Agenda. Généralités Microscopie photonique Microscopie électronique Microscopie à fluorescence

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Sylvain Lefrançois
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2 Agenda Généralités Microscopie photonique Microscopie électronique Microscopie à fluorescence

4 TD Cytologie MICROSCOPIE GÉNÉRALITÉS SUR LA MICROSCOPIE Kitab al-manazir, le livre des optiques, el Hasan Ibn al-haytham - donne une expression «البيت المظام» ce qui signifie camera obscura

5 TD Cytologie MICROSCOPIE GÉNÉRALITÉS SUR LA MICROSCOPIE 1 Qu est ce qu un microscope? Instrument qui: - donne une image grossie d un petit objet (grossisement) - sépare les détails de celui-ci sur l image (résolution) - rend les détails visibles à l œil ou avec une caméra

6 Structure du microscope optique TD Cytologie MICROSCOPIE 2.1 L optique/ principe Laser Lampe UV Absorbants Diffusants Dépolarisants Fluorescents Objectifs Lentilles Caméras Photodiodes

Différents type de microscope optique: Une comparaison Type de microscope Type de microscope Champs clair

$contraste dans les cellule non colorées en amplifiant des variation dans l index de réfraction dans l$ échantillons elle même; spécialement utile pour l examen de cellule vivante non pigmentées, Champs clair

échantillons elle même; spécialement utile pour l examen de cellule vivante non pigmentées, Champs clair

néanmoins la plus part des procédures de coloration requirent une fixation des cellules Contraste d

$réfraction Fluorescence: montrant une localisation de molécules spécifiques dans la cellule Shows the$ Confocal: utilise laser et optique spécial pour focaliser un fiscaux sur un seul plan (optique) à l intérieur

Confocal: utilise laser et optique spécial pour focaliser un fiscaux sur un seul plan (optique) à l intérieur

7 Différents type de microscope optique: Une comparaison Type de microscope Type de microscope Champs clair (échantillons non colorés) Faisant passé la lumière directement à travers l échantillon, sauf si la cellule est naturellement pigmenté, l image obtenue et très peu contrastée, Contraste de phase : augmente le contraste dans les cellule non colorées en amplifiant des variation dans l index de réfraction dans l échantillons elle même; spécialement utile pour l examen de cellule vivante non pigmentées, Champs clair (avec coloration): La coloration de l échantillon par différents colorant permet augmente le contraste néanmoins la plus part des procédures de coloration requirent une fixation des cellules Contraste d interférence différentielle : Utilise une procédure optique permettant «d exagérer» la différance d indexe de réfraction Fluorescence: montrant une localisation de molécules spécifiques dans la cellule Shows the locations. Les substance fluorescentes (fluorochrome) absorbe les UV pour emmètre ensuite une lumière visible. Confocal: utilise laser et optique spécial pour focaliser un fiscaux sur un seul plan (optique) à l intérieur de l échantillon, seulement une région dans un champs étroit est visualisée, les régions en dessous et en dessus du plan choisie, apparaissent obscure ou floutées

$les cellules (non viable) ce qui détruit ou bien alter les composants Microscope à champs obscur: la lumière est difractée à un certain angle vers le spécimen, une lentille condensatrice transmet$ seulement la lumière réfléchis par l objet, le champs est noir tendis que le spécimen est plus clair que celui ci à contraste de phase : les composants du microscope passe les ondes lumineuse hors

seulement la lumière réfléchis par l objet, le champs est noir tendis que le spécimen est plus clair que celui ci à contraste de phase : les composants du microscope passe les ondes lumineuse hors

8 M I C R O S C O P I E O P T I Q U E Microscope champs claire: la lumière diffuse à travers le spécimen, donnant un peu de contraste, la coloration de l objet augmente le contraste mais oblige a fixer les cellules (non viable) ce qui détruit ou bien alter les composants Microscope à champs obscur: la lumière est difractée à un certain angle vers le spécimen, une lentille condensatrice transmet seulement la lumière réfléchis par l objet, le champs est noir tendis que le spécimen est plus clair que celui ci à contraste de phase : les composants du microscope passe les ondes lumineuse hors phase, ce qui produit une différence en contraste et luminescence quand les ondes lumineuse se recombines a différentiel contraste interférence : la lumière polarisée est scindée en deux faisceaux qui ont un trajectoire légèrement diffèrent à travers l échantillon. La combinaison de ces deux faisceaux, produit un meilleur contraste, spécialement sur les cotés du spécimen Fluorescence: les colorations fluorescentes absorbe la lumière à une longueur d onde précise ensuite émettent à une autre longueur d onde, le filtre ne transmet que la lumière émise Microscope confocal: la lumière d un laser est focalisé sur un point en scannant la coloration fluorescente de l échantillons en deux démentions, ce procédure est appliqué sur un seul plans optique de l échantillon, tout les autres plans sont exclus Plusieurs plans scannés sont utilisé aussi pour reconstituer une image en 3 D M I C R O S C O P I E E L E C T R O N I Q U E Microscope électronique à transmission MET: utilisation d un faisceau d électrons «traversant l échantillon» Microscope électronique à balayage MEB: utilisation d un faisceau d électrons «balayant la surface de l échantillon,

9 Structure du microscope optique TD Cytologie MICROSCOPIE 2.1 L optique

10 Structure du microscope optique TD Cytologie MICROSCOPIE l imagerie microscopique

11 Pierre Roux (CNRS) Image en microscopie optique selon la technique «Nomarski» qui permet d améliorer la netteté et le relief. Cette séquence a été filmée à raison d une image toutes les 3 secondes, pour une durée d environ 5 minutes. Il s agit ici d une cellule de type embryonnaire de souris. Cette cellule émet des extensions, appelées filopodes, en forme de filaments. La membrane forme ensuite des replis, les lamellipodes, pour rejoindre les filopodes. Ces extensions permettent à la cellule de se déplacer par reptation. C est le cytosquelette d actine qui permet la formation des filopodes et des lamellipodes.

12 Vidéo montrant l'apoptose d'un ostéoclaste en microscopie optique à contraste de phase. Un ostéoclaste entre en apoptose, d'autres ostéoclastes sont attirés et phagocytent les débris. Description: L'ostéoclaste situé en haut à droite (> 5 noyaux) entre en apoptose. On remarque les deux petits ostéoclastes, ou macrophages, attirés pour "nettoyer" la zone et finalement phagocyter l'ostéoclaste mort. Le macrophage qui a phagocyté les débris cellulaires finira par se diviser. Deux larges ostéoclastes (sur le coté gauche) vont aussi migrer (mais lentement) vers le corps apoptotique (séquence de 16 heures).

13 Cellule Procaryote Structure cellulaire 4.2 Cellule procaryote

14 3. Le pouvoir de séparation varie directement selon le(s) paramètre(s) suivant(s) a, b, d Pouvoir de séparation = Pouvoir de résolution = 0,61λ/n sin α Or n= c/v donc dépend de la vitesse de la lumière dans le vide et de la vitesse de la lumière dans le milieu. a) Vrai : n caractérise un milieu translucide b) Vrai : α = demi angle du cône de vision de l objet par l objectif du microscope. c) Faux : grossissement du microscope = grossissement objectif x grossissement oculaire d) Vrai : λ = longueur d onde e) Faux.

15 4. A propos du microscope optique, quelles sont les propositions vraies et uniquement les propositions vraies a, b, e a) VRAI : Deux lentilles convergentes. b) VRAI c) FAUX : Objectif et oculaire. d) FAUX : le grossissement maximal est de l ordre de x1000 à x2000. e) VRAI f) FAUX

16 Structure du microscope optique TD Cytologie MICROSCOPIE Les Objectifs de Microscope Élément le plus important du microscope, détermine la qualité de l image qu on peut obtenir (forme l image primaire)

19 5. Concernant les différents types de microscopes optiques, indiquer la (ou les) proposition (s) exacte (s) : F a) Faux : pour l observation de cultures cellulaires, le microscope droit permet un grossissement utile de x5 (ce qui n est pas suffisant), le microscope inversé permet un grossissement utile de x40, le grossissement de la loupe binoculaire est de x80. Pour une coupe le grossissement utile du microscope droit est de x b) Faux : l objet observé devient une source lumineuse, d où une annulation du gain de pouvoir de résolution : on ne peut distinguer précisément la forme et la taille de la structure. Attention : le microscope à fond noir ne permet de voir que des petits objets et pas de grosses cellules. c) Faux : le froid n est pas un fixateur, il permet seulement de durcir la préparation et de la conserver, il n y a pas de fixation. d) Faux : le stéréomicroscope travaille en réflexion et permet l observation de cellules vivantes ou d objets fixés. e) Faux : il présente une inversion entre objectif et condenseur.

21 6. A propos du microscope électronique, quelles sont les propositions vraies et uniquement les propositions vraies A, C a) VRAI b) FAUX : le microscope électronique à transmission et le microscope électronique à balayage. c) VRAI d) FAUX : Les coupes réalisées pour la microscopie électronique à transmission sont plus fines que les coupes réalisées pour le microscope optique. e) FAUX : Pas de coupe au MEB donc pas d inclusion! f) FAUX

22 Microscope électronique TD Cytologie MICROSCOPIE structure

23 Structure du microscope électronique TD Cytologie MICROSCOPIE l imagerie microscopique G=1 (à 25cm) R=100μm G=1000 R= 0,2μm G= R= μm

24 L ultrastructure cellulaire en microscope électronique TD Cytologie MICROSCOPIE

25 a) Cellule cancéreuse, humaine (b) Grains de pollen c) Cellule intestinale (d) Mitochondrion FIGURE Microscopie electronique Imagerie MEB (a) cancer du sein (b) Grains de pollen du tournesol. Imagerie MET(c) cellules épithéliales de l intestin du chat (d) Mitochondrie du pancréas de chauvesouris

26 Infiltrat inflammatoire lymphocyte X400 X20.000

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