas-là, si le lisier stocké de l élevage 1 est moins contaminé que le lisier brut, c est peut-être parce qu il y a eu des phénomènes de dégradation des composés dans la fosse ou de dilution suite à des précipitations. 256

257 Chapitre 5 : Applications environnementales 3. de savoir si les antibiotiques administrés sont les mêmes pour un même stade physiologique dans les différents élevages ou si ce sont les mêmes traitements administrés à tous les stades mais spécifique à chaque élevage. Pour répondre à ces questions, il a été décidé qu une campagne de prélèvement spécifique serait réalisée et qu au cours de cette dernière, du lisier brut provenant de chacun des 3 bâtiments ainsi que du lisier stocké seraient prélevés. Les prélèvements ont été réalisés en août 2009 pour l élevage 3 et en octobre 2009 pour l élevage 1. Pour l élevage 2, seuls LB MATER et PS ont été prélevés en octobre 2009, leurs concentrations sont comparées avec celles des LB ENG et LS prélevés à la même époque mais un an plus tôt (fin septembre 2008). II.3.1. rigine du lisier brut et niveau de contamination élevage 1 élevage 2 élevage 3 ENG ENG PS MATER ENG PS MATER PS MATER Figure 105 : Répartition de la contamination des lisiers bruts en fonction de leur bâtiment d'origine (phase solide et phase liquide prise en compte) (ENG : engraissement, MATER : maternité, PS : postsevrage). La répartition de la contamination entre les 3 lisiers bruts s est révélée être différente d un élevage à un autre (Figure 105). Pour l élevage 1, ce sont les porcs à l engraissement qui produisent les lisiers les plus contaminés en antibiotiques. Pour l élevage 2, la contamination du lisier provenant du bâtiment des porcelets sevrés est aussi importante que celle du lisier provenant des truies gestantes. Enfin, pour l élevage 3, le lisier le plus contaminé provient du bâtiment des porcelets sevrés. Par conséquent, aucun lien ne peut être fait de façon générale entre le stade physiologique des porcs et le niveau de contamination du lisier. Le lisier brut provenant du stade post-sevrage n est donc pas toujours le lisier brut le plus contaminé contrairement à ce qu il pouvait être attendu. En effet, au moment du sevrage, les porcelets sont plus vulnérables et donc plus soignés. Néanmoins, dans les élevages 2 et 3, la contamination des lisiers bruts provenant du bâtiment post-sevrage est plus importante que celle des autres stades, ce qui laisse supposer que les porcelets en post-sevrage reçoivent beaucoup d antibiotiques. Cependant, ces interprétations ne sont valables que si les volumes de lisier, et par conséquent les flux, sont considérés comme homogènes entre les batiments et entre les élevages. II.3.2. bruts Niveau de contamination du lisier stocké par rapport aux lisiers Le lisier stocké de l élevage 1 est plus contaminé que n importe quel lisier brut (Figure 106). Son niveau de contamination ne reflète donc pas un niveau moyen de contamination qui 257

258 concentration (µg/l) Chapitre 5 : Applications environnementales proviendrait du mélange des lisiers bruts. Dans cet élevage là, il semblerait donc intéressant, d un point de vue environnemental, d épandre séparément chacun des lisiers bruts, en particulier le lisier provenant du bâtiment maternité, dans le but de limiter la pollution des sols par les antibiotiques. Le lisier stocké de l élevage 2 est légèrement plus contaminé que les lisiers bruts provenant des bâtiments de maternité et de post-sevrage (Figure 106). Son niveau de contamination ne reflète donc pas ni une moyenne ni une somme de la contamination des lisiers bruts. Dans cet élevage, il serait intéressant d épandre séparément le lisier provenant du bâtiment des porcs à l engraissement mais le stockage des lisiers ne semble pas augmenter les risques de pollution des sols par les antibiotiques. Enfin, le lisier stocké de l élevage 3 contient beaucoup moins d antibiotiques que les lisiers bruts provenant des bâtiments de maternité et de post-sevrage (Figure 106). Son niveau de contamination ne reflète donc pas la somme de la contamination des lisiers bruts. Dans cet élevage, il semble utile de mélanger et de stocker les lisiers avant de l épandre sur les terres agricoles. Par ailleurs, le lisier de l élevage 3 est plus contaminé que celui des deux autres élevages ce qui reflète un caractère élevage-dépendant du niveau de contamination global du lisier. LB ENG LB MATER LB PS LS élevage Figure 106: Niveau de contamination du lisier stocké et brut en fonction de son origine (LB ENG : lisier brut engraissement, LB MATER : lisier brut maternité, LB PS : lisier brut post-sevrage, LS : lisier stocké). Pour l élevage 2, les données de LB ENG et LS proviennent d analyses qui ont été réalisées sur du lisier prélevé à la même époque mais un an auparavant par rapport à LB MATER et LB PS. En conclusion de cette étude, suivant les élevages, le lisier stocké est soit autant, soit plus, soit moins contaminé que le lisier brut. Par conséquent, la contamination du lisier stocké ne représente ni la moyenne ni la somme de la contamination des lisiers bruts, à moins que des phénomènes de dégradation particulièrement efficaces (élevage 3) et différents d un élevage à l autre n interviennent. Le suivi sur 5 mois du niveau de contamination du lisier stocké a permis d étudier si des phénomènes de dégradation interviennent malgré l apport régulier de lisier brut provenant d un bâtiment ou d un autre (cf. partie II.5. de ce chapitre). Par ailleurs, il faut prendre en considération que toutes ces remarques sont issues de l analyse d un échantillon unique de chaque sorte de lisier dans chacun des élevages, la généralisation des résutlats ne serait donc pas pertinente bien que du point de vue analytique les différences soient avérées. 258

259 ENG MATER PS ENG MATER PS ENG MATER PS contamination (%) Chapitre 5 : Applications environnementales II.3.3. Distribution des antibiotiques en fonction du stade physiologique et de l élevage considéré Une analyse détaillée, molécule par molécule, du niveau de contamination de chaque lisier brut (Figure 107) semble indiquer que sur un même élevage, un antibiotique est plus administré qu un autre à certains stades physiologiques mais aucune généralité ne peut être faite pour l ensemble des élevages. Par exemple, la marbofloxacine est retrouvée dans les lisiers du stade post-sevrage de l élevage 2 alors qu elle est analysée dans les lisiers du stade maternité de l élevage 3. Autre exemple, la lincomycine semble être administrée aux stades post-sevrage et maternité d après l analyse des lisiers des élevages 1 et 3 alors qu elle semble être administrée au stade importance engraissement relative dans des différents l élevage antibiotiques 2. à la contamination global du lisier en fonction de son origine 100% 80% 60% 40% 20% 0% monensine sulfadiazine oxytétracycline tétracycline marbofloxacine lincomycine tylosine élevage 1 élevage 2 élevage 3 Figure 107: Part relative de chaque antibiotique à la contamination globale du lisier en fonction de son origine (ENG : lisier brut engraissement, MATER : lisier brut maternité, PS : lisier brut post-sevrage, LS : lisier stocké). Les pratiques médicales vétérinaires ne semblent donc pas être les même d un élevage à l autre que se soit en terme de molécules (Figure 107) ou de doses administrées (Figure 106). Par ailleurs, aucun antibiotique ne semble être spécifique d un élevage. Toutes les molécules ont été analysées dans tous les élevages bien qu elles ne soient pas administrées au même stade. II.4. Devenir des antibiotiques dans les filières de traitement du lisier En France, la plupart des élevages porcins disposent d une fosse de stockage qui permet de conserver le lisier avant qu il ne soit épandu pour enrichir les sols agricoles. Cependant, dans certaines zones, quand le lisier contient trop d azote, il ne peut être utilisé pour de telles pratiques (directive nitrates, (European Commission, 1991)). Pour résoudre ce problème, certains élevages, ou groupement d élevages, se sont équipés d un système de traitement du lisier, sorte de mini station d épuration. Un des objectifs du projet DIPERPHA, dans le cadre duquel ces analyses de lisiers ont été réalisées, est de connaître le devenir des antibiotiques lors du stockage et du traitement des effluents issus des élevages porcins. C est pourquoi il a été réalisé l étude sur 5 mois du lisier stocké dans 3 élevages traditionnels (filières simples) et l étude, à 2 dates (printemps et automne), le long de la filière de traitement dans 2 élevages possédant un système différent de traitement du lisier (filières complexes). 259

260 concentration (µg/l) Chapitre 5 : Applications environnementales II.4.1. Filières traditionnelles de stockage du lisier Dans les 3 élevages étudiés, la fosse de stockage est régulièrement remplie par l arrivée de lisier brut provenant des différents bâtiments d élevage nettoyés toutes les 3-4 semaines. Celle-ci est ensuite vidée deux fois par an, à l automne et au printemps généralement, et le lisier est utilisé comme engrais pour les sols agricoles. Une étude a consisté à suivre sur 5 mois le niveau de contamination des fosses de stockage. L intérêt de cette étude était de savoir si le fait de stocker le lisier avant de l épandre permet d en faire varier la contamination en antibiotiques. Trois situations sont envisageables : i) la contamination diminue au cours du temps à cause des phénomènes de dégradation ou de dilution par les eaux pluviales, ii) la contamination augmente au cours du temps consécutivement à l accumulation de lisiers contaminés par les antibiotiques, ou iii) la contamination reste stable au cours du temps avec des phénomènes de dégradation/dilution qui compensent les apports. Au cours des 5 mois d analyse, aucune tendance n a pu être dégagée sur l évolution de la contamination totale (phase liquide et phase solide) du lisier stocké (Figure 108). Il semblerait que dans l élevage 1 la contamination augmente au cours du remplissage de la fosse, que dans l élevage 2 elle diminue et que dans l élevage 3 elle reste plus ou moins constante. Ainsi les variations des concentrations totales en antibiotiques sont aléatoires et tous les cas de figures évoqués sont représentés. Si ces résultats sont mis en parallèle avec ceux concernant le niveau de contamination du lisier stocké par rapport à celui des lisiers bruts, il n est pas possible de conclure sur l intérêt de stocker le lisier avant épandage afin d en réduire la pollution par les antibiotiques. Au contraire, le stockage peut même contribuer à en augmenter le niveau (élevage 1). De plus, bien que variables, les concentrations totales en antibiotiques du lisier stocké sont très élevées et fluctuent entre 0,2 et 1,05 mg/l de lisier. D un point de vue écologique, ces concentrations représentent un risque écotoxicologique car elles sont de l ordre de grandeur de certaines EC 50 pour des cyanobactéries d eau douce par exemple (EC évolution de la contamination total du lisier stocké sur 5 50 Microcystis aeruginosa = 0,207 mg/l (Holten Lützhøft et al., 1999)). mois dans 3 élevages porcins différents élevage 1 élevage 2 élevage 3 Figure 108 : Evolution de la contamination totale du lisier stocké en fosse durant 5 mois dans 3 élevages porcins différents. L analyse séparée des phases dissoute et solide (Figure 109) montre que les tendances dans chacune des deux phases ne sont pas les mêmes. Au cours des 5 mois de suivi, la contamination de la phase dissoute du lisier stocké des élevages 1 et 2 semble diminuer. Celle de l élevage 3 varie de façon aléatoire. Contrairement à la contamination de la phase dissoute qui décroit, la contamination de la phase solide augmente au cours des 5 mois de suivi essentiellement dans les élevages 1 et 3. Celle de l élevage 2 varie de façon aléatoire. Il semblerait que les tendances globales (Figure 108) soient liées à celles de la phase solide (Figure 109 b), en particulier dans les élevages 1 et

261 08/07/08 28/07/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 08/07/08 28/07/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 08/12/08 19/01/09 08/07/08 28/07/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 08/07/08 28/07/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 08/12/08 19/01/09 concentration (µg/l) concentration (µg/l) 08/07/08 28/07/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 08/07/08 28/07/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 08/12/08 19/01/09 concentration (µg/l) concentration (µg/g) concentration (µg/l) Chapitre 5 : Applications environnementales phase dissoute élevage 1 élevage 2 élevage 3 phase solide élevage 1 élevage 2 élevage 3 (b) Figure 109 : Evolution de la contamination de la phase dissoute (a) et de la phase solide (b) du lisier stocké en fosse pendant les 5 mois de suivi dans les 3 élevages. suivi contamination de la fosse (total) sur 5 mois et dans 3 élevages différents (a) suivi contamination de la fosse (total) sur 5 mois et dans 3 élevages différents suivi contamination de la fosse (total) sur 5 mois et dans 3 élevages différents élevage 1 élevage 2 élevage 3 monensine marbofloxacine tétracycline tylosine lincomycine sulfadiazine oxytétracycline monensine marbofloxacine tétracycline tylosine lincomycine sulfadiazine oxytétracycline monensine marbofloxacine tétracycline tylosine lincomycine sulfadiazine 0 élevage 1 élevage 2 élevage 3 élevage 1 élevage 2 élevage 3 Figure 110 : Evolution détaillée par molécule de la contamination du lisier de la fosse de stockage sur 5 mois de suivi dans 3 élevages différents, en tenant compte (haut) ou non (bas) de l oxytétracycline. 261

262 Chapitre 5 : Applications environnementales L évolution de la concentration de chaque molécule individuellement au cours de ces 5 mois de suivi a ensuite été étudiée. Il en résulte (Figure 110 haut) que les tendances globales sont essentiellement liées à celle de l oxytétracycline, la molécule majoritaire (> 50%). Si l oxytétracycline n est plus prise en compte (Figure 110 bas), des tendances différentes sont observées. Néanmoins, aucune généralité ne peut être faite sur les 3 élevages. En conséquence, que ce soit de façon globale ou individuelle pour chaque molécule, la contamination du lisier stocké est aléatoirement variable au cours des 5 mois de suivi. La prise en compte de paramètres tels que les précipitations, les volumes de lisier brut apportés, le temps écoulé entre le dernier apport de lisier brut et la date de prélèvement ou l origine du dernier lisier brut auraient peut-être pu expliquer les tendances observées s ils avaient été suivis. En conclusion, le stockage du lisier dans la fosse ne permet pas d en modifier significativement la contamination par les antibiotiques. Ces derniers ne semblent pas être dégradés par les traitements anaérobies mis en œuvre dans ce type de stockage. Les résultats des analyses des phases dissoutes et solides ont ensuite été exploités de façon séparée afin de savoir comment les molécules se répartissent entre les deux phases et si les mêmes molécules sont présentent dans les 2 phases. Les analyses séparées des phases dissoutes et solides du lisier ont mis en évidence une répartition différente des antibiotiques. L oxytétracycline est la molécule majoritaire. Elle représente plus de 50% de la contamination de la phase dissoute et plus de 70% de la contamination de la phase solide, à l exception d une analyse (Figure 111bas). La lincomycine et le sulfadiazine sont les 2 autres molécules majoritaires de la phase dissoute. Les autres antibiotiques y sont décelés mais en proportions négligeables. A l inverse, la tétracycline, la tylosine et la marbofloxacine sont davantage présentes dans la phase solide. Les profils de contamination des deux phases ne sont donc pas les mêmes. La distribution de chaque antibiotique entre la phase dissoute et la phase solide a été étudiée (Figure 112). En conclusion, au minimum 95% de la tylosine, de la marbofloxacine ou de la tétracycline et 80 % de l oxytétracycline se trouvent dans la phase solide. Suivant l élevage considéré, entre 32 et 56 % de la sulfadiazine et entre 33 et 67 % de la lincomycine se retrouve dans la phase liquide. La monensine se retrouve à plus de 98 % dans la phase liquide. Il est donc indispensable d analyser les 2 phases des lisiers car le dosage de la phase dissoute uniquement sous-doserait la tétracycline, la tylosine, la marbofloxacine et l oxytétracycline alors qu un dosage de la phase solide uniquement sous-doserait très fortement la sulfadiazine, la lincomycine et la monensine. 262

263 08/07/08 28/07/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 08/07/08 28/07/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 08/12/08 19/01/09 08/07/08 28/07/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 08/07/08 28/07/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 08/12/08 19/01/09 contribution à la contamination (%) contribution à la contamination (%) 08/07/08 28/07/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 08/07/08 28/07/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 27/08/08 30/09/08 04/11/08 08/12/08 19/01/09 contribution à la contamination (%) Chapitre 5 : Applications environnementales 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% 10% 0% 100% 90% 80% 70% 60% 50% 40% 30% 20% phase dissoute phase dissoute élevage 1 élevage 2 élevage 3 phase solide élevage 10% 1 élevage 2 élevage 3 0% monensine marbofloxacine tétracycline tylosine lincomycine sulfadiazine oxytétracycline monensine marbofloxacine tétracycline tylosine lincomycine sulfadiazine oxytétracycline monensine marbofloxacine tétracycline tylosine lincomycine sulfadiazine oxytétracycline élevage 1 élevage 2 élevage 3 Figure 111 : Evolution et importance relative de chaque antibiotique à la contamination du lisier stocké, dans la phase dissoute (haut) et dans la phase solide (bas). tylosine 7% marbofloxacine 2% tétracycline 2% oxytétracycline sulfadiazine lincomycine monensine 1% élevage 1 93% 98% 98% 80% 20% 68% 32% 65% 35% 99% tylosine 3% marbofloxacine 3% tétracycline 3% oxytétracycline sulfadiazine lincomycine monensine élevage 2 97% 97% 97% 83% 17% 44% 56% 67% 33% 100 % tylosine 4% marbofloxacine 5% tétracycline 5% oxytétracycline sulfadiazine lincomycine monensine 2% élevage 3 96% 95% 95% 79% 21% 56% 44% 33% 67% 98% Figure 112 : Répartition des antibiotiques entre la phase dissoute (clair) et la phase solide (foncé) des lisiers stockés pour les 3 élevages étudiés. 263

264 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 concentration (ng/g) 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 concentration (ng/l) concentration (ng/g) Chapitre 5 : Applications environnementales II.4.2. Filières complexes avec traitement du lisier Une troisième étude a concerné l évolution de la teneur en antibiotiques des lisiers le long des filières complexe de traitement. Deux élevages porcins possédant des systèmes de traitement différents ont été étudiés. Dans le premier élevage, les phases solides et liquides sont séparées dès le début du traitement. Le deuxième élevage ne sépare pas la phase solide de la phase liquide et c est l ensemble du lisier qui subit les processus de traitement. Dans les 2 élévages, les volumes de lisier transitant entre les différents compartiments n ayant pu être mesurés pour des raisons d accéssibilité, les interprétations présentées dans la suite de cette étude ne sont valables que si les débits sont considérés comme homogènes et constants. Les résultats du suivi de la contamination le long de la filière de traitement de l élevage 4 sont présentés Figure 113. Quelle que soit la saison, la phase dissoute est principalement contaminée par de la sulfadiazine et de l oxytétracycline alors que la phase solide est principalement contaminée par l oxytétracycline, la marbofloxacine, la tylosine et la sulfadiazine. La contamination de la phase dissoute diminue le long de la filière de traitement avec une chute importante de la concentration en antibiotiques entre la fosse de stockage et le bassin d aération (Figure 113 gauche). A l inverse, la contamination de la phase solide varie peu. Une diminution générale est observée entre le lisier stocké et la lagune mais la contamination du reflux de séparation est supérieure à celle du lisier stocké. La baisse importante de la contamination entre le lisier stocké et le bassin d aération de la phase dissoute est à mettre en parallèle avec l augmentation de la contamination entre le lisier stocké et le reflux de séparation. La contamination semble être reportée du lisier stocké vers le reflux de séparation. L évolution de la contamination de la phase dissoute est donc probablement liée à la séparation des phases solides et liquides plutôt qu à des phénomènes de dégradation. Les niveaux de contamination équivalents du bassin d aération, du bassin de décantation et de la lagune peuvent être expliqués par ces phénomènes de dégradation peu importants lisier stocké phase dissoute bassin d'aération bassin de décantation lagune monensine sulfadiazine oxytétracycline 800 tétracycline 600 marbofloxacine lincomycine 400 tylosine lisier stocké bassin d'aération phase solide phase solide bassin de décantation lagune reflux de séparation 200 Figure 113 : Evolution de la contamination le long de la filière de traitement dans la phase dissoute (gauche) et dans la phase 0solide (droite, ng/g de poids sec) de l'élevage 4. monensine sulfadiazine oxytétracycline tétracycline marbofloxacine lincomycine monensine tylosine sulfadiazine oxytétracycline tétracycline marbofloxacine lincomycine tylosine lisier stocké bassin d'aération bassin de décantation lagune reflux de séparation Les résultats du suivi le long de la filière de traitement de l élevage 5 sont présentés Figure 114. Quelle que soit la saison, la contamination de la phase dissoute est liée à la présence d oxytétracycline, de tétracycline, de sulfadiazine, de lincomycine et de marbofloxacine. La monensine est également décelée dans le lisier stocké prélevé en automne. Dans la phase 264

265 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 20/04/09 16/11/09 04/05/09 30/10/09 04/05/09 30/10/09 04/05/09 30/10/09 04/05/09 30/10/09 concentration (µg/l) concentration (µg/l) 04/05/09 30/10/09 04/05/09 30/10/09 04/05/09 30/10/09 04/05/09 30/10/09 04/05/09 30/10/09 04/05/09 30/10/09 04/05/09 30/10/09 concentration (ng/g) 04/05/09 30/10/09 04/05/09 30/10/09 04/05/09 30/10/09 04/05/09 30/10/09 04/05/09 30/10/09 concentration (ng/l) concentration (ng/g) Chapitre 5 : Applications environnementales solide (Figure 114 droite), les principales molécules responsables de la contamination sont la tétracycline, l oxytétracycline et la marbofloxacine. La contamination de la phase dissoute diminue fortement entre le lisier stocké et le bassin d aération mais elle ré-augmente entre le bassin d aération et le bassin de décantation. Le niveau de contamination de la lagune est plus faible que celui du lisier stocké mais il n y a pas de diminution progressive le long de la filière. Dans la phase solide, les variations sont faibles et la lagune est même davantage contaminée que le lisier stocké phase dissoute lisier stocké bassin d'aération bassin de décantation lagune monensine sulfadiazine oxytétracycline tétracycline marbofloxacine lincomycine tylosine phase solide phase solide lisier stocké bassin d'aération bassin de décantation Figure 114 : Evolution de la contamination le long de la filière de traitement dans la phase dissoute 0 (gauche) et dans la phase solide (droite, ng/g de poids sec) de l'élevage 5. lagune monensine sulfadiazine oxytétracycline tétracycline marbofloxacine monensine lincomycine tylosine sulfadiazine oxytétracycline tétracycline marbofloxacine lincomycine tylosine lisier stocké bassin d'aération bassin de décantation La Figure 115 met en parallèle l évolution de la contamination totale (liquide et solide) dans les deux élevages étudiés. Dans l élevage 4, la contamination diminue le long de la filière de traitement entre le lisier stocké et la lagune. En revanche, la contamination augmente dans le reflux de séparation. Dans l élevage 5 où la phase solide n est pas séparée de la phase liquide, la contamination ne varie que très peu mais elle est plus faible dans la lagune que dans le lisier stocké. Elle est cependant plus importante dans le bassin d aération en automne et plus importante dans le bassin de décantation au printemps. D une façon générale, la contamination totale le long des filières de traitement complexe du lisier diminue mais cette diminution est plus marquée dans le cas où la phase solide et la phase liquide sont séparées. lagune élevage 1 élevage élevage lisier stocké bassin d'aération bassin de décantation lagune reflux de séparation lisier stocké bassin d'aération bassin de décantation Figure 115 : Comparaison des évolutions de la contamination du lisier le long des différentes filières de traitement. lagune 265

266 Chapitre 5 : Applications environnementales En conclusion de cette étude, il s avère que les filières complexes de traitement permettent de faire baisser la contamination du lisier par les antibiotiques essentiellement à cause de la séparation des phases solides et liquides. Les phénomènes de dégradation sont faibles comparativement à l impact que peut avoir la séparation des phases. Aussi, l évolution de la contamination le long de la filière de l élevage 5, où les phases ne sont pas séparées, est peu marquée. II.5. Devenir des antibiotiques en conditions contrôlées Pour finaliser les études sur le devenir des antibiotiques dans les lisiers porcins, 3 expériences de dégradation en laboratoire ont été conduites. Dans la première expérience, le devenir des antibiotiques est étudié durant le passage du lisier dans un couplage mettant en œuvre un digesteur anaérobie mésophile puis un réacteur dans lequel des réactions de nitrification et dénitrification sont provoquées par l alternance de conditions aérobies et anoxiques. En se basant sur les résultats de la première expérience, dans la deuxième expérience, le lisier arrive directement, depuis la cuve de stockage, dans le réacteur où les phases d anoxie et d aérobie alternent. Le devenir des antibiotiques est donc étudié uniquement dans le réacteur. Enfin, dans la troisième expérience, le devenir des antibiotiques est étudié dans 2 réacteurs différents utilisant des conditions anaérobies thermophiles. Les réacteurs se différencient par l origine de leurs inocula. L inoculum du réacteur 1 (R1) provient de boues de STEP alors que celui du réacteur 2 (R2) provient de fumier équin. II.5.1. Dégradation en condition mésophile anaérobie et aérobie/anoxique Dans la première expérience, les prélèvements ont été effectués en entrée du système (RLB), en sortie du digesteur (RLdig) et en sortie du réacteur (RLsort) à 3 dates différentes. L analyse des antibiotiques a été réalisée sur 5 des 7 composés majoritaires (un antibiotique par famille : lincomycine, oxytétracycline, sulfadiazine, marbofloxacine et monensine). Les résultats ont été moyennés sur les 3 dates et sont présentés dans le Tableau 67 et la Figure 116. Les résultats de l analyse de la phase dissoute montrent qu il n y a pas de dégradation lors du traitement anaérobie du lisier (RLdig) alors que la concentration diminue fortement après traitement aérobie/anoxie (RLsort). A l exception de l oxytétracycline, les résultats de l analyse de la phase solide présentent les mêmes tendances : pas de diminution des concentrations lors du traitement anaérobie du lisier (RLdig) et forte diminution des concentrations après le traitement aérobie/anoxie (RLsort). En revanche, en ce qui concerne l oxytétracycline, une diminution de sa concentration est observée dans le digesteur anaérobie mais cette dernière re-augmente en sortie du réacteur. Enfin, en considérant la phase solide et la phase dissoute (total, Figure 116), il apparait qu à l exception de l oxytétracycline, il n y a pas de dégradation dans le digesteur anaérobie. Avec une forte diminution de la concentration totale en antibiotique à la sortie du réacteur et un abattement global de 84 %, il semblerait en revanche, que les antibiotiques soient dégradés après traitement aérobie/anoxie, sauf la monensine probablement en raison de la variabilité des analyses. 266

267 concentration totale (ng/l) Chapitre 5 : Applications environnementales Tableau 67 : Concentrations moyennes en antibiotiques dans la phase dissoute et dans la phase solide des lisiers avant (RLB) et après traitement anaérobie (RLdig) ou couplage aérobie-anoxique (RLsort) mésophile. dissout (ng/l) (n=4) solide (ng/g poids sec) (n=3) composés RLB RLdig RLsort RLB RLdig RLsort oxytétracycline ± ± ± ± ± ± 211 sulfadiazine ± ± ± ± ± 46 8 ± 5 lincomycine ± ± ± ± ± ± 10 marbofloxacine 187 ± ± ± ± ± ± 10 monensine 15 ± ± ± 25 2 ± 2 6 ± 7 19 ± 14 RLB RLdig RLsort lincomycine marbofloxacine monensine oxytétracycline sulfadiazine lincomycine marbofloxacine monensine Figure 116 : Concentrations moyennes totales en antibiotiques dans le lisier avant (RLB) et après traitement anaérobie (RLdig) ou couplage aérobie-anoxique (RLsort) mésophile. II.5.2. Dégradation en condition mésophile aérobie/anoxique Dans la deuxième expérience, les prélèvements ont été effectués en entrée (alimentation) et en sortie (sortie) du réacteur aérobie/anoxie à 3 dates différentes. L analyse des antibiotiques a été réalisée sur les 7 composés majoritaires et les résultats ont été moyennés sur ces 3 dates. Ils sont présentés dans le Tableau 68 et la Figure 117. L analyse de la phase dissoute montre une forte diminution de la concentration en antibiotiques entre l entrée et la sortie du réacteur et confirme les résultats obtenus au cours de la première expérimentation. A l exception de la sulfadiazine, aucune diminution de concentration n est observée dans la phase solide des lisiers entre l entrée et la sortie des réacteurs. Cette tendance est un peu différente de celle observée au cours de la première expérimentation. Au total, la concentration en antibiotique diminue suite au traitement aérobie/anoxique appliqué dans le réacteur. Mais des différences sont observées entre les antibiotiques (oxytétracycline, sulfadiazine et lincomycine diminuent, marbofloxacine et tylosine restent constantes, tétracycline et monensine ne varient pas si les écart-types sont pris en compte). Ces différences génèrent un abattement total moindre dans cette deuxième expérience (45 %) par rapport à la première expérience (84 %). Les performances de ce système sont donc réduites par rapport à celles du couplage digesteur anaérobie - réacteur aérobie/anoxie. Il est donc probable que l étape de digestion anaérobie favorise la dégradation des composés dans le réacteur aérobie/anoxique en modifiant les caractéristiques de la matrice par exemple, bien qu elle n influence pas directement les concentrations en antibiotiques. 267

268 concentration total (ng/l) Chapitre 5 : Applications environnementales Tableau 68 : Concentrations moyennes en antibiotiques dans la phase dissoute et solide des lisiers à l entrée du réacteur (alimentation) et en sortie du réacteur (sortie) aérobie-anoxique mésophile. dissout (ng/l) (n=3) solide (ng/g poids sec) (n=3) composés alimentation sortie alimentation sortie oxytétracycline ± ± ± ± 84 sulfadiazine ± ± ± ± 16 lincomycine 613 ± 17 0 ± 0 46 ± 4 52 ± 3 tylosine 0 ± 0 28 ± 25 2 ± 0 5 ± 1 tétracycline 27 ± 0 40 ± ± 4 15 ± 1 marbofloxacine 149 ± ± ± ± 36 monensine 133 ± ± 17 1 ± 1 2 ± 1 alimentation sortie tétracycline monensine tylosine 0 oxytétracycline sulfadiazine marbofloxacine lincomycine tétracycline monensine Figure 117 : Concentrations moyennes totales en antibiotiques dans le lisier à l entrée du réacteur (alimentation) et en sortie du réacteur (sortie) aérobie-anoxique mésophile. tylosine II.5.3. Dégradation en condition thermophile anaérobie Dans la troisième expérience, les prélèvements ont été effectués à 4 dates différentes en entrée (alim.) et en sortie de 2 réacteurs (R1 et R2) fonctionnant tous les 2 en conditions thermophiles mais avec des inocula différents. L analyse des antibiotiques a été réalisée sur les 7 composés majoritaires et les résultats ont été moyennés sur les 4 dates. Ils sont présentés dans le Tableau 69 et la Figure 118. La phase dissoute et la phase solide présentent des tendances très similaires et par conséquent identiques à celle du total. Aucune dégradation n est observée dans le réacteur 1 dont l inoculum provient d une boue de STEP. La concentration totale en antibiotiques augmente et l abattement est négatif (-36 %). Il semblerait que l augmentation de la sulfadiazine et de la lincomycine dans la phase dissoute et celle de l oxytétracycline dans la phase solide soit responsable de ce résultat. Aucune dégradation n est également observée dans le réacteur 2 dont l inoculum provient d un fumier équin. La concentration en antibiotique entre l entrée et la sortie du réacteur reste stable. Bien que meilleur, l abattement reste aussi négatif (-4 %). Les antibiotiques ne sont donc pas dégradés en condition anaérobie. De plus, la température ne semble pas influencer la dégradation des antibiotiques puisque qu elle était plus élevée dans cette expérience (55 C) que dans les 2 premières (38 C). 268

269 concentration totale (ng/l) Chapitre 5 : Applications environnementales Tableau 69 : Concentrations moyennes en antibiotiques dans la phase dissoute et dans la phase solide à l entrée des réacteurs anaérobies thermophiles (alim) et en sortie du premier réacteur (R1) et du second réacteur (R2). dissout (ng/l) (n=4) solide (ng/g poids sec) (n=4) composés alim R1 (sortie1) R2 (sortie2) alim R1 (sortie1) R2 (sortie2) oxytétracycline 5716 ± ± ± ± ± ± 229 sulfadiazine 3778 ± ± ± ± ± 7 32 ± 20 lincomycine 1123 ± ± ± ± 6 69 ± ± 16 tylosine 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 1 ± 1 0 ± 0 1 ± 1 tétracycline 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 60 ± ± ± 35 marbofloxacine 0 ± 0 0 ± 0 0 ± 0 53 ± ± ± 25 monensine 518 ± ± ± 80 2 ± 2 2 ± 1 1 ± alimentation R1 (sortie1) R2 (sortie2) oxytétracycline sulfadiazine lincomycine sulfadiazine lincomycine tétracycline marbofloxacine monensine Figure 118 : Concentrations moyennes totales en antibiotiques à l entrée des réacteurs anaérobies thermophiles (alim) et en sortie du premier réacteur (R1) et du second réacteur (R2) tylosine II.5.4. Bilan sur le devenir des antibiotiques Si les résultats du suivi de la contamination de la fosse de stockage sur 5 mois dans les filières simples de traitement du lisier (cf. II.4.1 Filières traditionnelles de stockage du lisier) sont mis en parallèle avec ceux obtenus lors des études de dégradations en conditions contrôlées, il apparait clairement que les antibiotiques ne sont pas dégradés en condition anaérobie. Et si les résultats du suivi de la contamination du lisier le long de la filière de traitement dans les systèmes complexe de traitement du lisier (cf. II.4.2Filières complexes avec traitement du lisier) sont mis en parallèle avec ceux obtenus lors des études de dégradations en conditions contrôlées, il apparait que la dégradation des antibiotiques dans les lisiers est aérobie. De plus, pour améliorer la dégradation des composés il est important de séparer la phase solide de la phase liquide. C est pourquoi, les filières complexes de traitement incluant une étape de centrifugation entre la fosse de stockage et le bassin d aération sont intéressantes pour réduire la contamination du lisier par les antibiotiques car en plus de posséder des bassins d aération où la dégradation aérobie peut avoir lieu, elles séparent la phase liquide de la phase solide. Par ailleurs, pour traiter efficacement la pollution des lisiers par les antibiotiques, il est important de connaître à la fois les molécules antibiotiques présentes dans le lisier et leurs modes de répartition entre la phase liquide et solide. En effet, il faudra par exemple porter une attention particulière au traitement de la phase liquide d un lisier contaminé en lincomycine alors qu il faudra plus s attacher à traiter la phase solide d un lisier contaminé en tétracycline. En conséquence, pour traiter la contamination par les antibiotiques du lisier, il faut séparer la 269

270 Chapitre 5 : Applications environnementales phase solide de la phase liquide et adapter un mode de traitement à chacune des deux phases en fonction des molécules que l on cherche à y dégrader. II.6. Conclusion sur la contamination des lisiers De l ensemble de toutes ces analyses, il ressort : 1. que 7 antibiotiques sont majoritaires car identifiés et quantifiés dans tous les échantillons de lisiers (oxytétracycline, sulfadiazine, lincomycine, tétracycline, tylosine, marbofloxacine, monensine). 2. qu il est nécessaire, pour préserver les échantillons entre le prélèvement et l analyse, de les congeler en ayant préalablement séparé les phases dissoutes, solide et particulaire afin d éviter les phénomènes de spéciation et le transfert des molécules d une phase vers l autre. 3. que les niveaux de contamination du lisier par les antibiotiques sont élevés, de l ordre de la dizaine de µg/l au mg/l. 4. que le niveau de contamination des lisiers n est pas clairement lié au stade physiologique des cochons bien que le stade post-sevrage semble être celui qui contribue le plus à la contamination. 5. que la contamination du lisier dans la fosse de stockage varie de façon aléatoire au cours des 5 mois de suivi. L intérêt de stocker le lisier pour en réduire la contamination en antibiotique préalablement à l épandage n a pas été mis en évidence. 6. que les molécules se répartissent différemment entre la phase solide et la phase liquide. L oxytétracycline, la tétracycline, la tylosine et la marbofloxacine sont majoritairement présentes dans la phase solide alors que la sulfadiazine, la lincomycine et la monensine sont essentiellement présentes dans la phase liquide. 7. que la séparation des phases solides et liquides permet de réduire la contamination des lisiers dans les filières de traitement. 8. que la dégradation des antibiotiques se fait principalement en condition aérobie. 270

271 CHAPITRE 6 Développement et application des PCIS 271

272 272

273 Chapitre 6 : Développement et application des PCIS Chapitre 6 : Développement et application des PCIS I. DEVELPPEMENT DE L UTIL : EXPERIENCES DE CALIBRATIN II. APPLICATIN DES PCIS PUBLICATIN : CALIBRATIN ET APPLICATIN D'ECHANTILLNNEURS PASSIFS PUR LA DETERMINATIN DE 22 MLECULES PHARMACEUTIQUES DANS L'EAU RESUME INTRDUCTIN I. EXPERIMENTALE I.1. Produits chimiques et matériel I.2. Traitement de l'échantillon I.2.1. Extraction des échantillons aqueux et pré-concentration I.2.2. Extraction des PCIS I.3. Chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem I.4. Calibration en laboratoire I.4.1. Conditions expérimentales I.4.2. Determination des constantes d'adsorption et de desorption et des taux d'échantillonnage I.5. Application environnementale I.6. Paramètres de validation et assurance qualité II. RESULTATS II.1. Développement de l'extraction des PCIS II.2. Calibration en laboratoire II Application environnementale, comparaison entre échantillonnage ponctuel et passif CNCLUSIN REMERCIEMENTS REFERENCES Dans une première partie, les 3 phases nécessaires au développement des PCIS (Polar rganic Chemical Integrative Sampler) sont présentées : i) optimisation de l étape d extraction des composés piégés dans la phase adsorbante ; ii) vérification de la faisabilité de l expérience de calibration en laboratoire en s assurant de la stabilité de la contamination de l eau en aquarium ; et iii) expérience de calibration des PCIS en laboratoire et détermination des paramètres tels que le taux d échantillonnage (Rs) ou les constantes d adsorption (k 1 ) ou de désorption (k 2 ). Dans une deuxième partie, une comparaison des résultats obtenus suite à des analyses d eau prélevée ponctuellement et des analyses consécutives au déploiement des PCIS est présentée. 273

274 Chapitre 6 : Développement et application des PCIS La question de la représentativité des échantillons analysés et donc de leurs modes de prélèvement peut être soulevée. Généralement, les échantillons aqueux environnementaux sont prélevés en une fois, à un moment T, variable d un point de prélèvement à un autre en fonction de diverses contraintes comme l accessibilité au site par exemple. r ce moment T peut avoir lieu durant un pic de pollution par exemple, générant alors des niveaux élevés de contamination du site étudié. A l inverse, il peut avoir lieu à un instant où les eaux sont diluées par de fortes précipitations par exemple, générant alors des niveaux de contamination faibles. Dans un cas comme dans l autre, les concentrations déterminées ne reflètent pas le niveau général de contamination. En conséquence, un seul prélèvement n est pas suffisant pour représenter la contamination d un site. Ce phénomène est encore davantage marqué dans le cas des molécules pharmaceutiques car leur présence, particulièrement dans les eaux usées, est liée à leur consommation et à leur excrétion. Les médicaments étant souvent pris au cours des repas, l excrétion et donc la présence des molécules pharmaceutiques est souvent maximales 3 4 heures après les repas. Ainsi, il est fort probable que des échantillons prélevés en fin de matinée ou en fin d après midi ne donnent pas les mêmes informations que si ils avaient été prélevés tôt le matin ou en milieu d après-midi. Pour pallier ce problème, une technique consiste à réaliser un échantillon moyen soit à partir de prélèvements réguliers sur une journée soit à l aide d un préleveur automatique. Mais ces techniques sont fastidieuses et/ou coûteuses. De plus, dans le cadre d analyse de traces, de grands volumes d eau sont généralement nécessaire ce qui rajoute une difficulté supplémentaire. Par ailleurs, une fois les échantillons prélevés, il faut encore les filtrer, en extraire les composés d intérêt et les concentrer avant de pouvoir pratiquer l analyse. Les échantillonneurs passifs sont des outils qui ont été mis au point pour remédier à ces problèmes. Ils permettent d extraire et de concentrer les composés directement au cours du prélèvement et comme ils peuvent être déployés plusieurs semaines, ils intègrent les différents pics ou chutes de pollution. Ils présentent donc le double avantage d'intégrer la contamination sur toute la durée de leur exposition et de pré-concentrer les molécules d'intérêt. Dans le cas des molécules pharmaceutiques, les échantillonneurs passifs classiquement utilisés sont les PCIS (Vrana et al., 2005). Au cours de ces travaux de thèse, cet outil a été calibré pour permettre l analyse de 22 des 78 molécules pharmaceutiques sélectionnées. Ces 22 molécules ont été choisies selon des critères économiques (représentativité des 5 classes thérapeutiques et coût des composés standard de référence), analytiques (facilité d analyse, fiabilité de l analyse, étalonnage interne possible) et littéraire (stabilité, propriétés physico-chimiques). I. Développement de l outil : expériences de calibration Dans un premier temps le protocole permettant d extraire les composés piégés dans la phase des PCIS a été optimisé. Le choix du solvant et du volume d élution a été effectué au cours de tests réalisés en triplicat sur de la phase asis HLB dopée avec les composés d intérêt. En s appuyant sur la littérature scientifique (Vrana et al., 2005 ; Bartelt-Hunt et al., 2009 ; li et al., 2010) et en raison de l absence d antibiotiques appartenant à la famille des pénicillines dans les composés étudiés, le méthanol a été choisi comme solvant d élution. Différents volumes de solvant (10 ml MeH + 10 ml MeH/DCM 50/50 ; 20 ml MeH ; 40 ml MeH) ont été testés pour éluer les composés. En raison du peu de différences observées entre les résultats obtenus pour les diverses conditions, le protocole consommant le moins de solvant a été retenu. Les composés sont donc élués de la phase adsorbante avec 20 ml de méthanol. L optimisation de la méthodologie d évaporation/reconcentration et en particulier de la température à laquelle cette étape peut être pratiquée a ensuite été réalisée. Les résultats 274

275 concentration dans l'échantillonneur Chapitre 6 : Développement et application des PCIS de ces tests ont conduit à choisir une température de 60 C pour réduire le temps d évaporation sans risque de perdre les composés. Puis les PCIS ont été calibrés au cours d expérimentations conduites en laboratoire dans des aquariums dont la contamination, mesurée régulièrement, était apportée par un flux continu. La première expérience a permis de vérifier la stabilité de la contamination de l eau et la faisabilité de l expérimentation. régime à l'équilibre régime cinétique C C eau CPCIS. m Ceau Rs. t PCIS k 1. k 2 temps Figure 119 : Les différents régimes d'adsorption des échantillonneurs passifs. Tableau 70: Régime d'adsorption sur 15 jours d exposition et valeurs des paramètres calculés pour les 22 molécules pharmaceutiques. composés type de régime taux d échantillonnage Rs (L/j) constante d adsorption k 1 (L/g/j) constante de désorption k 2 (j -1 ) azithromycine cinétique 0,201 1,86 clarithromycine cinétique 0,178 1,65 érythromycine cinétique 0,140 1,29 clindamycine cinétique 0,199 1,84 ciprofloxacine cinétique 0,102 0,95 ofloxacine cinétique 0,204 1,88 acide pipémidique équilibre 1,49 0,27 tétracycline cinétique 0,060 0,56 oxytétracycline cinétique 0,027 0,25 sulfaméthoxazole équilibre 0,35 0,27 triméthoprime cinétique 0,221 2,04 métronidazole équilibre 0,30 0,34 aténolol équilibre 0,98 0,20 métoprolol cinétique 0,161 1,49 propranolol cinétique 0,193 1,79 daunorubicine équilibre 85,28 0,16 cyclophosphamide cinétique 0,102 0,94 méthotréxate équilibre 2,40 0,36 tamoxifen? abacavir cinétique 0,180 1,67 ritonavir? sildénafil cinétique 0,213 1,97 Une fois la stabilité de la contamination validée, la deuxième expérience a pu être réalisée. Elle a permis de définir le régime d adsorption des PCIS pour chacun des composés en se basant sur la courbe «concentration dans l échantillonneur en fonction du temps» (Figure 275

276 Chapitre 6 : Développement et application des PCIS 119). Elle a également permis de déterminer différents paramètres comme le taux d échantillonnage (Rs) ou les constantes d adsorption (k1) et de désorption (k2) à partir des concentrations mesurées dans l eau des aquariums et dans les PCIS pour chaque composé. Lors d application dans le milieu naturel, ces paramètres servent à calculer la concentration moyenne dans l eau (C eau ) au cours de la période d exposition à partir de la concentration en analytes mesurée dans le PCIS (C PCIS ). Si, sur la durée de l exposition, les composés ont atteint le régime à l équilibre, alors la concentration moyenne dans l eau est calculée à partir C. k2 de l équation suivante C PCIS eau. Si, sur la durée de l exposition, les composés sont k1 dans le régime cinétique, alors la concentration moyenne dans l eau est calculée à partir de CPCIS. m l équation suivante Ceau avec m la masse de phase adsorbante dans le PCIS et t Rs. t la durée de l exposition. Sur une durée d exposition de 15 jours, 14 des 22 molécules pharmaceutiques étudiées présentent des régimes d accumulation de type cinétique et leur Rs ont pu être calculés ; 6 semblent avoir atteint leur équilibre et les constantes d adsorption et de désorption ont été calculées ; et 2 présentent des cinétiques d accumulation très particulières qui n ont pas permis de déterminer aucun des 3 paramètres (Tableau 70). II. Application des PCIS Une fois l outil calibré, il a été utilisé en milieu naturel pour évaluer la contamination d une rivière, la Garonne, en amont et en aval d une zone urbaine, la ville de Bordeaux. Des prélèvements ponctuels d'eau ont été réalisés en parallèle au moment du dépôt et du retrait des capteurs. Les PCIS ont permis de détecter des composés qui ne l étaient pas avec les prélèvements ponctuels (exemple : abacavir et cyclophosphamide). De plus, l impact de la zone urbaine, et notamment des 2 rejets de STEP qu elle englobe, sur la contamination de la rivière a été mis en évidence avec des concentrations détectées en aval plus fortes que celles détectées en amont. Les PCIS se sont donc révélés être de bons outils pour échantillonner les molécules ciblées. L ensemble des développements et applications sont détaillés dans la publication «Calibration et application d'échantillonneurs passifs pour la détermination de 22 molécules pharmaceutiques dans l'eau». 276

277 Chapitre 6 : Développement et application des PCIS Publication : Calibration et application d'échantillonneurs passifs pour la détermination de 22 molécules pharmaceutiques dans l'eau CAPDEVILLE M.J., BUYTAERT S., BELLES A. AND BUDZINSKI H. * EPC-LPTC, UMR 5805, CNRS - Université Bordeaux 1, 351 cours de la libération, Talence cedex, France * Corresponding author. Tel.: + 33 (0) Fax: + 33 (0) A soumettre dans Analytica Chimica Acta Résumé L utilisation de PCIS (Polar rganic Chemical Integrative Sampler) pour l échantillonnage, dans des eaux de surface, de molécules pharmaceutiques appartenant à 5 classes thérapeutiques différentes (antibiotiques, anticancéreux, anti-vih, -bloquants et inhibiteurs de phosphodiestérase de type 5 (PDE 5)), a été étudiée dans cet article. La première étape a consisté à mettre au point un protocole d'extraction. Ce développement a conduit à l'utilisation de 20 ml de méthanol pour éluer les composés retenus dans la phase adsorbante. Une fois la méthode d'extraction optimisée, une expérience de calibration des capteurs a été conduite en laboratoire. Cette expérimentation a mis en jeu un aquarium maintenu sous agitation et alimenté en continu avec de l'eau du robinet et la solution méthanolique de contamination. Des PCIS et de l'eau ont été prélevés et analysés régulièrement durant les 15 jours de l'expérience. Le tracé des courbes d'accumulation des analytes dans les capteurs en fonction du temps ont permis de définir les régimes d'accumulation des PCIS pour chacune des molécules ciblées. 14 composés présentent des régimes cinétiques d'accumulation et leurs taux d'échantillonnage (Rs) ont pu être déterminés par régression linéaire. 6 composés semblent avoir déjà atteint leur équilibre sur la durée de la manipulation et les valeurs de leurs constantes d adsorption (k 1 ) et de désorption (k 2 ) ont pu être calculées. 2 composés (tamoxifen, ritonavir), apparemment trop hydrophobes pour les outils employés ici, ont donné des courbes particulières (type exponentiel, pas d accumulation ou accumulation negligeable les premiers jours puis forte accumulation) et aucun paramètre n'a pu être établi pour eux. Enfin, les outils ont été déployés dans une rivière en amont et en aval d'une zone urbaine. Parallèlement, des prélèvements ponctuels d'eau ont été réalisés au moment du dépôt et du retrait des capteurs. Quelque soit le mode d'échantillonnage, les concentrations mesurées en aval de la ville sont plus fortes que celles mesurées en amont mettant ainsi en évidence l'impact de la zone urbaine sur la contamination du milieu. Les PCIS ont permis de détecter des molécules qui n ont pas été décelées dans les prélèvements d'eau. Les concentrations déterminées par échantillonnage passif sont globalement du même ordre de grandeur que celles déterminées par échantillonnage ponctuel. Les PCIS se sont donc révélés être de bons outils pour échantillonner les molécules ciblées. Keywords: pharmaceuticals, PCIS, passive sampling, RRLC/MS/MS, sampling rate Rs 277

278 Chapitre 6 : Développement et application des PCIS Introduction Une des origines principales des molécules pharmaceutiques dans les eaux de surface sont les rejets de stations d'épuration (STEP). En effet, une fois ingérés les médicaments sont excrétés via les urines ou les fèces et se retrouvent ainsi dans les eaux usées. Les STEP n'ont pas initialement été conçues pour éliminer totalement ces composés et les résidus médicamenteux sont rejetés avec les eaux traitées dans les cours d eau et les eaux marines. De par leurs origines et leurs modes de consommation, les médicaments étant souvent consommés aux heures des repas, le niveau de contamination des eaux de surface est donc variable selon l'heure à laquelle le prélèvement est effectué. Lindberg et al. (2004) mettent bien en évidence ce phénomène à l'échelle de la journée pour des antibiotiques tels que la ciprofloxacine, le sulfaméthoxazole ou le métronidazole. De plus des évènements météorologiques comme de fortes pluies (dilution) ou une sècheresse (rejet de STEP qui peut constituer plus de 50% du cours d'eau dans lequel il se déverse) peuvent entraîner des variations de concentration à l'échelle de la semaine. Pour palier ce genre de problème, une solution consiste à fabriquer un échantillon "moyen" en mélangeant plusieurs prélèvements effectués à intervalles de temps courts et réguliers. Mais ce système nécessite soit la disponibilité d'un technicien sur le site de prélèvement pendant une journée entière, voir plusieurs jours, ce qui est contraignant, soit de disposer d'un appareillage coûteux qui réalise automatiquement les prélèvements avec le risque qu'ils soient dégradés puisque laissés sur site. L échantillonnage peut aussi être asservi au débit. Une fois les échantillons collectés il faut encore les filtrer pour séparer la phase dissoute de la phase particulaire puis en extraire les composés d'intérêt. Par ailleurs, pour pouvoir analyser des composés présents à l'état de traces, comme c'est le cas des molécules pharmaceutiques, il est nécessaire d'avoir un grand volume d'eau pour concentrer les molécules ce qui rajoute une contrainte supplémentaire. Une alternative à ces problèmes est l'utilisation d'échantillonneurs passifs qui sont déposés dans le milieu pour une durée de quelques jours à plusieurs semaines. Ces échantillonneurs présentent le double avantage d'intégrer la contamination sur toute la durée de leur exposition et de pré-concentrer les molécules d'intérêt. Dans le cas des molécules pharmaceutiques, un dispositif couramment utilisé est le PCIS ou Polar rganic Chemical Integrative Sampler (Togola et Budzinski, 2007). Il est constitué de phase adsorbante solide retenue entre deux membranes en polyéthersulfone qui sont maintenues collées l'une à l'autre par deux anneaux métalliques (Vrana et al., 2005). La technique de l'échantillonnage passif est basée sur les mécanismes de diffusion des polluants du milieu aquatique vers la phase réceptrice du dispositif (AQUA- REF, 2010). Ainsi, à partir des concentrations en polluants mesurées dans la phase des PCIS et à partir des valeurs des constantes d adsorption et de désorption ou de celles du taux d échantillonnage, les concentrations en polluants dans le milieu aquatique peuvent-être calculées. Les valeurs des constantes d adsorption et de désorption et celles du taux d échantillonage sont composé-dépendantes et sont définies lors d expériences de calibration réalisées en laboratoire lorsque les concentrations dans l eau et dans les PCIS sont connues (Vrana et al., 2005). Les molécules pharmaceutiques appartiennent au groupe des contaminants émergents de l'environnement car ce sont des composés qui sont étudiés depuis moins longtemps que des polluants classiques tels que les hydrocarbures aromatiques polycycliques (HAP) ou les pesticides. Du fait de leur caractère récent, les outils nécessaire à leur dosage dans l environnement ne sont pas encore tous calibrés. Cet article traitera donc du développement des PCIS pour une vingtaine de composés pharmaceutiques appartenant à des classes thérapeutique diverses (antibiotiques, anticancereux, -bloquants, anti-vih et inhibiteurs de PDE 5). Les composés étudiés ont été sélectionnés en s appuyant sur des critères à la fois 278

279 Chapitre 6 : Développement et application des PCIS économique (coût des composés standards de référence), analytique (facilité d analyse, étalonnage interne possible) et bibliograhique (stabilité, propriétés physico-chimiques, usage et consommation des médicaments, présence potentielle en raison de leur détection dans d autres études environnementales). Le but était de diversifier le plus possible la sélection pour avoir à la fois des composés dont on dispose de valeurs de Rs afin de pouvoir comparer nos résultats avec ceux déjà obtenus dans d autres études et de composés, qui à notre connaissance, n ont jamais été étudiés afin d améliorer la connaissance de l outil. Le Tableau 1 présente les composés sélectionnés avec certaines de leurs propriétés physico-chimiques. La première partie du développement a consisté à trouver un protocole d extraction adéquat pour l ensemble des composés étudiés. La deuxième partie a consisté à calibrer les PCIS en laboratoire c est-à-dire à définir les valeurs des constantes d adsorption et de désorption ou du taux d échantillonage des PCIS pour chaque composé. Enfin, une fois calibrés, les PCIS ont été appliqués à l étude de la contamination de la Garonne en amont et en aval de la ville de Bordeaux (France), partie de la rivière où le milieu est dilué et variable. Les concentrations en molécules pharmaceutiques mesurées par les échantillonneurs passifs ont ensuite été comparées avec celles issues d échantillonnages ponctuels d eau réalisés au moment de la pose et du retrait des PCIS. Tableau 1: Utilisation au cours de cette étude, propriétés physico-chimiques et limites instrumentales de detection et de quantification des composés étudiés (MM = masse molaire). classe famille antibiotique macrolide composés utilisation 1 structure des molecule azithromycine calibration CH 3 CH 3 H 3 C H H 3 C CH H 3 H H 3 C CH 3 N H H H 3 C CH 3 H 3 C N CH 3 CH Azi t hr omyci n 3 H 3C CH 3 CH3 H MM 2 (g/mol) Log Kow 2 (25 C) Solubility 2 (mg/l) (25 C, ph 7) IDL / IQL (pg injectés) 748,98 3, / 33 CH 3 CH 3 CH 3 CH 3 clarithromycine calibration H 3C H CH 3 747,95 3, ,4 / 1 H 3C H CH 3 N H H 3C CH 3 CH 3 H 3C CH 3 H3C Clarithromycin H CH 3 CH 3 érythromycine stabilité / calibration CH 3 H3C H CH 3 CH 3 733,93 2, / 8 H 3C H CH 3 N H 3C H H CH 3 H 3C CH 3 Erythromycin CH 3 H3C H CH 3 CH 3 CH 3 roxithromycine stabilité H3C H CH 3 837,1 3,73 n,a 1 / 3 H 3C H CH 3 N H 3C H H CH 3 H 3C CH 3 Roxithromycin N CH 3 279

280 Chapitre 6 : Développement et application des PCIS classe famille antibiotique lincosamide composés utilisation 1 structure des molecule clindamycine calibration CH 3 N Cl N H CH 3 CH 3 S MM 2 (g/mol) Log Kow 2 (25 C) Solubility 2 (mg/l) (25 C, ph 7) IDL / IQL (pg injectés) 424,98 1, ,2 / 0,6 H H H 3C H Clindamycin H CH 3 H 3C CH 3 lincomycine stabilité N N H S 406,54 0, ,3 / 0,8 H H H antibiotique fluoroquinolone H 3C Lincomycin F H ciprofloxacine calibration N N 331,34 1, / 10 HN Ciprofloxacin F ofloxacine stabilité / calibration N N H 361,37 1, ,8 / 2 N H3C CH 3 antibiotique quinolone acide oxolinique stabilité floxacin N H 261,23 0, ,1 / 0,2 xolinic acid CH 3 N H acide pipemidique calibration N N N 303,32 0, ,8 / 6 HN CH 3 antibiotic tétracycline tétracycline stabilité / calibration H Pipemidic acid H 3C CH 3 N CH3 H NH2 444,43-1, ,7 / 2 H H H H Tetracyclin H 3C CH 3 CH 3 H N oxytétracycline stabilité / calibration H NH 2 460,43-1, / 3 H H H antibiotique sulfonamide sulfaméthazine stabilité H 3C N xytetracyclin HN S NH 2 N Sulfamethazine 278,33 0, ,2 / 0,7 CH 3 sulfaméthoxazole stabilité / calibration N HN S Sulfamethoxazole NH 2 253,28 0, / 3 CH 3 280

281 Chapitre 6 : Développement et application des PCIS classe famille composés utilisation 1 structure des molecule MM 2 (g/mol) Log Kow 2 (25 C) Solubility 2 (mg/l) (25 C, ph 7) IDL / IQL (pg injectés) CH 3 triméthoprime stabilité / calibration H 2N N N CH 3 CH 3 290,32 0, ,7 / 2 antibiotique imidazole métronidazole calibration NH2 - N + Trimethoprim N CH N 3 H 171,15-0, ,4 / 1 -bloquant aténolol calibration H 3C H N H metronidazole 266,34 0, / 4 CH 3 NH 2 Atenolol H métoprolol stabilité / calibration H 3C CH 3 H N Metoprolol H CH 3 267,36 1, ,9 / 3 propranolol stabilité / calibration H 3C CH 3 H N 259,34 3, ,5 / 2 Propranolol anticancereux 5-fluorouracil calibration NH F H N H 5-fluorouracil H 130,08-0, / 495 CH 3 daunorubicine calibration NH 2 527,52 3,17 5,8 2 / 7 H 3C H H Daunorubicin Cl cyclophosphamide calibration Cl N P NH 261,09 0, / 4 H 2 N N N Cyclophosphamide CH 3 méthotréxate calibration N NH 2 N N H N H 454,44-0, / 5 Methotrexate H tamoxifen calibration H 3 C N CH 3 CH 3 371,51 7,88 2,5 8 / 25 Tamoxifen anti-vih HN abacavir calibration N N H N N NH 2 286,33 0, ,5 / 2 Abacavir CH 3 H 3C S ritonavir calibration N N H3C N H CH3 H N N H S 720,94 5,28 3,7 7 / 20 CH 3 H N Ritonavir 281

282 Chapitre 6 : Développement et application des PCIS classe famille inhibiteur PDE 5 composés utilisation 1 structure des molecule sildenafil calibration N H 3 C N S HN sildenafil N MM 2 (g/mol) 1 : calibration = expérience de calibration des PCIS stabilité = expérience pour s assurer de la stabilité des concentrations des composés dans l eau. 2 : valeurs calculées par SciFinder ACD/Lab, n.d = non disponible. CH 3 N CH 3 N CH 3 Log Kow 2 (25 C) Solubility 2 (mg/l) (25 C, ph 7) IDL / IQL (pg injectés) 747,58 2,28 7,1 3 / 8 I. Expérimentale I.1. Produits chimiques et matériel Les composés standards d'érythromycine, roxithromycine, lincomycine, tétracycline, oxytétracycline, acide oxolinique, acide pipemidique, ciprofloxacine, ofloxacine, sulfaméthazine, sulfaméthoxazole, triméthoprime, métronidazole, aténolol, métoprolol, propranolol, tamoxifèn et cyclophosphamide ont été achetés chez Sigma-Aldrich (Saint Qunetin Fallavier, France). Les composés d'azithromycine, clarithromycine, clindamycine, méthotréxate, daunorubicine, 5-fluorouracil, abacavir, ritonavir et sildénafil ont été achetés LGC Standards (Molsheim, France). Des composés isotopiques ont été utilisés comme étalons internes. L'érythromycine- 13 C 2, sulfaméthoxazole- 13 C 6, triméthoprime- 13 C 3 et ciprofloxacine- 13 C 2-15 N ont aussi été achetés chez LGC Standards. L'ofloxacine-d 3 a été acheté chez Sigma- Aldrich. L'atenolol-d 7, propranolol-d 7, 5-fluorouracil- 15 N, tamoxifen-d 5 and sildenafil-d 3 ont été achetés chez Cluzeau Info Labo (Sainte Foy la Grande, France). Les 3 derniers étalons internes clarithromycin-d 3, lincomycin-d 3 et tetracycline-d 6 ont été achetés chez Toronto Research Chemicals (North York, Toronto, Canada). Les solvents utilisés pour les expérimentations et les analyses sont le dichloromethane (DCM, Acros organic, for residues and pesticides analysis (Fisher Bioblock Scientific, Illkirch Graffens, France)), le méthanol (MeH, Merck Lichrosolv, gradient grade for LC (VWR, Strasbourg, France)), l'acétonitrile (ACN, Baker, ultra gradient HPLC grade (Atlantic labo, Bruges, France)), l'eau ultrapure (milliq, Millipore, Saint Quentin en Yvelines, France) et l'eau minérale naturelle (NMW, Vittel, Nestlé (France Boissons, Lormont, France)). Les réactifs utilisés pour cette étude sont l'acide acétique glacial (CH 3 CH, Sharlau, HPLC grade (Atlantic labo)), acide formique (HCH, Baker analyzed, 98% purity (Atlantic labo)), acide hydrochlorique (HCl, Baker analyzed reagent, % purity (Atlantic labo)), hydroxyde de sodium (NaH, VWR BDH Prolabo, normapur 97% purity (VWR)) et l'acide dissodium dihydraté d'éthylène-diamine-tétra-acétique (Na 2 -EDTA.2H 2, Sigma, 99 % purity (Sigma Aldrich)). Les cartouches en verre (6 ml) et les frittés en Teflon (Supelco) ont été achetés chez Sigma-Aldrich. Les PCIS sont montés au laboratoire avec 200 mg de phase adsorbante asis HLB (Waters, Saint Quentin en Yvelines, France) et des membranes microporeuses en polyéthersulfone (Pall Life Sciences (VWR)). La phase adorbante et les membranes sont préalablement rincées avec du méthanol. Dans la constitution finale, la phase adsorbante est piégée entre les 2 membranes qui sont maintenues colllées l'une à l'autres par des anneaux en acier inoxydable. Les cartouches utilisées pour la SPE (Solid Phase Extraction) sont des asis HLB (Hydrophilic-Lipophilic Balance, 200 mg, 6 cc) de chez Waters. Les filtres utilisés sont des filtres en fibres de verre d'une porosité de 0.7 µm (GF/F, Whatmann (Fisher Bioblock Scientific)) et 1.6 (GF/A, Whatmann (Fisher Bioblock Scientific)). Toute la verrerie est lavée à l'eau osmosée puis calciniée à 450 C pendant une nuit avant utilisation. Les filtres en fibres de verre sont aussi calcinés à 450 C pendant une nuit avant utilisation. 282

283 Chapitre 6 : Développement et application des PCIS I.2. Traitement de l'échantillon I.2.1. Extraction des échantillons aqueux et pré-concentration Les molécules pharmaceutiques sont extraites de l'eau par Extraction en Phase Solide (SPE) avec des cartouche asis HLB (200 mg, 6 ml). Le protocole a préalablement été optimisé et les détails des expériences sont accessibles dans Capdeville et al. (Development of a method for the simultaneous extraction of antibiotics, -blockers, antineoplastics and antivirals by solid-phase extraction followed by liquid chromatography tandem mass spectrometry analysis application to sewage treatment plant effluents). Avant l'extraction, les étalons internes sont ajoutés dans l'eau et le ph est ajusté à 7 avec de l'acide chlorhydrique ou de la soude. Puis quelques millilitres d'une solution de Na 2 -EDTA à 250 mm sont ajoutés pour obtenir une concentration finale à 10 mm dans chaque échantillon. L'addition de Na 2 -EDTA provoque la diminution du ph entre 4 et 5. Les cartouches sont conditionnées avec 5 ml d'acn puis 5 ml de NMW à ph ml pour les expériences de calibration et 300 ml pour les eaux de surface sont passés sur les cartouches. Les cartouches sont ensuite rincées avec 5 ml de NMW à ph 7 puis séchées sous vide pendant 1 heure. Après le séchage des cartouches, les composés sont élués avec 5 ml d'un mélange NMW/ACN (40/60, v/v). Les extraits obtenus sont évaporés à 40 C sous flux d'azote jusqu'à ce qu'il ne reste plus que quelques microlitres. Les résidus sont ensuite transférés dans des inserts de 300 µl placés dans des flacons d'injections de 2 ml. Les extraits sont évaporés une seconde fois, juste avant l'analyse, et les résidus sont dissouts dans un volume compris entre 50 et 150 µl d'un mélange eau ultrapure/acétonitrile (90/10, v/v), selon le niveau de contamination de l'échantillon. I.2.2. Extraction des PCIS Une fois retirés du milieu naturel, les PCIS sont rincés avec de l'eau ultrapure pour éliminer le biofouling. Les PCIS utilisés pour la calibration en laboratoire ou ceux exposés dans l'environnement suivent ensuite le même protocole. Ils sont démontés et les membranes sont rincées avec 5 ml de NMW pour éliminer la phase adsorbante collée dessus. La phase est collectée dans des cartouches en verre et est maitenue entre 2 frittés en Teflon. La phase est ensuite séchées sous vide et conservée à -20 C jusqu'à l'extraction. Avant l'extraction, les carrtouches sont mises à décongeler pendant une nuit et la masse exacte de phase est déterminée par différence entre le poids des cartouches vides et celui des cartouches pleines, préalablement pesées avec les 2 frittés. Les étalons internes sont ajoutés dans les flacons collecteurs des extraits organiques et la quantité exacte introduite est controlée par gravimétrie. La phase adsorbante est éluée avec un solvant organique. Cette étape a été optimisée au travers d'une série de tests utilisant différents solvants (DCM, MeH) et volumes de solvant (10, 20 et 40 ml). Dans le protocole optimisé, 20 ml de méthanol sont utilisés pour éluer les composés. Les extraits sont ensuite concentrés sous vide à basses pression et température en utilisant un Rapivap (Labconco). Cette étape peut être très longue et la température a été optimisée dans le but de réduire le temps d'évaporation. Dans le protocole final, les paramètres sont : 70% d'agitation, 60 C, 550 mbar, 30 minutes. Quand il reste environ 1 ml, 1 ml d'eau contenant 5 mm de Na 2 -EDTA est ajouté. L'évaporation est ensuite poursuivie avec les paramètres suivant : 80% d'agitation, 60 C, 250 mbar, 10 minutes puis 80% d'agitation, 60 C, 150 mbar jusqu'à ce qu'il ne reste plus que quelques gouttes. Comme pour les extraits SPE, les résidus sont transférés dans un insert en verre de 300 µl placé dans un flacon d'injection de 2 ml. Ils sont évaporés une seconde fois à 40 C sous flux d'azote juste avant l'analyse. Les résidus issus des PCIS utilisés pour la calibration en laboratoire sont dissouts dans 300 µl d'un mélange eau ultrapure/acétonitrile (90/10, v/v) et 283

284 Chapitre 6 : Développement et application des PCIS ceux issus des PCIS exposés dans l'environnement sont dissouts dans 100 µl du même mélange. I.3. Chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem Les PCIS et les échantillons d'eau sont analysés par Chromatographie en phase Liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (LC/MS/MS) utilisant une colonne Zorbax-SB C 18. Les analyses sont pratiquées avec une chaîne chromatographique Agilent 1200 series RRLC (Rapid Resolution Liquid Chromatography) et un spectromètre de masse Agilent QQQ 6410 triple quadrupôle équipé d'une source d'ionisation électrospray (Agilent, Massy, France). La RRLC est équipée de tuyaux de fin diamètre pour réduire les volumes morts et par conséquent réduire le temps d'analyse. De plus, cette technique chromatographique utilise des colonnes courtes (5 and 10 cm) contenant une phase stationnaire avec des particules de petite taille (1,8 μm), ce qui permet des pressions plus fortes, des pics chromatographiques moins larges et un temps d'analyse plus court. Les phases mobiles sont de l'eau ultrapure et de l'acétonitrile toutes 2 supplémentées avec 0,3 % d'acide formique en mode positif d'ionisation (ESI+) ou 0,1 % d'acide acétique en mode négatif d'ionisation (ESI-). Tous les composés sont analysés en ESI+ sauf le 5-fluorouracil analysé en ESI-. Les composés sont suivis en mode MRM (Multi Reaction Monitor) avec 2 transitions, une pour la quantification et une pour la confirmation. Ils sont identifiés par leurs temps de rétention, ces 2 transitions et le rapport entre elles. Les conditions analytiques sont plus détaillées dans Capdeville et al. (Multiresidue simultaneous analysis of 78 pharmaceuticals compounds in aqueous samples: development and application). I.4. Calibration en laboratoire I.4.1. Conditions expérimentales Préalablement à l expérience de calibration des PCIS, un essai sans PCIS a été réalisé dans des conditions similaires afin de s assurer que l on pouvait maintenir constante la concentration des composés dans l eau. Cette manipulation permet de vérifier qu il n y a pas de perte (adsorption sur les parois par exemple) ou de gains (pollution par le matériel utilisé par exemple) de composés durant toute la durée de l exposition. Elle a été réalisée sur une sélection réduite de 12 molécules choisies d après le cout des composés, leur toxicité et la facilité d analyse. Pour ces raisons, ce ne sont pas forcément les mêmes molécules que celles utilisées dans l expérience de calibration qui ont été retenues mais des molécules ayant des comportements supposés similaires car appartenant à la même famille (exemple : lincomycine/clindamycine, roxithromycine/clarithromycine et acide oxolinique/acide pipémidique). Cette expérience ainsi que celle de calibration des PCIS se sont déroulées dans les mêmes conditions. Elles ont utilisées un aquarium de 27 l (dimensions : 30 x 30 x 30 cm) dont l eau a été renouvelée en continu par un apport d eau du robinet (débit 13,5 L/j) et de solution méthanolique de contamination (débit 200 ml/j) et un débordement constant. Le système était maintenu sous agitation par une pale métallique (80 rpm). L eau contaminée a été évacuée vers un autre aquarium où elle a été nettoyée par passage sur charbon actif pendant au moins une semaine avant d être rejetée à l évier. La bouteille contenant la solution de contamination a été remplacée quotidiennement par une nouvelle. Les solutions de contamination, conservées au congélateur, ont été issues de la dilution d une solution mère fortement concentrée (environ 135 µg/l) ayant servi au dopage initial de l aquarium. Le dopage initial a consisté à verser directement 95,2 ml de la solution mère dans l aquarium. 284

285 concentration in the sampler Chapitre 6 : Développement et application des PCIS Ce volume a été défini d après le débit mesuré des pompes peristaltiques (eau et MeH) et la valeur de la concentration finale désirée. La solution mère a été réalisée à partir de la pesée de cristaux de composés purs dilués dans 1 litre de méthanol. Le niveau de contamination visé était compris entre 500 et 1000 ng/l suivant les composés. Pour suivre la contamination de l eau de l aquarium et vérifier la stabilité de sa concentration dans l expérience préliminaire, 200 ml d eau ont été prélevés dans des flacons Nalgen (HDPE) 6h après le dopage initial, puis tous les jours les 4 premiers jours de l expérience et enfin tous les 2 jours jusqu à la fin de l expérimentation. Pour l expérience de calibration des PCIS, afin de s assurer la stabilité du montage (débit stable des pompes péristaltiques, homogénéité de la contamination), le dopage initial a été réalisé 3 jours avant l exposition des PCIS puis le système de flux continu a été équilibré pendant 3 jours en renouvelant quotidiennement l eau et la solution de contamination. Comme pour la manipulation préliminaire, le suivi de la concentration de l eau de l aquarium a été assuré par un prélèvement de 200 ml d eau, dans des bouteilles Nalgen (HDPE), tous les jours les 4 premiers jours où sont exposés les PCIS puis tous les 2 jours jusqu à la fin de l expérimentation. Les 12 PCIS exposées ont été retirés progressivement de l aquarium : 3 sont retirés après 5 et 15 jours d exposition, 2 après 10 et un après 7, 8, 12 et 13 jours (Figure 1). nombre number de PCIS of PCIS collectés collected jours days Figure 1: Prélèvement des PCIS au cours de l expérience de calibration réalisée en laboratoire. A l exception des trois derniers PCIS, prélevés à T 15, qui ont été démontés aussitôt après avoir été sortis de l aquarium, les PCIS sont conservés à -20 C une fois retirés de l eau. Elles sont ensuite toutes démontés dans les 15 jours qui suivent leur retrait et la phase est récupérée comme décrit dans la partie I.2.2 PCIS extraction. I.4.2. Determination des constantes d'adsorption et de desorption et des taux d'échantillonnage L'adsorption des polluants suit le modèle présenté Figure 2. kinetic regime equilibrium regime time Figure 2: Passive sampling devices adsorption regimes. 285

286 Chapitre 6 : Développement et application des PCIS Les échanges entre la phase réceptrice et l'eau peuvent être modélisés par l'équation suivante (Vrana et al., 2005): C PCIS : analyte concentration in PCIS (µg/g) k1 k2t CPCIS ( t) Cwater.. (1 e ) (1) C water : analyte concentration in water (µg/l) k k 2 1 : uptake rate constant (L/g/d) k 2 : offload rate constant (d -1 ) Si le capteur fonctionne en régime à l'équilibre, c'est-à-dire que les concentrations dans le PCIS et dans l'eau sont à l'équilibre, cette équation (1) peut être réduite à (Vrana et al., 2005): k1 k1 CPCIS C PCIS ( t) Cwater. Cwater. K (2) with K C k 2 k water (3) K 2 K, appelait coefficient de partage échantillonneur-eau exprimé en ml/g (AQUA-REF, 2010), peut être déterminé lors d'expériences de calibration en laboratoire quand les concentrations CPCIS en analytes dans l'eau et dans le PCIS sont connues ( K Cf equilibrium ). Une fois K Cwater caractérisé pour chaque molécule, l'équation (3) peut être appliquée pour déterminer les concentrations en analytes dans l'eau lors d'applications terrain. Si le capteur fonctionne en régime cinétique, l'accumulation de l'analyte dans l'échantillonneur est linéaire et l'équation (1) peut être réduite à (Vrana et al., 2005) : C M PCIS M PCIS : analyte mass in PCIS (µg) ( t ) C. k. t PCIS water 1 (4) avec CPCIS ( t) m m: phase mass in PCIS (g) Une nouvelle équation peut alors être définie à partir des deux précédentes : M PCIS ( t) Cwater. k1. m. t Cwater. Rs. t (5) avec Rs le taux d échantillonnage. Ce Rs correspond au volume d eau épuré pour un analyte par unité de temps d exposition du dispositif (Vrana et al., 2005). Il est composé-dépendant. Ainsi dans le cas où l échantillonneur fonctionne en régime cinétique, il est nécessaire de connaître ce Rs pour chaque contaminant de façon à pouvoir remonter jusqu à la concentration moyenne temporelle (TWA, Time Weighted Average) dans l eau. Tout comme le K du régime à l équilibre, les Rs sont déterminés lors d expérience de calibration réalisées en laboratoire avec des concentrations en analytes dans l'eau et dans le PCIS connues. A partir de l équation (5), on peut établir la formule suivante : M PCIS CPCIS. m m CPCIS CPCIS. m Rs Cf. (6) with Cf C water C. t C. t t C Rs. t water water water (7) Le facteur de concentration Cf permet de normaliser la concentration dans le PCIS avec la concentration de l eau au cours de l expérience de calibration. Ainsi, lors de ces expériences, en se basant sur le modèle de la Figure 2, un nouveau graphique peut être obtenu en traçant Cf en fonction du temps. Comme on est en régime cinétique, l accumulation dans l échantillonneur est linéaire et on obtient alors une droite passant par zéro dont l équation est de la forme : Cf = a.t avec a le coefficient directeur de la droite. D après l équation (4), on Rs obtient Cf = k 1.t et d'après l'équation (6), on a : Cf. t. En établissant un parallèle entre m 286

287 Chapitre 6 : Développement et application des PCIS Rs ces trois formules, on peut en déduire que a k 1 et ainsi déterminer k 1 et Rs m avec Rs k1. m. Une fois le Rs caractérisé, l'équation (7) peut être appliquée pour déterminer les concentrations en analytes dans l'eau lors d'applications terrain. I.5. Application environnementale Une fois les valeurs de taux d échantillonnage déterminées, des PCIS ont été déployés durant 15 jours dans la Garonne en amont et en aval de l agglomération Bordelaise (Figure 3). FRANCE Bordeaux Figure 3: Localisation of the sampling points. SWTP release Sampling points Trois PCIS ont été posés au niveau de la ville de Cadaujac (amont) et trois autres au niveau du port autonome de Bordeaux (aval) en juin Entre les deux points d échantillonnage, deux stations d épuration, d une capacité de et de équivalent habitants, rejettent leurs eaux traitées dans la Garonne. En parallèle des échantillonneurs passifs, des prélèvements ponctuels d eau ont été réalisés au moment du dépôt et du retrait des PCIS dans le but de comparer les résultats obtenus par les deux méthodes. Les PCIS sont montés sur des supports métalliques et sont enfermés dans une cage en acier afin de les protéger et d éviter que les membranes ne se percent. Les cages sont attachées à un point fixe (pilier de ponton, échelle) et immergées à environ 1 m de la surface. Les eaux des prélèvements ponctuels sont collectées aux mêmes endroits que là où les cages ont été fixées et à la même profondeur. Les eaux de surface sont filtrées le jour de leur prélèvement sur des filtres en fibre de verre d une porosité de 1,6 µm (GF/A) puis de 0,7 µm (GF/F) puis sont conservées dans des bouteilles Nalgen (HDPE) -20 C en attendant d être analysées. La phase des PCIS est transférée dans les cartouches en verre le jour où les PCIS ont été récupérés puis séchée sous vide. Les cartouches sont ensuite individuellement emballées dans du papier d aluminium, placées dans un bouteille en verre contenant des billes de silices utilisées comme desséchant pour absorber l humidité et conservées à -20 C en attendant d extraire les composés contenus dans la phase 3 jours plus tard. I.6. Paramètres de validation et assurance qualité Pour assurer le contrôle qualité, des blancs et des dopages sont réalisés en parallèle du traitement des échantillons. Les blancs de manipulation réalisés en même temps que 287

288 Chapitre 6 : Développement et application des PCIS l extraction des eaux ou des PCIS ne voient que les solvants servant aux élutions, l eau minérale naturelle servant au conditionnement des cartouches ou au rinçage des membranes, les étalons internes et les réactifs comme l EDTA. Ils permettent de contrôler que les étapes de traitement des échantillons ne les contaminent pas. Le blanc «phase» est constitué de 200 mg de phase asis HLB pesés et déposés directement entre les 2 frittés en Teflon dans une cartouche en verre. Il est réalisé en parallèle du transfert de la phase contenue dans les PCIS vers les cartouches en verre et permet de controler que les échantillons ne se contaminent pas au cours de cette étape de récupération de la phase. D autres blancs sont insérés dans les séquences d analyse pour s affranchir des problèmes de contamination croisée liés à l aiguille d injection ou aux résidus d un échantillon très contaminé. Par ailleurs, des eaux minérales naturelles, dépourvues des analytes recherchés, sont dopées et subissent le même traitement SPE que les eaux échantillonnées afin de vérifier les rendements d extraction de chaque série. De même, de la phase adsorbante HLB identique à celle utilisée pour les PCIS, mais n ayant jamais été exposée en milieu naturel, est dopée avec les composés ciblés afin de vérifier les performances du protocole d extraction. Du point de vue analytique, la linéarité, la précision, la justesse et les limites de détection et de quantification ont été étudiées. La linéarité a été étudiée au travers du coefficient de détermination, R², sur une gamme de dilution allant environ de 30 à 1200 pg injectés. Quand R² est inférieur à des gammes plus petites sont utilisées (technique des bracket). La précision correspond à la variation intra- et inter-jour. Elle est étudiée au travers de l injection successive sur un ou plusieurs jours d une même solution standard. La variabilité intra-jour moyenne est de % et celle inter-jour de % pour l ensemble des composés ciblés. La justesse correspond au rendement de quantification, soit par étalonnage interne soit par étalonnage externe, d une solution pseudo-inconnue. La justesse moyenne est de %. Enfin les limites instrumentales de détection (IDL) et de quantification (IQL) ont été extrapolées d après l injection d une solution standard. Les valeurs des IDL et IQL sont données pour chaque composé dans le Tableau 1. II. Résultats II.1. Développement de l'extraction des PCIS Pour développer le protocole d élution des PCIS, des dopages ont été réalisés en triplicat. Pour cela, 200 mg de phase asis HLB identique à celle utilisée dans les PCIS, préalablement lavée et dépourvue des composés recherchés, ont été déposés directement dans les cartouches en verre entre les deux frittés en Teflon et une quantité connue de composés a été ajoutée. Après dépôt des composés natifs sur le fritté supérieur, les cartouches ont été rincées avec 5 ml d eau Vittel afin de reproduire l étape de transfert de la phase des PCIS. De même, les cartouches sont ensuite mises à sécher sous vide durant 60 min. Les étalons internes sont introduits dans les flacons collecteurs avant l élution et la quantité de solution introduite est controlée par gravimétrie. Trois protocoles différents d élution ont été testés : i) 10 ml de méthanol puis 10 ml méthanol/dichlorométhane (50/50 v/v) ; ii) 20 ml méthanol ; iii) 40 ml méthanol. Ils ont été adaptés de celui actuellement utilisé au laboratoire pour l extraction de composés pharmaceutiques appartenant à d autres classes que celles étudiées ici (Budzinski et Togola, 2007) ou de la littérature (Bartelthunt et al., 2009; Li et al., 2010; MacLeod et al., 2007; Zhang et al., 2008). Les différences de rendement obtenues avec les 3 protocoles sont minimes. Le protocole ii consommant moins de solvant que les deux autres, a été retenu. Une fois la méthode d élution mise au point, le protocole a été amélioré en optimisant le temps d évaporation en se focalisant sur la température. Dans un premier temps, 288

289 Chapitre 6 : Développement et application des PCIS celle-ci avait été fixée à 40 C afin de protéger les composés potentiellement thermosensibles. Ce test a été pratiqué avec des triplicats de 20 ml de méthanol enrichis avec les composés ciblés et trois conditions de température ont été essayées : 40, 60 et 80 C. L augmentation de la température n entraîne pas de dégradation particulière des composés. Cependant, à 80 C, l évaporation est trop rapide et il y a un risque d'évaporer complètement le solvant ce qui entraînerait la perte des composés. Pour cette raison, c est la température de 60 C qui est sélectionnée. Elle permet d évaporer les 20 ml de méthanol en environ 30 min au lieu de 3h à 40 C. La méthode d extraction des PCIS a été validée en déterminant les rendements d extraction de trois échantillons dopés avec une quantité connue de composés natifs. Les résultats sont présentés dans le Tableau 2 et les rendements d extraction des eaux par SPE sont présentés en parallèle. Tableau 2: rendements moyens d extraction SPE et PCIS (%, SPE : n=4, PCIS : n=5). composés SPE PCIS composés SPE PCIS composés SPE PCIS azithromycine 125 ± ± 8 tétracycline 100 ± 9 20 ± 5 5-fluorouracil 0 ± 0 0 ± 0 clarithromycine 103 ± 7 88 ± 9 oxytétracycline 131 ± ± 4 daunorubicine 102 ± 7 66 ± 5 érythromycine 94 ± 7 86 ± 4 sulfaméthoxazole 102 ± 4 96 ± 3 cyclophosphamide 79 ± ± 6 clindamycine 96 ± 2 88 ± 8 triméthoprime 96 ± 6 93 ± 6 méthotréxate 118 ± 6 24 ± 7 ciprofloxacine 99 ± 8 73 ± 7 métronidazole 92 ± ± 26 tamoxifen 99 ± 6 81 ± 6 ofloxacine 104 ± 5 87 ± 1 aténolol 106 ± ± 3 abacavir 137 ± ± 23 acide pipemidique 100 ± ± 9 métoprolol 109 ± ± 10 ritonavir 104 ± ± 14 propranolol 98 ± 9 85 ± 5 sildénafil 81 ± 8 82 ± 13 Le 5-fluorouracil (5-FU) n est jamais récupéré que se soit lors d une SPE ou lors d extraction de PCIS. Un test dans lequel les 5 ml d eau, servant au rinçage des cartouches pour mimer l étape de récupération de la phase, ont été analysés, montre qu environ 75% du 5-FU se retrouve dans ces eaux de rinçage. De plus ce composé est le seul à être analysé en ESI-. Pour toutes ces raisons, le suivi de ce composé a été abandonné. Hormis pour les tétracyclines et le méthotréxate dont les taux de récupération sont compris entre 20 et 30%, les rendements d'extraction des PCIS sont bons (> 65%) et la variabilité faible (< 15 %, excepté metronidazole et abacavir). Le protocole est donc applicable. II.2. Calibration en laboratoire Les résultats de l'expérience préliminaire sur la stabilité de la contamination de l'eau sont présentés Tableau 3. Avec un écart-type relatif moyen de 23 % et des écart-types relatifs individuels inférieurs à 34 %, il ressort que les concentrations de 8 des 12 composés étudiés au cours de cette expérimentation sont stables dans l'aquarium (érythromycine, roxithromycine, ofloxacine, sulfaméthazine, sulfaméthoxazole, triméthoprime, métoprolol et propranolol). Pour les 4 autres composés, les variations sont plus importantes. Pour ces molécules, la variabilité de la concentration mesurée est davantage liée au mode de quantification (étalonnage externe) utilisé qu à des pertes ou des gains dans l aquarium. En conclusion, après une période de stabilisation de 2 à 3 jours, les concentrations des contaminants dans l'eau de l'aquarium sont stables sur une durée de 15 jours. La calibration des PCIS pourra donc se faire avec le même dispositif en prenant soin de laisser une période d'équilibrage de quelques jours. 289

290 Chapitre 6 : Développement et application des PCIS Tableau 3 : Concentration moyenne (ng/l) mesurée (n = 10) pour chaque composé sur toute la durée de l expérimentation (15 jours). composés [moy.] ± ET composés [moy.] ± ET érythromycine 1090 ± 150 sulfaméthoxazole 634 ± 121 roxithromycine 1705 ± 584 triméthoprime 602 ± 186 lincomycine 3808 ± 3446 tétracycline 1484 ± 1029 ofloxacine 270 ± 66 oxytétraycline 1151 ± 927 acide oxolinique 4217 ± 2573 métoprolol 577 ± 98 sulfaméthazine 841 ± 246 propranolol 491 ± 73 Comme précedemment expliqué (cf. paragraphe I.4.2 dans la partie «expérimentale»), pour pouvoir utiliser les PCIS comme outils quantitatifs dans l étude de la contamination de l eau, il faut résoudre les équations (3) ou (7), selon le régime dans lequel les PCIS se trouvent au moment où ils sont retirés du milieu. Des expériences de calibration permettent, à partir des concentrations mesurées dans les PCIS et dans les eaux, d identifier le régime d accumulation de chaque composé et de définir les paramètres manquants de ces équations (K pour le régime à l équilibre et Rs pour le régime cinétique). Une expérience de calibration a donc été conduite au laboratoire sur une durée de 15 jours afin d identifier le type de régime des 22 composés étudiés. Les prélèvements réguliers et les analyses des eaux et des PCIS, réalisés selon les modes opératoires décrits dans la partie «expérimentale», ont permis de tracer les courbes d accumulation des analytes en fonction du temps. Ces courbes utilisent le facteur de concentration Cf qui correspond aux concentrations mesurées dans les PCIS normalisées par rapport à la concentration moyenne de l'eau sur la durée d'exposition du CPCIS ( T10) PCIS (exemple: Cf ( T10) ). Les régimes et les paramètres des équations C water( averaget T obtenus sont présentés dans la Tableau ) Tableau 4: Régimes d accumulation et équations associées permettant de déterminer les constantes d adsorption (k 1 ) et de desorption (k 2 ) et les taux d échantillonage (Rs) pour les 22 composés (Rs = k 1. m et K = k 1 /k 2 ). composés régime paramètres nécessaires? équation paramèters de calibration azithromycine clarithromycine érythromycine clindamycine ciprofloxacine ofloxacine cinétique Rs? cinétique Rs? cinétique Rs? cinétique Rs? cinétique Rs? cinétique Rs? Cf = t (R² = ) k 1 = L/g/j m = g Cf = t (R² = ) k 1 = L/g/j m = g Cf = t (R² = ) k 1 = L/g/j m = g Cf = t (R² = ) k 1 = L/g/j m = g Cf = t (R² = ) k 1 = L/g/j m = g Cf = t (R² = ) k 1 = L/g/j m = g Rs = L/j k 1 = 1.86 L/g/j Rs = L/j k 1 = 1.65 L/g/j Rs = L/j k 1 = 1.29 L/g/j Rs = L/j k 1 = 1.84 L/g/j Rs = L/j k 1 = 0.95 L/g/j Rs = L/j k 1 = 1.88 L/g/j 290

291 Chapitre 6 : Développement et application des PCIS composés acide pipemidique tétracycline oxytétracycline sulfaméthoxazole triméthoprime métronidazole aténolol métoprolol propranolol daunorubicine cyclophosphamide méthotréxate régime paramètres nécessaires? équilibre K? k 1? k 2? cinétique Rs? cinétique Rs? équilibre K? k 1? k 2? cinétique Rs? équilibre K? k 1? k 2? équilibre K? k 1? k 2? cinétique Rs? cinétique Rs? équilibre K? k 1? k 2? cinétique Rs? équilibre K? k 1? k 2? équation Cf = 5.51 (1 e t ) k1 k = k 2 = 0.27 Cf = t (R 2 = ) k 1 = L/g/j m = g Cf = t (R 2 = ) k 1 = L/g/j m = g Cf = 1.28 (1 e t ) k1 k = k 2 = 0.27 Cf = t (R 2 = ) k 1 = L/g/j m = g Cf = 0.89 (1 e t ) k1 k = k 2 = 0.34 Cf = 4.92 (1 e t ) k1 k = k 2 = 0.20 Cf = t (R 2 = ) k 1 = L/g/j m = g Cf = t (R 2 = ) k 1 = L/g/j m = g Cf = 533 (1 e t ) k1 k = k 2 = 0.16 Cf = t (R 2 = ) k 1 = L/g/j m = g Cf = 6.67 (1 e t ) k1 k = k 2 = 0.36 tamoxifen Cf = e 0,.296 t (R 2 = ) abacavir cinétique Rs? Cf = t (R 2 = ) k 1 = L/g/j m = g ritonavir Cf = e t (R 2 = ) sildénafil cinétique Rs? Cf = t (R 2 = ) k 1 = L/g/j m = g paramèters de calibration K = 5.51 L/g k 1 = 1.49 L/g/j k 2 = 0.27 j -1 Rs = L/j k 1 = 0.56 L/g/j Rs = L/j k 1 = 0.25 L/g/j K = 1.28 L/g k 1 = 0.35 L/g/j k 2 = 0.27 j -1 Rs = L/j k 1 = 2.04 L/g/j K = 0.89 L/g k 1 = 0.30 L/g/j k 2 = 0.34 j -1 K = 4.92 L/g k 1 = 0.98 L/g/j k 2 = 0.20 j -1 Rs = L/j k 1 = 1.49 L/g/j Rs = L/j k 1 = 1.79 L/g/j K = 533 L/g k 1 = L/g/j k 2 = 0.16 j -1 Rs = L/j k 1 = 0.94 L/g/j K = 6.67 L/g k 1 = 2.40 L/g/j k 2 = 0.36 j -1 Rs = L/j k 1 = 1.67 L/g/j Rs = L/j k 1 = 1.97 L/g/j 291

292 Cf Cf Chapitre 6 : Développement et application des PCIS Sur une durée d exposition de 15 jours, 14 des 22 molécules pharmaceutiques étudiées présentent des régimes d accumulation de type cinétique. L accumulation est donc linéaire et proportionnelle à la durée d exposition (ex. : azithromycine Figure 4). Par régression linéaire, les équations des droites ont pu être déterminées et le Rs calculé. Ces taux d échantillonnage ont ensuite été comparés avec ceux disponibles dans la littérature (Tableau 5). Bien que les conditions et les durées d immersions soient différentes, les taux d échantillonnages calculés par Martinez Bueno et al. (2009) et Li et al. (2010) sont en bonne adéquation avec ceux déterminés dans cette étude. Cette similitude dans les résultats permet d affirmer que les Rs calculés ici ne sont pas aberrants. A l inverse les valeurs données par MacLeod et al. (2007) sont très différentes de celles calculées ici et sont élevées par rapport aux valeurs de Rs généralement trouvées (0,1 à 0,3 L/j). azithromycine temps (jours) Figure 4 : Exemple de régime d accumulation de type cinétique (cas de l azithromycine). Sur les 22 composés ciblés, 2 composés, le tamoxifen et le ritonavir, présentent des cinétiques d accumulation très particulières avec un temps de latence initial («lag effect») avant une accumulation exponentielle des composés dans les PCIS (ex : ritonavir Figure 5). Leurs log Kow sont les plus forts parmi les molécules sélectionnées ici (Tableau 5) avec des valeurs de 7,88 et 5,28 pour le tamoxifen et le ritonavir respectivement. Les PCIS sont au départ pensés pour être utilisés avec des composés hydrophiles (Vrana et al., 2005) ayant des log Kow 3. Pour les composés ayant des log Kow > 3, une phase de latence est généralement observée (Lardy, 2008), elle correspond au temps que met le composé à traverser la membrane en PES ritonavir temps (jours) Figure 5 : Exemple de régime d accumulation avec «lag effect» (cas du ritonavir). Enfin, 6 composés (acide pipemidique, sulfaméthoxazole, métronidazole, aténolol, daunorubicine et méthotréxate) ne présentent pas des régimes d accumulation de type cinétique et semblent avoir déjà atteint leur équilibre (ex. : acide pipémidique Figure 6). Les 292

293 Cf Chapitre 6 : Développement et application des PCIS valeurs des constantes d adsorption (k 1 ) et de désorption (k 2 ) ont pu être calculées (Tableau 4) en se basant sur le raisonnement suivant : Quand l équilibre est atteint, donc à T 15, on peut déduire de l équation (2) présentée dans la CPCIS ( T k 15) 1 partie expérimentale : Cf ( T ) K. Avant cela, donc à T 15 x (avec 0 < x < 15), C k water( T ) 15 2 CPCIS ( T ) k x 1 k2. x k2. x on a d après l équation (1) : Cf ( T ). (1 e ) Cf ( T ). (1 e ). Le x 15 C k water( T ) Cf ( T x ) ln 1 Cf T réarrangement de cette nouvelle équation permet de calculé k 2 avec k ( 15) 2. x Une fois K et k2 définis, k1 est facilement déduit. Ainsi pour ces 6 composés, la concentration dans les eaux lors d application terrain peut être calculée à partir de l équation CPCIS ( T ) Cwater ( T ) 2. (8) suivante : K. (1 e k T ) (8). Contrairement aux résultats de cette expérimentation, des valeurs de Rs ont pu être calculées pour le sulfaméthoxazole par Zhang et al. (2008), Bartelthunt et al. (2009) et Li et al. (2010) et pour l aténolol par MacLeod et al. (2007) et Li et al. (2010) (Tableau 5). Dans le but de pouvoir néanmoins comparer, nos résultats avec ceux de ces auteurs, des Rs ont été calculés en associant les régimes d accumulation de ces 2 composés à des régimes de type cinétique. Ainsi, avec une équation de droite égale à Cf = 0,1014. t, le Rs du sulfaméthoxazole a été estimé à 0,011 L/j. Cette valeur est très différente de celles trouvées dans la littérature (environ 0,2 L/j, Tableau 5) et confirme que sur la durée de l expérimentation, le régime d accumulation du sulfaméthoxazole dans les PCIS n est pas de type cinétique. En revanche, le Rs de l aténolol a été déterminé à 0,043 L/j, avec une équation de droite égale à Cf = 0,3938. t, ce qui est proche des valeurs de Rs déterminées par MacLeod et al. (2007) ( L/j) et Li et al. (2010) (0,073 L/j). Le régime d accumulation de l aténolol peut alors être reconsidéré et être associé à un régime cinétique bien que le coefficient de regression linéaire (R 2 = 0,2372) soit faible et n incite pas à considérer la courbe d accumulation de l aténolol dans les PCIS comme une droite (Figure 7). Par ailleurs, comme pour MacLeod et al. (2007) et Li et al. (2010), le Rs de l aténolol est faible par rapport à ceux déterminés pour les 2 autres - bloquants étudiés (métorpolol et propranolol). Ceci peut être expliqué par les valeurs de log Kow de ces composés. En effet, avec un log Kow de 0,09, l aténolol est plus hydrophile que le métoprolol (log Kow 1,79) et que le propranolol (log Kow 3,10) et est donc potentiellement moins bien retenu dans la phase des PCIS que les 2 autres -bloquants x pipemidic acid temps (jours) Figrue 6 : Exemple de régime d accumulation ayant atteint l équilibre (cas de l acide pipémidique)

294 Cf Chapitre 6 : Développement et application des PCIS atenolol temps (jours) Figure 7 : Comparaison des 2 régimes d accumulation envisagés pour l aténolol (cinétique droite en points tillés, équilibre droite trait plein). Tableau 5: Comparaison des taux d échantillonnage (Rs L/j) determines dans cette etude avec ceux trouvés dans la bibliographie. Martínez Bueno Alvarez et Zhang et al. MacLeod Li et al. Bartelthunt log Kow this study et al. (2009) al. (2004) (2008) et al. (2007) (2010) et al. (2009) azithrmomycin clarithromycin erythromycin clindamycin ciprofloxacin ofloxacin pipemidic acid 0.99 tetracycline oxytetracycline sulfamethoxazole trimethoprim metronidazole atenolol metoprolol propranolol daunorubicin 3.17 cyclophophamide methotrexate tamoxifen 7.88 abacavir ritonavir 5.28 sildenafil II Application environnementale, comparaison entre échantillonnage ponctuel et passif Une fois que les paramètres de calibration des PCIS ont été définis, ces échantillonneurs ont pu être utilisés pour étudier la contamination de l eau de la Garonne aux alentours de la ville de Bordeaux. A Cadaujac (amont), 11 composés ont été détectés avec des concentrations moyennes allant de 0,9 0,1 à 30,6 1,3 ng/g de phase. En aval de Bordeaux, ces 11 mêmes composés, plus le cyclophosphamide, ont été retrouvés. Les concentrations moyennes y sont plus élevées et se situent entre 2,7 0,6 à 96,6 3,0 ng/g de phase (Figure 8). 294

295 concentration (ng/g) concentration (ng/g) concentration (ng/l) concentration EAU (ng/l) concentration PCIS (ng/g) Chapitre 6 : Développement et application des PCIS amont aval Figure 8 : Concentrations en molécules pharmaceutiques mesurées dans les PCIS (ng/g de phase). Des prélèvements ponctuels d eau ont été réalisés en triplicats au moment de la pose (T 0 ) et du retrait (T 15 ) des PCIS. En amont de Bordeaux aucune des molécules ciblées n a pu être quantifiées à aucun moment. En aval, 10 médicaments ont été identifiés à T 0 et ont également été retrouvés à T 15 (Figure 9). Leurs concentrations sont du même ordre de grandeur aux deux dates à l exception du sulfaméthoxazole qui est 2 fois plus présent à T 15 qu à T 0. Elles sont comprises entre 0,1 0,02 et 3,32 0,63 ng/l. 4,5 4 3,5 3 2,5 2 1,5 1 0,5 0 aval T0 aval T15 Figure 9 : Concentrations en molécules pharmaceutiques mesurées dans l eau à partir des prélèvements ponctuels (ng/l). Que ce soit dans les PCIS ou dans les eaux, les quantités sont toujours plus importantes en aval qu'en amont, ce qui reflète l'impact de la zone urbaine sur la contamination du milieu aquatique. Par ailleurs, les PCIS permettent de détecter et de quantifier des composés qui n ont pu être analysés dans les échantillons d eau prélevés ponctuellement (Figure 10) total PCIS amont aval 5 0 total PCIS total EAU (T15) Figure 10 : Comparaison des concentrations totales en molécules pharmaceutiques mesurées en amont et en aval de la zone urbaine dans les PCIS et dans l eau suite à l échantillonnage ponctuel à T

296 concentration (ng/l) concentration (ng/l) Chapitre 6 : Développement et application des PCIS Pour pouvoir comparer les données obtenues par échantillonnage passif avec celles obtenues par échantillonnage ponctuel, il faut déterminer les concentrations dans l'eau, exprimées en ng/l, à partir de celles mesurées dans les PCIS et exprimées en ng/g de phase. Ceci a été réalisé grâce aux équations (7) et (8). La Figure 11 présente les données obtenues avec les deux techniques d'échantillonnage amont ponctuel amont PCIS aval ponctuel aval PCIS aval ponctuel aval PCIS Figure 11: Comparaison des concentrations individuelles mesurées pour chaque composes en fonction de la technique d échantillonnnage appliquée. En amont, seul les PCIS ont permis de détecter et de quantifier des molécules grâce à leur caractère intégratif et accumulatif (Figure 11 haut). En aval, d'un point de vue qualitatif, la majorité des composés détectés avec une méthode le sont aussi avec l'autre. Cependant, l'abacavir, un anti-vih, et le cyclophosphamide, un anticancéreux, ne sont retrouvés que dans les PCIS. D'un point de vue quantitatif, les concentrations mesurées en aval de la ville sont globalement plus fortes quand elles sont issues des PCIS que des prélèvements d'eau (Figure 11 bas). Néanmoins cette différence n'est réellement marquée que pour le sulfamethoxazole et l'atenolol pour qui les concentrations sont 18 et 7 fois plus fortes que quand elles proviennent de l'échantillonnage ponctuel. Lors de l expérience de calibration, ces 2 composés ont montré des régimes d accumulation qui avaient atteint leurs équilibres au bout des 15 jours d exposition. Aussi, les concentrations de ces 2 composés ont été calculés en utilisant les Rs 296

297 Chapitre 6 : Développement et application des PCIS de Li et al. (2010). Une hypothèse pour expliquer ces différences provient des valeurs des paramètres utilisés pour calculer les concentrations dans l'eau à partir de celles mesurées dans les PCIS. En effet, les conditions rencontrées dans le milieu ne sont pas exactement les mêmes que celles établies lors des expériences de calibration. Dans le milieu, à durée d'exposition égale, les paramètres environnementaux comme le débit, la salinité, le biofouling ou encore la turbidité ont pu modifier les cinétiques d'adsorption et ainsi les valeurs de ces paramètres (Li et al., 2011). Les concentrations dans l'eau déduites de celles des PCIS sont alors faussées. Conclusion Le développement d un protocole d extraction, la calibration et l application de PCIS pour 22 molécules pharmaceutiques appartenant à 5 classes thérapeutiques différentes ont été réalisés au cours de cette étude. L optimisation de la méthode d extraction a abouti à l utilisation de 20 ml de méthanol pour récupérer 19 des 23 composés initialement sélectionnés avec des rendements supérieurs à 65 %. Sur les 4 composés restants, 3 ont des rendements d extraction compris entre 20 et 30 % mais avec une variabilité inférieure à 10% ce qui rend quand même le protocole utilisable pour eux. En revanche, le 5-FU a du être abandonné faute d une méthodologie suffisamment adaptée. La calibration des PCIS a ensuite été réalisée en laboratoire sur une durée de 15 jours. Quatorze composés présentent des régimes d adsorption linéaire pour cette durée d exposition et leurs taux d échantillonnage (Rs) ont pu être calculés. Six molécules (acide pipemidique, sulfaméthoxazole, métronidazole, aténolol, daunorubicine et méthotréxate) ont atteint l état d équilibre sur cette période et leurs constantes d adsorption (k 1 ) et de désorption (k 2 ) ont pu être définies. Enfin, 2 molécules, avec des log Kow supérieurs à 4, ont présenté des profils particuliers d adsorption montrant une phase de latence correspondant à la traversée de la membrane par le composé. Une durée d exposition de 15 jours n est probablement pas suffisante pour ces molécules. Finalement, des PCIS ont été déployés dans la rivière Garonne en amont et en aval d'une zone urbaine (Bordeaux). Parallèlement, des prélèvements ponctuels d'eau ont été réalisés au moment du dépôt et du retrait des capteurs. Les PCIS ont permis de détecter des molécules qui n'avaient pas été décelées dans les prélèvements ponctuels d'eau. Par ailleurs les concentrations déterminées par échantillonnage passif pour le sulfaméthoxazole et l aténolol sont plus élevées que celles déterminées par échantillonnage ponctuel alors que pour les autres composés les concentrations sont du même ordre de grandeur. Ces deux résultats peuvent être expliqués d'une part, par le caractère intégratif des PCIS, qui prennent en compte les pics de pollution qui échappent aux prélèvements ponctuels, et d'autre part, par les différences de conditions d'exposition entre le milieu naturel et l'aquarium de calibration. En effet, le débit, la turbidité, la salinité et le biofouling modifient les valeurs des paramètres Rs, k 1 et k 2 déterminés en laboratoire. Une façon de compenser ces perturbations réside dans l'utilisation de PRC ou Performance Reference Compounds (Mazzella et al., 2010). En conclusion, lorsque les concentrations sont faibles, les PCIS permettent une meilleure détection que l échantillonnage ponctuel et lorsque les concentrations sont plus importantes, les valeurs mesurées par les 2 méthodes sont du même ordre de grandeur, les PCIS présentent donc un fort interêt pour palier aux problèmes d échantillonnage des molécules pharmaceutiques. Remerciements Les auteurs souhaitent remercier la Région Aquitaine, le projet Mediceau, le projet Etiage, le CPER A2E et le projet Interreg Portonouvo pour le financement de ces travaux. Ils souhaitent 297

298 Chapitre 6 : Développement et application des PCIS également remercier le Ministère de l Enseignement Supérieur et de la Recherché, l'anr (projet SEST DIPERPHA) et l'agence de l'environnement et de la Maîtrise de l'energie (ADEME) pour le fiancement de la thèse de M.J. Capdeville. Réferences AQUA-REF. (2010). fiche ME4, Application du PCIS pour l échantillonnage des molécules pharmaceutiques. Alvarez, D. A., Petty, J. D., Huckins, J. N., Jones-Lepp, T. L., Getting, D. T., Goddard, J. P., & Manahan, S. E. (2004). Development of a passive, in situ, integrative sampler for hydrophilic organic contaminants in aquatic environments. Environmental Toxicology and Chemistry, 23(7), BarteltHunt, S., Snow, D., Damon, T., Shockley, J., & Hoagland, K. (2009). The occurrence of illicit and therapeutic pharmaceuticals in wastewater effluent and surface waters in Nebraska. Environmental Pollution, 157(3), Capdeville, M. J., & Budzinski, H. (2011). Trace-level analysis of organic contaminants in drinking waters and groundwaters. TrAC Trends in Analytical Chemistry. Lardy-Fontan, S. (2008). Les substances émergentes dans les écosystèmes aquatiques français. Une application aux alkylphénol-polyéthoxylés et aux molécules pharmaceutiques. Thèse. Université Bordeaux 1. Li, H., Helm, P. A., & Metcalfe, C. D. (2010). Sampling in the Great Lakes for pharmaceuticals, personal care products, and endocrine-disrupting substances using the passive polar organic chemical integrative sampler. Environmental Toxicology and Chemistry, 29(4), Lindberg, R., Jarnheimer, P.-A., lsen, B., Johansson, M., & Tysklind, M. (2004). Determination of antibiotic substances in hospital sewage water using solid phase extraction and liquid chromatography/mass spectrometry and group analogue internal standards. Chemosphere, 57(10), MacLeod, S. L., McClure, E. L., & Wong, C. S. (2007). Laboratory calibration and field deployment of the polar organic chemical integrative sampler for pharmaceuticals and personal care products in wastewater and surface water. Environmental Toxicology and Chemistry, 26(12), Martínez Bueno, M. J., Hernando, M. D., Agüera, A., & Fernández-Alba, A. R. (2009). Application of passive sampling devices for screening of micro-pollutants in marine aquaculture using LC-MS/MS. Talanta, 77(4), Mazzella, N., Lissalde, S., Moreira, S., Delmas, F., Mazellier, P., & Huckins, J. N. (2010). Evaluation of the Use of Performance Reference Compounds in an asis-hlb Adsorbent Based Passive Sampler for Improving Water Concentration Estimates of Polar Herbicides in Freshwater. Environmental Science & Technology, 44(5), Togola, A., & Budzinski, Hélène. (2007b). Development of Polar rganic Integrative Samplers for Analysis of Pharmaceuticals in Aquatic Systems. Analytical Chemistry, 79(17), Vrana, B., Allan, I., Greenwood, R., Mills, G., Dominiak, E., Svensson, K., Knutsson, J., et al. (2005). Passive sampling techniques for monitoring pollutants in water. TrAC Trends in Analytical Chemistry, 24(10), Zhang, Z., Hibberd, A., & Zhou, J. (2008). Analysis of emerging contaminants in sewage effluent and river water: Comparison between spot and passive sampling. Analytica Chimica Acta, 607(1),

299 Conclusion et perspectives 299

300 300

301 Conclusion et perspectives Conclusion et perspectives Ce travail de thèse avait comme premier objectif le développement de méthodes analytiques permettant le dosage de composés pharmaceutiques appartenant à 5 classes thérapeutiques différentes dans diverses matrices environnementales, des plus simples comme les eaux souterraines aux plus complexes comme les effluents d élevage. Le deuxième objectif concernait l application de ces protocoles dans le cadre de différents projets de recherche appliqués aux eaux (projet FLASH) mais aussi aux déchets d élevage (ANR SEST DIPERPHA) dans le but d étudier à la fois l origine humaine et vétérinaire de la contamination et le devenir des composés. Un premier protocole a été développé pour permettre le dosage de 23 antibiotiques, 5 anticancéreux, 2 -bloquants et 2 anti-vih. Les 32 molécules pharmaceutiques sont extraites simultanément au cours d une étape d extraction sur phase solide (SPE) mettant en œuvre des cartouches asis HLB. Elles sont éluées de la phase adsorbante avec un mélange d eau minérale naturelle et d acétonitrile (EMN/ACN, 40/60, v/v). Les extraits sont ensuite reconcentrés puis analysés par chromatographie en phase liquide couplée à la spectrométrie de masse en tandem (RRLC/MS/MS). Les molécules sont séparées sur une phase stationnaire C 18 avec un mélange de phases mobiles constituées d eau ultra-pure et d acétonitrile. La source d ionisation est une source électrospray (ESI), ainsi 27 composés sont analysés en mode positif et 5 en mode négatif. En ESI+, les phases mobiles sont enrichies chacune avec 0,3 % d acide formique alors qu en ESI-, elles sont enrichies chacune avec 0,1 % d acide acétique. Les analyses sont pratiquées en mode MRM et les composés sont identifiés par 2 transitions, le rapport d intensité entre ces 2 transitions et leur temps de rétention. Pour ce protocole, les limites méthodologiques de détection varient entre moins de 5 ng/l pour le sulfaméthoxazole, le triméthoprime ou les -bloquants et 100 ng/l pour l amoxicilline, l ampicilline et les antibiotiques de la famille des céphalosporines. Avec un coefficient de détermination supérieur à 0,998 pour 25 des 32 composés étudiés, la linéarité est bonne entre 60 et 3000 pg injectés. Pour les autres composés, des gammes plus petites de concentration sont utilisées. Les variations intra-jours moyennes sont inférieures à 15 % et les variations inter-jours moyennes sont de 24 % en ESI+ et de 19 % ESI-. La justesse moyenne de la méthode est de 97 ± 10 %. Le rendement d extraction moyen pour l ensemble des 32 composés est de 53 ± 24 %. Il varie entre 26 ± 15 % pour les antibiotiques appartenant à la famille des pénicillines et 70 ± 8 % pour les -bloquants par exemple. Ce protocole est donc suffisamment sensible, précis, juste et performant pour permettre l analyse des 32 molécules pharmaceutiques sélectionnées dans des matrices environnementales. Une fois validée, cette méthode a été appliquée à l analyse de 10 effluents de stations d épuration (STEP) françaises mettant en œuvre des procédés de traitement différents et à l analyse d un continuum «eaux usées brutes - eaux usées traitées - eau de surface - eau de captage souterraine» dans l Hérault. Les résultats obtenus sont venus confirmer ce qui avait été observé dans d autres études environnementales européennes ou françaises (Andreozzi et al., 2003 ; Bendz et al., 2005 ; Castiglioni et al., 2006 ; Vieno et al., 2006 ; Thomas et al., 2007 ; Tamtam et al., 2008 ; AFSSA, 2009 ; Gros et al., 2009 ; Kasprzyk-Hordern et al., 2009 ; Gabet-Giraud et al., 2010) : les antibiotiques appartenant aux familles des macrolides (ex. : clarithromycine, érythromycine), des fluoroquinolones (ex. : ciprofloxacine, ofloxacine) et des sulfonamides (ex. : sulfaméthoxazole et triméthoprime) ainsi que les -bloquants (ex. : métoprolol et propranolol) sont les composés qui sont les plus fréquemment détectés dans les eaux usées et les eaux de surface. De plus, la contamination des effluents de STEP françaises 301

302 Conclusion et perspectives par des anti-vih tel que le ritonavir a été mise en évidence pour la première fois à notre connaissance. Dans l étude du continuum «eaux usées brutes-traitées/eaux de surface/eaux souterraines», il a été mis en évidence : i) l impact des rejets de STEP sur la contamination des eaux de surface et donc l origine humaine de la pollution ; ii) des concentrations en molécules pharmaceutiques plus fortes dans les eaux usées en hiver qu en été ; et iii) des concentrations en molécules pharmaceutiques plus fortes dans les eaux de surface, en aval des rejets de STEP, en été qu en hiver. Enfin, le sulfaméthoxazole, comme dans d autres études (Sacher et al., 2001 ; Barnes et al., 2008 ; Avisar et al., 2009), est le seul composé à avoir été détecté dans les eaux de captage souterraines. Ce protocole a ensuite été étendu à une sélection plus large de 78 composés comprenant 52 antibiotiques, 10 anticancéreux, 6 -bloquants, 9 anti-vih et 1 inhibiteur de la phosphodiestérase de type 5 (PDE 5). Il combinait également une seule étape d extraction par SPE et une double analyse par RRLC/MS/MS, une en mode positif pour 66 molécules (+ 19 étalons internes) et une autre en mode négatif pour 12 molécules (+ 3 étalons internes). A l exception du 5-fluorouracile et des -lactames, notamment de l amoxicilline qui avait déjà des taux de récupérations faibles, les rendements d extraction étant satisfaisants, le protocole d extraction n a pas subi de changement et a été utilisé de la même façon pour extraire les 32 ou les 78 molécules. Concernant la méthode d analyse, en ESI +, en raison du plus grand nombre de composés à séparer, la longueur de la colonne a été augmentée impliquant des ajustements au niveau du débit de la phase mobile et au niveau du gradient chromatographique. En revanche, la constitution des phases mobiles n a pas été modifiée. En ESI-, aucun changement n a été opéré. Les 7 nouveaux composés ont été intégrés à la méthode existante pour les 5 premières molécules. Les limites méthodologiques de détection et de quantification de ce protocole multi-résidus varient respectivement entre 0,03 (bisoprolol) et 142 (bacitracine) ng/l et entre 0,1 (acide oxolinique, sulfadiméthoxine et bisoprolol) et 425 (bacitracine) ng/l. Avec un coefficient de détermination supérieur à 0,999, la linéarité est bonne entre 30 et 1200 pg injectés pour 50 composés. Pour les autres composés, comme avec la méthode précédente, des gammes plus petites de concentration sont utilisées. Les variations intra-jours moyennes sont de 7 % en ESI+ et de 5% en ESI-. Les variations inter-jours moyennes sont de 54 % en ESI+ et de 29 % ESI-. La justesse moyenne de la méthode est de 109 ± 16 %. Le rendement d extraction moyen pour l ensemble des 78 composés est de 74 ± 39 %. Bien qu il montre certaines faiblesses notamment au niveau de la sensibilité pour des composés comme la bacitracine et la salinomycine ou au niveau des rendements d extraction pour le fluorouracile et les pénicillines, ce protocole est suffisamment sensible, précis, juste et performant pour permettre l analyse des 78 molécules dans des échantillons environnementaux. Une fois validée, cette méthode a été appliquée au dosage des 78 composés le long d un continuum hospitalier et d un continuum agricole dans le cadre du projet FLASH (Devenir des antibiotiques, FLux de gènes et de bactéries Antibiorésistantes dans les Systèmes Hydriques de surface). Parmi les classes thérapeutiques étudiées, les analyses réalisées le long du continuum hospitalier ont permis de mettre en évidence une contamination du rejet hospitalier par les antibiotiques, une contamination du rejet de la maison de retraite par les antibiotiques et les -bloquants et une contamination des eaux usées et des eaux de surface impactées par ces rejets par les -bloquants, les anti-vih et les antibiotiques, en particulier ceux appartenant aux familles des macrolides, des fluoroquinolones et des sulfonamides. Ce dernier résultat est ainsi venu confirmer ce qui avait déjà été observé dans les études évoquées précédemment. De plus, de la même façon que lors du suivi de la contamination le long du continuum dans l Hérault, il a été mis en évidence : i) une contamination des eaux usées plus forte en hiver qu en été liée à la présence d antibiotiques, ce qui semble cohérent au regard 302

303 Conclusion et perspectives des modes d usages de ces médicaments ; et ii) une contamination des eaux de surface plus forte en été qu en hiver probablement liée à une dilution moindre en raison des débits des cours d eau plus faibles en été. Enfin, une diminution de la contamination le long du continuum hospitalier a été observée. L étude du continuum agricole a fait ressortir une