TP biologie cellulaire 3 : chromatographie et électrophorèse

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1 TP biologie cellulaire 3 : chromatographie et électrophorèse Objectifs : - Connaître le principe des techniques de chromatographie et électrophorèse. - Savoir réaliser une chromatographie sur couche mince, sur papier ou sur colonne, savoir réaliser une électrophorèse de protéines sur acétate de cellulose. - Savoir interpréter des résultats de chromatographies et électrophorèses variés. L objectif est d identifier des substances biologiques contenues dans un organisme, à partir d un prélèvement. Les chromatographies et les électrophorèses sont des techniques : - de séparation de molécules à partir d'un mélange par migration sur un support, en fonction de leurs propriétés physico-chimiques, - et d identification de ces molécules par comparaison avec série de témoins (solutions contenant une molécule connue). La chromatographie est une séparation de molécules grâce à la migration d un solvant (phase mobile) sur/dans un support (phase stationnaire). La distance de migration des molécules dépend de la solubilité des molécules dans le solvant et de leur affinité pour le support. Les méthodes de chromatographie sont variées et sont classées suivant : - la nature de la phase mobile = liquide ou gaz (phase stationnaire = support solide) - selon la nature de la phase stationnaire (chromatographie de partage, d adsorption, d exclusion, d échanges d ions, d affinité). - selon le procédé utilisé (sur papier, sur couche mince, sur colonne). L électrophorèse est la séparation de molécules chargées par migration dans un champ électrique (qui entraîne le déplacement des molécules chargées, à un ph donné) sur un support imprégné de solvant. La distance de migration dépend de la charge (nette), de la masse de la molécule et de sa forme. On utilise l électrophorèse pour séparer les acides aminés, les protéines ou les acides nucléiques. L électrophorèse des protéines peut être réalisée sur des supports variés : - selon un montage horizontal : support papier, acétate de cellulose ou gel d agarose - selon un montage vertical : gel de polyacrylamide. Partie I : Chromatographie Partie II : Electrophorèse Chromatographie sur couche mince Chromatographie sur papier Chromatographies sur colonne Chromatographie en phase gazeuse Électrophorèse sur acétate de cellulose Électrophorèses sur gel de polyacrylamide Réalisation et interprétation Observation et interprétation Principe et protocole décrits Interprétation de résultats Réalisation et interprétation Interprétation de résultats 1

2 PARTIE I : CHROMATOGRAPHIE I. Réalisation d une chromatographie sur couche mince : séparation et identification des sucres d un jus de fruit frais A. Principe de la chromatographie sur couche mince La chromatographie sur couche mince permet de séparer différentes molécules par migration par capillarité d un éluant, constitué d un solvant organique ou d un mélange de solvants (phase mobile), sur un support constitué d un gel de silice sur aluminium (phase stationnaire). La vitesse de migration et donc la distance de migration des solutés dépend de leur solubilité dans le solvant organique (donc apolaire) et de leur adsorption sur le support. Les solutés apolaires migrent plus rapidement que les solutés polaires. Les solutés sont identifiés par comparaison de leur rapport frontal avec les rapports frontaux de témoins. Mélange étudié : sucres d un jus de fruit frais (jus de raisin pressé) dont vous souhaitez déterminer la composition en oses Solutions témoins : solutions de glucose, fructose, saccharose à 1g/L. B. Protocole de la chromatographie sur couche mince 1. Préparation des plaques - Les plaques sont constituées d un gel de silice sur aluminium : la face blanche ne doit pas être touchée. - Les plaques ont été réactivées pendant 30 minutes à l étuve à 105 C : manipulez-les avec des pinces. Toutes vos marques doivent être réalisées au crayon à papier en appuyant le moins possible de façon à ne pas entamer la couche de gel de silice. - Tracez très finement au crayon, une ligne de dépôts à 1,5 cm du bord 1,5 inférieur. - Indiquez les points de dépôts, espacés de 0,5cm, en laissant 1cm aux extrémités pour éviter les effets de bord. Légendez (J,G,F,S). - Portez vos initiales au crayon en haut de la plaque. 2

3 2. Dépôts - Faites un dépôt le plus petit possible (le diamètre de la tache ne doit pas dépasser 3 mm). Pour cela, déposez une goutte avec un fin capillaire : mettre le capillaire vertical de façon à ce que la solution descende par capillarité. Sécher immédiatement avec le sèche-cheveux en maintenant la plaque avec une pince et sans abîmer le gel de silice (attention au voisin). - Effectuez 4 dépôts successifs au même point, en séchant aussitôt après chaque dépôt (ceci permet d augmenter la quantité de matière déposée). Déposez dans l ordre : 1- solution à 2% de glucose (G) 2- solution à 2% de fructose (F) 3- solution à 2% de saccharose (S) 4- jus de fruit frais (J) 3. Migration (= élution) - Commencez par ajuster le niveau de l éluant à environ 0,5 cm du fond de la cuve. - Déposez la plaque dans la cuve, le plus verticalement possible. Attention! la ligne des dépôts ne doit pas toucher l éluant. - Fermez la cuve hermétiquement avec du papier aluminium. Ne déplacez pas la cuve durant la migration de l éluant. - La migration dure 10 à 15 minutes environ, donc surveillez le front de migration dès 10 minutes. Quand le front de migration du solvant arrive à environ 1 cm du bord supérieur de la plaque, ouvrez la cuve, retirez la plaque, repassez au crayon la position atteinte par le front de migration du solvant. 4. Révélation de la plaque (étape de coloration de substances non colorées) - Mélangez au dernier moment dans la cuvette à révélation (1 par paillasse) un volume de permanganate de potassium à 2% et un volume de carbonate anhydre de sodium à 4% (1 à 2 cm au fond). - Immergez la plaque dans le mélange durant 10 secondes, puis séchez longuement. - Délimitez les tâches au crayon. Les taches jaunes qui apparaissent correspondent à la réduction du permanganate (oxydant) par les fonctions alcools des sucres (réducteurs). C. Interprétation des résultats : calcul du rapport frontal (à faire à la fin du TP) - Calculez le rapport frontal Rf de chaque tache pour chaque échantillon. Tracez un point au centre de chaque tache. Rapport frontal = distance de migration de la molécule / distance de migration du solvant Rf = d1 / d2 Même rapport frontal même espèce chimique. (Attention! Pour une espèce donnée, le Rf dépend de la nature du solvant et de la plaque). - Identifiez les sucres présents dans le jus de fruit en comparant le rapport frontal de chaque sucre présent dans le mélange aux rapports frontaux des sucres témoins. 3

4 II. Chromatographie sur papier (chromatographie de partage) : séparation des pigments végétaux ou des acides aminés d une protéine A faire en fin de TP A. Principe de la chromatographie sur papier La chromatographie sur papier (ou chromatographie de partage) permet de séparer différentes molécules en fonction de leur solubilité dans un solvant organique (donc hydrophobe) qui migre par capillarité dans le support, la feuille de cellulose. La migration du solvant entraîne les solutés déposés sur la feuille. La vitesse de migration et donc la distance de migration des solutés dépend de leur solubilité dans le solvant : - les solutés apolaires ont beaucoup d'affinité pour le solvant donc migrent rapidement - les solutés polaires ont plus d affinité pour le papier donc migrent lentement. Les solutés sont identifiés par comparaison de leur rapport frontal avec les rapports frontaux de témoins. B. Protocole de la chromatographie sur papier à titre de document - Déposez d une très petite goutte de la solution concentrée de pigments sur la feuille de cellulose (bande de papier Whatman) avec un capillaire : on réalise plusieurs dépôts successifs au même endroit avec séchage immédiat au sèche-cheveux entre deux dépôts. (Pour la chromatographie des pigments des végétaux, il suffit d écraser un morceau de végétal directement sur la feuille de cellulose.) - Positionnez la feuille dans l éprouvette contenant le solvant : le bord de la feuille trempe dans le solvant, mais les taches de dépôts sont situées au-dessus du niveau de solvant. L éprouvette est refermée car le solvant est très volatile. - Laissez migrer au moins une heure. C. Analyse de chromatogrammes 1. Chromatographie sur papier de pigments végétaux (chromatogramme au bureau) Méthode pour le concours!!! - Déterminez le nombre de pigments différents présents initialement dans le mélange. - Identifiez les différents pigments contenus dans les feuilles des végétaux chlorophylliens, par comparaison du rapport frontal de chaque pigment avec les rapports frontaux de témoins (Le Rf est variable selon les phases mobiles et stationnaires utilisées) : mesurez la distance parcourue par le pigment et la distance du front de migration. Rapport frontal : Rf = distance parcourue par la molécule / distance parcourue par le solvant 4

5 - Comparez la solubilité des différents pigments pour le solvant utilisé. - Comparez la vitesse de migration des pigments dans la chromatographie sur papier avec l ordre d obtention des pigments dans les fractions de la chromatographie sur colonne (III.). 2. Chromatographie sur papier des acides aminés d une protéine a. Chromatographie sur papier unidimensionnelle On cherche à identifier les acides aminés constituant un tétrapeptide. Après hydrolyse des liaisons peptidiques du peptide, les acides aminés sont séparés par chromatographie sur papier. - Acides aminés du tétrapeptide hydrolysé : première et dernière colonnes acides aminés témoins : colonnes du milieu. Peut-on identifier les 4 acides aminés composant le tetrapeptide? b. Chromatographie sur papier bidimensionnelle La chromatographie bidimensionnelle permet de séparer plus finement des molécules dont les profils de migration en une dimension se superposent. On utilise deux solvants différents: - Première chromatographie dans une direction avec un premier solvant. - Deuxième chromatographie en tournant la feuille de 90 avec un deuxième solvant. Comparer la solubilité des différents acides aminés pour les solvants utilisés (2 solvants apolaires), et l interpréter. 5

6 A. Principe des chromatographies sur colonne III. Chromatographies sur colonne La chromatographie sur colonne permet de séparer des molécules selon leur affinité pour la phase stationnaire et la phase mobile. Le mélange à séparer est placé au sommet d une colonne remplie d une matrice (phase stationnaire). Les molécules sont plus ou moins adsorbées par la matrice. Un solvant descend la colonne par gravité en entraînant les molécules. La vitesse de migration des molécules dépend de leur adsorption dans la matrice et de leur solubilité dans l éluant. On récupère les différentes molécules dans des fractions successives de l éluat. 1. Chromatographie d adsorption (gel de silice) La colonne est remplie d un gel de silice et saturée d un solvant organique. Un solvant organique (éluant) descend la colonne par gravité en entraînant les molécules. On peut ainsi séparer des pigments photosynthétiques selon leur hydrophobicité (solubilité dans le solvant organique). Les pigments contenus dans chaque fraction sont ensuite identifiés selon leurs propriétés optiques, par spectrophotométrie. On compare le spectre d absorption de chaque molécule avec des spectres de molécules connues. 2. Chromatographies sur colonne Elles permettent de séparer des molécules d un mélange à travers une colonne contenant des microbilles. On récupère les protéines éluées à la sortie de la colonne par lavages de la colonne par un tampon d'élution. a. Chromatographie d exclusion Les microbilles sont poreuses : - les petites protéines peuvent passer par l intérieur des billes - les grosses protéines sont exclues des billes et migrent plus rapidement à travers la colonne. On récupère dans les fractions les différentes protéines en fonction de leur taille : d abord les plus grosses puis les plus petites. b. Chromatographie par échanges d'ions Les microbilles sont chargées positivement. Les protéines (ou les acides aminés) sont placées dans un tampon très basique : elles sont chargées négativement et se lient aux billes par liaisons ioniques. Le ph du tampon d'élution qui circule dans la colonne est progressivement abaissé, et les protéines sont progressivement éluées en fonction de leur phi(ph pour lequel la protéine est électriquement neutre) c. Chromatographie d affinité Les microbilles sont recouvertes d un ligand (exemple : un anticorps). Les protéines interagissant avec ce ligand se fixent au ligand dans la colonne, tandis que les autres protéines ne sont pas retenues. Les protéines fixées sont ensuite récupérées en faisant circuler un solvant qui dissocie le complexe solvantprotéines. Cette méthode permet de purifier une protéine au sein d un mélange de protéines. 6

7 B. Protocole de la chromatographie sur colonne d adsorption : séparation des pigments végétaux Protocole à titre de document pour le concours La chromatographie sur colonne réalisée est basée sur une séparation par solubilité différentielle dans deux solvants organiques (plus ou moins apolaires). La colonne est remplie d'une matrice (gel de silice) ralentissant la migration des molécules. Une solution concentrée de pigments végétaux a été obtenue par broyage puis extraction des pigments de la feuille dans un solvant organique très apolaire, l éther de pétrole. Le mélange à séparer est placé au sommet de la colonne, et des solvants de plus en plus polaires sont mis en circulation dans la colonne, qui entraînent les molécules en fonction de leur solubilité : les plus apolaires puis les plus polaires. Attention! Toujours verser les solutions au goutte à goutte! Attention! Laisser toujours quelques millimètres de solvant au-dessus de la colonne. La colonne ne doit jamais sécher! (sinon la formation de bulles empêche l écoulement). Attention! Ne changer de solvant que lorsque les bandes colorées sont stabilisées (sinon tous les pigments se décrocheront simultanément). 1. Préparation de la colonne : - La colonne est remplie de 10 ml de gel de silice. - Laissez couler lentement de l'éther de pétrole dans la colonne afin de saturer le gel de silice (verser 5-6 ml au goutte à goutte). Arrêtez l'écoulement lorsque quelques millimètres d'éther de pétrole recouvrent la colonne. - Déposez lentement 2 ml d'extrait de pigments végétaux au sommet de la colonne, au rythme de une goutte par seconde. - Lorsque l extrait a pénétré dans la colonne et que la solution affleure à la surface de la silice, ajoutez 2 ml d éther de pétrole (solvant très apolaire) au goutte à goutte au sommet de la colonne. Collectez le solvant sans pigments dans le petit bécher. Puis recueillir le premier éluat (contenant le premier pigment) dans un tube épendorf et l étiqueter avec le marqueur. 2. Élution de la colonne par des solvants de plus en plus polaires = de plus en plus riches en acétone (0, 2, 4, 6, 8, 10 % d acétone dans l'éther de pétrole). L acétone est moins apolaire que l éther de pétrole. Lorsque les bandes colorées sont stabilisées, ajouter progressivement un nouveau solvant plus polaire (plus riche en acétone) en haut de la colonne. Le laisser s'écouler (dans le bécher), puis recueillir la fraction avec pigments (éluat) dans un tube épendorf. Noter quel solvant permet d'éluer les caroténoïdes, xanthophylles, chlorophylles a et b. 7

8 C. Interprétation des résultats et identification des pigments par spectrophotométrie Méthode pour le concours Comparez l ordre d élution des différents pigments photosynthétiques dans la chromatographie sur colonne avec la distance de migration dans la chromatographie sur papier. Classez les pigments du plus apolaire au plus polaire. Les pigments obtenus dans chaque éluat peuvent être identifiés par spectrophotométrie. On réalise un spectre d absorption de l éluat avec un spectrophotomètre : on mesure l absorbance du pigment à chaque longueur d onde. On compare le spectre obtenu avec des spectres d absorption de référence des différents pigments Spectre d absorption du mélange de pigments photosynthétiques (avant séparation par chromatographie sur colonne) Absorbance = f(longueur d onde) Spectres d absorption de différents pigments 8

9 IV. Chromatographie en phase gazeuse Principe : Le mélange à analyser est vaporisé à l'entrée d'une colonne, qui renferme une phase stationnaire solide (silicone), puis il est transporté à travers celle-ci à l'aide d'un gaz porteur (ou gaz vecteur). Les différentes molécules du mélange vont se séparer et sortir de la colonne les unes après les autres après un certain laps de temps qui est fonction de l'affinité de la phase stationnaire avec ces molécules. Exemple : Identification des acides gras contenus dans un mélange de triglycérides Les acides gras d'un mélange de triglycérides sont estérifiés par le méthanol (CH3-OH). Puis les esters méthyliques sont vaporisés (passage à l état gazeux) à 100 C. On détecte l ordre d arrivée des différentes molécules sous forme gazeuse : on note le temps de rétention de la molécule (temps indiqué en minutes au-dessus du pic). On compare le temps de rétention avec des étalons externes (témoins obtenus à partir de solutions pures connues). La surface du pic est proportionnelle à l abondance des molécules dans le mélange. Questions : 1. Le standard interne est ici l'acide stéarique (C18:0). Il présente un temps de rétention de 17,16 minutes. A l'aide du tableau 1, déterminez la nature des autres acides gras élués. 2. Que représente le premier pic (tr : 1,7 min)? 3. Selon quelle(s) propriété(s) les acides gras sont-ils séparés? 9

10 PARTIE II : ÉLECTROPHORÈSE I. Electrophorèse sur bande d acétate de cellulose : séparation et identification des protéines du blanc d œuf A. Principe de l électrophorèse sur bande d acétate de cellulose Les protéines ont une charge électrique nette qui reflète leur composition en acides aminés. Le blanc de l'œuf (ou le sérum) contiennent plusieurs protéines qui peuvent être séparées en fonction de leur charge électrique. L électrophorèse de protéines sur bande d acétate de cellulose est une électrophorèse horizontale. Les molécules sont séparées par migration dans un champ électrique sur une bande d acétate de cellulose (dérivé acétate d'une forme purifiée de cellulose) imprégnée de solvant. La distance de migration dépend de la charge (nette) et de la masse de la molécule (ainsi que de sa forme tridimensionnelle). Une cuve d électrophorèse pour montage horizontal est formée de deux réservoirs de tampon séparés munis chacun d'une électrode de platine. Chaque support de bande est placé à cheval au-dessus de la cloison qui sépare les deux réservoirs. Les deux bouts de la bande plongent dans le tampon (solution d'électrolytes). 10

11 B. Protocole de l électrophorèse sur bande d acétate de cellulose 1. Préparation des bandes d acétate de cellulose Les bandes d acétate de cellulose ne doivent jamais sécher. Ne jamais toucher la bande avec les doigts ; toujours utiliser la pince! a. Imprégnation des bandes dans le tampon Tris-véronal - Imprégnez les bandes dans le tampon Tris-véronal (ph constant =8,6) progressivement par capillarité face absorbante vers le dessus sans emprisonner de bulles d air (taches blanches). Lorsque les bandes sont imprégnées, immergez-les 15 minutes environ (étape faite au préalable). - Essorez légèrement les bandes entre deux feuilles de papier absorbant sans les toucher!!! - Notez vos initiales dans un coin en haut avec un crayon gras b. Mise en place des bandes - Repérez la face absorbante (pour une bande verticale, le coin coupé est en bas à droite). - Placez les bandes sur un chevalet, face absorbante au-dessus. - Fixez les bandes avec les fixe-bandes et tendez-les. Les extrémités devront dépasser suffisamment pour tremper dans le tampon. Les bandes sont orientées de la même façon. - Disposez le chevalet dans la cuve à électrophorèse, coin coupé vers la borne -. - Remplissez la cuve avec la solution tampon Tris-véronal (ph constant = 8,6) de façon à ce que les extrémités des bandes trempent dans le tampon. 2. Dépôts Trempez un applicateur dans le blanc d œuf dilué et faites le dépôt : - du côté de la cathode (borne -) - à 3 cm du bord - sur la face absorbante. ATTENTION : le dépôt doit être une bande fine (2mm) sur toute la largeur de la bande d acétate. Les anions migrent vers l anode (borne +). Opérez rapidement, les bandes ne devant pas sécher. 3. Migration - Fermez le couvercle et reliez la cuve à l alimentation. Réglez la tension à 200 V. - Laissez migrer 35 minutes à 200 V. - Puis déconnectez l alimentation. 4. Révélation - Fixation et coloration : plongez les bandes 5 min dans le rouge Ponceau (colorant spécifique des protéines), face absorbante contre le fond. (Ce colorant sera récupéré). - Décoloration : transférez les bandes dans 3 bains successifs d acide acétique à 5% jusqu à disparition de la couleur de fond. 11

12 C. Interprétation des résultats : électrophorégramme Combien de bandes observez-vous sur votre électrophorégramme? Le ph isoélectrique (phi) d une protéine est le ph pour lequel la protéine est électriquement neutre (charge nette nulle). À ph = phi, la protéine ne se déplace pas dans un champ électrique (autant de charges + que de charges - : la conductivité de la protéine est nulle). Ci-dessous sont données les valeurs des pka associés aux chaînes latérales d'acides aminés chargés : Ka = [H+][B]/[A] ph = pka + log ([B]/[A]). Acide aminé Couple acide / base pka Cystéine SH / S - 8,3 Aspartate COOH / COO - 3,8 Glutamate COOH / COO - 4,2 Lysine NH3 + / NH2 10,6 Arginine NH3 + / NH2 12,5 Histidine NH + / N (dans un cycle carboné) 6 1. Tracez les domaines de prédominance en fonction du ph. Quels acides aminés apportent des charges aux protéines à ph = 8,6? Quels acides aminés apportent des charges + aux protéines à ph = 8,6? 2. Dans quelle direction migrent les protéines majoritairement chargées négativement? Dans quelle direction migrent les protéines majoritairement chargées positivement? 3. Réalisez un schéma de l électrophorégramme (résultats). Indiquer l anode et la cathode. A partir de vos résultats, déterminez pour chaque protéine du blanc d'œuf sa charge nette à ph = 8,6. Indiquez pour chaque protéine si son phi est supérieur ou inférieur à 8,6 (ph du tampon). 4. Identifier la localisation des deux protéines du blanc d'œuf majoritaires : ovalbumine et lysozyme 5. Justifiez le fait que l extrait de blanc d œuf soit déposé à proximité de la cathode. 6. Expliquez la migration différentielle des protéines du blanc d œuf. Remarque analyse quantitative des résultats : On mesure l intensité de la coloration de chaque bande de l électrophorégramme par lecture optique (numérisation avec une tête de lecture). On obtient un profil densitométrique, qui indique l absorbance de chaque position X sur l électrophorégramme. 12

13 II. Electrophorèse de protéines sur gel de polyacrylamide : analyse de résultats A. Principe de l électrophorèse de protéines sur gel de polyacrylamide L électrophorèse sur gel de polyacrylamide est une électrophorèse verticale. Les molécules sont séparées par migration dans un champ électrique sur une bande d acétate de cellulose (dérivé acétate d'une forme purifiée de cellulose) imprégnée de solvant. Les protéines, chargées négativement, migrent vers l anode, borne chargée positivement. La distance de migration dépend de la charge (nette) et de la masse de la molécule (ainsi que de sa forme tridimensionnelle). L électrophorèse sur gel de polyacrylamide s effectue par montage vertical. Le gel est situé entre deux plaques de verre. Chaque extrémité du gel est mise en contact avec un tampon contenant des électrolytes qui, soumis à un champ électrique, permet la propagation d'un courant électrique dans le gel. Les mélanges à tester et les témoins (marqueurs de poids moléculaire) sont déposés dans les micro-puits. Les protéines sont révélées au bleu de Coomassie (bandes). En parallèle, on fait migrer un mélange de protéines marqueurs de poids moléculaire dont la longueur est connue (kit acheté dans le commerce). Ceci permet de déterminer le poids moléculaire d une protéine inconnue et ainsi l identifier. Le gel est constitué d acrylamide (formant des chaînes linéaires) et de bis-acrylamide (formant des ponts entre les chaînes). Selon la proportion des deux composés, on obtient un gel avec des mailles plus ou moins grandes : il joue le rôle de tamis moléculaire. La taille des mailles doit être du même ordre de grandeur que la taille des protéines. Électrophorèses de protéines sur gel de polyacrylamide : - en conditions non dénaturantes : migration selon la charge nette, la masse moléculaire et la forme (structure tridimensionnelle) de la protéine. - en conditions dénaturantes (SDS-page) : séparation selon la masse uniquement ( B.) - électrophorèse bidimensionnelle : séparation selon la charge nette, puis selon la masse moléculaire ( C.). 13

14 B. L électrophorèse de protéines sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (électrophorèse SDS-page) sépare les protéines selon leur masse moléculaire (uniquement) Dans l électrophorèse de protéines sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (électrophorèse SDS-page), les protéines sont dénaturées et recouvertes de SDS chargé négativement : - La chaleur (100 C) détruit les structures secondaires, tertiaires et quaternaires. - Le ß-mercaptoéthanol (réducteur) rompt les ponts disulfures. Dans le cas de protéines polymériques, les différentes chaînes polypeptidiques (sous-unités) sont dissociées. - Le SDS (dodécyl sulfated sodium) est un détergent ionisé qui se fixe aux protéines. Les protéines sont alors recouvertes par les charges négatives du SDS, leur propre charge nette est masquée. Dénaturées et uniformément chargées négativement par le SDS, les protéines migrent vers l anode (borne +) uniquement en fonction de leur masse, donc de la longueur de leur chaîne polypeptidique. On ne sépare pas les protéines en fonction de leur charge. Protéine polymérique : - plusieurs chaînes identiques (AA) même bande - plusieurs chaînes différentes (masse différente : AB) plusieurs bandes. BILAN : L électrophorèse sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDSpage) sépare les protéines en fonction de leur masse moléculaire (les petites migrent le plus) 14

15 Analyse de résultats d électrophorèse de protéines du blanc d œuf sur gel de polyacrylamide en conditions dénaturantes (SDS-page) Dépôts 1 : Ovalbumine pure 2 mg 2 : Lysosyme 2 mg 3 : Ovalbumine non purifiée 5 mg 4 : Protéines marqueurs de PM 1,5 mg/bande 5 : Myoglobine 2 mg 6 : Blanc d oeuf frais 5 mg 7 : Blanc d oeuf frais prélevé à proximité du jaune 2 mg 8 : Protéines marqueurs de PM 1,5 mg/bande 9 : Blanc d oeuf vieux 5 mg 10:Blanc d oeuf vieux prélevé à proximité du jaune 5 mg 1. Quelle différence constatez-vous en comparant les deux gels portant les mêmes protéines mais de concentration en acrylamide différente? Quel est l intérêt de chaque type de gel? 2. Tracez sur le papier semi-log, dans le cas du gel à 13%, le graphique représentant : poids moléculaire des protéines marqueurs = f(distance de migration). Sur du papier millimétré normal, il faudrait calculer alors le log du poids moléculaire des protéines marqueurs et représenter log PM = f(distance de migration). 3. Quel est le PM des protéines a, b et c du blanc d œuf? 15

16 4. À l aide des électrophorèses et du tableau ci-dessous, identifiez les protéines du blanc d œuf. 5. Comparez le blanc d œuf frais et le blanc d œuf vieux. La position du prélèvement (près ou loin du jaune) a-t-elle une importance? Exercice : Détermination du poids moléculaire de chaînes polypeptidiques sur un gel d'électrophorèse SDS-page. La première et la dernière piste sont les pistes des marqueurs de poids moléculaires. 1. À l'aide des pistes de marqueurs de poids moléculaire, tracer la courbe log (poids moléculaire en kda) = f (distance de migration) sur papier millimétré (classique). On prendra le trait indiqué comme repère de début de migration, et la photo comme image de la taille réelle du gel. 2. Déterminer à partir de cette courbe la taille des protéines ayant migré dans les profils A, B, C et D. 3. Sachant que chaque échantillon analysé est une préparation d'un anticorps purifié, expliquer l'origine des deux bandes observées, et expliquer les différences de tailles observées entre les bandes de petite taille 16

17 TPBC3 : chromatographie/électrophorèse BCPST1, ENCPB C. L électrophorèse de protéines bidimensionnelle sépare les protéines selon leur charge puis selon leur masse moléculaire 1ère dimension : séparation des protéines en fonction de leur charge par focalisation isoélectrique Pour toute protéine, il existe un ph isoélectrique (phi), ph pour lequel la protéine est électriquement neutre et ne se déplace pas dans un champ électrique (la conductivité de la protéine est nulle : γ = 0). Dans la focalisation isoélectrique, les protéines (à l état natif, non dénaturées) migrent dans un tube étroit de gel de polyacrylamide dans lequel il est établi un gradient de ph grâce à un mélange de tampons spéciaux. Chaque protéine migre dans le gradient de ph jusqu à un point qui correspond à son ph isoélectrique et elle se stabilise à ce niveau. 2ème dimension : séparation des protéines en fonction de leur masse moléculaire par électrophorèse sur gel de polyacrylamide en SDS-page (conditions dénaturantes) BILAN : l électrophorèse bidimensionnelle sépare des protéines en fonction de leur charge puis de leur masse moléculaire. 17

18 D. Le western blot : électrophorèse de protéines suivie de la recherche d une protéine X par un anticorps anti-protéine X Le Western blot est une technique complémentaire de l'électrophorèse des protéines. Après migration dans un gel de polyacrylamide, les protéines sont transférées sur une membrane, qui est alors l'exacte réplique du gel de polyacrylamide après migration. La présence d une protéine particulière est ensuite révélée par réaction avec un anticorps se liant spécifiquement à la protéine recherchée. L'anticorps est marqué par un fluorochrome, par un isotope radioactif, ou lié à une enzyme dont la réaction avec son substrat produit une substance colorée. 18

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