TP1 Spécificité enzymatique

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1 TP1 Spécificité enzymatique L'approvisionnement en glucose commence par la digestion de macromolécules glucidiques comme l'amidon. Cette digestion s'effectue grâce à enzymes digestives. Les enzymes sont des protéines. Ce sont des biocatalyseurs, c est-à-dire qu elles permettent des réactions chimiques cellulaires en transformant un substrat en produit. Enzyme Substrat(s) Produit(s) On cherche à montrer que la digestion complète de l'amidon en glucose fait intervenir plusieurs enzymes spécifiques à un substrat. Document 1 : Les enzymes digestives Les enzymes digestives sont produites par le pancréas, la muqueuse intestinale, les glandes salivaires, la muqueuse stomacale. Les enzymes digestives entraînent la simplification des molécules complexes en permettant la cassure des liaisons entre les molécules simples (hydrolyse). Ressources Document 2 : Précisions sur la biochimie des glucides Les glucides simples ou oses sont définis par leur nombre d'atomes de carbone. Leur formule générale est (CH 2 O)n, avec n = nombre de C. Les oses les plus courants sont les hexoses (C 6 H 12 O 6 ) : glucose, fructose, galactose Les glucides complexes, ou osides, sont constitués de plusieurs oses reliés par des liaisons osidiques. - Diosides constitués de l'assemblage de 2 oses Saccharose = Glucose-Fructose Maltose = Glucose-Glucose Lactose = Glucose-Galactose - Polyosides constitués d'un grand nombre d'oses Amidon, glycogène sont des polyglucoses. Matériel disponible - Matériel de laboratoire. - Enzymes : à définir - Solutions de glucides : à définir 1. Concevoir une démarche d'investigation permettant de répondre au problème posé. 2. Réaliser le protocole fourni. 3. Présenter les résultats. 4. Mettre en relation les résultats obtenus et les informations du document fourni de façon à répondre au problème posé. Construire un schéma présentant la digestion complète de l'amidon en glucose.

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3 FICHE PROTOCOLE : Spécificité enzymatique Pour montrer que la digestion de l'amidon en glucose fait intervenir plusieurs enzymes spécifiques à un substrat, il faut : - Comparer l'action d'une enzyme vis à vis de différents substrats. Enzymes choisies : amylase et maltase, substrats choisis : amidon et maltose - Caractériser les produits de la réaction enzymatique par chromatographie. Mise en évidence de la spécificité enzymatique Matériel - Matériel de laboratoire : pipettes, tubes à essai - Feutre - Enzymes : amylase, maltase - Solutions de glucides : - amidon - maltose - Eau iodée (réactif de Lugol) Avertissement Le bain-marie doit être à 37 C avant toute mise en incubation. Un plan de remplissage des tubes doit être fait avant toute manipulation. Mise en œuvre Les différentes combinaisons possibles doivent être testées. Volumes utilisés : 3 ml de substrat, 2 ml d'enzyme. Bien agiter les tubes après mélange. Un tube témoin contenant de l'amidon seul sera fait. Le temps d'incubation est de 15 minutes à 37 C. En fin d'expérience, réaliser le test de Lugol sur les tubes contenant de l'amidon en début d'expérience. Présenter les résultats sous forme d'un tableau. Chromatographie des glucides Matériel - Matériel de laboratoire : cure-dents, pinces - Plaque CCM - Cuve à chromatographie avec solvant - Hotte, sèche cheveux, étuve - Révélateur à manipuler avec lunettes et gants - Bécher, sopalin. - Solutions de glucides témoins : - maltose - glucose - Résultats Substrat / Enzyme : - Amidon / Amylase - Maltose / Amylase - Maltose / Maltase Protocole Préparation de la plaque de chromatographie : - Sur la plaque de gel de silice, tracer un trait au crayon représentant la ligne de dépôt (quelques millimètres au-dessus du niveau du solvant). NB. Ne pas toucher la face blanche avec les doigts. - Définir un plan de dépôts puis tracer des points figurant les emplacements des futurs dépôts. Réalisation des dépôts : - Déposer au cure-dents, 3 fois une goutte de chaque solution. NB. La tache ne doit pas dépasser 1 mm de diamètre. Laisser sécher entre chaque dépôt. - Mettre la plaque dans la cuve : la ligne de dépôts doit se situer au-dessus du solvant. - Fermer la cuve et laisser migrer le solvant pendant 15 minutes. Protocole de la révélation de la chromatographie : - Sortir la plaque, la sécher sous la hotte, au sèche cheveux. - Plonger totalement la plaque dans le révélateur contenu dans un bécher. Laisser agir 5 secondes. - Sortir la plaque, l'essorer avec du papier absorbant puis la placer à l'étuve jusqu à apparition de taches jaunes. Schématiser le chromatogramme obtenu.

4 CORRIGÉ Comparaison de l'action d'une enzyme vis à vis de différents substrats On doit tester toutes les combinaisons enzyme-substrat. Le témoin ne contient pas d'enzyme. Le test à l'eau iodée est effectuée uniquement dans les tubes contenant l'amidon au départ car ce test est caractéristique de l'amidon. Caractérisation des produits des réactions enzymatiques On doit caractériser les glucides présents en fin d'hydrolyse. Le dépôt des glucides témoins permettra l'identification. Tube Substrat Amidon Amidon Amidon Maltose Maltose Enzyme x Amylase Maltase Amylase Maltase Test Lugol Positif Négatif Positif x x Glucide identifié par CCM x Maltose x Maltose Glucose Par rapport au tube témoin et la CCM, on observe que le test au Lugol est : - négatif dans le tube 2 donc l'amidon a été transformé en maltose mis en évidence par la CCM. - positif dans le tube 3 donc l'amidon n'a pas été transformé par la maltase. 3 et 4 : maltose 5 : glucose D'après la CCM : - le tube 2 contient du maltose donc l'amidon a été transformé en maltose par l'amylase - le tube 5 contient du glucose donc le maltose a été transformé en glucose par la maltase. - le tube 4 contient toujours du maltose donc il n'a pas été transformé par l'amylase. Par conséquent, l'amylase agit sur l'amidon mais pas sur le maltose, la maltase agit sur le maltose mais pas sur l'amidon. Chaque enzyme est donc spécifique à un substrat. La digestion complète de l'amidon en glucose fait donc intervenir 2 étapes nécessitant 2 enzymes spécifiques à un substrat.

5 FICHE-LABORATOIRE : Spécificité enzymatique Spécificité Solutions de glucides : saccharose nommé maltose amidon Enzymes : amylase saccharase nommée maltase Matériel élève : - Flacons avec les 2 glucides - Flacons avec les 2 enzymes - 5 tubes - 4 pipettes - Eau iodée Chromatographie (d'après ECE EvII3p04) Préparation du solvant : 60% de méthyl éthyl acétone 20% d acide acétique glacial 20% de méthanol Préparation du révélateur (mélanger les deux produits au dernier moment) : 1 volume de permanganate de potassium à 2% 1 volume de carbonate anhydre de sodium à 4% Solutions de glucides : (1) saccharose nommé maltose (2) glucose Hydrolysats : (3) saccharose nommé Amidon + Amylase (4) saccharose nommé Maltose + Amylase (5) glucose nommé Maltose + Maltase Boîte de Pétri pour le révélateur Plat avec sopalin pour égouttage et séchage Etuve Matériel élève : - Plaque CCM - 5 cure-dents - Cuve à électrophorèse - Flacons avec les 3 glucides témoins - Pinces

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