Partiel n 1 Techniques d Analyses Spectrale & Séparative (4h00)

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1 Partiel n 1 Techniques d Analyses Spectrale & Séparative (4h00) Documents non autorisés - Calculatrice autorisée Justifier les calculs Séparer calcul littéral et numérique Questions de cours : (8,5 points) Technique d analyse spectrale 1) Qu appelle-t-on chromophore? Indiquer ce que représente l effet hypsochrome, l effet hypochrome. Ces deux effets peuvent-ils avoir lieu en même temps? 2) Quel est l effet d une augmentation de température sur l absorption des chromophores? 3) Compléter le schéma d un spectrophotomètre double faisceaux, fourni en annexe en indiquant l élément associé à chaque flèche. (ne pas oublier de le rendre avec votre copie). - a - Quelle est l utilité du hacheur optique? - b - Quelles sont les différences entre un double faisceaux et un mono faisceau? 4) En quoi consiste la méthode des additions connues? 5) Si l on veut épargner du temps ou de l échantillon, il est possible d effectuer une analyse d addition connue en n utilisant que deux prélèvements d échantillon. Ces deux échantillons présentent un volume V x de solution inconnue de concentration C x. On effectue une seule addition connue V S d étalon de concentration C S au deuxième échantillon. Ces deux échantillons sont ensuite placés dans deux fioles jaugées de volume V t que l on complète jusqu au trait de jauge par un solvant approprié. - a - Écrire les expressions littérales des absorbances A 1 du premier échantillon et A 2 du deuxième échantillon. (on utilisera comme notation, ε le coefficient d absorption molaire de la solution et b l épaisseur des cuves de mesure utilisées). - b - En déduire l expression littérale de la concentration de l inconnue C x. ETSL, 95 rue du Dessous des Berges, PARIS 1/7

2 Exercice 1 : (5,5 points) Des solutions contenant des résidus tyrosine et tryptophane peuvent être différenciées en milieu alcalin (hydroxyde de potassium à 0,1 mol.l -1 ) d après leur spectre d absorption dans l UV. Dans ces conditions, les coefficients d absorption molaires sont donnés dans le tableau 1 ci-dessous. Tableau 1 : Coefficients d absorption molaires de la tyrosine et du tryptophane. Tyrosine Tryptophane ε à 240 nm (L.mol -1.cm -1 ) ε à 280 nm (L.mol -1.cm -1 ) Un échantillon de 10 mg de protéine est soumis à une hydrolyse totale non acide et dilué dans un volume final de 100 ml d hydroxyde de potassium à 0.1 mol.l -1. L absorbance dans une cuve de 1 cm est respectivement de 0,717 à 240 nm et 0,239 à 280 nm. 1/ Donner les formules développées de la tyrosine et du tryptophane. 2/ Pourquoi l hydrolyse réalisée n est-elle pas acide? 3/ Quel type de cuve utiliser? Justifier votre réponse. 4/ Calculer les concentrations en tyrosine et en tryptophane. 5/ Estimer la quantité de tryptophane et de tyrosine par masse de protéine. Exercice 2 : (11 points) La mesure de la chlorophylle a est utilisée comme indicateur de la biomasse phytoplanctonique dans les eaux naturelles. La chlorophylle a représente en effet le plus important pigment chez les organismes photosynthétiques aérobies (en excluant les cyanobactéries) et toutes les algues en contiennent. Le contenu cellulaire en chlorophylle a est de 1 % à 2 % en poids sec. Afin de doser la chlorophylle a, nous nous basons sur un mode opératoire trouvé dans la littérature. Certaines étapes étant peu claires voire non précisées ; il sera nécessaire de les compléter. Il faut filtrer 250 ml d eau sur une membrane 0,8 µm, pour recueillir les cellules algales. Les pigments sont extraits de ces cellules avec 250 ml d acétone à 90 % (v/v). Cette dernière solution sera directement utilisée pour le dosage. Le dosage est réalisé par fluorimétrie. 1/ Qu indique la technique utilisée à propos de la structure de la chlorophylle a? Justifier votre réponse. 2/ La publication parle des longueurs d onde de 431 et 664 nm. Préciser, en justifiant, quelle est la longueur d onde d excitation et quelle est la longueur d onde d émission. 3/ Indiquer comment préparer 500 ml d acétone à environ 90 % (v/v) à partir d acétone à 100 % (v/v). ETSL, 95 rue du Dessous des Berges, PARIS 2/7

3 Il faut ensuite préparer une gamme d étalonnage dont l intensité de fluorescence sera mesurée en même temps que l inconnue. Vous disposez d une solution mère à 10 mg.l -1 de chlorophylle a dans de l acétone à 90 % (v/v). Il est nécessaire de préparer une gamme d étalonnage allant de 0 à 0,200 mg.l -1 de chlorophylle a. 4/ Expliquer, en justifiant, comment réaliser 6 points de gamme régulièrement répartis (dont les points 0 et 0,200 mg.l -1 ). La liste du matériel dont vous disposez est la suivante : Tubes à hémolyse (contenance 5 ml) Fioles jaugées de 10 et 100 ml classe A, Pipettes jaugées de 1 et 10 ml classe A, Pipettes graduées de 1 ml et 5 ml au 1/100 ème (2 traits), Eprouvettes de 5, 100, 500 ml, Béchers. Vous commencerez par faire une dilution exacte de la solution étalon au 1/10 ème, puis réaliserez la gamme. Préciser la verrerie et le diluant utilisés. Puis 3 ml de chaque solution et de l inconnue sont déposés dans les cuves pour les mesures. 5/ Quel type de cuve utiliser? Justifier. 6/ Quelle doit être la composition du blanc? Après ces mesures, nous désirons étudier l interférence d un autre pigment, la phéophitine. Pour cela, il suffit d acidifier l échantillon pour atteindre un ph de 2,5 environ puis de mesurer l intensité de fluorescence correspondante. Vous disposez d acide chlorhydrique à 0,1 mol.l -1. 7/ Calculer le volume d acide chlorhydrique à ajouter sachant que la cuve contient déjà 3 ml de solution. La chlorophylle a totale est obtenue en additionnant la chlorophylle a et la phéophitine. ETSL, 95 rue du Dessous des Berges, PARIS 3/7

4 Questions de cours : (9 points) Technique d analyse séparative 1) Définir le phénomène d électroosmose ainsi que le phénomène d électrophorèse. Quelle différence essentielle y a-t-il entre les deux phénomènes? Est-ce la même théorie qui s applique? 2) Donner l expression de la mobilité électrophorétique en fonction des paramètres expérimentaux, d la distance de migration à travers le support, t la durée de migration et E la valeur du champ électrique. 3) Indiquer quels sont les facteurs influençant la mobilité électrophorétique. 4) À propos de l électrophorèse capillaire en zone libre : - a - Quelles sont ses caractéristiques principales? - b - Que veut dire l acronyme F.C.Z.E? - c - Indiquer l ordre de séparation des espèces chimiques. - d - Que ne permet pas de faire cette technique? 5) Qu appelle-t-on électrophorèse à focalisation isoélectrique? Exercice 3 : (6 points) Nous disposons d une solution contenant les 5 protéines de poids moléculaires et phi données dans le tableau n 1 ci-dessous. Tableau 1 : Caractéristiques des protéines du mélange étudié. Protéine Poids moléculaire (Da) phi α - antitrypsine ,4 Cytochrome c ,6 Myoglobine ,0 Sérum albumine ,8 Transferrine ,9 1/ Si nous séparons ce mélange sur un gel de polyacrylamide en présence de SDS, quel sera l ordre de migration des différentes protéines (de la cathode vers l anode)? 2/ Si nous séparons ce mélange par focalisation isoélectrique, quel sera l ordre de migration des différentes protéines (de la cathode vers l anode)? ETSL, 95 rue du Dessous des Berges, PARIS 4/7

5 3/ Comment procéder pour séparer ce mélange selon la masse et le phi sur le même gel? Dessiner le gel obtenu. Exercice 4 : (10 points) Nous désirons déterminer la masse molaire de l anhydrase carbonique. Dans un premier temps, nous effectuons une électrophorèse sur gel de polyacrylamide en présence de dodécylsulfate de sodium après traitement au β-mercaptoéthanol. 1/ Expliquer l intérêt de réaliser l électrophorèse dans ces conditions? Après révélation, nous mesurons les distances de migration des protéines de masse molaire connue. Les résultats sont donnés dans le tableau n 2 ci-dessous. Tableau n 2 : Distance de migration en SDS PAGE de protéines de masse molaire connue. Protéines Masse molaire (g.mol -1 ) Distance de migration (mm) Myoglobine Inhibiteur trypsique Ovalbumine Albumine / Tracer la droite d étalonnage. 3/ Déterminer la masse molaire de l anhydrase carbonique sachant que sa distance de migration dans ces conditions est de 56 mm. Parallèlement, nous effectuons une électrophorèse capillaire. Nous utilisons deux témoins d étalonnage, l ovalbumine et la myoglobine ; leur vitesse de migration est respectivement 1,5 et 5,5 cm.min -1. 4/ Quelles sont les différences entre l électrophorèse de zone et l électrophorèse capillaire? 5/ Dans cette même expérience, la protéine étudiée a une vitesse de migration dont la valeur est 3,25 cm.min -1. Déterminer se masse molaire. 6/ Comparer ce résultat avec celui déterminé précédemment et conclure. ETSL, 95 rue du Dessous des Berges, PARIS 5/7

6 ETSL, 95 rue du Dessous des Berges, PARIS 6/7

7 ANNEXE à RENDRE avec la COPIE ETSL, 95 rue du Dessous des Berges, PARIS 7/7