Validation des épreuves sérologiques pour le diagnostic des maladies infectieuses

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1 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 1998,17 (2), Validation des épreuves sérologiques pour le diagnostic des maladies infectieuses R.H. Jacobson Diagnostic Laboratory, College of Veterinary Medicine, Cornell University, Ithaca, NY , États-Unis d'amérique Résumé La validation d'une épreuve consiste en un série de procédures liées entre elles : - une procédure expérimentale : les réactifs et protocoles sont optimisés par expérimentation pour détecter avec exactitude et précision l'analyte et s'assurer de la capacité à la réitération et de la reproductibilité de l'épreuve ; - une procédure comparative : la sensibilité et la spécificité diagnostiques de l'épreuve sont calculées par rapport aux résultats de tests obtenus à partir de populations animales de référence dont le statut infection/exposition est connu ; - une procédure relative : la répartition entre animaux infectés et non infectés dans la population cible est reliée à la représentativité de la population animale de référence utilisée pour valider l'épreuve (l'exactitude des prévisions sur le statut infectieux des animaux, établies d'après les résultats du test, et les valeurs prédictives des résultats de test positifs et négatifs sont fonction de la prévalence estimée de la maladie/infection dans la population cible) ; - une procédure graduelle : la confiance dans la validité d'une épreuve augmente avec le temps au fur et à mesure que l'usage confirme sa robustesse, telle que démontrée par l'exactitude et la précision des résultats (la validité de l'épreuve peut également aller en se renforçant au fur et à mesure de son actualisation et de son extension par addition de populations de référence dont la situation sanitaire est connue) ; - une procédure continue : l'épreuve ne demeure valable que dans la mesure où elle continue de fournir des résultats exacts et précis, attestés par vérification statistique. Dès lors, la validation des épreuves de diagnostic pour les maladies infectieuses ne se résume pas à un série limitée dans le temps d'expériences basées sur quelques échantillons de référence. Il s'agit plutôt d'un processus qui implique une surveillance et un suivi constants ainsi qu'une réévaluation de leurs caractéristiques de performance pour chaque population animale à laquelle ces épreuves s'appliquent. La tendance actuelle visant à développer et mettre en œuvre des critères d'accréditation des laboratoires vétérinaires de diagnostic ne présente guère d'intérêt si l'on n'a pas l'assurance que les épreuves réalisées dans ces établissements ne sont pas correctement validées. Des laboratoires parfaitement accrédités peuvent générer des résultats de test d'une très grande reproductibilité, mais ceux-ci peuvent se traduire par un classement erroné des animaux selon leur statut infectieux en raison d'une mauvaise procédure de validation de l'épreuve. Dès lors, la validation des épreuves revêt une importance fondamentale pour la plupart des analyses des laboratoires vétérinaires de diagnostic - les résultats de tests et leur interprétation. Mots-clés Épreuves - Évaluation - Laboratoires - Maladies infectieuses - Normalisation - Santé animale - Sérologie -Techniques diagnostiques - Validation des épreuves.

2 488 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2) Introduction En quoi consìste une «épreuve validée»? Une épreuve sérologique est considérée comme validée lorsqu'elle produit des résultats de test discernant la présence ou l'absence d'une substance dans le sérum à un niveau déterminé de confiance statistique. Des déductions à partir des résultats de l'essai peuvent alors être faites sur le statut des animaux au regard de l'infection. Entre autres substances pouvant être décelées dans le sérum, on trouve des anticorps (polyclonaux ou isotypes), des organismes, des antigènes (complexes ou quelques épitopes), des acides nucléiques et des composés non antigéniques ; ces substances sont collectivement désignées par le terme «analytes». Lorsqu'on essaie de valider soigneusement une épreuve sérologique pour une maladie infectieuse, on s'aperçoit rapidement que les critères spécifiques requis pour la validation de l'épreuve sont plutôt flous et que la procédure de validation de l'épreuve n'est pas standardisée. Avant le démarrage de la validation, il faut choisir une méthode pour cibler une composante spécifique de l'échantillon ayant une pertinence diagnostique particulière. Or pour choisir une méthode, il faut la connaître parfaitement bien, comprendre la relation entre l'agent infectieux et la réponse immunitaire de l'hôte et disposer de quelques éléments préliminaires fournis par des études pilotes et prouvant que la méthode peut réussir. Il faut sélectionner avec soin la méthode appropriée pour obtenir une épreuve validée. Il suffit de considérer les paramètres pouvant affecter les performances d'une épreuve pour connaître les critères essentiels dans le processus de validation. Ces paramètres peuvent être classés en trois catégories : - l'échantillon : les interactions hôte/organisme modifiant la composition de l'analyte et la concentration dans réchantillon de sérum ; - l'essai : des facteurs liés au technicien ou des variables physiques, chimiques, biologiques peuvent compromettre la capacité de l'épreuve à détecter un analyte spécifique dans l'échantillon ; - le résultat du test : la capacité d'un résultat de test, découlant de l'épreuve, à prévoir avec exactitude le statut de l'hôte par rapport à l'analyte concerné. Les facteurs affectant la concentration et la composition de l'analyte dans l'échantillon de sérum sont essentiellement imputables à l'hôte et sont, soit inhérents (par exemple : âge, sexe, race, statut nutritionnel, gestation, réponse immunitaire) soit acquis (par exemple : immunité passive, immunité active obtenue par vaccination ou infection). Les facteurs non liés à l'hôte, tels que la contamination ou la détérioration de l'échantillon peuvent également avoir une incidence sur l'analyte de l'échantillon. Les facteurs susceptibles d'affecter l'exactitude analytique de l'épreuve peuvent provenir des instruments utilisés ou d'une erreur du technicien, du choix du réactif et de l'étalonnage, des contenants de la réaction, de la qualité de l'eau, du ph et de l'ionisation des solutions tampons et diluants, des températures et durées d'incubation, ainsi que d'erreurs introduites par la détection d'analytes étroitement apparentés tels que des anticorps qui croisent avec différents agents pathogènes ou micro-organismes, du facteur rhumatoïde ou d'anticorps hétérophiles. Les facteurs qui déterminent la capacité du résultat du test à permettre de tirer des conclusions précises sur l'infection de l'hôte ou le statut de l'analyte chez cet hôte sont la sensibilité diagnostique, la spécificité diagnostique et la prévalence de la maladie au sein de la population ciblée par l'épreuve. Dans cet article, les termes «positif» et «négatif» ont été réservés aux résultats des tests ; ils ne font jamais référence à l'infection ou au statut anticorps/antigène de l'hôte. Chaque fois qu'il est fait allusion aux mots «infection» ou «analyte», il est entendu que tout mode d'exposition à un agent infectieux peut être détecté par une méthode directe (par exemple, antigène) ou indirecte (par exemple, anticorps). La sensibilité et la spécificité diagnostiques découlent des résultats de tests effectués sur des échantillons obtenus à partir d'animaux de référence sélectionnés. Le degré de représentativité des animaux de référence pour toutes les variables liées à l'hôte ou à l'environnement dans la population ciblée par l'épreuve a une incidence majeure sur l'exactitude de l'interprétation des résultats du test. Par exemple, les diagnostiqueurs avertis savent qu'une épreuve validée à partir d'échantillons provenant de bovins du nord de l'europe, risque de ne pas donner des résultats valables pour différentes populations de bovidés en Afrique. La capacité d'un résultat de test positif ou négatif à prévoir le statut infectieux de l'animal est un objectif majeur de la validation de l'épreuve. Cette capacité ne dépend pas seulement de la précision et de l'exactitude extrêmes de l'épreuve et d'estimations déduites avec soin de la sensibilité et de la spécificité diagnostiques, mais aussi et surtout de la prévalence de l'infection dans la population ciblée. Sans une estimation actuelle de la prévalence de la maladie étudiée au sein de cette population, l'interprétation d'un résultat de test positif ou négatif sera compromise. Nombre de variables doivent, à l'évidence, être prises en compte avant qu'une épreuve ne puisse être considérée comme «validée». Cependant, la question reste posée de savoir si la validation d'une épreuve est un processus limité dans le temps pendant lequel seuls les facteurs intrinsèques de l'épreuve sont optimisés et normalisés, ou si elle doit impliquer une évaluation continue des performances de l'épreuve pendant toute la durée d'utilisation de celle-ci. Aussi l'expression «épreuve validée» donne-t-elle lieu à des interprétations diverses selon les diagnostiqueurs de

3 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz, 17 (2) 489 laboratoires et cliniciens vétérinaires. Nous donnerons donc une définition pratique de la validation d'une épreuve, applicable aux méthodes décrites ci-après. Validation d'une épreuve : définition Une épreuve validée fournit avec régularité des résultats de tests permettant d'identifier des animaux comme positifs ou négatifs d'après un analyte ou un procédé (par exemple : anticorps, antigène ou induration à l'endroit du test cutané) et, par déduction, de prévoir avec précision le statut infectieux des animaux avec un degré prédéterminé de certitude statistique. Le présent article met l'accent sur les principes qui sous-tendent le développement et la pérennité d'une épreuve validée. La procédure de validation d'une épreuve Le développement et la validation d'une épreuve est une procédure graduelle qui comporte deux parties. La première consiste à établir les paramètres et caractéristiques de l'épreuve, comme suit : a) détermination de la faisabilité de la méthode, b) développement de l'épreuve par le choix, l'optimisation et la standardisation des réactifs et protocoles, c) détermination des caractéristiques d'exécution de l'épreuve. La deuxième partie de la procédure, destinée à garantir la validité constante des résultats du test et à améliorer les critères de validation de l'épreuve, s'effectue de la manière suivante : a) surveillance continue des performances de l'épreuve pour s'assurer que le statut d'«épreuve validée» est justifié, b) suivi et amélioration des critères de validation dans le cadre d'une utilisation de l'épreuve en routine (Fig. 1) (12). Bien que l'intérêt de la deuxième partie soit contesté par certains scientifiques, nous l'avons incluse ici car une épreuve ne peut être considérée comme valable que dans la mesure où les résultats de test sont eux-mêmes valables, c'est-à-dire lorsqu'ils se situent dans des limites statistiquement définies et permettent de faire des déductions sur l'infection ou le statut d'un animal vis-à-vis d'un antigène. Pour illustrer les principes de la validation d'une épreuve, nous prendrons pour exemple un test immuno-enzymatique (enzyme-linked immunosorbent assay : ELISA) indirect appliqué à la détection d'anticorps. Ce type d'épreuve peut s'avérer difficile à valider en raison de l'amplification du signal des composants spécifiques et non spécifiques. Cela permet de passer en revue les problèmes qui se posent lors d'une procédure de validation d'épreuve sérologique. La validation d'autres épreuves, simples ou complexes, s'effectue selon les mêmes principes. La procédure de validation d'une épreuve relève de la responsabilité des chercheurs et diagnostiqueurs. Le développement initial et l'optimisation d'une épreuve par un chercheur peut nécessiter une caractérisation plus approfondie des performances de l'épreuve par des diagnostiqueurs de laboratoire avant sa mise en œuvre. Le laboratoire qui fournit des résultats de test doit s'assurer, à partir de la documentation existante ou des recherches effectuées dans ce même laboratoire, que l'épreuve est valable ; il doit également veiller à ce que les résultats des tests soient déduits d'une épreuve validée. Première partie de la procédure : établir les paramètres et caractériser les performances de l'épreuve Études de faisabilité On commence par effectuer des études de faisabilité pour savoir si les réactifs et protocoles sélectionnés peuvent discerner plusieurs concentrations d'anticorps d'un agent infectieux tout en présentant un bruit de fond minimal. Ces études fournissent également des estimations initiales de capacité à la réitération, de sensibilité et de spécificité analytiques. Échantillons destinés aux études de faisabilité : sérums de contrôle Il convient de sélectionner quatre à cinq échantillons (de sérum dans notre exemple) allant des titres les plus élevés d'anticorps vis-à-vis de l'agent infectieux concerné aux titres les plus faibles, ainsi qu'un échantillon exempt de tout anticorps. Ces prélèvements permettront d'optimiser les réactifs et protocoles de l'épreuve et serviront, ensuite, de sérums de contrôle lors de la réalisation de l'épreuve en routine. Les échantillons doivent idéalement représenter des animaux infectés et non infectés connus provenant de la population qui deviendra la cible de l'épreuve validée. Les prélèvements proviennent, de préférence, d'animaux distincts mais ils peuvent également être composés par des groupes de sérums (pools) provenant de plusieurs animaux. Le mieux est de préparer une grande quantité (par exemple : 10 ml) de chaque échantillon et de la répartir en parties aliquotes de 0,1 ml pour stockage à - 20 C. Une fraction aliquote de chaque est décongelée, utilisée pour les expériences et conservée à 4 C entre les expériences, puis détruite. Une autre est alors mise à décongeler pour une autre expérimentation. On travaille ainsi à partir de la même source

4 490 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2 Première partie Phase 1 Faisabilité Phase 2 Développement et standardisation Phase 3 Caractérisation des performances de l'épreuve Deuxième partie Phase 4 Surveillance des performances pour le maintien du statut d'épreuve validée Phase 5 Maintien et extension des critères de validation Fig. 1 Les cinq phases de la procédure graduelle de validation d'une épreuve Les cases ombrées indiquent les points d'action à chaque phase de la procédure de sérums et avec le même nombre de cycles de congélation/décongélation pour toutes les expériences (une congélation et une décongélation répétées de.sérum risquent de dénaturer les anticorps). De même, la variation est moins grande lorsque l'opérateur utilise des sérums identiques pour toutes les expériences au lieu de passer d'un sérum à l'autre entre les diverses expériences. Cette méthode présente, en outre, l'avantage de générer un ensemble d'informations pour les prélèvements soumis à des essais répétés. Lorsque les premières phases de la validation de l'épreuve sont terminées, un ou plusieurs prélèvements peuvent devenir un ou des sérums de contrôle et servir de base pour l'expression de données et l'évaluation de la capacité à la réitération dans le cadre d'un même passage ou de passages différents de l'épreuve. Ils peuvent également servir de sérums de référence si leur activité a été prédéterminée ; de tels sérums de référence offrent la garantie que les essais en série fournissent des données exactes (21). Choix de la méthode pour obtenir des résultats de test normalisés La normalisation consiste à ajuster les résultats du test brut de tous les échantillons par rapport aux valeurs des prélèvements de contrôle inclus dans chaque réalisation de l'épreuve (à ne pas confondre avec la transformation des données pour obtenir une distribution [de Gauss] «normale»). En général, la méthode de normalisation et d'expression des données doit être choisie au plus tard à la fin des études de faisabilité. Les comparaisons de résultats d'un jour sur l'autre et entre laboratoires sont plus exactes lorsqu'on utilise des données normalisées. Par exemple, dans les systèmes ELISA, les valeurs relatives à la densité optique brute (absorbance) sont des

5 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2) 491 mesures absolues pouvant être influencées par la température ambiante, les paramètres du test et l'appareillage photométrique. Pour tenir compte de cette variabilité, les résultats sont exprimés comme étant une fonction de la réactivité d'un ou de plusieurs sérums de contrôle inclus dans chaque test réalisé. Ces données sont dites normalisées ou indexées sur les échantillons de contrôle. Pour normaliser les données dans l'épreuve ELISA indirecte, on exprime les valeurs d'absorbance d'une ou de plusieurs façons (21). Une méthode simple et utile consiste à exprimer toutes les valeurs de densité optique en pourcentage d'un sérum de contrôle positif unique, inclus dans chaque plaque. Cette méthode convient pour la plupart des applications. Il existe une méthode plus rigoureuse qui consiste à calculer les résultats à partir d'une courbe standard générée par plusieurs sérums de contrôle. Elle nécessite un algorithme plus sophistiqué tel que la régression linéaire ou une analyse «log-logit» (20). Il s'agit là d'une approche plus précise dans la mesure où elle ne repose pas sur un prélèvement unique de contrôle pour la normalisation des données, mais sur plusieurs prélèvements, ajustés en fonction des valeurs attendues, pour tracer une courbe standard à partir de laquelle la valeur de l'échantillon est extrapolée. Elle permet également d'exclure une valeur de contrôle pouvant se trouver en dehors des limites de l'intervalle de confiance déterminé lors du tracé de la courbe standard. Pour des épreuves telles que la neutralisation virale avec titrage en dilution limite du prélèvement, chaque passage de l'épreuve est accepté ou rejeté selon que les valeurs de référence se situent ou non dans les limites préétablies. Comme les valeurs du prélèvement ne sont habituellement pas ajustées en fonction d'une valeur de référence, les données ne sont pas normalisées au sens strict du terme. Quelle que soit la méthode utilisée pour la normalisation des données, il est essentiel de prévoir des échantillons de contrôle supplémentaires pour un réactif pouvant introduire une variabilité et, partant, compromettre les efforts visant à obtenir une épreuve validée. Les valeurs normalisées de ces échantillons de contrôle doivent se situer dans les limites prédéterminées (par exemple : écart type de ± 2 ou ± 3 par rapport à la moyenne d'un grand nombre de passages de chaque échantillon de contrôle). Développement et standardisation Détermination des concentrations de réactifs et paramètres de protocole optimaux Le développement de l'épreuve fait suite à plusieurs études pilotes indiquant que la méthode est prometteuse. La première étape consiste à optimiser les concentrations/ dilutions de l'antigène adsorbé par la plaque, du sérum, de l'ensemble conjugué enzyme-anticorps et de la solution du substrat. Ces différents paramètres sont déterminés au moyen d'un titrage en échiquier pour chaque réactif par rapport à tous les autres réactifs après confirmation du meilleur choix du contenant de la réaction (on évalue habituellement deux ou trois types de microplaques, chacune avec ses caractéristiques de fixation uniques afin de réduire au minimum le bruit de fond et d'obtenir la fourchette la plus large possible de titres d'anticorps, allant des échantillons négatifs aux échantillons fortement positifs). Des expériences complémentaires permettent de déterminer les variables temporelles optimales, chimiques et physiques du protocole, y compris les températures et durées d'incubation ; le type, le ph et la molarité du diluant, les tampons de lavage et de saturation ainsi que le matériel utilisé à chaque étape de l'épreuve (par exemple, les pipettes et laveur conférant la meilleure reproductibilité). La littérature abonde en articles et monographies indiquant en détail les réactifs et protocoles disponibles pour la réalisation d'épreuves (pour le test ELISA, voir 2, 9, 20). L'optimisation des réactifs et protocoles doit comprendre une évaluation de la justesse par inclusion d'un ou de plusieurs sérums de référence présentant un niveau connu d'activité pour l'analyte en question. Une épreuve optimisée qui obtient, à plusieurs reprises, les mêmes résultats pour un sérum de référence et des sérums de contrôle peut être qualifiée d'«épreuve standardisée». Capacité à la réitération : estimations préliminaires Une mise en évidence préliminaire de la capacité à la réitération (accord entre des échantillons analysés en parallèle lors d'un même test ou de la répétition de différents tests) est indispensable pour justifier un développement ultérieur de l'épreuve. Pour ce faire, on évalue les résultats de tous les échantillons et de leur réplique dans une même plaque (variation intraplaque) et dans des plaques différentes (variation interplaques) au cours d'une même série de tests ou de séries différentes. Pour l'épreuve ELISA, on a normalement recours, à ce stade de la validation, à des valeurs d'absorbance brutes, car on ignore si les résultats du sérum de contrôle nettement positif, pouvant être utilisés pour calculer des valeurs normalisées, sont reproductibles dès les premières étapes de l'épreuve. Par ailleurs, les valeurs moyennes provenant d'essais répétés sur chaque échantillon de contrôle (valeurs attendues pour les échantillons de contrôle) peuvent ne pas avoir été établies. Trois à quatre répliques de chaque échantillon de contrôle traitées dans, au moins, cinq plaques en cinq occasions distinctes suffisent pour fournir des estimations préliminaires de la réitération. Des coefficients de variation (écart type des répliques divisé par la moyenne des répliques), généralement inférieurs à 20 % pour les valeurs d'absorbance brutes, indiquent une capacité à la réitération adéquate à ce stade du développement de l'épreuve. Toutefois, si la plupart des échantillons, lors d'un même passage ou de passages différents de l'épreuve, dorment des signes évidents de variation excessive (> 30 %), des études préliminaires supplémentaires doivent être effectuées pour savoir si une stabilisation de l'épreuve est possible ou si ce

6 492 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2 type de test doit être abandonné. Il s'agit là d'un point important car une épreuve dont la variabilité inhérente est importante risque fort de ne pas résister à des tests quotidiens sur des prélèvements issus de la population animale cible. Détermination de la sensibilité et de la spécificité analytiques La sensibilité analytique d'une épreuve désigne la quantité minimale d'analyte pouvant être décelée ; la spécificité analytique désigne l'aptitude de l'épreuve à ne pas présenter de réaction croisée avec d'autres analytes. Ces paramètres sont à distinguer de la sensibilité et de la spécificité diagnostiques que nous définissons ci-après. La sensibilité analytique relative de l'épreuve ELISA par rapport à l'immunofluorescence indirecte peut être évaluée, par exemple, par analyse de la dilution limite qui indique la dilution du sérum dans laquelle on ne détecte plus d'anticorps. Une estimation quantitative de la sensibilité analytique peut être effectuée par une dilution limite d'un échantillon à la concentration connue d'anticorps (mg/ml). Pour évaluer la spécificité analytique on a recours à une série de sérums provenant d'animaux qui ont eu des infections apparentées susceptibles de stimuler des anticorps à réaction croisée. Si l'épreuve ne détecte pas d'anticorps pour des dilutions extrêmes de sérum avec la même efficacité que pour d'autres épreuves, ou si une réactivité croisée avec des anticorps provenant d'agents étroitement apparentés est fréquemment observée, les réactifs doivent être réétalonnés, remplacés ou l'épreuve doit être abandonnée. Importance de la batterie de sérums de référence pour le calcul de la sensibilité et de la spécificité diagnostiques En théorie, le nombre d'échantillons de référence provenant d'animaux au statut infection/exposition connu peut être déterminé, pour le calcul de la sensibilité et de la spécificité diagnostiques, dans des limites statistiquement définies (5). Il convient tout d'abord de faire quelques hypothèses et de retenir des estimations de performances modestes de l'ordre de 92 % pour la sensibilité diagnostique et de 90 % pour la spécificité diagnostique. Il est en effet préférable de sous-estimer les performances d'une épreuve plutôt que de les surestimer, car le nombre d'échantillons de référence nécessaire est inversement proportionnel aux estimations de sensibilité et de spécificité diagnostiques (dans la mesure où ces estimations ne tombent pas en dessous de 50 %). Ainsi, des estimations élevées de ces paramètres induiront des erreurs dans le calcul de la taille des échantillons. Les calculs suivants supposent que les animaux de référence, d'où proviennent les échantillons de sérum, constituent un échantillon aléatoire d'animaux connus comme infectés ou non infectés au sein de la population cible. Nombre d'animaux de référence infectés requis Le nombre d'animaux de référence infectés requis pour aboutir à une sensibilité diagnostique anticipée (± erreur admissible) peut être établi approximativement par la formule suivante : Déterminer les caractéristiques de performance de l'épreuve Sensibilité et spécificité diagnostiques Les estimations de sensibilité et de spécificité diagnostiques figurent parmi les principaux paramètres obtenus au cours de la validation d'une épreuve. Elles constituent une base pour le calcul d'autres paramètres permettant de réaliser des déductions à partir des résultats du test. Idéalement, elles doivent découler de tests effectués sur une série d'échantillons de référence provenant d'animaux de référence dont l'historique et le statut infectieux sont connus pour la maladie ou l'infection concernée. La sensibilité diagnostique désigne le pourcentage d'animaux de référence infectés connus, ayant donné des résultats positifs lors de l'épreuve ; les résultats négatifs chez les animaux infectés sont considérés comme de faux négatifs. La spécificité diagnostique désigne le pourcentage d'animaux de référence non infectés donnant des résultats négatifs lors de l'épreuve ; les résultats positifs observés chez les animaux de référence non infectés sont considérés comme de faux positifs. Le nombre et la source des échantillons de référence utilisés pour déduire le niveau de sensibilité et de spécificité diagnostiques sont de la plus haute importance pour une bonne validation de l'épreuve. où n est le nombre d'animaux infectés connus, Dsn, la sensibilité diagnostique dans les conditions extrêmes (c'est-à-dire le pourcentage attendu d'animaux infectés dans la population cible qui donneront des résultats de test positifs), e le pourcentage d'erreur (exprimé comme une décimale) admis lors de l'estimation de la sensibilité diagnostique et c l'intervalle de confiance de l'estimation (données modifiées du Manual of standards for diagnostic tests and vaccines de l'oie [12]). Pour une sensibilité diagnostique de 92 % (± 2 % d'erreur admise), avec un pourcentage de confiance de 95 (1,96 correspondant à un écart type de ± 2) pour obtenir une estimation correcte, le nombre théorique des animaux requis est : Le Tableau I se fonde sur cette formule pour fournir le nombre théorique d'animaux de référence requis pour plusieurs estimations de la sensibilité et de la spécificité diagnostiques pour divers intervalles de confiance, avec une erreur de 2 % acceptée pour les estimations. Lorsqu'un niveau d'erreur différent est autorisé pour les estimations de sensibilité et de spécificité diagnostiques, le nombre

7 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2) 493 Tableau I Nombre théorique d'échantillons provenant d'animaux au statut infectieux connu requis pour valider une épreuve Sensibilité ou spécifie :ité diagnostiques estimées (%) 75% (1,0694) 80% (1,2814) Niveaux de confiance 85% (1,4532) 90% (1,6462) 95% (1,9599) 99% (2,5758) 80% % % % % % % % % % % % % Pourcentage d'erreur autorisé dans l'estimation de la sensibilité ou de la spécificité diagnostiques = 0,02. Pour calculer le nombre d'échantillons requis pour une erreur admissible de 0,01, multiplier le nombre d'échantillons du tableau par un facteur de 4 ; pour une erreur de 0,03, par un facteur de 0,444 ; pour une erreur de 0,04, par un facteur de 0,25 ; pour une erreur de 0,05, multiplier par un facteur de 0, d'échantillons figurant dans le corps du tableau peut être multiplié par l'un des facteurs indiqués dans la note du Tableau I. Par exemple, au lieu de 707 échantillons requis à un intervalle de confiance de 95 %, pour une sensibilité diagnostique de 92 % avec une erreur de 0,02, si l'erreur acceptable est de 0,04, le nombre d'échantillons requis sera de 177 (707 x 0,25). La sélection de 707 animaux infectés peut s'avérer appropriée pour obtenir des estimations raisonnables de sensibilité et de spécificité diagnostiques à condition que l'échantillonnage soit soigneusement préparé de manière à inclure autant de variables que possible, susceptibles d'avoir une incidence sur la production d'anticorps. Entre autres exemples de ces variables, citons la race, l'âge, le sexe, le statut nutritionnel, la gestation, le stade de l'infection, les réactions (différentes selon l'animal) aux agents infectieux et les réactions différentes de chaque hôte pour des infections chroniques et suraiguës. De plus, les anticorps vis-à-vis d'agents infectieux étroitement apparentés peuvent susciter des réactions croisées lors de l'épreuve ; si ces agents apparaissent seulement dans une partie de la population totale ciblée par l'épreuve, mais ne sont pas représentés dans la batterie de sérums de référence, les estimations de sensibilité et de spécificité diagnostiques seront erronées. Il est donc souhaitable de porter le nombre des échantillons provenant d'animaux de référence infectés à environ. Même si ce nombre de sérums peut être difficile à obtenir, il doit constituer le but final comme indiqué ci-dessous. Porter la sensibilité diagnostique attendue du nouveau test à 99 % reviendrait à abaisser le nombre théorique d'animaux requis à 95 à peine (Tableau I, voir niveau de confiance de 95 %). Or cette estimation est incorrecte dans la mesure où il est impossible de représenter intégralement toutes les variables pouvant exister dans une population cible de 25 millions d'animaux, par exemple, en utilisant des échantillons provenant de 95 animaux seulement, même si ceux-ci appartiennent à la population cible. Ces calculs relatifs au nombre d'échantillons supposent une distribution normale de valeurs pour un nombre indéterminé de variables continues pouvant affecter la production d'anticorps dans la population cible. Comme il est peu probable que les hypothèses de normalité soient vraies dans de telles circonstances, surtout lorsque l'importance des échantillons est faible, il est recommandé de tester un minimum de 300 échantillons pour renforcer la confiance dans les estimations de sensibilité et de spécificité diagnostiques. Nombre d'animaux de référence non infectés requis Comme il s'agit d'estimer des taux, on peut théoriquement appliquer la même formule au calcul du nombre d'animaux de référence non infectés connus pour estimer la spécificité diagnostique (taux des résultats négatifs parmi les animaux non infectés connus) de la nouvelle épreuve. Là encore, le taux recherché (la spécificité diagnostique dans ce cas) est inversement proportionnel au nombre d'échantillons requis pour obtenir une estimation précise de cette spécificité diagnostique. Dès lors, bien que l'on souhaite en général une spécificité diagnostique élevée pour réduire au minimum les faux positifs dans la population cible, il convient là aussi de choisir une estimation faible de spécificité diagnostique plutôt. qu'une estimation élevée pour l'essai validé résultant. Une estimation basse permettra d'obtenir un nombre suffisant d'échantillons prélevés sur des animaux non infectés pour permettre une estimation suffisante de la spécificité diagnostique, s'il s'avère nécessaire d'affecter une sensibilité

8 494 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz.. 17 (2) diagnostique élevée à l'épreuve (avec réduction proportionnelle de la spécificité). Si nous estimons que la nouvelle épreuve présentera une spécificité diagnostique de 90 %, le nombre calculé d'animaux requis est de 864 (pour un niveau de confiance de 95 %). Beaucoup plus de variables biologiques peuvent entraîner des résultats faussement positifs (par exemple : anticorps à réaction croisée de nombreux autres agents) plutôt que des faux négatifs (face à la plupart des agents pathogènes, et non à la totalité, les animaux développent en général des réponses immunitaires et ne donnent pas, par conséquent, de faux négatifs). Il faut donc tenir compte de cette augmentation probable de la variance pouvant affecter les estimations de la spécificité diagnostique. Autrement dit, ce serait certainement très louable de vouloir tester de à animaux non infectés connus pour garantir un niveau de confiance très élevé dans les estimations de la spécificité diagnostique. Force est, cependant, de reconnaître qu'un tel nombre d'animaux de référence peut s'avérer irréaliste (voir plus loin la section intitulée «Sources alternatives et nombre de sérums de référence» pour la solution de ce problème). Utilisation envisagée de l'épreuve : les conséquences sur le nombre d'échantillons requis L'utilisation envisagée de l'épreuve peut avoir une incidence sur les décisions quant au nombre d'échantillons requis pour établir la sensibilité et la spécificité diagnostiques de la nouvelle épreuve. Les méthodes pour l'établissement des caractéristiques du test seront différentes selon qu'il s'agit d'épreuves de criblage, de confirmation ou de diagnostic «polyvalentes». Lorsqu'une épreuve de criblage est nécessaire pour la recherche d'une maladie gravissime telle que la fièvre aphteuse, il est impératif de réduire la probabilité que des animaux infectés soient classés à tort parmi les non infectés. En conséquence, le pourcentage d'erreur admise lors de l'estimation de la sensibilité diagnostique (e dans la formule ci-dessus) doit être réduit au minimum. En revanche, lorsqu'une épreuve est conçue pour une maladie moins grave, on retiendra une spécificité diagnostique élevée, avec augmentation proportionnelle du nombre de faux négatifs ; cela permettra de réduire la probabilité que des animaux non infectés soient classés parmi les animaux infectés. Afin d'optimiser la spécificité diagnostique de l'épreuve, un nombre important d'animaux de référence non infectés doit être évalué pour minimiser les erreurs d'échantillonnage. Les épreuves présentant une spécificité élevée sont souvent utilisées à des fins de confirmation. Une épreuve de diagnostic universelle risque de placer le point limite au centre de la fourchette faux positifs-faux négatifs (voir «Sélection d'un seuil de coupure [seuil positif-négatif]» ci-dessous). Si Si l'épreuve doit être appliquée avec des sérums d'animaux vaccinés, des estimations séparées de la spécificité et de la sensibilité diagnostiques peuvent être nécessaires pour les animaux vaccinés et non vaccinés, de manière à traduire correctement l'incidence de la vaccination sur l'interprétation du test. Sources alternatives et nombre de sérums de référence Il est très difficile, sinon impossible, de trouver un grand nombre d'animaux reconnus comme non infectés dans la population cible si la maladie/infection est endémique ou si la vaccination n'est pas répandue. Dès lors, il faut commencer à la phase 3 (Fig. 1) de la procédure de validation avec de petites batteries de sérums. Lorsque l'épreuve fait l'objet d'une utilisation courante, il faut disposer de données de confirmation chaque fois que possible pour mettre à jour les estimations de la sensibilité et de la spécificité diagnostiques. L'épreuve risque fort de ne pas être exacte lorsqu'un petit nombre seulement d'animaux de référence servent de base à la validation. Dans certains cas, il convient de commencer les études de validation en recourant à des animaux situés dans un région géographique distincte, où l'infection concernée n'existe pas. La réunion d'une batterie de sérums provenant d'animaux reconnus infectés peut être tout aussi difficile. Inévitablement, ces animaux de référence proviennent d'une région éloignée géographiquement de la population cible, voire même d'un autre continent. Les résultats des tests réalisés sur ces animaux servent uniquement de point de départ à l'établissement des estimations de sensibilité et de spécificité diagnostiques pour la population cible. Comme les prélèvements issus de la population cible sont par la suite testés et que plusieurs milliers de résultats sont obtenus, il est alors possible d'estimer un seuil raisonnable pour l'épreuve grâce à de nouvelles techniques statistiques telles que l'analyse du mélange et l'analyse typologique (3). Cette méthodologie est discutée dans la section intitulée «Seuil de coupure intrinsèque établi lorsqu'aucun animal de référence n'est disponible», ci-après. Méthodes de comparaison : une base pour la définition de certaines caractéristiques de performances de l'épreuve En sérologie, l'expression «méthode de référence» a trait aux résultats d'une méthode ou d'une combinaison de méthodes prises en considération pour classer les animaux en sujets infectés et non infectés. Elle peut également faire allusion à une méthode qui classe les échantillons en positifs ou négatifs, telle qu'un autre système d'épreuve sérologique. En conséquence, la méthode dite «de référence» ou «normalisée» revêt des connotations diverses et peut ne pas être aussi parfaite que l'expression le laisse entendre. En effet, les résultats de la méthode de référence peuvent prêter à équivoque par rapport au statut infectieux de l'animal. Dès lors, nous remplacerons ci-après l'expression «méthode normalisée» par plusieurs «méthodes de comparaison» qui serviront à définir certaines caractéristiques de performance de la nouvelle épreuve. Les résultats de la nouvelle épreuve sont considérés comme corrects ou incorrects d'après la «méthode de comparaison». Plusieurs méthodes, qui ont été décrites, peuvent être utilisées

9 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2) 495 avec des succès divers pour caractériser le statut infectieux des animaux servant de source aux sérums de référence. Vérification de l'infection : une méthode de comparaison absolue Lorsque l'agent infectieux est isolé ou que l'examen histopathologique confirme sa présence, ces observations constituent habituellement une méthode de comparaison sans équivoque pouvant être légitimement qualifiée de méthode normalisée pour le classement de l'animal dans la catégorie des animaux infectés. Toutefois, cette méthode comporte également certaines limites. Des animaux de référence reconnus comme infectés d'après la méthode de référence peuvent avoir déjà généré de fortes réponses immunitaires et, dès lors, posséder des anticorps facilement détectables. En revanche, la population cible de la nouvelle épreuve peut comporter de nombreux animaux avec une infection précoce ou latente n'entraînant pas une réponse immunitaire décelable dans les épreuves à faible sensibilité analytique, ou qui pourraient ne pas être décelés par culture ou histopathologie. Dès lors, l'utilisation exclusive d'animaux de référence pour lesquels la confirmation s'est faite par culture ou histopathologie peut générer des estimations plus élevées de la sensibilité diagnostique que le niveau qui serait réaliste pour la population cible. Aussi, même une méthode sans équivoque classant les animaux dans la catégorie des sujets infectés peut avoir ses limites comme base de comparaison pour la nouvelle épreuve. Sérologie comparative : une méthode de comparaison relative Il peut s'avérer peu pratique, techniquement difficile, voire impossible d'obtenir une confirmation définitive de l'infection par les techniques de mise en culture ou d'isolement. Dès lors, d'autres méthodes doivent être utilisées comme méthode de comparaison pour la nouvelle épreuve. Si d'autres épreuves présentent des performances acceptables et établies, telles que le test de criblage au rose Bengale suivi de l'épreuve de confirmation par fixation du complément pour la détection d'anticorps vis-à-vis de Brucella abortus, les résultats collectifs de ces épreuves fournissent une norme composite à laquelle la nouvelle épreuve peut être comparée. Lorsque la nouvelle épreuve est évaluée par comparaison avec une autre épreuve sérologique ou une combinaison d'épreuves, les estimations de sensibilité et de spécificité diagnostiques de la nouvelle épreuve sont qualifiées de sensibilité et spécificité diagnostiques relatives. Ces méthodes de comparaison ont, toutefois, leurs propres niveaux établis de faux positifs et de faux négatifs, qui constituent des sources d'erreurs pouvant se cumuler lors du calcul de la sensibilité et de la spécificité diagnostiques de la nouvelle épreuve. Il s'ensuit que plus le taux de faux positifs ou de faux négatifs est élevé dans l'épreuve utilisée comme méthode de comparaison, plus la qualité des caractéristiques des paramètres de la nouvelle épreuve sera compromise. Il est possible que la nouvelle épreuve présente une plus grande sensibilité et/ou spécificité que celles utilisées comme méthode de comparaison. C'est en général ce que l'on attend lorsque la nouvelle épreuve donne un pourcentage de faux positifs ou faux négatifs supérieur au taux prévu. Pour évaluer ce scénario, il convient tout d'abord de recourir à l'analyse du mélange ou à l'analyse typologique, telle que décrite ci-dessous (voir la section intitulée «Seuil de coupure intrinsèque, établi lorsqu'aucun animal de référence n'est disponible» ; référence 3) afin de sélectionner un seuil possible pour la nouvelle épreuve. Les échantillons sont qualifiés de positifs ou de négatifs en fonction de ce seuil. Les rôles des deux tests sont ensuite inversés, ce qui revient à faire de la nouvelle épreuve la méthode de comparaison (variable indépendante). Les résultats peuvent indiquer que la nouvelle épreuve offre de meilleures performances que les épreuves établies. Les valeurs des paramètres estimées doivent être confirmées par des études complémentaires qui évaluent les sérums provenant d'animaux au statut infectieux connu ou ceux d'animaux infectés expérimentalement. Infection expérimentale ou vaccination : une méthode de comparaison d'appoint Il existe une autre méthode d'évaluation de la réponse immunitaire humorale, à partir des sérums obtenus régulièrement sur plusieurs mois, pour chacun des animaux infectés expérimentalement ou vaccinés. Ces sérums doivent révéler l'aptitude de l'épreuve à détecter une faible teneur en anticorps et la cinétique de la production des anticorps vis-à-vis de l'agent concerné. Si des signes évidents montrent que les animaux sont infectés et qu'ils excrètent des micro-organismes en petite quantité mais qu'aucun anticorps n'est détecté par la nouvelle épreuve au cours des deux à trois premiers mois de l'infection, la sensibilité analytique de l'épreuve est sans doute inadéquate et les estimations de la sensibilité diagnostique seront faibles. Par contre, si des anticorps apparaissent rapidement après inoculation de l'agent infectieux, et plus tôt que dans les épreuves classiques utilisées comme méthodes de comparaison, cela signifie que le nouveau test peut présenter une sensibilité analytique et une sensibilité diagnostique associée supérieures à celles des épreuves classiques. Des infections expérimentales peuvent également fournir la preuve d'une réaction immunitaire spécifique d'une catégorie d'anticorps donnée, ce qui peut être utile pour sélectionner des réactifs qui détecteront les réponses précoces (IgM) ou d'autres catégories d'anticorps appropriées à l'agent, telles que les IgE pour les infections helminthiques. Il faut cependant se montrer prudent lors de l'interprétation de la réponse immunitaire induite par une infection d'origine expérimentale. La souche du micro-organisme mis en culture, le mode d'exposition et la dose ne sont que trois variables, parmi d'autres, pouvant susciter des réponses immunitaires, quantitativement et qualitativement atypiques de l'infection naturelle dans la population cible. Il en va de même de la

10 496 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2) vaccination. Dès lors, il est essentiel que des réponses immunitaires humorales induites expérimentalement soient rattachées à celles qui se produisent lors d'épidémies naturelles dues au même agent infectieux; sinon, les estimations de la sensibilité et de la spécificité diagnostiques relatives risquent d'être erronées. Compte tenu de la difficulté d'obtenir des réponses équivalentes chez des animaux atteints d'une infection naturelle et ceux infectés expérimentalement ou vaccinés, les données sur la sensibilité et la spécificité diagnostiques relatives découlant de ces animaux doivent être considérées comme un élément de comparaison complémentaire et ne doivent pas être utilisées seules pour déterminer la sensibilité et la spécificité diagnostiques relatives d'une nouvelle épreuve. Vérification du statut non infecté ou non exposé : une méthode composite Il est impossible de déclarer avec une certitude absolue qu'un animal n'a pas été exposé à l'agent en question. Les examens ante mortem ne permettent pas d'exclure la possibilité de résultats faussement négatifs. Il faut donc recourir à plusieurs sources d'information pour établir la probabilité que les animaux de référence n'ont pas été exposés à l'agent concerné. Dans l'idéal, les animaux de référence sélectionnés pour représenter le groupe non exposé aux fins d'évaluation de la spécificité diagnostique doivent provenir : a) de zones géographiques au sein de la population cible, dans lesquelles la maladie n'a pas été endémique depuis trois ans environ (cette durée peut être plus ou moins longue en fonction de la maladie étudiée), b) de troupeaux établis à l'intérieur de ces zones, dans lesquels aucun signe clinique de la maladie n'a été observé pendant au moins trois ans et où les animaux n'ont pas été vaccinés contre l'agent en question, c) de troupeaux ne recevant aucun animal provenant de zones d'endémie et ne se trouvant pas dans le voisinage d'un troupeau infecté, d) de troupeaux dans lesquels aucun animal n'a présenté de réponse immunitaire humorale vis-à-vis de l'agent en question, lors de tests répétés pratiqués au cours des deux à trois dernières années. Si toutes ces conditions sont réunies, on peut raisonnablement affirmer que ces animaux n'ont pas été exposés à l'agent en question. Ils peuvent donc servir de source de sérums de référence pour le groupe d'animaux de référence non exposés. Précision, capacité à la réitération, reproductibilité et exactitude La capacité de réitérer une épreuve et la capacité de la reproduire permettent d'estimer sa précision. La précision correspond à la mesure de la dispersion des résultats pour un prélèvement testé à plusieurs reprises ; plus la dispersion est faible, plus l'épreuve est précise. La capacité à la réitération comporte deux éléments : le niveau de l'accord entre les résultats de deux ou trois prélèvements testés en parallèle lors d'un même passage de l'épreuve et le niveau de l'accord interpassages pour les valeurs normalisées de chaque prélèvement de contrôle. La reproductibilité correspond au niveau de l'accord entre les résultats des prélèvements testés dans différents laboratoires. L'exactitude est le niveau de l'accord entre une valeur de test et la valeur attendue pour un analyte dans un sérum de référence ayant une activité connue (par exemple, titre ou concentration). Une épreuve exacte comporte un minimum de biais et d'erreurs aléatoires. Une épreuve peut être précise sans être exacte, lorsque les résultats des tests ne coïncident pas avec les valeurs attendues du sérum de référence ; en revanche, elle ne saurait être exacte, si elle n'est pas précise. Évaluation de la capacité à la réitération Les preuves préliminaires de la possibilité de réitérer une épreuve (comme indiqué ci-dessus) étaient fondées sur l'utilisation de données brutes. D'importants coefficients de variation (CV), pouvant aller jusqu'à 20 %-30 %, étaient alors acceptables. Les éléments sur la réitération sont, pour l'essentiel, obtenus à partir de données normalisées (non brutes), de sorte que la fourchette acceptable du CV sera plus étroite. Pour déterminer la réitération et l'exactitude, il convient d'utiliser les résultats normalisés découlant des nombreux passages de la nouvelle épreuve, nécessaires pour évaluer les sérums des animaux de référence. Pour obtenir des estimations initiales raisonnables de ces paramètres, il faut au moins dix passages de l'épreuve (et de préférence vingt). Pour ce qui est de la réitération au sein d'un même passage, on calcule l'écart type moyen + des échantillons en réplique de chaque sérum testé. Les CV des données normalisées découlant des échantillons en réplique de chaque sérum ne doivent pas excéder 10 %, sauf lorsque la valeur moyenne est proche de zéro, auquel cas les CV ne sont pas significatifs. La réitération entre passages différents de l'épreuve au sein d'un même laboratoire peut être basée sur les résultats de tests normalisés pour les sérums de contrôle, représentant des niveaux d'anticorps négatifs, faibles et élevés. Il convient de relever la moyenne des échantillons en réplique pour chaque sérum de contrôle testé à chacun des vingt passages de l'épreuve. En général, les valeurs présentant un écart type de ± 2 par rapport à la moyenne de tous les passages sont jugées acceptables. Ces valeurs peuvent être représentées par des points sur des graphiques Levey-Jennings (1), à raison d'un graphique par échantillon de contrôle (Fig. 2) pour visualiser les résultats. Les lignes représentant des écarts types de ± 1, ±2 et ± 3 par rapport à la moyenne peuvent être utilisées comme mesures de dispersion (11). La précision diminue à mesure que la dispersion augmente (Fig. 2a). En utilisation courante des épreuves sur la population cible, les graphiques peuvent représenter les 30 dernières séries consécutives de l'épreuve ; une moyenne cumulée avec ses écarts types constituera dès lors le graphique avec mise à jour constante de chaque échantillon. Il peut s'avérer nécessaire d'adapter les

11 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2) 497 primaires ou secondaires (21), et que le sérum de contrôle ne soit pas utilisé dans la procédure de normalisation des données. Les graphiques Levey-Jennings peuvent servir à évaluer l'exactitude de l'épreuve (Fig. 2b). Une modification brutale ou une évolution à la hausse ou à la baisse du profil d'un sérum de référence indiquent qu'un biais s'est produit, réduisant d'autant l'exactitude. La nécessité d'apporter des mesures correctrices dépendra de l'ampleur de la modification (11). Évaluation de la reproductibilité Fig. 2 Graphiques des valeurs de contrôle illustrant la précision (a) et l'exactitude (b) Les résultats de test pour chaque contrôle sont tracés quotidiennement sur des graphiques séparés. Chaque marque sur l'axe des abscisses correspond à un passage de l'épreuve. Après une vingtaine de passages de l'épreuve, six lignes horizontales sont tirées sur chaque graphique, représentant des écarts types de ± 1, ± 2 et ± 3, au-dessus et au-dessous de la moyenne des vingt valeurs pour chaque contrôle. Le groupe a) représente une plus grande dispersion (précision réduite) des résultats d'un sérum de contrôle au-delà du 12 e passage. Le groupe b)correspond à une excellente précision mais avec une tendance à des valeurs de test supérieures (exactitude réduite) au-delà du 12 e passage critères de décision pour une épreuve donnée en raison de la variation inhérente attribuable au système hôte/agent pathogène. Pour établir la reproductibilité, plusieurs laboratoires utilisant la même épreuve (protocole, réactifs et témoins) doivent comparer les résultats obtenus. Un groupe d'au moins dix prélèvements, de préférence en double, soit un total de vingt avec identifications codées, représentant toute la fourchette de concentrations d'analytes attendues, est évalué dans chaque laboratoire. L'écart entre les résultats obtenus pour chaque échantillon et dans différents laboratoires, et la valeur attendue pour chacun des échantillons permet de mesurer la reproductibilité de l'épreuve. L'évaluation se fonde sur des valeurs obtenues dans l'épreuve (par exemple, données normalisées sur une échelle continue) et non sur des interprétations de ces valeurs (par exemple, données «positives» ou «négatives»). Le degré de concordance des données interlaboratoires constitue un élément supplémentaire pour juger si les caractéristiques de performance de l'épreuve permettent de la valider. Il n'existe pas de critère de décision universel pour évaluer la reproductibilité. Les critères utilisés pour l'établissement des graphiques Levey-Jennings peuvent fonder les décisions d'acceptation ou de rejet. Évaluation de l'erreur du technicien au moyen des graphiques Levey-Jennings Comme l'erreur du technicien est la principale source de variation pour la plupart des épreuves, il convient d'élaborer des graphiques Levey-Jennings séparés représentant les données sur la réitération et sur l'exactitude pour chaque technicien. Ces graphiques viennent compléter ceux représentant les efforts collectifs de tous les techniciens qui réalisent l'épreuve au sein d'un même laboratoire. Si la variation entre techniciens et/ou entre laboratoires est importante, il faut absolument chercher à savoir si l'épreuve est intrinsèquement soumise à des variations (par exemple, absence de robustesse) ou si certains techniciens sont incapables d'obtenir des résultats répétables. L'exactitude peut être évaluée par l'inclusion d'un ou de plusieurs sérums de référence dans chaque passage de l'épreuve. Il faut entendre par sérum de référence, un prélèvement dont la concentration ou le titre de l'analyte a été établi par des méthodes indépendantes de l'épreuve à valider. Les sérums de référence peuvent consister en des sérums de contrôle, sous réserve que le niveau de l'analyte (titre, concentration) de chacun de ces sérums ait été préalablement déterminé par comparaison avec des sérums de référence Sélection d'un seuil de coupure (seuil positif/négatif) Pour parvenir à estimer la sensibilité et la spécificité diagnostiques de la nouvelle épreuve, les résultats de test doivent être réduits à des catégories positives ou négatives. L'insertion d'un point limite (seuil ou limite de décision) sur l'échelle continue des résultats de test permet de calculer la sensibilité et la spécificité diagnostiques. Même si nombre de méthodes ont été décrites à cette fin, nous prendrons trois

12 498 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz, 17 (2 Fréquences des valeurs de test normalisées Fig. 3 Distribution de fréquence hypothétique des valeurs de test normalisées (par exemple, titre, absorbance, pourcentage de contrôles positifs) à partir des sérums d'animaux de référence au statut infectieux connu Une ligne représentant le seuil de coupure est tracée à l'intersection des deux distributions de fréquence exemples pour illustrer différentes approches avec leurs avantages et leurs inconvénients. La première méthode est celle d'un seuil de coupure basé sur la distribution des résultats de test provenant d'animaux de référence non infectés ou infectés, qui permet de calculer la sensibilité et la spécificité diagnostiques. La seconde méthode consiste à établir un seuil de coupure fondé uniquement sur des animaux de référence non infectés ; on peut ainsi estimer la spécificité diagnostique, mais non la sensibilité diagnostique. La troisième fournit un «seuil de coupure intrinsèque», basé sur les résultats obtenus à partir de sérums prélevés de manière aléatoire au sein de la population cible, sans connaissance préalable du statut infectieux des animaux donneurs (3). On n'obtient aucune estimation de sensibilité et de spécificité diagnostiques à l'aide de cette méthode, mais on peut les évaluer au fur et à mesure que les données de confirmation s'accumulent. Seuil de coupure basé sur les résultats de test des sérums de référence provenant d'animaux non infectés et infectés Le choix d'un seuil de coupure se fonde sur les trois critères suivants : - les distributions de fréquence des résultats du test normalisé à partir de deux ensembles de sérums de référence, les uns provenant d'animaux infectés par l'agent en question et les autres d'animaux non infectés, - la prévalence de la maladie dans la population cible, - l'impact de résultats de test faussement positifs et faussement négatifs (19). Sélection d'un seuil de coupure par examen visuel des distributions de fréquence Les distributions de fréquence relatives à 600 animaux infectés et à animaux non infectés (Fig. 3) indiquent une zone de chevauchement pour les résultats de test (les tests parfaits sans chevauchement, donnant 100 % de sensibilité diagnostique et 100 % de spécificité diagnostique, sont rares voire inexistants). Lorsqu'on place le seuil de coupure à l'intersection des deux distributions, on obtient 5,0 % de faux négatifs et 4,7 % de faux positifs pour l'épreuve. L'importance du chevauchement peut varier considérablement d'une épreuve à l'autre. On peut, selon l'application envisagée de l'épreuve, déplacer le seuil de coupure vers la gauche et réduire au minimum les résultats faussement négatifs (d'où une plus grande sensibilité diagnostique) ; un déplacement vers la droite minimise les résultats faussement positifs (d'où une plus grande spécificité diagnostique). Cette méthode offre l'avantage d'être simple et flexible, et ne nécessite aucun calcul statistique ou hypothèse sur la normalité des deux distributions.

13 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2) 499 Fréquences des valeurs de test normalisées Fig. 4 Sélection de seuils de coupure à l'aide d'une analyse des caractéristiques récepteur-opérateur (ROC) modifiée qui trace la sensibilité et la spécificité diagnostiques (axes des ordonnées à droite du graphique) en fonction des seuils de coupure (axe des abscisses) Les courbes ROC sont superposées sur les distributions de fréquence de la Figure 3. Trois seuils de coupure sont indiqués : le numéro 1, qui représente un seuil de coupure de 87 unités sur l'axe des abscisses, a été choisi par examen visuel comme indiqué à la Figure 3 ; le numéro 2 se situe à 82 unités avec une sensibilité et une spécificité diagnostiques égales (97,5 %) ; le numéro 3 est à 70 unités, soit la plus grande exactitude diagnostique (total de la sensibilité et de la spécificité diagnostiques) de l'épreuve, 94,9 % et 98,8 %, respectivement Sélection d'un seuil de coupure à l'aide d'une analyse modifiée des caractéristiques récepteur-opérateur sensibilité et une spécificité diagnostiques supérieures à 50 % (J.W. Wilesmith, communication personnelle, 1995). La courbe des caractéristiques récepteur-opérateur (receiveroperator characteristics : ROC) (22) constitue une autre méthode utile pour déterminer les caractéristiques des performances d'une épreuve. Les courbes ROC correspondent au tracé des pourcentages de vrais positifs (sensibilité sur l'axe des ordonnées) par rapport au pourcentage de faux positifs (1 - spécificité sur l'axe des abscisses) à l'aide des résultats du test provenant de batteries de sérums prélevés chez des animaux non infectés et infectés connus. Les points qui déterminent la courbe ne sont autres qu'un ensemble de valeurs limites. Lorsque les courbes ROC sont tracées pour plusieurs épreuves sur le même graphique, l'épreuve représentant la zone la plus large dans une courbe ROC est considérée comme la plus exacte. Il s'agit là d'un moyen simple de comparaison graphique de deux épreuves permettant d'établir leur degré de concordance. Les courbes ROC servent également à sélectionner un seuil de coupure lorsque le coût relatif des résultats faussement négatifs et faussement positifs peut être estimé (10). Les courbes ROC standard ne sont cependant pas aussi utiles pour sélectionner un seuil de coupure optimal applicable à une épreuve de criblage ou de confirmation. Les statistiques Kappa, d'un usage fréquent, ne sont pas recommandées en raison de leur dépendance à l'égard de la prévalence, et du risque que la concordance entre deux tests ne se produise que par hasard, la condition étant qu'ils affichent tous deux une Compte tenu de la difficulté de lire un seuil de coupure optimal à partir d'une courbe ROC, une courbe ROC modifiée a été conçue pour rendre le choix d'un seuil de coupure plus intuitif tout en étant statistiquement exact (4, 8). La méthode ROC modifiée trace les taux de vrais positifs (sensibilité diagnostique) et de vrais négatifs (spécificité diagnostique) séparément pour chaque seuil de coupure dans une série de seuils de coupure représentés par des intervalles de plus en plus grands de valeurs de test sur l'axe horizontal (Fig. 4). La superposition des courbes de sensibilité et spécificité diagnostiques qui en résultent et des distributions de fréquence dont elles découlent illustre la relation entre le chevauchement des distributions de fréquence et la sensibilité ou spécificité diagnostiques à différents seuils de coupure dans cette zone de chevauchement. Le fait de sélectionner différents seuils de coupure en les déplaçant de gauche à droite sur l'axe horizontal, montre clairement l'incidence du choix d'un seuil de coupure sur la sensibilité et la spécificité diagnostiques. Seuil de coupure basé sur des résultats de test provenant uniquement d'animaux non infectés On utilise souvent la moyenne des valeurs de test obtenues à partir d'un groupe important d'animaux non infectés connus, avec un écart type de + 2 ou + 3, comme seuil de coupure dans la technique ELISA. En supposant une distribution (de

14 500 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2) Gauss) normale, la spécificité diagnostique attendue serait d'environ 97,5 %, 97,7 % ou 99,9 % si la valeur limite sélectionnée était égale à la moyenne des sérums de référence négatifs plus 1,96, deux ou trois fois l'écart type, respectivement. Comme les résultats de test, en particulier ceux provenant d'animaux non infectés, ne donnent que rarement lieu à une distribution normale et qu'ils sont biaisés vers la droite, des estimations erronées de la spécificité diagnostique peuvent se produire. En ajoutant des écarts types de 2 ou de 3 à la moyenne, on ne détermine pas nécessairement le point limite qui représenterait les 97,7 % ou 99,9 % attendus, pour les résultats de test. En fait, si les valeurs pour la plupart des animaux non infectés sont minimales et se traduisent par une moyenne basse, mais que la distribution se prolonge vers la droite (ce qui est fréquemment observé), les seuils de coupure établis d'après les calculs d'écarts types peuvent aboutir à une plus forte proportion de faux positifs que celle estimée au moyen de l'écart type statistique. Les animaux infectés, en revanche, donnent souvent des distributions de fréquence proches d'une distribution normale. On préférera donc à l'écart type paramétrique statistique, un centile des valeurs (par exemple, 99 % des valeurs des animaux non infectés). En effet, une telle méthode n'est pas sujette à des erreurs liées à des distributions anormales. Toutefois, l'utilisation exclusive d'animaux non infectés ne permet pas de calculer la sensibilité diagnostique. Aussi cette méthode n'est-elle recommandée que pour des tests pour lesquels les estimations de la spécificité diagnostique sont prioritaires par rapport à celles de la sensibilité diagnostique ; c'est le cas des tests de confirmation destinés à exclure les faux positifs. Seuil de coupure intrinsèque, établi lorsqu'aucun animal de référence n'est disponible Pour beaucoup de maladies/infections, il est impossible d'obtenir un nombre suffisant de sérums d'animaux infectés et non infectés connus pour établir un seuil de coupure. De plus, lorsque les sérums de référence ne proviennent pas de la population cible, le seuil de coupure sélectionné risque de ne pas être approprié à la population cible. On peut fonder uniquement le seuil de coupure sur l'analyse de distribution des données provenant d'animaux endémiques appartenant à la population cible. Si une distribution bimodale permet de discerner nettement les distributions des animaux infectés de celles des animaux non infectés, un seuil de coupure peut être sélectionné uniquement par examen visuel des données tracées. Toutefois, il est de loin préférable de disposer d'une base statistique pour sélectionner le seuil de coupure. D'après les descriptions qui en ont été faites, l'analyse des distributions de mélange constituerait une méthode efficace pour obtenir une estimation non biaisée de la séro-prévalence en l'absence de sérums provenant d'animaux de référence reconnus comme non infectés (3). La principale raison pour laquelle on utilise des sérums obtenus de manière aléatoire à partir de la population cible pour l'établissement du seuil de coupure est que cela permet d'éviter le biais susceptible de se produire lorsqu'on prend pour hypothèse que les sérums d'une population de référence sont représentatifs de la population cible. L'inconvénient est que cette méthode ne permet pas de calculer la sensibilité et la spécificité diagnostiques. Ces paramètres ne peuvent être établis que par une confirmation ultérieure du statut infectieux à l'aide d'une méthode de comparaison. Seuils de coupure multiples : addition de la catégorie «douteux» aux résultats négatifs et positifs Lorsqu'il y a un chevauchement important dans les distributions de valeurs de test provenant d'animaux infectés et non infectés connus, il est difficile de sélectionner un seuil de coupure permettant de déterminer avec précision le statut infectieux des animaux. Au lieu d'un seul seuil de coupure, deux seuils peuvent être sélectionnés, le premier permettant de définir une sensibilité diagnostique élevée (par exemple : 99 % des sérums de référence provenant d'animaux infectés donnent des résultats au-dessus du seuil de coupure), et le second de déterminer une spécificité diagnostique élevée (par exemple : 99 % des sérums de référence provenant d'animaux non infectés donnent des résultats en dessous du seuil de coupure). Les valeurs qui se situent entre ces centiles seraient dès lors qualifiées de douteuses ou d'équivoques et nécessiteraient une épreuve de confirmation ou une nouvelle analyse de l'animal à une date ultérieure pour détecter une séroconversion éventuelle. Calcul de la sensibilité et de la spécificité diagnostiques La sélection d'un seuil de coupure permet de classer les résultats des tests en deux catégories : positifs ou négatifs. Les calculs de la sensibilité et de la spécificité diagnostiques sont facilités en associant les données des catégories positives/ négatives au statut connu (méthode de comparaison) pour chaque animal dans un tableau croisé à deux entrées (Fig. 5). Une fois le seuil de coupure établi, les résultats des tests effectués sur les sérums de référence peuvent être classés en deux catégories : les vrais positifs et les vrais négatifs. Ces désignations indiquent l'existence d'un accord entre les résultats des tests et ceux de la méthode de comparaison. En revanche, les résultats des sérums de référence classés dans les catégories faux positifs ou faux négatifs témoignent de l'existence d'un désaccord avec la méthode de comparaison. La sensibilité diagnostique est calculée selon la formule (vrais positifs)/(vrais positifs + faux négatifs) alors que la spécificité diagnostique se calcule selon la formule (vrais négatifs)/(vrais négatifs + faux positifs). Les résultats de ces deux types de calculs sont habituellement exprimés en pourcentages (Fig. 5). Les estimations de la sensibilité et de la spécificité diagnostiques dépendent, dès lors, entièrement des caractéristiques de la population de référence ; ces estimations risquent de n'avoir que peu d'intérêt pour la population cible si les animaux utilisés pour les obtenir ne sont pas représentatifs de cette population. C'est notamment le cas lorsqu'une épreuve est appliquée dans un autre continent sur une population

15 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2) 501 spécificité diagnostiques sont bien établies pour une épreuve, un test effectué sur l'ensemble d'un élevage à l'aide de cette épreuve donnera la prévalence apparente de l'infection dans l'élevage en question. À partir de ces résultats, la prévalence réelle peut être estimée (18) à l'aide de la formule suivante : PR PA + DSp - 1 DSn + DSp - 1 Fig. 5 Des calculs de sensibilité et de spécificité diagnostiques facilités par un tableau croisé qui associe le statut infectieux aux résultats de tests de 600 animaux de référence infectés et de animaux de référence non infectés, comme décrit à la Figure 3 complètement différente. Dans ce cas, les estimations de sensibilité et de spécificité diagnostiques doivent être recalculées pour la nouvelle population cible et revalidées en les soumettant aux phases 3 à 5 de la procédure de validation de l'épreuve (Fig. 1). où PR est la prévalence réelle estimée, PA la prévalence apparente (nombre de résultats positifs divisé par nombre d'échantillons testés), DSp la spécificité diagnostique et DSn la sensibilité diagnostique. Détermination des valeurs prédictives des résultats positifs et négatifs On trouvera à la Figure 6 une méthode intuitive de calcul des valeurs prédictives des résultats de test positifs et négatifs. Un graphique à consulter (Tableau II) est également fourni pour illustrer l'impact de la prévalence sur les valeurs prédictives. Interprétation des résultats du test Les résultats du test n'ont d'intérêt que si les conclusions qu'on en tire sont exactes. L'erreur la plus répandue est de supposer qu'une épreuve présentant 99 % de sensibilité diagnostique et 99 % de spécificité diagnostique générera un résultat faussement positif et un résultat faussement négatif pour 100 tests effectués sur des animaux de la population cible. L'épreuve peut être précise et exacte tout en produisant des résultats qui ne permettent pas de prévoir avec exactitude le statut infectieux. Ainsi, si la prévalence d'une maladie dans une population cible est de 1 pour animaux et que le taux de faux positifs est de 1 pour 100 animaux (99 % de sensibilité diagnostique), on obtiendra pour tests effectués sur cette population 10 faux positifs et 1 vrai positif (si la sensibilité diagnostique est supérieure à 50 %). Par conséquent, environ 9 % seulement des résultats positifs indiqueront avec exactitude le statut infectieux de l'animal ; le résultat du test sera erroné dans 91 % des cas. Cet exemple montre qu'une valeur prédictive positive (VP+) n'est pas directement corrélée à la spécificité diagnostique, mais qu'elle est plutôt une fonction de la prévalence. Ainsi, les calculs de la VP+ et de la VP- à partir des résultats de test effectués sur des sérums de référence ne sauraient être pertinents, dans la mesure où les animaux de référence infectés et non infectés ne sont pas sélectionnés en fonction de la prévalence dans la population cible. En revanche, la prévalence estimée dans la population cible est le chiffre de prévalence pertinent pour le calcul de la VP+ et de la VP- à partir des résultats du test. Fig. 6 Méthode intuitive de calcul des valeurs prédictives des résultats positifs (VP+) et des valeurs prédictives des résultats négatifs (VP-) obtenus à partir d'animaux issus de la population cible Soit: Des calculs basés sur un groupe hypothétique de animaux de la population cible Une sensibilité diagnostique (DSn) = 99 % Une spécificité diagnostique (DSp) = 99 % Une prévalence estimée de l'infection dans la population cible = 5 % Calculs : Pourcentage d'infectés : x 5 % de prévalence = 500 animaux Nombre de vrais positifs :(DSn)x (% d'infectés) = 0,99 x 500 = 495 Nombre de faux négatifs : (% d'infectés) - (vrais positifs) = = 5 Nombre de non infectés : infectés = = Nombre de vrais négatifs : (DSp) x (non infectés) = 0,99 x = Nombre de faux positifs : (Nombre de non infectés)-(vrais négatifs)= = 95 Valeurs prédictives des résultats de test sur la population cible : Pour un résultat de test positif : (VP+) = (vrais positifs)/(vrais positifs + faux positifs) = 495/( ) = 83,9 % Pour un résultat de test négatif : (VP-) = (vrais négatifs)/(vrais négatifs + faux négatifs) = 9 405/( ) = 99,9 % Estimation de la prévalence réelle à partir de la prévalence apparente Il est souvent difficile d'estimer la prévalence de l'infection pour le calcul des valeurs prédictives. Si la sensibilité et la Impact de la prévalence de l'infection sur l'interprétation des résultats de tests Lorsque la prévalence dans la population cible est relativement élevée, de l'ordre de 10 %, la VP- et la VP+ sont

16 502 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 Z Tableau II Valeurs prédictives d'un résultat positif ou négatif, exprimées en pourcentage de probabilité que le résultat du test donne un bon classement du statut infectieux de l'animal Dans les deux colonnes du centre du graphique, descendre jusqu'à la ligne donnant la combinaison de sensibilité et de spécificité diagnostiques de l'épreuve ; puis, se déplacer latéralement vers la colonne représentant la prévalence estimée de l'infection. C'est à l'intersection de la colonne et de la ligne que se situe la valeur prédictive d'un résultat positif (tableau de gauche) ou la valeur prédictive d'un résultat négatif (tableau de droite) Valeur prédictive d'un résultat positif (%) : prévalence estimée de l'infection* 40% 25% 10% 5% 1% 0,5% 0,1 % 0,01 % Spécificité diagnostique de l'épreuve Sensibilité diagnostique de l'épreuve 40% Valeur prédictive d'un résultat négatif (%) : prévalence estimée de l'infection* 25% 10% 5% 1% 0,5% 0,1% 0,01 % % 100% D % 99% 99,3 99,7 99,9 99, % 98% 98,7 99,3 99,8 99, % 95% 96,8 98,4 99,4 99,7 99, % 90% 93,8 96,8 98,9 99,5 99,9 99, % 80% 88,2 93,8 97,8 99,0 99,8 99, % 65% 81,1 89,6 96,3 98,2 99,6 99, % 50% 75,0 85,7 94,7 97,4 99,5 99,7 99, ,5 97,1 91,7 84,0 50,3 33,4 9,1 1,0 99% 100% ,5 97,1 91,7 83,9 50,0 33,2 9,0 1,0 99% 99% 99,3 99,7 99,9 99, ,5 97,0 91,6 83,8 49,7 33,0 8,9 1,0 99% 98% 98,7 99,3 99,8 99, ,4 96,9 91,3 83,3 49,0 32,3 8,7 0,9 99% 95% 96,7 98,3 99,4 99,7 99, ,4 96,8 90,9 82,6 47,6 31,1 8,3 0,9 99% 90% 93,7 96,7 98,9 99,5 99,9 99, ,2 96,4 89,9 80,8 44,7 28,7 7,4 0,8 99% 80% 88,1 93,7 97,8 98,9 99,8 99, ,7 95,6 87,8 77,4 39,6 24,6 6,1 0,6 99% 65% 80,9 89,5 96,2 98,2 99,6 99, ,1 94,3 84,7 72,5 33,6 20,1 4,8 0,5 99% 50% 74,8 85,6 94,7 97,4 99,5 99,7 99, ,1 94,3 84,7 72,5 33,6 20,1 4,8 0,5 98% 100% ,1 94,3 84,6 72,3 33,3 19,9 4,7 0,5 98% 99% 99,3 99,7 99,9 99, ,0 94,2 84,5 72,1 33,1 19,8 4,7 0,5 98% 98% 98,7 99,3 99,8 99, ,9 94,1 84,1 71,4 32, ,5 0,5 98% 95% 96,7 98,3 99,4 99,7 99, ,8 83,3 70,3 31,3 18,4 4,3 0,4 98% 90 % 93,6 96,7 98,9 99,5 99,9 99, ,4 93,0 81,6 67,8 28,8 16,7 3,8 0,4 98% 80% 88,0 93,6 97,8 98,9 99,8 99, ,6 91,5 78,3 63,1 24,7 14,0 3,2 0,3 98% 65% 80,8 89,4 96,2 98,2 99,6 99, ,3 89,3 73,5 56,8 20,2 11,2 2,4 0,2 98% 50% 74,6 85,5 94,6 97,4 99,5 99,7 99, ,0 87,0 69,0 51,3 16,8 9,1 2,0 0,2 95% 100% ,0 86,8 68,8 51,0 16,7 9,0 1,9 0,2 95% 99% 99,3 99,7 99,9 99, ,7 68,5 50,8 16,5 9,0 1,9 0,2 95% 98% 98,6 99,3 99,8 99, ,7 86,4 67,9 50,0 16,1 8,7 1,9 0,2 95% 95% 96,6 98,3 99,4 99,7 99, ,3 85,7 66,7 48,6 15,4 8,3 1,8 0,2 95% 90% 93,4 96,6 98,8 99,4 99,9 99, ,4 84,2 64,0 45,7 13,9 7,4 1,6 0,2 95% 80% 87,7 93,4 97,7 98,9 99,8 99, ,7 81,3 59,1 40,6 11,6 6,1 1,3 0,1 95% 65% 80,3 89,1 96,1 98,1 99,6 99, ,0 76,9 52,6 34,5 9,2 4,8 1,0 0,1 95% 50% 74,0 85,1 94,5 97,3 99,5 99,7 99, ,0 76,9 52,6 34,5 9,2 4,8 1,0 0,1 90% 100% ,8 76,7 52,4 34,3 9,1 4,7 1,0 0,1 90% 99% 99,3 99,6 99,9 99, ,7 76,6 52,1 34,0 9,0 4,7 1,0 0,1 90% 98% 98,5 99,3 99,8 99, ,4 76,0 51,4 33,3 8,8 4,6 0,9 0,1 90% 95% 96,4 98,2 99,4 99,7 99, ,7 75,0 50,0 32,1 8,3 4,3 0,9 0,1 90% 90% 93,1 96,4 98,8 99,4 99,9 99, ,2 72,7 47,1 29,6 7,5 3,9 0,8 0,1 90% 80% 87,1 93,1 97,6 98,8 99,8 99, ,3 68,4 41,9 25,5 6,2 3,2 0,6 0,1 90% 65% 79,4 88,5 95,9 98,0 99,6 99, ,9 62,5 35,7 20,8 4,8 2,5 0,5 0,0 90% 50% 73,0 84,4 94,2 97,2 99,4 99,7 99,9 100

17 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz.. 17 (2) 503 Tableau II (suite) Valeur prédictive d'un résultat positif (% : prévalence estimée de l'infection* 40% 25% 10% 5% 1% 0,5% 0,1 % 0,01 % Spécificité diagnostique de l'épreuve Sensibilité diagnostique de l'épreuve 40% Valeur prédictive d'un résultat négatif (%) : prévalence estimée de l'infection* 25% 10% 5% 1% 0,5% 0,1% 0,01 % 76,9 62,5 35,7 20,8 4,8 2,5 0,5 0,0 80% 100% ,7 62,3 35,5 20,7 4,8 2,4 0,5 0,0 80% 99% 99,2 99,6 99,9 99, ,6 62,0 35,3 20,5 4,7 2,4 0,5 0,0 80% 98% 98,4 99,2 99,7 99, ,0 61,3 34,5 20,0 4,6 2,3 0,5 0,0 80% 95% 96,0 98,0 99,3 99,7 99, ,0 60,0 33,3 19,1 4,3 2,2 0,4 0,0 80% 90% 92,3 96,0 98,6 99,3 99,9 99, ,7 57,1 30,8 17,4 3,9 2,0 0,4 0,0 80% 80% 85,7 92,3 97,3 98,7 99,7 99, ,4 52,0 26,5 14,6 3,2 1,6 0,3 0,0 80% 65% 77,4 87,3" 95,4 97,7 99,6 99, ,5 45,5 21,7 11,6 2,5 1,2 0,2 0,0 80% 50% 70,6 82,8 93,5 96,8 99,4 99,7 99, ,6 48,8 24,1 13,1 2,8 1,4 0,3 0,0 65% 100% ,3 48,5 23,9 13,0 2,8 1,4 0,3 0,0 65% 99% 99,0 99,5 99,8 99, ,1 48,3 23,7 12,8 2,8 1,4 0,3 0,0 65% 98% 98,0 99,0 99,7 99, ,4 47,5 23,2 12,5 2,7 1,3 0,3 0,0 65% 95% 95,1 97,5 99,2 99,6 99, ,2 46,2 22,2 11,9 2,5 1,3 0,3 0,0 65% 90% 90,7 95,1 98,3 99,2 99,8 99, ,4 43,2 20,3 10,7 2,3 1,1 0,2 0,0 65% 80% 83,0 90,7 96,7 98,4 99,7 99, ,3 38,2 17,1 8,9 1,8 0,9 0,2 0,0 65% 65% 73,6 84,8 94,4 97,2 99,5 99, ,8 32,3 13,7 7,0 1,4 0,7 0,1 0,0 65% 50% 66,1 79,6 92,1 96,1 99,2 99,6 99, ,1 40,0 18,2 9,5 2,0 1,0 0,2 0,0 50% 100% ,9 39,8 18,0 9,4 2,0 1,0 0,2 0,0 50% 99% 98,7 99,3 99,8 99, ,6 39,5 17,9 9,4 1,9 1,0 0,2 0,0 50% 98% 97,4 98,7 99,6 99, ,9 38,8 17,4 9,1 1,9 0,9 0,2 0,0 50% 95% 93,8 96,8 98,9 99,5 99, ,5 37,5 16,7 8,7 1,8 0,9 0,2 0,0 50% 90% 88,2 93,8 97,8 99,0 99,8 99, ,6 34,8 15,1 7,8 1,6 0,8 0,2 0,0 50% 80% 78,9 88,2 95,7 97,9 99,6 99, ,4 30,2 12,6 6,4 1,3 0,6 0,1 0,0 50% 65% 68,2 81,1 92,8 96,4 99,3 99, ,0 25,0 10,0 5,0 1,0 0,5 0,1 0,0 50% 50% 60,0 75,0 90,0 95,0 99,0 99,5 99,9 100 * Estimation de prévalence, basée sur le calcul de la prévalence estimée à partir de la prévalence apparente (voir section intitulée «Estimation de la prévalence réelle à partir de la prévalence apparente»), ou sur une prévalence estimée dans la population d'où proviennent les prélèvements respectivement de 99,9 % et de 91,7 %, pour une épreuve ayant une sensibilité et une spécificité diagnostiques de 99 % (Tableau II). Une prévalence de 5 % donne une VP- de 99,9 % et une VP+ de 83,9 %. Toutefois, lorsque la prévalence n'est plus que de 0,1 %, comme c'est le cas pendant une campagne d'éradication, les mêmes résultats donneront une VP- de 99,9 % avec une chute de la VP+ à 9 %. Comme les baisses de prévalence affectent essentiellement la VP+, lorsque la prévalence recule, il est préférable de déplacer le seuil de coupure vers la droite pour augmenter la spécificité diagnostique, par exemple à 99,9 % ; cela entraînera un repli proportionnel de la sensibilité diagnostique à 90 %. Toutefois, cette réduction de la sensibilité diagnostique n'a qu'un effet négligeable sur la VP-, qui restera de 99,9 % ; par contre, elle portera la VP+ de 9 % à environ 50 % (6, 7). Remise aux clients des résultats des tests accompagnés d'une interprétation Lorsque les valeurs des tests ne sont pas accompagnées d'estimations de la spécificité et de la sensibilité diagnostiques de l'épreuve, il est impossible de faire des prévisions éclairées sur le statut infectieux à partir des résultats du test. Il est donc important de donner une interprétation avec ces résultats. Il est également utile de fournir un tableau indiquant les VP+ et VP- pour une fourchette de prévalences attendues de l'infection dans la. population cible, car il est peu probable que les clients calculent les valeurs prédictives à partir des formules. En l'absence de cette information, les clients risquent de procéder à des classements erronés pour ce qui est du statut infectieux des animaux ; si cela se produit fréquemment, l'épreuve ne peut être considérée comme pleinement validée.

18 504 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2) Deuxième partie de la procédure : garantir la validité de l'épreuve dans le cadre d'une utilisation courante et améliorer les critères de validation Surveillance et suivi des performances de l'épreuve Le principe de départ de cet article est qu'une épreuve n'est valide que dans la mesure où les résultats du test le sont. Si la première partie de la procédure décrite ci-dessus (phases 1 à 3 de la Figure 1) a été mise en œuvre, la validation de l'épreuve, dans son acception classique, a été menée à bien. Toutefois, pour garantir la validité des résultats et conserver la désignation d'«épreuve validée», la surveillance, le suivi et l'amélioration continus de l'épreuve s'imposent. Pour étendre l'épreuve à des populations disparates d'animaux, il faut réaliser des tests sur les animaux de référence représentant ces populations pour actualiser les estimations de sensibilité et de spécificité diagnostiques. Précision et exactitude : le rôle de la surveillance Lorsque l'épreuve fait l'objet d'une utilisation de routine, on procède à un contrôle de qualité interne en surveillant en permanence l'épreuve à l'aide de graphiques Levey-Jennings (Fig. 2) qui permettent d'évaluer la capacité à la réitération et l'exactitude. Les graphiques représentant les 30 derniers passages révéleront des tendances ou modifications de valeurs des sérums de contrôle et de référence. Les lignes représentant des écarts types de ± 1, ± 2 et ± 3 par rapport à la moyenne peuvent servir de critères de décision pour inclure ou exclure une ou plusieurs séries de l'épreuve (11). Une série est rejetée lorsque l'écart type d'un sérum de contrôle/sérum de référence est supérieur à ± 3 ou lorsque l'écart type de deux ou plusieurs d'entre eux est supérieur à ± 2. Les critères de décision doivent éventuellement être adaptés à une épreuve donnée en raison des différences inhérentes aux épreuves et à celles imputables au système hôte/agent pathogène. Contrôle des compétences d'un laboratoire La reproductibilité des données de test entre laboratoires doit être évaluée au moins deux fois par an. Il peut être utile, à cet égard, de constituer un réseau de laboratoires intéressés par l'évaluation de leurs résultats. À court terme, de bonnes pratiques de laboratoire comportant la mise en œuvre d'un programme d'assurance qualité totale conforme aux normes de la série ISO 9000 (13, 14, 15, 16) et au Guide 25 (17) de l'organisation internationale de normalisation (ISO), seront indispensables pour les laboratoires désireux d'obtenir l'accréditation sur le plan national ou international. L'évaluation des compétences est une forme de contrôle de qualité externe pour une épreuve. Elle est habituellement confiée à un laboratoire de référence qui distribue des séries de prélèvements, reçoit les résultats des laboratoires, analyse les données et adresse un rapport sur les résultats aux laboratoires participants. Si les résultats d'un laboratoire restent dans des limites acceptables indiquant qu'il réunit les conditions d'exactitude et de reproductibilité requises, ce laboratoire peut être accrédité par des organismes publics ou des laboratoires de référence comme laboratoire officiel pour ce type d'épreuve. Par ailleurs, un laboratoire qui s'écarte sensiblement des valeurs attendues sera considéré comme ayant échoué au contrôle des compétences et ne sera pas accrédité. Ces mesures sont fortement recommandées pour le maintien de la validité de la nouvelle épreuve. Les batteries de sérums utilisées pour l'évaluation des compétences doivent représenter toute la fourchette d'analytes de la population cible. Si ces batteries ne comportent que des sérums aux valeurs fortement positives et faiblement positives (et aucun sérum dont les valeurs soient proches du seuil de coupure de l'épreuve), l'exercice prouvera uniquement la reproductibilité de l'épreuve aux limites extrêmes de la concentration d'analytes, et ne permettra pas de savoir si les résultats du test en utilisation courante sur la population cible aboutissent à un bon classement des animaux selon leur statut infectieux. Mise à jour des critères de validation Compte tenu du nombre important de variables pouvant affecter la réalisation d'épreuves sérologiques de diagnostic, il convient d'augmenter, chaque fois que possible, le nombre des sérums de référence selon le principe que plus la taille de l'échantillon est importante, plus le risque d'erreur est réduit. Une banque de sérums de référence supplémentaires doit être utilisée pour actualiser les estimations de sensibilité et de spécificité diagnostiques pour la population cible. De plus, lorsque l'épreuve doit être appliquée dans une zone géographique différente (par exemple, d'un hémisphère à l'autre), il est indispensable de revalider l'épreuve en la soumettant à des sérums prélevés chez la population locale. Pour ce faire, il faut évaluer les sérums de référence représentant ces populations conformément aux phases 3 à 5 (Fig. 1) de la procédure de validation. C'est le seul moyen de s'assurer que l'épreuve est valide pour des populations d'une composition différente de celle de la population d'origine ciblée par l'épreuve. Validation de nouveaux réactifs ou modifications du protocole Lorsque les prélèvements de contrôle sont près d'être épuisés, il convient de préparer et de soumettre à des tests répétés les prélèvements de remplacement. Ceux-ci doivent être inclus dans au moins dix passages de l'épreuve courante pour vérifier leurs performances. Lorsque d'autres réactifs, tels que des antigènes pour la capture d'anticorps, doivent être remplacés, ils doivent être produits ou fournis conformément aux mêmes protocoles ou critères que les réactifs d'origine. Ils doivent être évalués à l'aide de sérums provenant des

19 Rev. sci. tech. Off. int. Epiz., 17 (2) 505 contrôles de routine pendant 5 à 10 passages, en incluant en parallèle le réactif actuel et celui de remplacement. Le remplacement d'un antigène produit selon un protocole différent implique une restandardisation complète et une nouvelle caractérisation des performances diagnostiques (phases 2 et 3 de la validation de l'épreuve, Fig. 1). Dans la mesure du possible, il est préférable de ne remplacer qu'un réactif à la fois pour éviter d'avoir à évaluer plusieurs variables en même temps. Ce faisant, les nouveaux réactifs n'introduiront pas de variabilité excessive et la validité de l'épreuve devrait être maintenue. Validation d'autres épreuves que les épreuves immuno-enzymatiques Nous avons pris pour exemple une épreuve ELISA indirecte, mais les principes sont les mêmes pour la validation de n'importe quelle épreuve de diagnostic. Le plus important est de ne pas s'arrêter après la phase 2 de la validation. Cela peut suffire pour en tirer un article, mais ne saurait constituer une épreuve validée aux fins de diagnostic. Même si l'élaboration des réactifs et protocoles est importante au cours des phases 1 à 3, la sélection des populations de référence est certainement le facteur le plus critique. Ainsi il n'est pas rare de trouver, dans la littérature, des estimations de sensibilité et de spécificité diagnostiques très différentes pour la même épreuve de base. Certes, cette variation peut être attribuée en partie aux réactifs, mais elle est plus vraisemblablement liée à une mauvaise sélection des sérums ayant servi à la «validation» de l'épreuve. Dans le contexte actuel d'accords commerciaux internationaux, les phases 4 et 5 de la validation de l'épreuve (Fig. 1) doivent faire l'objet d'une attention accrue, en tenant compte des déplacements d'animaux et de produits d'origine animale. Conclusions Avec la multiplication des échanges et la globalisation des accords commerciaux, les pays doivent avoir l'assurance que les animaux et les produits d'origine animale qu'ils importent sont exempts de certains agents pathogènes. Le contrôle de ces animaux doit être effectué à l'aide d'épreuves validées ; sinon, aucune certitude sur leur statut infectieux ne pourra être établie. L'accréditation des laboratoires est l'un des moyens permettant d'oeuvrer dans ce sens, mais rien ne garantit que les laboratoires accrédités utilisent des épreuves validées. Des épreuves commerciales autorisées peuvent répondre à certaines normes, mais les diagnostiqueurs de laboratoire expérimentés savent que ces épreuves ne sont pas toujours correctement validées. Les programmes d'assurance qualité internes et externes permettent de surveiller la capacité à la réitération, la reproductibilité, la précision et même l'«exactitude» des épreuves. Mais l'exactitude est un terme relatif, qui est fonction de la «méthode de comparaison» sur laquelle l'épreuve a été basée. Si la méthode n'est pas valide, l'épreuve ne l'est pas non plus. Une épreuve correctement validée est donc la première des exigences pour un laboratoire vétérinaire de diagnostic. Le but ultime de la validation d'une épreuve est de fournir un résultat permettant d'identifier les animaux comme positifs ou négatifs et, par déduction, de prévoir avec précision leur statut infectieux avec un degré préétabli de certitude statistique. Dès lors, la validation d'une épreuve est un processus complexe qui ne s'arrête pas à une série limitée dans le temps d'expériences basées sur quelques échantillons de référence. Elle implique également une vérification par application de l'épreuve à un grand nombre d'animaux de référence représentant toutes les variables de la population cible. Elle comprend, par ailleurs, une interprétation des données dans un contexte biologiquement et statistiquement pertinent. C'est le seul moyen d'avoir la certitude que le résultat du test et son interprétation permettent de déterminer correctement le statut infectieux d'un animal. Cet article donne un aperçu des procédures de validation d'une épreuve. Mais il existe certainement d'autres éléments et aspects utiles à préciser. Le moment est donc venu d'engager la discussion afin qu'un document consensuel final soit établi sur la validation des épreuves diagnostiques. Remerciements L'auteur tient à remercier tout particulièrement les personnels du Laboratoire de référence de l'oie pour les techniques moléculaires et les épreuves ELISA appliquées au diagnostic des maladie animales, Unité de production animale, Laboratoire de l'agence internationale de l'énergie atomique (AIEA), Seibersdorf, Autriche, et la section conjointe de l'organisation des Nations unies pour l'alimentation et l'agriculture (FAO)/AIEA pour la production et la santé animales de Vienne qui ont apporté de nombreuses contributions à cet article et en ont approuvé le contenu. Il exprime également toute sa reconnaissance aux Docteurs Peter Wright, Matthias Greiner et Susan Sutherland pour leur lecture constructive du manuscrit. Cet article développe les principes de validation des épreuves de diagnostic pour les maladies infectieuses, décrits dans le Manual of standards for diagnostic tests and vaccines de l'oie (12). Les précisions apportées ici devraient permettre de donner plus de clarté aux questions et aspects essentiels de la validation d'une épreuve.

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