Trafic intracellulaire de l ADN thérapeutique lors d un transfert de gène non viral

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1 La thérapie génique ou l AD médicament Thérapie génique Trafic intracellulaire de l AD thérapeutique lors d un transfert de gène non viral Protéine Gène Fonction 5 décembre 2001 Virginie ECRIU Petites molécules Les méthodes de transfert de gène L'AD médicament peut être : véhiculé par un virus recombinant rétrovirus adénovirus autres (AAV, Herpes, HIV,...) un AD plasmidique formulé avec un vecteur chimique s'auto-associant à l'ad et assurant le transfert du gène seul, associé ou non à une méthode physique (microinjection, électroporation, gene gun...) Taille d un plasmide 500 nm < 50 nm Taille d une cellule animale environ 10 µm

2 Ces transparents ne sont pas disponibles dans ce fichier Transparents sur la structure et l organisation d une cellule Eucaryote Transparent sur l endocytose Transparent sur la structure d un lipoplexe Etapes cellulaires du transfert de gène Endocytose Complexe lipide / AD Fusion avec la membrane Plasmide Lipide cationique + Cheminement intracellulaire Transcription Expression Import nucléaire tructure du lipide cationique RPR (lipopolyamine) L'efficacité de transfert de gène d un lipide cationique dépend de sa formulation en lipoplexe H 2 H H H H Comparaison de différentes formulations de RPR sur l'efficacité de transfection (IH 3T3; pcmvluc) 1E+07 1E+06 érum 10 % 0 % * sup Phe expression cassette V40 late polya cer pxl pb Gène de la luciférase rigine de réplication Promoteur viral RLU/µg prot. 1E+05 1E+04 1E+03 1E+02 H 2 0 R=6 * acl R=6 H1 acl R=3 ahc 3 R=6 acl R=6

3 Utilisation d un analogue fluorescent du lipide cationique RPR pour doser la quantité de lipide internalisée par les cellules H 2 H H H H Utilisation de la méthode de «dot-blot» pour doser la quantité de plasmide internalisée par les cellules Plasmide, non purifié, extrait des cellules transfectées H C - + Groupement rhodamine (excitation = 560 nm; émission = 590 nm) Formation de lipoplexes contenant ce lipide fluorescent Transfection des cellules avec ces lipoplexes fluorescents Extraction des lipides internalisés dans ou fortement associés aux cellules Dosage de la fluorescence * * * Dépôt et fixation sur une membrane de nylon * Hybridation avec une sonde spécifique, radio-active Dosage de la radio-activité, comparaison avec une gamme L'efficacité de transfection n'est pas corrélée à l'internalisation de l'ad et du lipe cationique Internalisation de complexes AD / lipide cationique fluorescent Lipofectant (pmole/µg protéine) Internalisation Plasmide (ng AD/µg protéine) RLU/µg prot. Transfert de gène 1E+07 1E+06 1E+05 1E+04 Efficacité de transfection IH 3T3 acl / + sérum - acl / - sérum ++ ahc 3 / + sérum ++ 1E+03 0 acl / + sérum ahc 3 / + sérum 1E+02 CV 1

4 Utilisation d une molécule fluorescente photoactivable pour obtenir du plasmide fluorescent Internalisation de complexes AD fluorescent / lipide cationique Fluorophore + + Internalisation de billes fluorescentes Transfection 100 nm 200 nm acl / + sérum AD fluo H H F F F 3 F Groupe photoactivable hν IH 3T3 Molécule de photored CV 1 IH 3T3 Internalisation de complexes AD fluorescent / lipide cationique Transfection + sérum AD fluo ahc 3 peptide compactant Billes fluorescentes 500 nm 1000 nm Conclusions sur le trafic intracellulaire des lipoplexes les complexes AD / lipofectant efficaces in vitro sont généralement de grande taille l'internalisation des complexes ne suffit pas pour obtenir une transfection efficace CV 1

5 Etapes cellulaires du transfert de gène Endocytose Complexe lipide / AD Fusion avec la membrane Plasmide Lipide cationique + ligo 21pb 2 min 5 min AD 500 pb Microinjection dans le cytoplasme de cellules de fragments d AD fluorescents de longueurs variables Microinjection cytoplasmique Cheminement intracellulaire 10 min AD 6000 pb Transcription Expression Import nucléaire 5 min 60 min D après Lukacs et coll. (2000) The Journal of Biological Chemistry Récupération de fluorescence après photoblanchiment FRAP (Fluorescence recovery after photobleaching) Conclusions sur la diffusion cytoplasmique de l AD Des petits oligonucléotides diffusent rapidement dans le cytoplasme et vont se concentrer dans le noyau Un fragment d AD de 100 paires de bases est mobile dans le cytoplasme (même mobilité que dans l eau), comparable à du polymère de type dextran de même taille Un fragment d AD de taille supérieure à 2000 paires de base est pratiquement immobile dans le cytoplasme Le cytoplasme contient des nucléases qui digèrent le plasmide retenu

6 L AD plasmidique peut-il franchir le pore nucléaire Techniques cellulaires pour l étude de l import nucléaire de molécules Technique de microinjection Technique des cellules perméabilisées Cytoplasme oyau Traitement à la digitonine 500 nm < 50 nm Ø théorique 10 à 40 nm Microinjection cytoplasmique Microinjection nucléaire Cellules perméabilisées Pore nucléaire Etude de l import en ajoutant des extraits cytoplasmiques Microinjection Cellules perméabilisées Microinjection d'ad plasmidique fluorescent dans des cellules CV1 BA-Rhod BA-Rhod-L Injection cytoplasmique, 30 min Injection cytoplasmique, 2 h Injection nucléaire, 2 h

7 Test d'import de l'ad plasmidique fluorescent sur HeLa perméabilisées Expression d'un gène rapporteur après microinjection d'ad plasmidique % de cellules CV1 exprimant la GFP après microinjection 60 nucléaire cytoplasmique 0 Cycle cellulaire des cellules Hela Avant injection 4h après G2 M 2n n 2n 3 h 6h après 1h après 6h 14 h G0/G1 n 6h après Utilisation de l iodure de propidium pour analyser la position d une cellule dans le cycle.

8 Principe du cytomètre de flux G0/G1 M G2 2n n 2n 3 h ombre de cellules G2/M 6 h 14 h G0/G1 n Cellules Hela en culture normale Intensité de fluorescence G0/G1 G2/M (%) Protocole de synchronisation 1 Thymidine 2 mm 15h 2 Déoxycytidine 24 µm 8h 3 Thymidine 2 mm 15h 4 Déoxycytidine 24 µm M G2 2n n 2n 3 h G0/G1 6 h 14 h n Cellules non synchronisées Cellules synchronisées 0h 2h 4h G0/G1 G2/M (%) (%) (%) 1. Les cellules en sont bloquées, les autres continuent leur cycle pour s arrêter en tout début de. 2. Les cellules bloquées en sortent de, les cellules bloquées en début de traversent. 3. Toutes les cellules sont sorties de, elles réalisent le cycle et viennent s arrêter en tout début de. 4. Libération du blocage pour toutes les cellules en début de. G0/G1 G2/M (%) 6h 8h 10h (%) (%) (%) (%) 12h

9 Effet de la position dans le cycle sur l efficacité de transfert de gène Intervalle de temps Contrôle 0h 4h 2h 6h Activité luciférase (pg luciférase/µg protéine) 1,43 ± 0,81 0,20 ± 0,15 0,65 ± 0,56 % Répartition des cellules dans le cycle à la fin de l intervalle (%) G0/G1 G2/M h 2h 4h 6h Conclusions sur le franchissement du pore nucléaire Le franchissement du pore nucléaire par un AD plasmidique est un événement très rare Lorsqu une cellule passe par une étape de mitose, l efficacité de transfert de gène est considérablement augmenté 4h 8h 0,72 ± 0, h 6h 10h 1,44 ± 0, h 8h 12h 13,54 ± 2, h