Les banques BAC à l ère des nouvelles technologies de séquençage : l exemple du génome du blé.

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1 Les banques BAC à l ère des nouvelles technologies de séquençage : l exemple du génome du blé. Hélène BERGES GentoToul - Décembre 2010 CNRGV-INRA Castanet-Tolosan France

2 Le Centre National de Ressources Génomiques Végétales Création en 2004 par l INRA (DGAP) ISO 9001:2000 Dépositaire de banques génomiques d importance pour la communauté Octobre 2005 scientifique banques génomiques (BAC, cdna...) Une structure d appui aux projets de recherche en génomique végétale Diffuser les banques génomiques (respect des statuts : MTA) Proposer outils et prestations pour le repérage de séquences d intérêt Créer de nouvelles ressources Mettre en œuvre des solutions innovantes

3 Les ressources biologiques : Banques de BACs et ADNc Arabidopsis thaliana 5 cdna libraries Medicago Truncatula 4 BAC libraries Triticum aestivum 5 BAC libraries Solanum lycopersicum 3 BAC libraries Helianthus annus L. 2 BAC libraries Nicotiania tabacum cdna library Vitis Vinifera 2 BAC libraries Brassica napus 2 cdna libraries / BAC library Plus de 100 banques disponibles Plus de 7 millions d échantillons uniques 2 à 3 copies Traçabilité via GenoLIMS Capsicum annum BAC library Raphanus sativus BAC library Zea mays cdna Library Hordeum vulgare 5 BAC libraries Cucumis melo BAC library Secale cereale BAC library

4 Les services associés : outils génomiques et criblage Distribution de clones de banques de BAC et cdna Production de macroarrays Criblage de Macroarrays Distribution de clones unitaires, partie ou intégralité de collection Densités de clones variables (de 2304 à clones) selon schémas de dépôts Criblage par hybridation (marquage de la sonde jusqu à la révélation des clones positifs) Production de Pools d ADN Criblage de pools d ADN Banques Génomiques Mélange de clones bactériens selon une matrice 2 ou 3-D Criblage par PCR Création de nouvelles banques picking de colonies

5 Les principales étapes de la construction de Banques BAC (protocol according to Paterson Chalhoub and modified) Extraction noyaux à partir de matériel jeune congelé Extraction noyaux Test qualité ADN HMW Digestion partielle BAC library «Sizings» Elution ADN grands fragments Picking QPix Colony picking + Quality tests and characterization Ligation dans vecteur BAC + Transformation

6 Les banques génomiques : Le point de départ de nombreuses questions scientifiques Piment b Blé b Vigne b Colza b A. thaliana b Génomes végétaux : Grande taille Fort % d éléments répétés été Duplications, polyploïdie Maïs b Banques BAC Repérage de séquences d intérêt Clonage positionnel Séquençage de novo de Génome Exploration de la diversité

7 Banques BAC Repérage de séquences d intérêt Clonage positionnel 1 - Marqueurs disponibles sur une zone d intérêt marqueurs génétiques liés à des QTL marqueurs liés à des gènes d intérêt marqueurs sur séquences conservées (familles de gènes) Criblage des banques BAC hybridation de membranes sondes radioactives Criblage PCR de pools 3 - Identification de clones BACs et Séquençage -> identification de gènes candidats Explication bases moléculaires de certains caractères Identification différents allèles / copies de gènes. Étude structurale t et fonctionnelle des génomes

8 Banques BAC Repérage de séquences d intérêt Clonage positionnel onnel ANR project- Plant Genomic Network Génoplante Sunyfuel : Améliorer la qualité et les rendements de production du tournesol pour les biocarburants par des approches concertées de génétique et génomique / Dr.Patrick Vincourt Mildiou IV : Etude de la résistance du tournesol au mildiou (Plasmopara halstedii) / Dr.Patrick Vincourt Cartographie du locus S d auto-incompatibilité chez la chicorée UMR USTL/INRA1281 SADV "Stress abiotiques et différenciation des végétaux cultivés", Lille Dr MC Quillet T Hendriks Eucalyptus BAC libraries as tools to identify and characterize genomic sequences involved in wood formation Dr. Jacqueline Grima-Pettenati UMR 5546 Toulouse / Dr. Jorge Paiva Portugal ANR project- Plant Genomic Network Génoplante Phytosol2 : Validation fonctionnelle de gènes candidats pour un QTL à spectre large agissant sur la résistance aux Phytophthora chez les Solanacées /Dr. Véronique Lefebvre Avignon

9 Banques BAC Séquençage des génomes Clones BAC «unités assemblables» BACs ancrés sur la carte génétique Clones BAC Carte génétique BACs caractérisés par fingerprinting carte physique Minimum Tilling Path = BACs à séquencer Combinaison possible avec d autres sources de p séquences Ex : BAC en shotgun Solexa

10 Banques BAC Séquençage des génomes Genomics of Sunflower France (INRA LIPM) Canada USA Production des banques BAC Sugarcane Genome Sequencing Initiative Strategies for Sequencing a Highly Complex Genome France (INRA CIRAD) Brésil Australie Afrique du Sud «Définition du MTP pour le séquençage du chr7 de la Tomate». Laboratoire de Génomique et Biotechnologies des fruits INRA - ENSAT Castanet Tolosan Seventh framework programme Food Agriculture and Fisheries, Biotechnology / Genomics for Triticeae improvement /Vers la caractérisation du génome du blé et de l'orge /Dr Catherine Feuillet

11 Les projets aboutis de séquençage de génomes de plantes

12 Les projets de séquençage en cours Feuillet et al., 2010

13 Importance socio-économique du blé Le blé est une source d alimentation essentielle pour un tiers de la population mondiale Le blé dont 95% correspond à du blé héxaploide (T. aestivum) est cultivé dans plus de 120 pays, sur environ 200 millions d ha (17% des surfaces cultivées) pour une production de plus de 600 Mt/an L Europe (138 Mt/an) et en son sein la France (35 Mt/an) sont les plus gros producteurs et plus de la moitié de la production est exportée (important pour la balance commerciale) Mtonnes/ China India USA France ygermany yturkey Pakistan Canada.RussianF. Argentina Utilisation également pour les animaux et dans l industrie non alimentaire

14 Le génome du blé : un défi Brachypodium Humain ~ Mb Taille moyenne de génomes de plantes ~ Mb 17,000 Mb 5,000 Mb 2,300 Mb 90% 140 Mb 10% 355 Mb 50-80% 70-80% Séquences répétées 50% 120 fois le génome d A.thaliana h 45 fois le génome du riz & Brachypodium A. thaliana (2x) Riz(2x) Maïs (2x) Orge (2x) Blé tendre(6x) Le génome du blé représente un défi en termes d études de son génome et de séquençage

15 Le génome du blé : un défi Qu est ce qui rend le génome du blé tendre si intéressant et si complexe? - Grand génome de Mb (5 fois la taille du génome humain et 40 fois le génome du riz) - 90 % de séquences répétées: complexité (~1.2% genes) - Génome hexaploïde (issu d un dun croisement interspécifiques et polyploïdization) (2n = 6x = 42, AABBDD genome) Riz 430 Mb Maïs 2600 Mb [ Feuillet et al; 2006]

16 Des méthodes qui réduisent le coût et la complexité de l analyse 1.Tri des Chromosomes Institute of Experimental Botany Jaroslav Dolezel Sheath fluid LLaser Excitation light Flow chamber Chromosomes in suspension Fluorescence emission L Flow karyotype mberofevents R Chromosomes: Mbp ( % of the genome) 3B Deflection plates Scattered light Num Relative fluorescence intensity Flow sorted chromosomes Left collector Right collector Flow sorted chromosomes Chromosome arms: Mbp ( % of the genome) Waste 1BS Banques BAC chromosomes spécifiques - 3B (Safar et al, 2004) - 14 Banques BAC chromosomes/ou bras chromosomique spécifiques

17 Des méthodes qui réduisent le coût et la complexité de l analyse 2. Next Generation Sequencing La séquence du génome du blé pour moins de 10M d Quel qualité de séquences? Pour qui et pour quoi? Fournir aux sélectionneurs, agronomes et industriels des outils et technologies de pointe aussi performants que pour les autres céréales

18 Approches combinées pour l établissement d une séquence de référence du génome du blé Etablissement de cartes physiques des chromosomes individualisés Whole Genome Shotgun (454) (re)sequençage ciblé sur des régions séquençage global de séquençage du (454/Solexa) chromosome individualisé (454/Solexa) MTP (454) catalogue de gènes marqueurs marqueurs SNP Obtenir une séquence de référence ancrée sur la Obtenir une séquence de référence ancrée sur la carte génétique et phénotypique

19 Construction de banques BAC chromosomes spécifiques clones BAC cvchinese Spring (T. aestivum) clones BAC clones BAC TOTAL (Nov 2010) : clones BAC (~ 15 x, 120 kb) libraries/cereals

20 Etablissement d une carte physique 1. Construction de la banque BAC 2. Assemblage des fragments en contigs analyse des fragments (fingerprint) et comparaison entre eux afin d identifier les fragments de la même région chromosome 3B = pb fragments de chromosome (BACs) 3. Reconstruction du chromosome Assemblage en groupes (contigs) par traitement informatique des données (FPC) contigs pour les BACs du 3B contigs Utilisation de marqueurs moléculaires ancrés sur la carte génétique dont l ordre est connu Marqueurs

21 Carte physique du génome du blé 1A 2A 3A 4A 5A 6A 7A 1B 2B 3B 4B 5B 6B 7B Financement Financement partiel Réalisé él é 1D 2D 3D 4D 5D 6D 7D T. Aestivum cv Chinese Spring org

22 Séquençage global de chromosome individualisé 454 Titanium Illumina 1A 2A 3A 4A 5A 6A 7A Fully funded with support from 1B 2B 3B 4B 5B 6B 7B 1D 2D 3D 4D 5D 6D 7D T. aestivum cv Chinese Spring Led for the IWGSCby Jane Rogers

23 Intérêt de la disponibilité de la séquence génomique riz blé Nb de QTL clonés chez le riz (bleu) et le blé (rouge) depuis La flèche bleue indique l année de publication de la séquence du riz Feuillet et al., 2010

24 Banque BAC Etude de diversité : Intérêt des banques BAC «à façon» Informations (marqueurs, séquences) disponibles uniquement sur un génotype de référence choisi par la communauté scientifique de l espèce Objectif : Disposer de l information sur des génotypes d intérêt ciblés en limitant les coûts liés à la construction d un banque BAC classique Criblages ponctuels (une ou quelques zones d intérêt) Identification puis séquencage de gène(s) commandant un caractère spécifique chez un génotype d intérêt Compléter des «gap» dans zones séquencées

25 Projet sur génotype blé tendre HOPE Partenaire : CSIRO Australia, W. Spielmeyer Objectif : Compléter la carte physique du locus Sr2 de la lignée Hope de Blé Le gène Sr2 confère une résistance à la rouille noire du blé (Puccinia Graminis) Une carte physique de la zone a été établie grâce à une banque chromosome spécifique mais il reste des trous à combler markers centromere C12F (1 ) D7R (2) (3) D10-C5 Ger1Inte (4) nd (5) (6) LRfare Ger6 ( p4d6-r Rend (7) p4e8-f Fend (8) p4f1-f Fend (9) Ger7 (1 10) p4d6-f Fend (11) rb-ssr (12) FrB-Tr (13) p4f1-f P4F1- p2b5-f Fend (14) Fend (15) Rend (16) p5c9-f p3a5-r B2-Re end (17) 8) FMO (1 C12 Bac clones Gap 1 ~85kb D7 C9 Gap 2 size? Gap 3 size? D10 A8 p4d6 p4f1 p4e8 p3a5 p2b5 p5c9 B2 ~300kb contig ~85-110kb ~ kb

26 Intérêt des banques BAC «à façon» Création d une banque à partir d un génotype spécifique dans l objectif de caractériser rapidement une région génomique d intérêt Séquençage des BACs

27 Séquençage de BACs en collaboration avec PlaGe 454 Roche Titanium sur plateforme Génomique de Toulouse Préparation des échantillons en commun (10 BACs / 8 e de run) Séquençage, transfert et analyse des données Séquençage réalisé par la Plateforme Génomique avec l équipe de recherche Transfert des données et analyses qualitatives sur la Plateforme Bioinformatique Analyse des séquences par la Plateforme Bioinformatique Collaboration Equipe de Recherche/Plateforme Bioinfo

28 Production de banque BAC «à façon» : nombreux projets en cours Un outil intéressant pour la caractérisation de région génomiques d intérêt au sein de génotypes spécifiques (QTL de résistances, qualité ) Blé, orge, café, piment,. - Jérôme Salse - INRA Clermont-Ferrand - Pierre Sourdille - INRA Clermont-Ferrand - Wolfgang Spielmeyer - CSIRO -Australie - Jan Gielen Syngenta Saint Sauveur - Evans Lagudah - CSIRO Canberra -Australie - Philipe Lashermes CIRAD Montpellier - Elena Salina - Institute of Cytology and Genetics - Russie Développements méthodologiques en cours

29 Arnaud BELLEC Sonia VAUTRIN Nicolas HELSMTETTER Ingrid MERCIER Genséric BEYDON Joëlle FOURMENT Elisa PRAT Nadine GAUTIER Marie BERNARD Stéphane CAUET David PUJOL Laetitia HOARAU Hélène BERGES INRA, Clermont-Ferrand Catherine Feuillet Etienne Paux Pierre Sourdille International Wheat Genome Sequencing Consortium CSIRO, Canberra Wolgang Spielmeyer Evans Lagudah Equipe PlaGE Cécile DONNADIEU D Olivier BOUCHEZ Jêrome LLUCH Merci! Equipe Bioinformatique i : Christophe KLOPP