MagSep Tissue gdna Kit

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1 ation e gdna Kit FR) tilisation Register your instrument! Notice d'utilisation

2 Copyright 2014 Eppendorf AG, Hamburg. All rights reserved, including graphics and images. No part of this publication may be reproduced without the prior permission of the copyright owner. Eppendorf and the Eppendorf logo are registered trademarks of Eppendorf AG, Germany. epmotion and ept.i.p.s. are registered trademarks of Eppendorf AG. Registered trademarks and protected trademarks are not marked in all cases with or in this manual /012015

3 Sommaire 3 Sommaire 1 Notes d'application Utilisation de ce manuel Symboles de danger et niveaux de danger Symboles de danger Niveaux de danger Convention de représentation Désignation Illustration d'ensemble Pièces inclues dans la livraison Consignes générales de sécurité Utilisation appropriée Dangers résultant d'une utilisation correcte Symboles de sécurité sur les réactifs Phrases de danger Phrases de précaution Utilisation Principe de base Spécifications du kit Préparations Préparation d'échantillon Préparation des composants du Démarrer la procédure Procédure Finition Terminer la procédure Procédures d'élution Résolution des problèmes Transport, stockage et mise au rebut Conditions de conservation Données techniques Nomenclature de commande Pointes de pipette recommandées Autres pointes de pipettes Kits MagSep

4 4 Notes d'application 1 Notes d'application 1.1 Utilisation de ce manuel Avant d'utiliser ce produit pour la première fois, veuillez lire le manuel en entier. Lire le manuel du logiciel et le manuel du matériel de l'epmotion. Ce manuel fait partie intégrante du produit et doit être conservé à un endroit accessible. 1.2 Symboles de danger et niveaux de danger Les consignes de sécurité de ce manuel contiennent les symboles de danger et de niveaux de danger suivants : Symboles de danger Danger général Niveaux de danger DANGER AVERTISSEMENT ATTENTION AVIS Va entraîner des blessures graves ou la mort. Peut entraîner des blessures graves ou la mort. Peut causer des blessures de légère à moyenne gravité. Peut entraîner des dommages matériels. 1.3 Convention de représentation Représentation Signification 1. Actions dans l'ordre indiqué 2. Actions sans ordre indiqué Liste Texte Texte affiché ou du logiciel Informations supplémentaires

5 Désignation 5 2 Désignation 2.1 Illustration d'ensemble Abb. 2-1: Fig. 2-1: 1 Tissus BB (Tampon de Liaison) 2 Tissus WB 1 (Tampon de Lavage) 3 Tissus WB 2 (Tampon de Lavage) 4 Tissus WB 3 (Tampon de Lavage) Les numéros sur l'image correspondent au nombre de réactifs dans le. 2.2 Pièces inclues dans la livraison 5 Billes pour Tissus 6 Tissus ProK (Protéinase K) 7 Tissus LB (Tampon de Lyse) 8 Tissus EB (Tampon d'élution) Quantité Description Portion 4 Tissus BB (Tampon de Liaison) 11 ml 4 Tissus WB 1 (Tampon de Lavage) 18 ml 4 Tissus WB 2 (Tampon de Lavage) 18 ml 4 Tissus WB 3 (Tampon de Lavage) 26 ml 4 Billes pour Tissus 0,7 ml 4 Tissus ProK (Protéinase K) 30 mg 4 Tissus LB (Tampon de Lyse) 6 ml 4 Tissus EB (Tampon d'élution) 6 ml 4 Tissus PB (Tampon de Protéinase) 1,4 ml 4 Tissue RNase A (ribonucléase A) 6 mg 4 Tubes Safe-Lock de 2,0 ml Pack de 50 tubes LoBind pour ADN 1 Manuel pour kit MagSep Tissue gdna

6 6 Consignes générales de sécurité 3 Consignes générales de sécurité 3.1 Utilisation appropriée Les composants ont été développés, conçus, distribués et vendus uniquement pour les besoins de la recherche. Ils sont conçus uniquement pour les applications in-vitro. Nous déclinons toute responsabilité pour leur utilisation pour l'identification d'un organisme particulier ou pour leur usage clinique (diagnostique, pronostique, thérapeutique ou banque de sang). En outre, il est de la responsabilité de l'utilisateur de vérifier l'usage du pour un domaine d'application spécifique, car la performance de ce kit n'a pas été vérifiée pour un programme en particulier. 3.2 Dangers résultant d'une utilisation correcte DANGER! Danger dû aux réactifs dans le. MagSep Kits contient des composants dangereux. Portez votre équipement de protection personnelle. Suivre les consignes de sécurité au chapitre Symboles de sécurité. 3.3 Symboles de sécurité sur les réactifs Composant Contenu dangereux Tissus BB Éthanol (Tampon de 35 % 55 % Liaison) Perchlorate de sodium 20 % 40 % Symbole GHS GHS02 GHS07 Phrases de danger Phrases de précaution CAS WARNING Tissus WB 1 Éthanol (Tampon de 20 % 35 % Lavage) Tissus WB 2 Éthanol (Tampon de 20 % 35 % Lavage) Tissus WB 3 Éthanol (Tampon de 55 % 75 % Lavage) GHS02 WARNING GHS02 WARNING GHS02 DANGER

7 Consignes générales de sécurité 7 Composant Contenu dangereux Tissus ProK (Protéinase K) Protéinase K Tissue RNase A RNase A (ribonucléas e A) Symbole GHS GHS07 GHS08 GHS07 GHS08 DANGER DANGER Phrases de danger H315 H317 H319 H334 H335 H317 H334 Phrases de précaution P261 P264 P271 P272 P280 P302+P352 P304+P340 P305+P351 +P338 P312 P333+P313 P337+P313 P342+P311 P363 P403+P233 P405 P261 P272 P280 P302+P352 P304+P340 P333+P313 P342+P311 P363 CAS Phrases de danger H315 H317 H319 H334 H335 Provoque l'irritation de la peau. Peut provoquer une réaction allergique cutanée. Provoque une irritation oculaire grave. Peut provoquer des symptômes d'allergie ou d'asthme ou des difficultés respiratoires en cas d'inhalation. Peut provoquer une irritation des voies respiratoires.

8 8 Consignes générales de sécurité Phrases de précaution P261 P264 P271 P272 P280 P302+P352 P304+P340 P305+P351+ P338 P312 P333+P313 P337+P313 P342+P311 P363 P403+P233 P405 Éviter de respirer poussière / fumées / gaz / brumes / vapeurs. Laver méticuleusement après manipulation. Utiliser uniquement en extérieur ou dans un endroit bien ventilé. Les vêtements de travail contaminés ne devraient pas être portés en dehors de l'espace de travail. Porter des gants de protection / une protection oculaire. EN CAS DE CONTACT AVEC LA PEAU : Laver abondamment à l'eau et au savon. EN CAS D'INHALATION : Amener la victime à un endroit où l'air est frais et la mettre dans une position confortable pour respirer. EN CAS DE CONTACT AVEC LES YEUX : Rincer à l'eau en continu pendant plusieurs minutes. Retirer les lentilles de contact éventuelles si elles sont faciles à enlever et continuer le rinçage. Contacter un CENTRE ANTIPOISON ou un médecin si vous ne vous sentez pas bien. En cas d'irritation de la peau d'éruption cutanée : Consulter un médecin. Si l'irritation oculaire persiste, consulter un médecin. En cas de difficultés respiratoires : Appeler un CENTRE ANTIPOISON / un médecin. Laver les vêtements contaminés avant réutilisation. Conserver dans un endroit bien ventilé. Garder le récipient bien fermé. Garder fermé à clé.

9 Utilisation 9 4 Utilisation 4.1 Principe de base La procédure de purification est basée sur l'adsorption réversible des acides nucléiques sur des billes paramagnétiques dans des conditions de tampon appropriées. Les échantillons de tissus, de cellules ou de bactéries sont lysés avec Tissus LB (Tampon de Lyse) et de la protéinase K. Les billes magnétiques sont ajoutées après incubation de lyse. Les conditions de liaison, qui forcent l'adn à se lier aux billes magnétiques, sont réglées en ajoutant Tissus BB (Tampon de Liaison). Après la séparation magnétique et le retrait du surnageant, les billes paramagnétiques sont nettoyées trois fois pour retirer els contaminants et le sel, puis une étape de séchage à haute température a lieu. Pour finir, l'adn purifié est élué avec du Tissus EB (Tampon d'élution) à faible taux de sel et peut être utilisé directement pour les applications en aval. En option, pour obtenir de l'adn pur, les quantités d'arn non souhaitées ou en excès peuvent être retirées en réalisant une digestion à la ribonucléase A (RNase A) selon les protocoles de préparation d'échantillon correspondants. Le est optimisé pour l'utilisation avec le système de pipetage automatisé Eppendorf epmotion Spécifications du kit Le est conçu pour la préparation rapide, automatisée et à petite échelle d'adn génomique haute pureté à partir d'échantillons de tissus, de cellules ou de bactéries au moyen de la technologie 3D MagStep sur le système epmotion. L'ADN obtenu est prêt à l'emploi comme modèle pour la PCR, le transfert ou toute sorte de réaction enzymatique. La durée réelle du processus dépend du nombre d'échantillons par lot. Le peut être utilisé pour la préparation d'adn génomique à partir de tissus, de bactéries et de nombreuses autres sources (par exemple, queues de souris ou de rat, prélèvements d'oreilles de souris, levures, selles). Des enzymes supplémentaires peuvent être nécessaires pour la lyse de certaines souches de bactéries et de levures. Ces enzymes ne sont pas comprises dans ce kit, voir le protocole d'assistance correspondant pour plus de détails. Pour une digestion de l'arn en option, du RNase A est fourni avec le kit. Les billes de tissus sont des billes paramagnétiques hautement réactives. Leur capacité de liaison est environ de 0,4 μg de gadn pour 1 μl de suspension de billes de tissus. 1 μl de suspension contient 130 μg de billes.

10 10 Utilisation 4.2 Préparations Préparation d'échantillon Utiliser des tubes appropriés à la centrifugation Échantillon de tissu Matériau d'échantillon : jusqu'à 25 mg de tissu Préparation de l'échantillon 1. Placer les échantillons dans un tube approprié à la centrifugation. Échantillon à lyser 2. Ajouter 25 μl Tissus ProK (Protéinase K) de solution. 3. Ajouter 200 μl Tissus LB (Tampon de Lyse). 4. Agiter pendant 1 h 3 h, ou pendant une nuit à 56 C En option 5. Refroidir le lysat à la température ambiante. 6. Ajouter 10 μl Tissue RNase A (ribonucléase A). 7. Laisser incuber pendant 10 min à la température ambiante. Continuer 8. Centrifuger pendant 5 min à 5600 g. 9. Transférer 225 μl de surnageant dans les tubes Safe-Lock de 2,0 ml fournis avec le kit. 10.Procéder avec l'assistant de Préparation pour le lysat de tissus Cellules de mammifères ou de bactéries gram-négatives Matériau d'échantillon : jusqu'à cellules ou 1 ml de culture nocturne de bactéries Préparation de l'échantillon 1. Transférer les échantillons dans des tubes 2 ml. 2. Centrifuger pendant 5 min à g. 3. Retirer le surnageant. 4. Vortexer pour remettre le culot de cellules en suspension. En option 5. Ajouter 10 μl Tissue RNase A (ribonucléase A). 6. Laisser incuber pendant 10 min à la température ambiante. 7. Procéder avec l'assistant de Préparation pour les culots de cellules / bactéries.

11 Utilisation Échantillon de queue de souris ou de rat ou d'oreille de souris Matériau d'échantillon : deux morceaux de queue de souris de 0,6 cm ou un morceau de queue de rat de 0,6 cm (jusqu'à 25 mg). Préparation de l'échantillon 1. Placer les échantillons dans un tube de 1,5 ml approprié à la centrifugation. Échantillon à lyser 2. Ajouter 200 μl Tissus LB (Tampon de Lyse). 3. Ajouter 25 μl Tissus ProK (Protéinase K) de solution et vortexer. 4. Laisser incuber à 56 C pendant la nuit ou jusqu'à obtention d'une lyse complète. Vortexer occasionnellement pendant l'incubation. 5. Pour retirer les débris tels que les résidus d'os ou de cheveux, centrifuger 5 min à grande vitesse, par exemple g. 6. Transférer 225 μl de surnageant dans le tube Safe-Lock de 2,0 ml fourni avec le kit. En option 7. Ajouter 10 μl Tissue RNase A (ribonucléase A). 8. Laisser incuber pendant 10 min à la température ambiante. 9. Procéder avec le pour la lyse des tissus Échantillon de bactéries difficile à lyser Certaines souches, en particulier les bactéries gram-positives, sont plus difficiles à lyser. La pré-incubation avec une enzyme lytique est nécessaire dans ces cas. Il est possible d'utiliser jusqu'à 1 ml de culture bactérienne pour la préparation en fonction par exemple de la densité de culture, du milieu de culture et de la souche bactérienne. Matériau d'échantillon : culture bactérienne nocturne jusqu'à 1 ml Préparation de l'échantillon 1. Transférer les échantillons dans des tubes appropriés à la centrifugation. 2. Centrifuger pendant 5 min à g. 3. Retirer le surnageant. Échantillon à lyser 4. Remettre en suspension les cellules dans 250 μl de tampon contenant 20 mm Tris/ HCl, 2 mm EDTA ; 1 % Triton X-100, ph 8 (au lieu de Tissus LB (Tampon de Lyse)) complété par 20 mg/ml de lysozyme ou 0,2 mg/ml de lysostaphine. 5. Laisser incuber pendant 30 min 60 min à 37 C. 6. Ajouter 25 μl Tissus ProK (Protéinase K) de solution et laisser incuber à 56 C jusqu'à obtention d'une lyse complète. 7. Si des particules insolubles sont visibles, centrifuger pendant 5 minutes à grande vitesse, par exemple g. 8. Transférer 225 μl de lysat / surnageant dans les tubes Safe-Lock de 2,0 ml fournis avec le kit.

12 12 Utilisation En option 9. Ajouter 10 μl Tissue RNase A (ribonucléase A). 10.Laisser incuber pendant 10 min à la température ambiante. 11.Procéder avec l'assistant de Préparation pour le lysat de tissus Échantillon de levure Matériau d'échantillon : jusqu'à 3 ml de culture cellulaire YPD (OD600 10) Préparation de l'échantillon 1. Transférer l'échantillon dans des tubes appropriés à la centrifugation. 2. Centrifuger pendant 10 min à g. 3. Retirer le surnageant. 4. Laver les cellules une fois avec 1 ml 10 mm EDTA, ph Centrifuger pendant 10 min à g. 6. Retirer le surnageant. Échantillon à lyser 7. Remettre en suspension les granulés dans 600 μl de tampon de sorbitol buffer (1,2 M sorbitol, 10 mm CaCl 2, 0,1 M Tris/HCl ph 7,5, 35 mm ß-mercaptoéthanol). 8. Ajouter 50 U de lyticase ou de zymolyase. Les autres protocoles utilisent 5 U 200 U de lyticase ou de zymolyase selon la qualité ou la marque de l'enzyme. Il peut être nécessaire d'augmenter la concentration d'enzyme s'il n'y a pas formation de sphéroplastes. 9. Laisser incuber à 30 C pendant 30 min. Cette étape dégrade la paroi des cellules de levure, créant ainsi des sphéroplastes. On peut contrôler la formation de sphéroplastes au microscope. 10.Centrifuger le mélange pendant 10 min à g. 11.Retirer le surnageant. 12.Remettre en suspension les sphéroplastes en granulés dans 200 μl de Tissus LB (Tampon de Lyse). 13.Ajouter 25 μl Tissus ProK (Protéinase K) de solution et vortexer vigoureusement. 14.Laisser incuber à 56 C jusqu'à obtention d'une lyse complète, au moins 1 h 3 h. Vortexer occasionnellement pendant l'incubation. 15.Si des particules insolubles sont visibles, centrifuger pendant 5 minutes à grande vitesse, par exemple g. 16.Transférer 225 μl de lysat / surnageant dans le tube Safe-Lock de 2,0 ml fourni avec le kit. En option 17.Ajouter 10 μl Tissue RNase A (ribonucléase A). 18.Laisser incuber pendant 10 min à la température ambiante. 19.Procéder avec l'assistant de Préparation pour le lysat de tissus.

13 Utilisation Échantillon ponctuel de sang séché Matériau d'échantillon : une ou deux taches de sang séché Préparation de l'échantillon 1. Découper les taches de sang séché aussi précisément que possible. 2. Couper les taches en petits morceaux et les mettre dans un tube de 1,5 ml. La surface des taches de sang séché doit être comprise entre 15 mm 2 et 30 mm 2. Échantillon à lyser 3. Ajouter 200 μl Tissus LB (Tampon de Lyse) et mélanger en vortexant. 4. Placer les échantillons dans un bloc chauffant et les chauffer pendant 10 min à 94 C. 5. Laisser les échantillons refroidir. 6. Ajouter 25 μl Tissus ProK (Protéinase K) de solution. 7. Tourner brièvement les échantillons et les vortexer à 56 C pendant 1 h. Vortexer périodiquement pendant l'incubation. S'assurer que les échantillons sont complètement recouverts par Tissus LB (Tampon de Lyse) durant l'incubation. 8. Transférer 225 μl de surnageant dans le tube Safe-Lock de 2,0 ml fourni avec le kit. En option 9. Ajouter 10 μl Tissue RNase A (ribonucléase A). 10.Laisser incuber pendant 10 min à la température ambiante. 11.Procéder avec l'assistant de Préparation pour le lysat de tissus Échantillons de selles Matériau d'échantillon : jusqu'à 250 mg de selles. Préparation de l'échantillon 1. Placer l'échantillon dans un tube approprié à la centrifugation. 2. Ajouter 1 ml de tampon TE (10 mm Tris/Cl, 1 mm EDTA, ph 8). 3. Remettre en suspension l'échantillon pendant 30 s en le vortexant vigoureusement. 4. Centrifuger l'échantillon pendant 15 min à g. 5. Retirer le surnageant. 6. Remettre en suspension le granulé dans 0,2 ml 1 ml de Tissus LB (Tampon de Lyse). Utiliser autant de tampon que nécessaire pour bien remettre en suspension l'échantillon. Le granulé préparé contient entre autres composants des cellules du tube digestif et des bactéries. 7. Transférer 200 μl de l'échantillon remis en suspension dans le nouveau tube approprié à la centrifugation. Échantillon à lyser 8. Ajouter 25 μl Tissus ProK (Protéinase K) de solution. 9. Vortexer l'échantillon et le laisser incuber à 56 C pendant 1 h - 3 h jusqu'à obtention d'une lyse complète. Vortexer occasionnellement pendant l'incubation ou utiliser un incubateur agitateur.

14 14 Utilisation 10.Si des particules insolubles sont visibles, centrifuger pendant 5 minutes à grande vitesse, par exemple g. 11.Transférer 225 μl de lysat / surnageant dans un tube de 2,0 ml. En option 12.Ajouter 10 μl Tissue RNase A (ribonucléase A). 13.Laisser incuber pendant 10 min à la température ambiante. 14.Procéder avec l'assistant de Préparation pour le lysat de tissus Échantillon de tissu inclus dans la paraffine Matériau d'échantillon : jusqu'à 25 mg de tissu inclus dans la paraffine 1. Préparer des sections à partir de blocs de tissus fixes inclus. 2. Si possible, retirer la paraffine en excès du bloc avant de découper des tranches. 3. Manipuler les sections avec des pinces ou des cure-dents. 4. Ajouter 1 ml de xylène ou de n-octane. 5. Agiter vigoureusement et laisser incuber à la température ambiante pendant environ 30 minutes. Vortexer occasionnellement pendant l'incubation ou utiliser un incubateur agitateur. 6. Centrifuger pendant 3 min à g. 7. Retirer le surnageant. 8. Ajouter 1 ml d'éthanol, 96 % 100 %. 9. Fermer et mélanger en inversant plusieurs fois. 10.Centrifuger pendant 3 min à g. 11.Retirer le surnageant. 12.Répéter le lavage de l'éthanol. 13.Retirer autant d'éthanol que possible. 14.Laisser incuber le tube ouvert à 37 C jusqu'à ce que l'éthanol se soit évaporé, environ ~ 15 min. Échantillon à lyser 15.Ajouter 200 μl Tissus LB (Tampon de Lyse) 16.Ajouter 25 μl Tissus ProK (Protéinase K) de solution et vortexer. 17.Laisser incuber à 56 C pendant 1 h 3 h ou pendant la nuit. Vortexer occasionnellement pendant l'incubation ou utiliser un incubateur agitateur. 18.Nettoyer le lysat en centrifugeant à 5600 g. 19.Transférer 225 μl de surnageant dans le tube Safe-Lock de 2,0 ml fourni avec le kit. En option 20.Ajouter 10 μl Tissue RNase A (ribonucléase A). 21.Laisser incuber pendant 10 min à la température ambiante. 22.Procéder avec l'assistant de Préparation pour le lysat de tissus.

15 Utilisation Préparation des composants du Tous les tampons sont fournis prêts à l'emploi Manipulation du Billes pour Tissus La distribution homogène des billes magnétiques à chaque tube dans le PrepRack est essentielle pour une bonne cohérence d'un tube à l'autre. 1. Avant de charger le plateau sur le epmotion, s'assurer que les Billes pour Tissus sont complètement remis en suspension. 2. Bien secouer le récipient de stockage ou le mettre brièvement dans un vortex. 3. Pour éviter un résultat de mesure incorrect du capteur optique, s'assurer qu'il n'y a pas de gouttes Billes pour Tissus dans le capuchon ou sur la paroi intérieure du récipient. 4. Placer correctement le récipient dans le plateau. Presser soigneusement le récipient vers le bas après l'avoir réinséré dans le plateau Préparation de la solution Tissue RNase A (ribonucléase A) Nous recommandons de préparer une solution fraîche Tissue RNase A (ribonucléase A) pour chaque set de 24 réactifs. 1. Ajouter 600 ml d'eau et mélanger doucement pour dissoudre le Tissue RNase A (ribonucléase A) lyophilisé. Cette solution Tissue RNase A (ribonucléase A) peut être conservée à 4 C jusqu'à 3 mois. Divisée en aliquots, la solution Tissue RNase A (ribonucléase A) peut être conservèe à -20 C pour une période plus longue Préparation de la solution Tissus ProK (Protéinase K) Nous recommandons de préparer une solution fraîche Tissus ProK (Protéinase K) pour chaque set de 24 réactifs. 1. Ajouter 1,1 ml de Tissus PB (Tampon de Protéinase) et mélanger doucement pour dissoudre le Tissus ProK (Protéinase K) lyophilisé. Cette solution Tissus ProK (Protéinase K) est stable à -20 C jusqu'à 6 mois. 2. Avant la prochaine utilisation, mélanger doucement la solution Tissus ProK (Protéinase K). 3. Placer la solution Tissus ProK (Protéinase K) en position Démarrer la procédure Prérequis epmotion est prêt à fonctionner. S'assurer que tous les échantillons et tous les composants du kit sont.préparés comme décrit.

16 16 Utilisation 1. Transférer les échantillons dans les tubes Safe-Lock de 2,0 ml fournis avec le kit. 2. Placer les tubes d'échantillon / élution rangée par rangée dans les racks, en commençant à la position Pour l'extraction du gadn depuis les cellules ou les granulés de bactéries, mettre la solution Tissus ProK (Protéinase K) à la position 6 dans le plateau. 4. Vortexer le Billes pour Tissus. 5. Ouvrir les flacons de réactif. 6. Vider le reste de liquide. 7. Démarrer l'application Assistant de Préparation sur la tablette EasyCon. L'assistant logiciel vous guide dans la configuration de la purification automatique des acides nucléiques. 4.3 Procédure Procédure en epmotion pour Lisat de tissu Granulés de cellules / bactéries Étapes de la procédure Commande Description Échantillon de lyse (seulement pour les Reagent Transfer Distribuer 200 μl Tissus LB (Tampon de Lyse). granulés de cellules / bactéries) Reagent Transfer Distribuer 25 μl de protéinase K. Thermomixer Agiter pendant 10 min à 1200 rpm, 56 C. Lier NA à Billes pour Reagent Transfer Distribuer 24 μl Billes pour Tissus. Tissus Thermomixer Agiter pendant 30 s à rpm. Reagent Transfer Distribuer 360 μl Tissus BB (Tampon de Liaison). Thermomixer Agiter pendant 5 min à 900 rpm (granulé de cellules / bactéries : rpm). Séparation Séparer pendant 2 min à 25 C. Pool one Destination Retirer le surnageant. Thermomixer Agiter pendant 30 s à rpm. Premier lavage Reagent Transfer Distribuer 600 μl Tissus WB 1 (Tampon de Lavage). Thermomixer Agiter pendant 2 min à rpm, 25 C.

17 Utilisation 17 Étapes de la procédure Commande Séparation Séparer pendant 2 min. Pool one Destination Retirer le surnageant. Thermomixer Agiter pendant 30 s à rpm. 2e lavage Reagent Transfer Distribuer 600 μl Tissus WB 2 (Tampon de Lavage). Thermomixer Agiter pendant 2 min à rpm, 25 C. Séparation Séparer pendant 2 min. Pool one Destination Retirer le surnageant. Thermomixer Agiter pendant 30 s à rpm. 3e lavage Reagent Transfer Distribuer 800 μl Tissus WB 3 (Tampon de Lavage). Thermomixer Agiter pendant 2 min à rpm. Séparation Séparer pendant 2 min. Pool one Destination Retirer le surnageant. Étape de séchage Thermomixer Laisser incuber pendant 7 min à 55 C Thermomixer Agiter pendant 7 min à 1200 rpm, 55 C. Élution Reagent Transfer Distribuer μl Tissus EB (Tampon d'élution). Thermomixer Agiter pendant 5 min à rpm, 55 C. Séparation Séparer pendant 2 min. Sample Transfer Transférer l'adn élué. 4.4 Finition Terminer la procédure 1. Fermer la bouteille de réactif après usage. L'alcool peut s'évaporer Procédures d'élution Description L'élution de l'adn génomique purifié peut être effectuée à un volume de 25 μl 200 μl. Pour un ratio optimal de rendement et de concentration, effectuer l'élution en fonction de votre matériau d'échantillon avec un volume de 50 à 100 μl. Pour une performance optimale de l'adn dans les applications en aval suivantes, nous recommandons le stockage, en particulier à long terme, à -20 C. Plusieurs cycles de congélation / dégel n'interfèrent pas avec la plupart des applications en aval.

18 18 Résolution des problèmes 5 Résolution des problèmes Symptôme/message Origine Dépannage Ingrédients salins de Tissus LB (Tampon de Lyse) ou précipité de Tissus BB (Tampon de Liaison). Rendement d'adn faible ou nul. ARN détecté via l'électrophorèse sur gel ou rendement d'adn en excès quantifié. Stockage à basse température. Disposition incorrecte du flacon dans le plateau. Ingrédients salins de Tissus LB (Tampon de Lyse) ou précipité de Tissus BB (Tampon de Liaison). Faire incuber le tampon à 40 C et bien secouer. Vérifier la position de tous les réactifs dans le plateau. Faire incuber le tampon à 40 C et bien secouer. Lyse incomplète. L'échantillon n'est pas correctement homogénéisé et mélangé avec la protéinase K Tissus LB (Tampon de Lyse). Activité de la Protéinase K diminuée. Conserver la protéinase K dissoute à -20 C jusqu'à 6 mois. Trop de matériau d'échantillon utilisé. L'ARN a été co-purifié dans de grandes quantités. Faible pureté. Ingrédients salins de Tissus LB (Tampon de Lyse) ou précipité de Tissus BB (Tampon de Liaison). Ne pas utiliser plus de matériau d'échantillon que ce qui est recommandé (25 mg pour la plupart des types de tissus). Si des matières insolubles telles que des os ou des cheveux demeurent dans le lysat, séparer les débris et transférer le surnageant clair dans un tube de 2 ml adapté à la centrifugation avant de travailler sur l'epmotion. Digestion de l'arn par RNase A. Voir les options de protocole correspondantes. Faire incuber le tampon à 40 C et bien secouer.

19 Résolution des problèmes 19 Symptôme/message Origine Dépannage Trop de matériau d'échantillon utilisé. Transfert des billes Haute concentration d'adn dans l'éluat. Matériau d'échantillon incorrect ou en excès. Performance Disposition incorrecte insuffisante de l'adn dans le plateau. dans les applications en aval. Ne pas utiliser plus de matériau d'échantillon que ce qui est recommandé (25 mg pour la plupart des types de tissus). Si des matières insolubles telles que des os ou des cheveux demeurent dans le lysat, séparer les débris et transférer le surnageant clair dans un tube de 2 ml adapté à la centrifugation avant de travailler sur l'epmotion. Augmenter le volume d'élution. Réduire la quantité de matériau utilisé. Vérifier la position de tous les réactifs dans le plateau. Ingrédients salins de Tissus LB (Tampon de Lyse) ou précipité de Tissus BB (Tampon de Liaison). Faire incuber le tampon à 40 C et bien secouer. Évaporation d'éthanol depuis les tampons de lavage. Fermer les flacons de réactif après usage. Contamination croisée. L'option pointes réutilisables est S'assurer qu'un SafeRack est chargé. sélectionnée même s'il S'assurer que l'option pointes n'y a pas de SafeRack réutilisables n'est pas sélectionnée. chargé. Détection de niveau incorrecte. Récipient positionné de manière incorrecte. Solution de billes sur la paroi intérieure du récipient. S'assurer que le récipient est placé sur le fond du plateau. Presser soigneusement le récipient vers le bas après l'avoir réinséré dans le plateau. S'assurer qu'il n'y a pas de gouttes de solution de billes dans le capuchon ni sur la paroi intérieure du récipient.

20 20 Transport, stockage et mise au rebut 6 Transport, stockage et mise au rebut 6.1 Conditions de conservation Les flacons de réactifs doivent être stockés hermétiquement fermés. L'alcool peut s'évaporer. Tampons et billes du Solution Tissus ProK (Protéinase K) Solution Tissue RNase A (ribonucléase A) Stable à 18 C 25 C jusqu'à un an. Ne pas conserver à moins de 18 C, car les ingrédients salins peuvent précipiter. Stable à -20 C jusqu'à 6 mois. Stable à 4 C jusqu'à 3 mois. Pour un stockage d'un an maximum, la solution Tissue RNase A (ribonucléase A) doit être divisée en aliquots et conservée à -20 C. 7 Données techniques Technologie Technologie à billes magnétiques Matériau d'échantillon <25 mg de tissus, <10 6 cellules ou bactéries Taille du fragment 300 bp 30 kbp Rendement caractéristique 10 μg 20 μg A 260/280 1,7 1,9 Volume d'élution 25 μl 200 μl Capacité de liaison 0,4 μg de gadn pour 1 μl de suspension de billes de tissus

21 Nomenclature de commande 21 8 Nomenclature de commande 8.1 Pointes de pipette recommandées Les ept.i.p.s. Les Motion SafeRacks sont destinés à la réutilisation des pointes dans le cadre d'une application epmotion. Vous disposez de chambres pour la séparation des pointes voisines. Les chambres empêchent les contaminations croisées de restes de liquides dans les pointes usagées. L'utilisation d'ept.i.p.s. Motion SafeRacks est recommandée si vous avez choisi dans l'assistant du logiciel l'option Re-use tips. Ref. (International) Description ept.i.p.s. Motion Filter 50 µl 10 SafeRacks à 96 pointes PCR clean ept.i.p.s. Motion Filter µl 10 SafeRacks à 96 pointes PCR clean 8.2 Autres pointes de pipettes Ref. (International) Description ept.i.p.s. Motion 50 µl 10 racks à 96 pointes Eppendorf Quality Sterile ept.i.p.s. Motion µl 10 racks à 96 pointes Eppendorf Quality Sterile ept.i.p.s. Motion Filter 50 µl 10 racks à 96 pointes PCR clean PCR clean et Sterile ept.i.p.s. Motion Filter µl 10 racks à 96 pointes PCR clean PCR clean et Sterile ept.i.p.s. Motion 50 µl 10 SafeRacks à 96 pointes Eppendorf Quality ept.i.p.s. Motion1 000 µl 10 SafeRacks à 96 pointes Eppendorf Quality

22 22 Nomenclature de commande 8.3 Kits MagSep Ref. (International) Description Kit MagSep Tissue gdna Kit de réactif pour isoler l'adn de 4 24 échantillons de tissu et de cellules Kit MagSep Blood gdna Kit de réactif pour isoler l'adn de 4 24 échantillons de sang. Kit MagSep Viral DNA/RNA Kit de réactifs de nettoyage de l'adn/rna viraux de 4 24 échantillons de liquides corporelles sans cellule.

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