Mise à jour technique : Diagnostic et dépistage génétiques préimplantatoires

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1 MISE À JOUR TECHNIQUE DE LA SOGC N 323, mai 2015 (remplace n 232, août 2009) Mise à jour technique : Diagnostic et dépistage génétiques préimplantatoires La présente mise à jour technique a été rédigée par le comité sur la génétique et approuvée par le comité exécutif et le conseil d administration de la Société des obstétriciens et gynécologues du Canada. AUTEURS PRINCIPAUX Elias M. Dahdouh, MD, Montréal (Québec) Jacques Balayla, MD, Montréal (Québec) François Audibert, MD, Montréal (Québec) COMITÉ SUR LA GÉNÉTIQUE R. Douglas Wilson, MD (président), Calgary (Alb.) François Audibert, MD, Montréal (Québec) Jo-Ann Brock, MD, Halifax (N.-É.) Carla Campagnolo, MSc, London (Ont.) June Carroll, MD, Toronto (Ont.) Karen Chong, MD, Toronto (Ont.) Alain Gagnon, MD, Vancouver (C.-B.) Jo-Ann Johnson, MD, Calgary (Alb.) William MacDonald, MD, Squamish (C.-B.) Nanette Okun, MD, Toronto (Ont.) Melanie Pastuck, inf. aut., Cochrane (Alb.) Karine Vallée-Pouliot, s.-f. aut., Montréal (Québec) Tous les collaborateurs nous ont fait parvenir une déclaration de divulgation. J Obstet Gynaecol Can 2015;37(5):S1 S16 Mots clés : Preimplantation genetic diagnosis, preimplantation genetic screening, comprehensive chromosome screening, acgh, SNP microarray, qpcr, embryo selection Résumé Objectif : Mettre à jour et passer en revue les techniques et les indications du diagnostic génétique préimplantatoire et du dépistage génétique préimplantatoire. Options : Discussion au sujet des aspects techniques et génétiques des techniques génésiques préimplantatoires, particulièrement en ce qui concerne celles qui font appel aux nouvelles technologies cytogénétiques et à la biopsie au stade de l embryon. Issues : Les issues cliniques obtenues par les techniques génésiques à la suite du recours au diagnostic génétique préimplantatoire et au dépistage génétique préimplantatoire sont incluses. La présente mise à jour ne traite pas en détail des issues indésirables qui ont été signalées en association avec les technologies de procréation assistée. Résultats : La littérature publiée a été récupérée par l intermédiaire de recherches menées dans Medline et The Cochrane Library en avril 2014 au moyen d un vocabulaire contrôlé («aneuploidy», «blastocyst/physiology», «genetic diseases», «preimplantation diagnosis/methods», «fertilization in vitro») et de mots clés (p. ex. «preimplantation genetic diagnosis», «preimplantation genetic screening», «comprehensive chromosome screening», «acgh», «SNP microarray», «qpcr» et «embryo selection») appropriés. Les résultats ont été restreints aux analyses systématiques, aux études observationnelles et aux essais comparatifs randomisés / essais cliniques comparatifs publiés en anglais entre 1990 et avril Aucune restriction n a été imposée en matière de langue. Les recherches ont été mises à jour de façon régulière et intégrées à la directive clinique jusqu en janvier Des publications additionnelles ont été identifiées à partir des bibliographies des articles récupérés. La littérature grise (non publiée) a été identifiée par l intermédiaire de recherches menées dans les sites Web d organismes s intéressant à l évaluation des technologies dans le domaine de la santé et d organismes connexes, dans des collections de directives cliniques, dans des registres d essais cliniques et auprès de sociétés de spécialité médicale nationales et internationales. Valeurs : La qualité des résultats a été évaluée au moyen des critères décrits dans le rapport du Groupe d étude canadien sur les soins de santé préventifs (Tableau 1). Avantages, désavantages et coûts : La présente mise à jour permettra aux lecteurs d en apprendre davantage au sujet des nouveautés en ce qui concerne les concepts, les orientations et Ce document fait état des percées récentes et des progrès cliniques et scientifiques à la date de sa publication et peut faire l objet de modifications. Il ne faut pas interpréter l information qui y figure comme l imposition d un mode de traitement exclusif à suivre. Un établissement hospitalier est libre de dicter des modifications à apporter à ces opinions. En l occurrence, il faut qu il y ait documentation à l appui de cet établissement. Aucune partie de ce document ne peut être reproduite sans une permission écrite de la SOGC. MAY JOGC MAI 2015 S1

2 MISE à JOUR TECHNIQUE DE LA SOGC Tableau 1 Critères d évaluation des résultats et de classification des recommandations, fondés sur ceux du Groupe d étude canadien sur les soins de santé préventifs Niveaux de résultats* Catégories de recommandations I: Résultats obtenus dans le cadre d au moins un essai comparatif convenablement randomisé. II-1: Résultats obtenus dans le cadre d essais comparatifs non randomisés bien conçus. II-2: Résultats obtenus dans le cadre d études de cohortes (prospectives ou rétrospectives) ou d études analytiques cas-témoins bien conçues, réalisées de préférence dans plus d un centre ou par plus d un groupe de recherche. II-3: Résultats découlant de comparaisons entre différents moments ou différents lieux, ou selon qu on a ou non recours à une intervention. Des résultats de première importance obtenus dans le cadre d études non comparatives (par exemple, les résultats du traitement à la pénicilline, dans les années 1940) pourraient en outre figurer dans cette catégorie. III: Opinions exprimées par des sommités dans le domaine, fondées sur l expérience clinique, études descriptives ou rapports de comités d experts. A. On dispose de données suffisantes pour appuyer la mesure clinique de prévention. B. On dispose de données acceptables pour appuyer la mesure clinique de prévention. C. Les données existantes sont contradictoires et ne permettent pas de formuler une recommandation pour ou contre l usage de la mesure clinique de prévention; cependant, d autres facteurs peuvent influer sur la prise de décision. D. On dispose de données acceptables pour déconseiller la mesure clinique de prévention. E. On dispose de données suffisantes pour déconseiller la mesure clinique de prévention. L. Les données sont insuffisantes (d un point de vue quantitatif ou qualitatif) et ne permettent pas de formuler une recommandation; cependant, d autres facteurs peuvent influer sur la prise de décision. *La qualité des résultats signalés dans les présentes directives cliniques a été établie conformément aux critères d évaluation des résultats présentés dans le Rapport du Groupe d étude canadien sur les soins de santé préventifs 89. Les recommandations que comprennent les présentes directives cliniques ont été classées conformément à la méthode de classification décrite dans le Rapport du Groupe d étude canadien sur les soins de santé préventifs 89. les technologies génétiques préimplantatoires. Les principaux coûts et désavantages identifiés sont ceux qui sont associés aux technologies de procréation assistée. Sommaire : Le diagnostic génétique préimplantatoire constitue une solution de rechange au diagnostic prénatal pour la détection des troubles génétiques chez les couples exposés à des risques de transmettre une pathologie génétique à leur progéniture. On avance que le dépistage génétique préimplantatoire est en mesure d améliorer l efficacité de la fécondation in vitro en permettant le dépistage de l aneuploïdie embryonnaire. Bien que l on ait constaté que le dépistage génétique préimplantatoire fondé sur la FISH donne lieu à des effets indésirables en ce qui concerne la réussite de la FIV, des données probantes issues de nouvelles études ayant fait appel au dépistage chromosomique exhaustif semblent prometteuses. Recommandations 1. Avant la tenue d un diagnostic génétique préimplantatoire, les patients doivent bénéficier de services de counseling génétique offerts par un conseiller génétique agréé, de façon à pouvoir bien comprendre le risque d obtenir un enfant affecté, les effets de la maladie sur l enfant affecté, ainsi que les avantages et les limites de toutes les options disponibles en matière de diagnostic préimplantatoire et prénatal. (III-A) 2. Les couples devraient être avisés de la capacité du diagnostic génétique préimplantatoire à réduire le risque de concevoir un enfant présentant une anomalie génétique portée par l un des parents ou les deux, lorsque l anomalie en question peut être identifiée au moyen de tests menés sur une seule cellule ou sur de multiples cellules trophectodermiques. (II-2B) 3. Le recours à des modalités effractives de dépistage prénatal ou postnatal en vue de confirmer les résultats du diagnostic génétique préimplantatoire est favorisé, puisque la possibilité de donner lieu à de faux résultats figure parmi les limites techniques de ce dernier. (II-2B) 4. La biopsie de cellules trophectodermiques n exerce aucun effet mesurable sur le développement de l embryon, contrairement à la biopsie de blastomères. Ainsi, dans la mesure du possible, la biopsie de cellules trophectodermiques devrait constituer la méthode à privilégier pour la biopsie de l embryon et devrait être menée par des professionnels expérimentés. (I-B) 5. Le diagnostic génétique préimplantatoire des maladies monogéniques devrait idéalement être effectué au moyen d une amplification en chaîne par polymérase multiplex, conjointement avec une biopsie de cellules trophectodermiques (lorsque cela s avère possible). (II-2B) 6. Chez les couples porteurs de translocations chromosomiques, l utilisation concomitante d une technologie de dépistage chromosomique exhaustif et d une biopsie de cellules trophectodermiques est recommandée dans le cadre du diagnostic génétique préimplantatoire, car elle est associée à des issues cliniques favorables. (II-2B) 7. Avant la tenue d un dépistage génétique préimplantatoire, des renseignements et des services de counseling exhaustifs doivent être offerts pour s assurer que les patientes comprennent bien les limites de la technique, le risque d erreur et le débat toujours en cours quant à la question de savoir si la tenue d un tel dépistage est nécessaire pour l amélioration des taux de naissance vivante dans le cadre de la fécondation in vitro. (III-A). 8. La mise en œuvre d un dépistage génétique préimplantatoire faisant appel à l hybridation in situ en fluorescence appliquée à un embryon biopsié au jour 3 est associée à une baisse des taux de naissance vivante; un tel dépistage ne devrait donc pas être mené dans le cadre de la fécondation in vitro. (I-E). 9. La mise en œuvre d un dépistage génétique préimplantatoire faisant appel au dépistage chromosomique exhaustif appliqué à un blastocyste biopsié entraîne une hausse des taux d implantation et une amélioration de la sélection des embryons dans le cadre des cycles de FIV menés chez des patientes présentant un bon pronostic. (I-B) S2 MAY JOGC MAI 2015

3 Mise à jour technique : Diagnostic et dépistage génétiques préimplantatoires ABRÉVIATIONS acgh ADO CCS CGH ESHRE FISH FIV GP HLA IICS Mbp NGS PCR qpcr SNP TPA TsSE WGA Le résumé du présent document a été publié antérieurement dans : J Obstet Gynaecol Can 2015;37(5): INTRODUCTION Grâce à de nouvelles techniques cytogénétiques, la pratique du diagnostic prénatal a connu des percées majeures dans les domaines de l obstétrique et des sciences génésiques au cours de la dernière décennie 1. Bien que l amniocentèse et le prélèvement de villosités choriales constituent les piliers du dépistage prénatal traditionnel, les améliorations qui ont été apportées au diagnostic génétique préimplantatoire ont révolutionné le monde du diagnostic génétique, particulièrement en ce qui concerne les patients porteurs de maladies monogéniques ou de translocations chromosomiques 2,3. L examen génétique préimplantatoire consiste en l utilisation de technologies génésiques aux fins de l analyse génétique des embryons avant leur transfert et leur implantation 2. Cette technologie a fait son apparition à la fin des années 1980 : la PCR était alors utilisée pour déterminer le sexe des embryons chez les patients porteurs de troubles liés à l X 3,4. Cette pratique faisait en sorte qu il était possible de ne transférer que des embryons non affectés triés sur le volet, ce qui permettait d éviter de devoir procéder à une interruption de grossesse planifiée à la suite d un dépistage prénatal conventionnel 2,3. hybridation génomique comparative sur microréseau d ADN absence d amplification d allèle dépistage chromosomique exhaustif hybridation génomique comparative European Society for Human Reproduction and Embryology hybridation in situ en fluorescence fécondation in vitro globule polaire antigène leucocytaire humain injection intracytoplasmique d un spermatozoïde mégabase séquençage de nouvelle génération amplification en chaîne par polymérase PCR quantitative polymorphisme mononucléotidique technologie de procréation assistée transfert sélectif d un seul embryon amplification génomique totale Chez les patients qui présentent un trouble génétique héréditaire, comme en présence d une mutation génétique héréditaire connue (maladie monogénique) ou lorsque l un ou l autre des parents biologiques est porteur d une anomalie chromosomique, le profilage génétique des ovocytes et des embryons avant leur implantation (au moyen de techniques cytogénétiques ou de biologie moléculaire) est connu sous le nom de diagnostic génétique préimplantatoire 1. Bien que cela ait suscité des controverses, le diagnostic génétique préimplantatoire a également été utilisé aux fins de la sélection du sexe, du typage HLA (visant l obtention d un «enfant donneur» compatible) et de l identification des cancers héréditaires à pénétrance variable (p. ex. état BRCA 1, 2) et des maladies génétiques d apparition tardive (p. ex. maladie de Huntington); il pourrait donc jouer un rôle important dans certains scénarios cliniques et sociaux 5 7. La prise en charge de l infertilité constitue une autre application possible de l examen génétique préimplantatoire 8. En effet, les données démographiques modernes et le report de la grossesse ont mené à une utilisation accrue de la FIV à titre de méthode de conception. Malgré de nombreuses percées, les taux de naissance vivante que l on constate à la suite des cycles de FIV par TsSE se situent entre 27 % et 35 %, selon le groupe d âge et la méthodologie utilisée. Des facteurs tels que le statut de l embryon (garniture chromosomique), la réceptivité endométriale et l efficacité du transfert doivent être pris en considération à titre de causes étiologiques potentielles expliquant ce faible taux d implantation L incidence accrue des anomalies du nombre de chromosomes (aneuploïdie) constitue, malgré la constatation par microscopie d une morphologie embryonnaire normale, la cause la plus probable à l origine du faible taux de grossesse constaté chez les femmes ayant recours à la FIV (plus particulièrement chez celles qui sont d âge avancé et qui connaissent des fausses couches récurrentes) 11,12. Par conséquent, le transfert d embryons euploïdes a été proposé à titre de façon d accroître les taux d implantation et de naissance vivante, et de réduire le taux de fausse couche précoce 13. Le processus de l examen génétique de l embryon au moyen de techniques cytogénétiques aux fins du dépistage de l aneuploïdie de novo est connu sous le nom de dépistage génétique préimplantatoire 13. Tant le diagnostic génétique préimplantatoire que le dépistage génétique préimplantatoire nécessitent la tenue d une FIV (avec ou sans IICS), d une biopsie de l embryon (afin d y prélever de l ADN), d une analyse génétique et d un transfert d embryons sélectionnés. L ADN peut être extrait d ovocytes (globules polaires) ou de cellules embryonnaires (p. ex. un blastomère issu d un embryon au stade de MAY JOGC MAI 2015 S3

4 MISE à JOUR TECHNIQUE DE LA SOGC la segmentation ou 5-10 cellules trophectodermiques issues d un embryon au stade du blastocyste) 12,14. Le matériel génétique est par la suite analysé pour y déceler des mutations monogéniques (au moyen de techniques de biologie moléculaire [PCR, PCR-multiplex] 15 ) ou une translocation chromosomique et une aneuploïdie de novo (au moyen de techniques cytogénétiques telles que la FISH ou le CCS) 13,16,17. Le CCS constitue la toute dernière technique cytogénétique : il s agit de l identification de l ensemble de la garniture chromosomique (24 chromosomes) 18,19. Le CCS peut s effectuer par l intermédiaire de la technologie de microréseau (comme l acgh et le SNP) ou de la qpcr Pendant l analyse des cellules, les embryons demeurent dans le milieu de culture de FIV. Lorsque le diagnostic génétique préimplantatoire indique que la ou les cellules biopsiées ne sont pas affectées par le trouble génétique visé ou lorsque le dépistage génétique préimplantatoire indique qu elles sont issues d un embryon euploïde, ce dernier est alors considéré comme un bon candidat pour le transfert dans l utérus 15, Une faible efficacité pour ce qui est de l obtention de l implantation et la faiblesse des taux de naissance vivante obtenus constituent les principales limites de l analyse génétique préimplantatoire. Cette situation pourrait être attribuable aux difficultés techniques qui se manifestent dans le cadre des interventions de FIV, des biopsies d embryon, de la mise en culture d embryons et du diagnostic génétique 22. Les faibles taux de grossesse pourraient également être attribuables au transfert d un embryon qui, malgré l obtention de résultats de dépistage indiquant qu il est exempt du trouble génétique en question (p. ex. une mutation monogénique ou une translocation chromosomique), est en fait anormal au plan chromosomique (aneuploïde). Nous sommes actuellement en mesure de procéder au dépistage d une mutation génique particulière de façon concomitante avec le dépistage de l aneuploïdie visant les 24 chromosomes; il s agit là de la façon idéale d accroître les taux de grossesse dans le cadre du diagnostic génétique préimplantatoire. 23 Les pratiques du diagnostic génétique préimplantatoire et du dépistage génétique préimplantatoire sont complexes et effractives, et pourraient être associées à des résultats faux positifs ou faux négatifs. Ainsi, une approche multidisciplinaire (faisant appel à l apport et à la coordination de professionnels des domaines des TPA, de la génétique, de la grossesse exposée à des risques élevés, de l éthique et de la psychologie) doit être mise en œuvre 24,25. Nous avons présentement recours au diagnostic génétique préimplantatoire pour atténuer les risque de transmettre des troubles génétiques à la progéniture; voilà pourquoi nous en proposons l utilisation chez les porteurs de troubles monogéniques (dominants et récessifs, autosomiques ou liés à l X) et les porteurs d anomalies chromosomiques structurelles (y compris, entre autres, les translocations réciproques et robertsoniennes, les inversions, les délétions et les insertions). On a actuellement recours au dépistage génétique préimplantatoire, dans le cadre des traitements de procréation assistée, pour améliorer les chances de grossesse grâce au transfert d embryons euploïdes; son utilisation est donc proposée pour ce qui est des femmes d âge avancé, des couples ayant connu des échecs répétés en ce qui concerne l implantation, des couples ayant connu des fausses couches inexpliquées à répétition et des couples qui font face à une grave infertilité imputable à l homme. Recommandations 1. Avant la tenue d un diagnostic génétique préimplantatoire, les patients doivent bénéficier de services de counseling génétique offerts par un conseiller génétique agréé, de façon à pouvoir bien comprendre le risque d obtenir un enfant affecté, les effets de la maladie sur l enfant affecté, ainsi que les avantages et les limites de toutes les options disponibles en matière de diagnostic préimplantatoire et prénatal. (III-A) 2. Les couples devraient être avisés de la capacité du diagnostic génétique préimplantatoire à réduire le risque de concevoir un enfant présentant une anomalie génétique portée par l un des parents ou les deux, lorsque l anomalie en question peut être identifiée au moyen de tests menés sur une seule cellule ou sur de multiples cellules trophectodermiques. (II-2B) 3. Le recours à des modalités effractives de dépistage prénatal ou postnatal en vue de confirmer les résultats du diagnostic génétique préimplantatoire est favorisé, puisque la possibilité de donner lieu à de faux résultats figure parmi les limites techniques de ce dernier. (II-2B) CONCEPTION DES TECHNIQUES CYTOGÉNÉTIQUES Les tout premiers essais ayant porté sur le diagnostic génétique préimplantatoire mettaient en jeu l utilisation du caryotypage et de la PCR pour établir le sexe des embryons humains préimplantés, ainsi que l analyse des GP pour écarter la présence d une maladie mendélienne 4. Au milieu des années 1990, l utilisation de techniques cytogénétiques telles que la FISH a permis le diagnostic préimplantatoire de certaines aneuploïdies et translocations chromosomiques, le processus ayant alors été grandement facilité par le séquençage S4 MAY JOGC MAI 2015

5 Mise à jour technique : Diagnostic et dépistage génétiques préimplantatoires du génome humain. Il a plus tard été démontré que la technique FISH imposait d importantes limites techniques : seul un nombre restreint de chromosomes pouvaient être analysés (maximum de 12 sondes); l interprétation était souvent complexe, puisque l échec de l hybridation, le chevauchement des signaux et le dédoublement affectent la précision des résultats. Ce qui est encore plus important, de nombreuses études ont indiqué que cette méthode n exerçait aucun effet sur les issues cliniques 13,26,27. Compte tenu de ces inconvénients, d autres techniques cytogénétiques novatrices (comme l acgh, l identification de SNP en microréseau et la qpcr) permettant le CCS (dépistage de tout le matériel chromosomique) ont été élaborées 18,19,28,29. CGH sur microréseau d ADN L acgh principale nécessite de l ADN marqué issu d échantillons d essai et d échantillons témoins; l ADN marqué est alors hybridé sur un microréseau d ADN. L analyse est menée en procédant au balayage et à l imagerie du microréseau, puis à la mesure de l intensité des deux signaux d hybridation en ce qui concerne chacune des sondes. Enfin, un programme informatique analyse les données et génère un graphique 30. À l origine, l analyse était menée au moyen d un microscope en utilisant une CGH métaphasique 31,32. Pour des raisons pratiques et liées à la précision, la CGH métaphasique a rapidement été remplacée par l acgh. L évaluation par acgh détermine la présence de quelque déviation quantitative (séquences d ADN supplémentaires ou manquantes) que ce soit dans l ADN du cas étudié. Ainsi, elle est en mesure de détecter les variations du nombre de copies chromosomiques (p. ex. trisomies ou monosomie) et les translocations chromosomiques déséquilibrées 10,33. Les réarrangements chromosomiques équilibrés comme les translocations ou les inversions (dans le cadre desquelles le matériel génétique n est que réarrangé, et non augmenté ou diminué) ne peuvent être identifiés par acgh. Identification de SNP en microréseau Un SNP est une variante de séquence d ADN au sein de laquelle un de deux nucléotides ou plus pourrait être présent, à une position ou à un locus particulier, sur différents chromosomes au sein d une population. À ce jour, près de 40 millions de SNP ont été validés dans le génome (au sein de régions non codantes, dans la plupart des cas). La plupart des microréseaux visant les SNP détectent de à deux millions de SNP le long de tous les chromosomes. Dans le cadre de la cytogénétique moléculaire, l analyse du rapport de l intensité des deux allèles aux locus hétérozygotes permet la détection en haute résolution des duplications et des délétions affectant les chromosomes entiers dans des régions de faible envergure. Dans le cas des délétions, la perte de l hétérozygotie est détectée par l absence de la bande hétérozygote 34,35. Les microréseaux visant les SNP ont également pour avantage de permettre l exploration de l origine parentale de toute anomalie en procédant au génotypage des parents, ce qui rend possible la détection de la disomie uniparentale, entre autres. Puisque les approches fondées sur le SNP offrent une résolution théorique supplémentaire et de l information sur le parent d origine, elles pourraient être particulièrement adaptées à certaines applications, telles que le diagnostic génétique préimplantatoire des anomalies monogéniques ou d une translocation chromosomique déséquilibrée, conjointement avec une détection exhaustive de l aneuploïdie. De surcroît, les microréseaux visant les SNP permettent l établissement d une distinction entre les chromosomes équilibrés et normaux dans les embryons issus d un porteur de translocation qpcr Une autre méthode d analyse du nombre de copies «24-chromosomes» qui utilise la qpcr en temps réel a été élaborée et a fait l objet d une validation exhaustive 37. Dans le cadre de cette méthode, une étape de préamplification, suivie d une réaction PCR multiplex d ordre élevé sur plaque multipuits à 384 puits, est utilisée pour amplifier au moins deux séquences sur chacun des bras de chacun des chromosomes. La qpcr en temps réel est par la suite utilisée pour la quantification rapide de chacun des produits, ce qui permet la comparaison dans tout le génome. La PCR multiplex est menée directement sur le prélèvement afin d éviter les biais d amplification attribuables à l amplification du génome complet et pour assurer la précision de l analyse du nombre de copies; ainsi, elle ne peut être utilisée que pour des prélèvements comptant de multiples cellules trophectodermiques 35. Tant l acgh que les microréseaux visant les SNP nécessitent une WGA avant leur mise en œuvre. La technologie qpcr a récemment fait l objet d études pour ce qui est du dépistage génétique préimplantatoire; il a été démontré que son utilisation dans le cadre de cycles de FIV entraînait une amélioration des taux d implantation et de naissance vivante 17. Les différentes techniques cytogénétiques utilisées dans le diagnostic génétique préimplantatoire et le dépistage génétique préimplantatoire sont décrites au Tableau 2. STADE DE L EMBRYON AU MOMENT DE LA BIOPSIE Que ce soit aux fins du diagnostic génétique préimplantatoire ou du dépistage génétique préimplantatoire, la biopsie MAY JOGC MAI 2015 S5

6 MISE à JOUR TECHNIQUE DE LA SOGC Tableau 2 Description des technologies cytogénétiques utilisées dans le diagnostic génétique préimplantatoire et le dépistage génétique préimplantatoire Acronyme FISH acgh Identification de SNP en microréseau qpcr Nom Hybridation in situ en fluorescence Technique Les cellules sont stoppées en mitose, puis fixées sur une lame de verre au moyen d acide acétique et de méthanol. Des sondes ADN fluorescentes de quelques centaines de kbp de longueur qui correspondent aux régions des chromosomes contenant la séquence d ADN en question sont utilisées. La détection est immédiate par microscopie de fluorescence. Indication Dépistage de l aneuploïdie et translocations chromosomiques Avantages Applicable aux cellules en métaphase et en interphase Peut identifier une gamme d anomalies structurelles, dont les délétions, les duplications, l aneuploïdie et la présence de chromosomes dérivés Permet la détection des produits de translocation Meilleure résolution que le marquage chromosomique traditionnel Limites Les mutations de faible envergure, les inversions chromosomiques et les disomies uniparentales ne peuvent être détectées Nous ne disposons pas de sondes pour tous les chromosomes Problèmes techniques en ce qui concerne l interprétation (chevauchement) Utilisation dans le cadre de l analyse génétique préimplantatoire Dépistage génétique préimplantatoire, diagnostic génétique préimplantatoire Hybridation génomique comparative sur microréseau d ADN L ADN de la patiente et de l ADN témoin sont marqués au moyen de colorants fluorescents et appliqués au microréseau Ces deux séquences d ADN entrent en compétition pour se fixer ou s hybrider sur le microréseau L analyseur de microréseau mesure les signaux fluorescents. Le logiciel analyse les données et génère un graphique. Dépistage de l aneuploïdie et translocations chromosomiques Analyse chromosomique complète Détecte les modifications du nombre de copies à un niveau de 5-10 kbp de séquences d ADN Détecte les variations structurelles à une résolution de 200 paires de base Identifie les microdélétions et les duplications Processus de 24 heures, renouvellement rapide Les translocations réciproques équilibrées, les inversions, les translocations robertsoniennes, les insertions réciproques et la triploïdie ne seront pas détectées Les degrés de mosaïcisme de 20 % ou moins ne seront pas détectés Relativement coûteuse Dépistage génétique préimplantatoire, diagnostic génétique préimplantatoire Identification de polymorphismes mononucléotidiques en microréseau À la suite de l amplification, l ADN est marqué au moyen de molécules fluorescentes rouges et vertes, l une des versions du SNP étant en rouge et l autre, en vert. Cet ADN est par la suite analysé en fonction de l intensité du signal et du nombre d appels de SNP. Il est par la suite comparé à une population témoin au moyen d un puissant logiciel, de façon à permettre le diagnostic de la transmission héréditaire. Dépistage de l aneuploïdie et translocations chromosomiques Dépistage simultané de maladies génétiques particulières et de l aneuploïdie Permet d analyser des centaines de milliers de locus dans tout le génome au moyen d un seul réseau, en fonction d un espacement moyen pouvant atteindre 5 kbp, ce qui permet une analyse en haute résolution Les renseignements sur le génotype permettent l identification de l origine parentale de toute anomalie Pourrait détecter les translocations chromosomiques équilibrées, les inversions et les modifications affectant tout le génome L analyse des SNP en microréseau à partir d ADN issu d une population de cellules ne peut indiquer l hétérogénéité au sein de l échantillon Pourrait ne pas être compatible avec le transfert d un embryon frais (processus de 72 heures) Relativement coûteuse Dépistage génétique préimplantatoire, diagnostic génétique préimplantatoire Amplification en chaîne par polymérase quantitative Une étape de préamplification, suivie d une réaction PCR multiplex d ordre élevé sur plaque multipuits à 384 puits, est utilisée pour amplifier au moins deux séquences sur chacun des bras de chacun des chromosomes. Dépistage de l aneuploïdie La biopsie et l analyse peuvent être menées en seulement 4 heures, ce qui facilite le transfert de blastocystes euploïdes uniques frais dans le cadre d un même cycle Nécessite moins d ADN que la PCR régulière L amplification pourrait échouer et une ADO pourrait se manifester Nombre limité des prélèvements (à l heure actuelle, 2 sur chaque plaque) pouvant être traités au moyen du matériel disponible Dépistage génétique préimplantatoire kpb : kilopaire de base S6 MAY JOGC MAI 2015

7 Mise à jour technique : Diagnostic et dépistage génétiques préimplantatoires de l embryon peut être effectuée à différent stades du développement de ce dernier dans le cadre des interventions de FIV. La biopsie peut être menée à partir de l ovocyte (un ou deux globules polaires), de l embryon au stade de la segmentation (un blastomère) ou de l embryon au stade du blastocyste (de 5 à 10 cellules trophectodermiques) 38. Biopsie de globules polaires Cette technique de biopsie est habituellement mise en œuvre dans des pays où la biopsie de l embryon est considérée illégale (p. ex. Italie, Allemagne, Autriche) 39. Le retrait de GP nécessite l obtention d un accès à l espace périvitellin de l ovocyte par la création d une ouverture dans la zone pellucide 39 (au moyen d une dissection mécanique ou au laser) 40. Cette intervention peut être effectuée de façon séquentielle en retirant le premier et le deuxième GP à des moments distincts ou, idéalement, être menée selon une approche simultanée dans le cadre de laquelle les deux GP sont retirés de façon concomitante (de 8 à 14 heures à la suite de l IICS). Bien que l analyse des GP fournisse d importants renseignements pronostiques aux couples en ce qui a trait à l origine des aneuploïdies, le débat se poursuit quant à la nécessité de procéder à ce type de biopsie. Une étude récente a indiqué que tant le premier que le deuxième GP étaient exposés à des erreurs méiotiques 41. Malheureusement, cette technique comporte son lot de désavantages lorsqu on l utilise dans le cadre du diagnostic génétique préimplantatoire; parmi ces désavantages, on trouve plus particulièrement le fait que ce type de biopsie n est en mesure de diagnostiquer que les anomalies génétiques ou chromosomiques qui sont portées par l ADN maternel. Dans le cadre du dépistage génétique préimplantatoire, la biopsie des GP fait encore l objet de débats en raison des questions soulevées au sujet de sa rentabilité (le nombre élevé des ovocytes qui sont requis aux fins de l analyse), de la forte incidence des anomalies chromosomiques post-méiotiques qui ne peuvent être détectées par cette approche et de sa précision diagnostique discutable, compte tenu de l autocorrection possible de l aneuploïdie méiotique 41. Biopsie de l embryon au stade de la segmentation L ouverture de la zone pellucide peut être effectuée au moyen d une solution de Tyrode acide, d une dissection mécanique ou d une dissection au laser. La biopsie de l embryon au stade de la segmentation est habituellement menée au jour 3 du développement in vitro en procédant à l extraction d un blastomère 20,38. Puisque l on a déjà démontré que l extraction de deux blastomères exerce des effets nuisibles sur le développement de l embryon, cette pratique devrait donc être évitée 42. Le risque de mosaïcisme (qui pourrait être à l origine des résultats faux positifs ou faux négatifs qui sont constatés dans le cadre des techniques génétiques préimplantatoires) constitue le principal inconvénient de la biopsie du blastomère 43,44. Toutefois, cette technique est compatible avec le transfert d embryons frais entre le jour 5 et le jour 6 du développement embryonnaire, puisque les résultats génétiques seront habituellement disponibles d un à deux jours à la suite de la biopsie du blastomère 43. Biopsie de l embryon au stade du blastocyste La biopsie de l embryon au stade du blastocyste consiste en l extraction de 5 à 10 cellules trophectodermiques au jour 5 ou au jour 6 du développement de l embryon 45. L ouverture de la zone pellucide est menée au jour 3 du développement de l embryon par dissection mécanique ou au laser. Ces embryons sont alors placés dans un milieu de culture FIV prolongée jusqu à l atteinte du stade du blastocyste; la biopsie du blastocyste est menée en procédant à l extraction des cellules trophectodermiques herniées. La récupération de 5 à 10 cellules trophectodermiques à partir d un blastocyste comptant de 100 à 150 cellules correspond à une perte de cellules proportionnellement moindre (de 3,3 % à 10 %) que celle que représente le retrait d un ou de deux blastomères à partir d un embryon comptant de 6 à 8 cellules (diminution du contenu cellulaire de l ordre de 12,5 % à 33 %) 46. La biopsie du blastocyste permet également l obtention d un plus grand nombre de matrices d ADN de départ que la biopsie menée au jour 3, ce qui mène en théorie à l amélioration de la sensibilité et de la spécificité du diagnostic génétique préimplantatoire, et qui est associé à des taux moindres de mosaïcisme. Cette technique est rentable, puisqu un nombre moindre d embryons ont à faire l objet d une analyse; de plus, elle a été associée à une augmentation des chances de naissance vivante au cours de la dernière décennie 45. Toutefois, les embryologistes qui œuvrent au sein d unités de diagnostic génétique préimplantatoiredépistage génétique préimplantatoire devraient avoir cumulé de l expérience en matière de culture d embryons au stade du blastocyste et de vitrification, lorsque le transfert d embryons congelés compte parmi les interventions à mener. Récemment, il a été démontré que la biopsie de cellules trophectodermiques n exerçait aucun effet sur le potentiel génésique du blastocyste, par comparaison avec la biopsie de l embryon au stade de la segmentation (une diminution du taux d implantation de l ordre de 39 % a été signalée en ce qui concerne cette dernière) 47. Bien que le taux de naissance vivante par transfert puisse connaître une hausse grâce à cette technique, il ne faut pas perdre de vue que, dans le cadre de la prolongation de la culture des embryons, un taux accru de patientes n atteindront pas l étape du transfert d embryons; ainsi, les couples devraient être rigoureusement conseillés au sujet de ces limites MAY JOGC MAI 2015 S7

8 MISE à JOUR TECHNIQUE DE LA SOGC Tableau 3 Avantages et inconvénients des biopsies à différents stades embryonnaires Stade au moment de la biopsie Globule polaire (ovocyte) Jour 3 - blastomère Avantages Aucun effet sur le développement Nécessite un faible nombre de Amplement de temps pour l analyse génétique cellules Excellent pour ce qui est de l origine maternelle Toutes les indications Permet d éviter les préoccupations d ordre Temps pour l analyse génétique légal et éthique Inconvénients Nombre élevé de globules analysés Biopsie séquentielle Aucun renseignement sur les mutations d origine paternelle Mosaïcisme ADO Taux moindres d implantation possibles Jour cellules trophectodermiques Peu de matériel à analyser Un plus grand nombre de cellules sont disponibles Toutes les indications Moins de mosaïcisme Culture du blastocyste Nécessite une vitrification Expertise requise techniques et des coûts accrus de cette intervention 48. Reportez-vous au Tableau 3 pour une comparaison des avantages et des inconvénients des interventions de biopsie menées à différents stades embryonnaires. Recommandation 4. La biopsie de cellules trophectodermiques n exerce aucun effet mesurable sur le développement de l embryon, contrairement à la biopsie de blastomères. Ainsi, dans la mesure du possible, la biopsie de cellules trophectodermiques devrait constituer la méthode à privilégier pour la biopsie de l embryon et devrait être menée par des professionnels expérimentés. (I-B) DIAGNOSTIC GÉNÉTIQUE PRÉIMPLANTATOIRE DES ANOMALIES MONOGÉNIQUES L utilisation de méthodes fondées sur la PCR en vue de procéder au dépistage des troubles liés à l X fut la première modalité de diagnostic génétique préimplantatoire à être mise en œuvre : elle permettait la détermination du sexe de l embryon et le transfert des embryons de sexe féminin non affectés 49. Peu après ces premiers cas de diagnostic génétique préimplantatoire, des protocoles fondés sur la PCR qui visaient des maladies héréditaires (telles que la fibrose kystique et le déficit en α1-antitrypsine) ont été élaborés. Ces protocoles se fondaient sur l amplification du fragment d ADN qui contenait la mutation causale et sur sa détection 50,51. Les stratégies fondées sur la PCR se sont complexifiées, ce qui a mené à la hausse du nombre des troubles pouvant faire l objet d un diagnostic génétique préimplantatoire, en plus de faire grimper les taux d exactitude. Le nombre des maladies pouvant être diagnostiquées à l heure actuelle au moyen du diagnostic génétique préimplantatoire-pcr s élève à environ 200; parmi les cibles visées, on trouve certaines formes de cancers héréditaires, telles que le rétinoblastome et le gène de prédisposition au cancer du sein (BRCA2) 52. Le diagnostic génétique préimplantatoire a également été utilisé dans le cadre de nouvelles applications, telles que l épreuve de compatibilité dans le système HLA 53,54. L analyse des données issues du PGD Consortium de la ESHRE en ce qui concerne les 10 dernières années de pratique indique des taux de grossesse clinique de 22 % par intervention de récupération d ovocytes et de 29 % par transfert d embryons 55. Le Tableau 4 présente un échantillon des différentes maladies monogéniques pour lesquelles un diagnostic génétique préimplantatoire a été mené entre janvier et décembre 2009, selon les données de la ESHRE 22. Dans le cadre de ces rapports, cycles de FIV ayant fait l objet d un diagnostic génétique préimplantatoire ou d un dépistage génétique préimplantatoire (y compris le dépistage génétique préimplantatoire visant la sélection du sexe) sont en tout présentés. De ces cycles, (41,8 %) ont été menés aux fins du diagnostic génétique préimplantatoire (dont le typage HLA); de ces cycles ont été menés dans le but de détecter la présence de maladies monogéniques. Pour ce qui est des autres cycles, (57,6 %) ont été menés aux fins du dépistage génétique préimplantatoire et 29 (0,5 %), aux fins du dépistage génétique préimplantatoire visant la sélection du sexe 22. Bien que les données de la ESHRE ne représentent qu une partie des cas de diagnostic génétique préimplantatoire ayant été menés à l échelle mondiale, elles évoquent néanmoins des tendances générales dans le domaine. L élaboration de protocoles de diagnostic génétique préimplantatoire-pcr peut s avérer difficile sur le plan technique, car le contenu en ADN utilisé est faible (de 5 à 10 pg/ml); un nombre important de cycles d amplification est donc requis pour que la mutation puisse être visualisée, ce qui donne lieu à un risque élevé de contamination par de l ADN étranger ou parental. Cet inconvénient peut être contourné par l amplification de fragments d ADN hypervariables additionnels, conjointement avec les allèles S8 MAY JOGC MAI 2015

9 Mise à jour technique : Diagnostic et dépistage génétiques préimplantatoires utilisés pour le diagnostic. Cette approche est effectivement semblable à celle de l analyse des empreintes génétiques et permet la détection d une contamination par une source d ADN externe en identifiant les allèles qui ne sont pas d origine embryonnaire. Lorsque deux allèles issus d un même parent sont présents, cela indique que l ADN contaminant est d origine parentale 56 ou que l embryon en question est trisomique (il compte deux copies de l un des chromosomes parentaux). Dans les deux cas, ces embryons ne sont alors plus candidats au transfert. De plus, le recours à l IICS, plutôt qu à la seule FIV, élimine le risque de contamination par des spermatozoïdes ou des cellules cumulus; cette méthode est systématiquement utilisée dans tous les cas de diagnostic génétique préimplantatoire- PCR. La dénudation de l ovocyte (dispersion des cellules cumulus) constitue également une pratique standard en ce qui concerne le diagnostic génétique préimplantatoire fondé sur la PCR 57. Le phénomène connu sous le nom d «absence d amplification d allèle (ADO)» (laquelle peut être défini comme un échec d amplification n affectant qu un seul des allèles parentaux présents dans une cellule prise isolément) représente un autre problème qui affecte couramment tous les tests PCR se fondant sur une seule cellule 58. Bien que l incidence de l ADO varie, elle a affecté, dans des cas extrêmes, 20 % des amplifications 59 et a, par le passé, donné lieu à plusieurs diagnostics erronés. L amplification simultanée d un ou de plusieurs marqueurs polymorphiques, situés sur le même chromosome et près du gène à l origine de la maladie, constitue un moyen de s assurer qu une approche faisant appel au diagnostic génétique préimplantatoire fondé sur la PCR sera exempte d erreurs liées à l ADO. Cette stratégie, connue sous le nom de «PCR multiplex», permet en effet d établir un diagnostic en évaluant la mutation elle-même (ou le ou les allèles polymorphiques qui l accompagnent de façon héréditaire), puisqu il est très peu probable qu une ADO affectera les deux fragments amplifiés au sein de la même réaction 60. D ordre général, les protocoles de diagnostic génétique préimplantatoire-pcr les plus fiables font appel à la PCR multiplex. En plus de procéder à l amplification d un fragment d ADN englobant le site de la mutation, cette approche amplifie également des fragments supplémentaires contenant des polymorphismes liés, et ce, pour éviter les erreurs diagnostiques attribuables à l ADO; de plus, au moins un marqueur grandement polymorphe est amplifié en vue de détecter la présence possible d une contamination 61. La biopsie du blastocyste (aux fins du diagnostic génétique préimplantatoire des Tableau 4 Exemples d indications en ce qui concerne le diagnostic génétique préimplantatoire visant les troubles monogéniques (Consortium ESHRE) 22 Mode de Trouble monogénique transmission Cas, n* β-thalassémie AR 153 Fibrose kystique AR 149 Maladie de Huntington AD 136 Syndrome du X fragile Lié à l X 124 Dystrophie myotonique AD 124 Amyotrophie spinale AR 58 Neurofibromatose de type I AD 45 Dystrophie de Duchenne Lié à l X 42 Syndrome de Marfan AD 27 Hémophilie A Lié à l X 17 Sclérose tubéreuse AD 15 AR : autosomique récessif; AD : autosomique dominant *Nombre total de cas = cycles (prélèvement d ovocytes) maladies monogéniques, dans le cadre du transfert d un embryon congelé) constitue une autre stratégie qui est utilisée pour atténuer l ADO. Cette pratique a été associée à des taux accrus de génotypage et d implantation, et à des taux moindres d échec de l amplification et d ADO, par comparaison avec la biopsie traditionnelle du blastomère 62,63. Recommandation 5. Le diagnostic génétique préimplantatoire des maladies monogéniques devrait idéalement être effectué au moyen d une amplification en chaîne par polymérase multiplex, conjointement avec une biopsie de cellules trophectodermiques (lorsque cela s avère possible). (II-2B) Reportez-vous au Tableau 4 pour un aperçu des indications du diagnostic génétique préimplantatoire en ce qui concerne les maladies monogéniques DIAGNOSTIC GÉNÉTIQUE PRÉIMPLANTATOIRE DES TRANSLOCATIONS CHROMOSOMIQUES Les deux types courants de translocations chromosomiques (robertsonienne et réciproque) donnent habituellement lieu à des phénotypes normaux lorsqu ils sont en équilibre. Toutefois, ces translocations s accompagnent de risques génésiques connexes (tels que l infertilité, l avortement spontané et la naissance d enfants présentant une déficience intellectuelle ou un retard du développement) 64. On signale que le transfert d embryons identifiés comme étant normaux et/ou équilibrés sur le plan chromosomique à la suite d un MAY JOGC MAI 2015 S9

10 MISE à JOUR TECHNIQUE DE LA SOGC diagnostic génétique préimplantatoire entraîne une baisse importante des risques de connaître une grossesse affectée et une fausse couche. Pendant des décennies, on a eu recours à la FISH ou au diagnostic génétique préimplantatoire fondé sur la PCR à cette fin. Contrairement au diagnostic génétique préimplantatoire-pcr dans le cadre duquel les cellules embryonnaires sont placées dans des microtubes à centrifuger, le diagnostic génétique préimplantatoire visant les anomalies chromosomiques met en jeu, à titre d étape initiale, l étalement et la fixation d une cellule prise isolément, ainsi que l analyse cytogénétique subséquente de celle-ci 57. Les techniques cytogénétiques classiques (p. ex. technique de marquage des bandes G) ne sont pas applicables aux cellules uniques, puisqu elles nécessitent des chromosomes se situant à l étape métaphasique du cycle cellulaire. La plupart des blastomères embryonnaires se trouvent, cependant, en interphase. Pour surmonter ce problème, les protocoles de diagnostic génétique préimplantatoire font fréquemment appel à une méthode cytogénétique moléculaire : l hybridation in situ en fluorescence. Cette technique met en jeu l hybridation de sondes ADN visant un chromosome particulier (marquées au moyen de différentes couleurs) à des noyaux ou à des chromosomes étalés sur des lames pour microscope. Cette méthode est rapide et donne des résultats tout aussi satisfaisants, qu elle soit appliquée à des noyaux en métaphase ou en interphase 65. Toutefois, la technique FISH nécessite une validation préclinique avant chaque cycle de FIV et est limitée à un certain nombre de chromosomes. Plusieurs inconvénients peuvent se manifester (dont l échec de l hybridation, le chevauchement de signaux et le dédoublement) et en venir à affecter l exactitude de l interprétation 66. Les protocoles fondés sur la PCR pourraient offrir des améliorations en matière de rendement, d automatisation, de délai d exécution, de sensibilité et de fiabilité 67. Les deux méthodes pourraient permettre l identification simultanée des aneuploïdies, mais seulement pour un nombre limité de chromosomes 68, ce qui pourrait mener au transfert d embryons aneuploïdes et expliquer les résultats cliniques relativement faibles du diagnostic génétique préimplantatoire précoce chez certains couples 68. La technique FISH ne peut être utilisée que sur une seule cellule; elle n est donc pas compatible avec le diagnostic génétique préimplantatoire mené dans le cadre de la biopsie de l embryon au stade du blastocyste. L acgh et l identification de SNP en microréseau menées dans le cadre d une biopsie de cellules trophectodermiques sont dorénavant utilisées à l échelle mondiale aux fins du diagnostic génétique préimplantatoire chez des couples porteurs de translocations réciproques ou robertsoniennes équilibrées. Ces techniques ne nécessitent pas une validation préclinique avant chaque cycle de FIV et permettent le dépistage simultané de l aneuploïdie et des dérivés de translocation déséquilibrés en ce qui concerne les 24 chromosomes 69,70. Fiorentino et coll. ont d abord signalé 28 cycles de diagnostic génétique préimplantatoire faisant appel à l acgh mené sur un embryon au stade de la segmentation en vue de déceler des translocations chromosomiques 70. Un fort pourcentage d embryons (93 %) ont été diagnostiqués avec succès. Soixante pour cent des cycles démarrés comptaient des embryons convenables aux fins du transfert. Un taux de grossesse de 70 % et un taux d implantation de 64 % par cycle de transfert ont été obtenus. Colls et coll. ont récemment validé l acgh pour ce qui est des translocations en réanalysant tous les embryons diagnostiqués au moyen du diagnostic génétique préimplantatoire-fish. Les plus petits fragments détectables étaient de ~6 Mbp pour les blastomères et de ~5 Mbp pour les cellules trophectodermiques. Le taux d erreur de l acgh était de 1,9 %. L analyse rétrospective de leurs 926 cycles de diagnostic génétique préimplantatoire-fish visant les translocations a indiqué que tous les fragments transloqués étaient < 6 Mbp et qu ils pouvaient donc être adéquatement diagnostiqués par acgh 71. Treff et coll. ont signalé l application réussie d un microréseau visant les SNP dans le cadre d une intervention de diagnostic génétique préimplantatoire qui cherchait à distinguer les chromosomes normaux des chromosomes équilibrés chez des embryons issus de porteurs de translocations. Soixante-sept pour cent (12/18) des cycles démarrés comptaient des embryons convenables aux fins du transfert 72. Le taux de grossesse clinique par transfert était de 75 % et un taux élevé d implantation de 45 % a été obtenu. Des résultats récents issus d une étude rétrospective ayant comparé le diagnostic génétique préimplantatoire-snp (169 couples) et le diagnostic génétique préimplantatoire- FISH (406 couples) ont indiqué que l intervention faisant appel à un microréseau visant les SNP (conjointement avec la biopsie de cellules trophectodermiques et le transfert subséquent d un embryon congelé) entraîne une hausse considérable du taux de grossesse en cours pour les porteurs de translocations (69 % vs 38 %) et une légère baisse du taux de fausse couche 69. Dans l ensemble, les études susmentionnées indiquent manifestement que l acgh et l identification de SNP en microréseau utilisées aux fins de la détection des S10 MAY JOGC MAI 2015

11 Mise à jour technique : Diagnostic et dépistage génétiques préimplantatoires translocations chromosomiques constituent théoriquement de meilleures approches que la FISH, puisqu elles permettent le dépistage simultané des translocations et de l aneuploïdie dans tous les chromosomes. De plus, ces approches ont été associées à des issues cliniques favorables et devraient bientôt constituer la norme en matière de diagnostic génétique préimplantatoire pour les couples porteurs de remaniements chromosomiques. Recommandation 6. Chez les couples porteurs de translocations chromosomiques, l utilisation concomitante d une technologie de dépistage chromosomique exhaustif et d une biopsie de cellules trophectodermiques est recommandée dans le cadre du diagnostic génétique préimplantatoire, car elle est associée à des issues cliniques favorables. (II-2B) DÉPISTAGE GÉNÉTIQUE PRÉIMPLANTATOIRE Cette technique visant le dépistage des aneuploïdies chromosomiques chez les embryons a récemment été utilisée pour améliorer les issues cliniques dans le cadre des cycles de FIV. Au moins de 40 % à 60 % des embryons humains sont anormaux; chez les femmes de 40 ans ou plus, ce nombre passe à 80 %. Ces anomalies se traduisent en faibles taux d implantation pour ce qui est des embryons transférés dans le cadre d interventions de FIV; ces taux passent en effet de 30 % chez les femmes de moins de 35 ans à 6 % chez les femmes de 40 ans ou plus 33. Dans le cadre d une récente analyse rétrospective ayant porté sur des biopsies de cellules trophectodermiques, l augmentation du risque d aneuploïdie en fonction du vieillissement chez la femme était manifeste. Une prévalence légèrement accrue a été constatée à des âges moins avancés (> 40 % d aneuploïdie chez les femmes de 23 ans ou moins). Le risque de ne présenter aucun blastocyste normal sur le plan chromosomique pouvant être transféré (le taux d embryon non euploïde) atteignait son niveau le plus bas (2 %-6 %) chez les femmes de 26 à 37 ans, pour ensuite passer à 33 % à l âge de 42 ans et enfin atteindre 53 % à l âge de 44 ans 11. L efficacité de la FIV repose sur deux facteurs : la réceptivité de l endomètre et l état chromosomique de l embryon. La réceptivité de l endomètre pourrait être améliorée par l atténuation de la stimulation ovarienne (laquelle est à l origine des effets œstrogéniques élevés indésirables qui sont constatés dans le cadre du transfert d embryons frais) ou par le transfert d embryons selon un cycle congelé-décongelé 73,74. Cependant, le potentiel que compte un embryon dépend principalement de son état chromosomique. Idéalement, le transfert d un seul embryon euploïde dans l utérus constituerait l intervention comptant le taux et le potentiel d implantation les plus élevés. Plusieurs techniques ont été élaborées pour évaluer l état chromosomique de l embryon par l intermédiaire d un dépistage chromosomique exhaustif. Puisqu un essai randomisé de grande envergure 13 et qu une métaanalyse récente 75 ont démontré que le dépistage génétique préimplantatoire fondé sur la FISH donnait lieu à des issues pires que celles qui sont associées à l absence de dépistage génétique préimplantatoire, de nombreux centres et de nombreuses recommandations en déconseillent l utilisation. Jusqu à présent, l utilisation du CCS (évaluation de tous les 24 chromosomes) s accompagnant de façon concomitante d une biopsie des cellules trophectodermiques et, de façon subséquente, du transfert d un embryon frais ou congelé constitue une pratique de dépistage génétique préimplantatoire qui semble permettre l obtention d issues cliniques favorables lorsqu elle est mise en œuvre chez des patientes qui présentent un bon pronostic. L acgh et l identification de SNP en microréseau ont récemment été validées aux fins du dépistage génétique préimplantatoire et mises en œuvre dans le cadre de l analyse de cellules trophectodermiques et de blastomères biopsiés 30,76. Les premiers signalements de Voullaire et coll. et de récentes données ont indiqué que dans le cadre de l analyse de blastomères par dépistage génétique préimplantatoire, l utilisation de la CGH métaphasique semblait donner lieu à une amélioration des taux d implantation et de grossesse, par comparaison avec l utilisation de la FISH 77. Dans le cadre de l étude menée par Schoolcraft et coll., l application clinique de cette nouvelle technologie au stade du blastocyste a permis l obtention d issues cliniques améliorées : en effet, les taux d implantation étaient alors plus élevés (72,2 %) que dans le cadre des cycles de transfert d embryons n ayant fait appel qu à des critères de morphologie du blastocyste aux fins de la sélection des embryons (46,5 %) 45. De nouvelles données préliminaires sur l issue de la FIV ont récemment été publiées par ce même groupe en ce qui concerne des patientes présentant une réponse normale à la suite du transfert d un seul embryon. Ces données indiquent clairement que les taux d implantation ont été considérablement accrus au sein du groupe ayant fait appel au transfert d un seul blastocyste congelé à la suite du CCS (65,1 %), par comparaison avec le transfert d un seul blastocyste congelé (52,6 %) ou le transfert d un seul embryon frais au jour 5 (49,2 %) ne s étant fondé que sur la morphologie 78. Chez les patientes qui ont subi le transfert d un seul blastocyste à la suite du CCS, l amélioration du taux de réussite de la FIV n était pas affectée par l âge maternel. Ainsi, le dépistage MAY JOGC MAI 2015 S11

12 MISE à JOUR TECHNIQUE DE LA SOGC de l aneuploïdie chromosomique représente une façon prometteuse d atteindre pleinement l objectif de la mise en œuvre régulière du TsSE. Dans les trois essais randomisés dont nous disposons, les taux d implantation étaient plus élevés lorsque le CCS était utilisé conjointement avec la biopsie de cellules trophectodermiques que lorsque des soins traditionnels de FIV étaient mis en œuvre 17,79,80. Dans les deux études au cours desquelles le même nombre d embryons ont été transférés au sein des groupes «dépistage génétique préimplantatoire- CCS» et «témoin», une amélioration a été constatée tant en ce qui concerne les taux de grossesse en cours au-delà de 20 semaines 79 que les taux d accouchement 17. Dans le cadre d une étude randomisée menée par Forman et coll., une baisse spectaculaire des taux de grossesse multiple a été constatée lorsqu un seul blastocyste euploïde était transféré (à la suite de la mise en œuvre d un dépistage génétique préimplantatoire-ccs), tandis que le taux de grossesse demeurait équivalent à celui qui est associé à l utilisation de deux blastocystes non testés 18. De plus, une récente analyse systématique d essais comparatifs randomisés menée par Dahdouh et coll. a indiqué que l application du CCS conjointement avec la biopsie de cellules trophectodermiques dans le cadre du dépistage génétique préimplantatoire est associée à une amélioration des taux de réussite de la FIV (hausse du taux de grossesse en cours au-delà de 20 semaines) et de la sélection des embryons 81. Toutefois, ces résultats ont été issus de patientes présentant une bonne réserve ovarienne qui comptaient des blastocystes pouvant être biopsiés; ainsi, les taux de réussite du dépistage génétique préimplantatoire faisant appel à cette technologie pourraient avoir été surestimés et ne pas être généralisables à d autres populations de patientes 81. Recommandations 7. Avant la tenue d un dépistage génétique préimplantatoire, des renseignements et des services de counseling exhaustifs doivent être offerts pour s assurer que les patientes comprennent bien les limites de la technique, le risque d erreur et le débat toujours en cours quant à la question de savoir si la tenue d un tel dépistage est nécessaire pour l amélioration des taux de naissance vivante dans le cadre de la fécondation in vitro. (III-A). 8. La mise en œuvre d un dépistage génétique préimplantatoire faisant appel à l hybridation in situ en fluorescence appliquée à un embryon biopsié au jour 3 est associée à une baisse des taux de naissance vivante; un tel dépistage ne devrait donc pas être mené dans le cadre de la fécondation in vitro. (I-E). 9. La mise en œuvre d un dépistage génétique préimplantatoire faisant appel au dépistage chromosomique exhaustif appliqué à un blastocyste biopsié entraîne une hausse des taux d implantation et une amélioration de la sélection des embryons dans le cadre des cycles de FIV menés chez des patientes présentant un bon pronostic. (I-B) PERSPECTIVES D AVENIR EN CE QUI CONCERNE LE DIAGNOSTIC GÉNÉTIQUE PRÉIMPLANTATOIRE / DÉPISTAGE GÉNÉTIQUE PRÉIMPLANTATOIRE Une nouvelle technique génétique, connue sous le nom de karyomapping (cartographie du caryotype), a été élaborée : elle constitue un outil prometteur en matière de diagnostic génétique préimplantatoire des maladies monogéniques qui ne nécessite aucun test préalable visant un patient ou une maladie particulière. Cette technique (une méthode universelle d analyse sur le génome entier visant les maladies génétiques qui est fondée sur la cartographie des entrecroisements entre les haplotypes parentaux) consiste en une approche exhaustive envers la détection simultanée des troubles monogéniques et chromosomiques 82,83. Compte tenu du fait que nous disposons du séquençage du génome en entier, le NGS est dorénavant mis en application dans le cadre du dépistage génétique préimplantatoire et du diagnostic génétique préimplantatoire en ce qui concerne les mutations monogéniques et les translocations chromosomiques 84. Treff et coll. ont utilisé une stratégie ciblée de NGS et une PCR multiplex qui englobaient tant le site de la mutation que les séquences chromosomiques ciblées nécessaires aux fins de la qpcr 85. Cette stratégie a permis de diminuer la profondeur de lecture nécessaire pour le séquençage précis du site de la mutation, ce qui entraîne la diminution tant du temps requis que des coûts mis en cause. De façon parallèle, la mise en œuvre d une qpcr sur les produits de la PCR multiplex a fourni une analyse rapide du nombre de copies chromosomiques. L aneuploïdie pour des chromosomes entiers (whole-chromosome aneuploidy) et des translocations chromosomiques déséquilibrées ont également fait l objet d un dépistage au moyen de cette approche en faisant appel à des prélèvements trophectodermiques issus d une série de blastocystes 86. Avant d être intégré dans la pratique clinique régulière, le NGS devrait faire l objet d une évaluation exhaustive dans le contexte du diagnostic génétique préimplantatoire / dépistage génétique préimplantatoire. S12 MAY JOGC MAI 2015

13 Mise à jour technique : Diagnostic et dépistage génétiques préimplantatoires COUNSELING, LIMITES ET RISQUES ASSOCIÉS AUX TPA En 2007, la American Society of Reproductive Medicine a publié une opinion de comité sur le counseling des couples ayant recours au diagnostic génétique préimplantatoire 87. Les couples qui envisagent d avoir recours au diagnostic génétique préimplantatoire doivent bénéficier de services de counseling couvrant des renseignements liés aux points clés suivants : Les risques associés aux technologies de procréation assistée 88 L option de choisir de ne pas procéder à la FIV et au diagnostic génétique préimplantatoire. Les risques associés à la biopsie embryonnaire et à la mise en culture prolongée. En ce qui concerne les porteurs de troubles autosomiques et liés au chromosome X, les modèles pertinents d hérédité et les effets du trouble en question sur la qualité de vie d un enfant affecté. En ce qui concerne les porteurs de translocations chromosomiques équilibrées ou d autres anomalies chromosomiques structurelles, une analyse des modèles possibles de ségrégation pendant la méiose et le risque accru de concevoir une progéniture présentant une composition chromosomique non équilibrée; Les limites techniques et les pièges du diagnostic génétique préimplantatoire, y compris le risque de diagnostic erroné et la nécessité de la tenue subséquente d interventions de diagnostic prénatal, par PVC ou par amniocentèse, pour confirmer les résultats obtenus au moyen du diagnostic génétique préimplantatoire. Les options liées aux interventions de diagnostic prénatal (prélèvement de villosités choriales, amniocentèse, échographie avec ou sans analyses sanguines supplémentaires, aucun dépistage prénatal) et leurs risques connexes. La possibilité qu aucun embryon ne puisse être transféré s ils s avèrent tous affectés et la possibilité que des embryons non affectés portant le trouble récessif ou lié au chromosome X soient transférés. La disposition des embryons pour lesquels les tests ne donnent aucun résultat concluant. La disposition des embryons non transférés (p. ex. élimination, cryoconservation, utilisation pour la recherche ou don), dans les cas où cela s avère approprié. Les méthodes de rechange pour éviter le risque de maladie (p. ex. l utilisation de gamètes provenant d un donneur). Disponibilité au Canada Enfin, les couples devraient savoir que le dépistage génétique préimplantatoire est offert par certaines cliniques de fertilité au Canada, mais que, pour l instant (contrairement à la situation au sein de plusieurs pays européens), ce service n est pas couvert par les programmes gouvernementaux d assurance-maladie et que des coûts importants y sont associés. Certaines autorités sanitaires provinciales, comme au Québec, ont commencé à couvrir le coût des cycles de diagnostic génétique préimplantatoire pour les couples qui présentent des anomalies génétiques connues (telles que les maladies monogéniques et les translocations chromosomiques) au sein de certains hôpitaux universitaires; cependant, le typage HLA et d autres indications controversées du diagnostic génétique préimplantatoire sont actuellement exclus de la couverture pour ce service. RÉSUMÉ Le diagnostic génétique préimplantatoire des maladies monogéniques et des translocations chromosomiques constitue une solution de rechange au diagnostic prénatal pour la détection des troubles génétiques chez les couples qui courent le risque de transmettre une pathologie génétique à leur progéniture. Idéalement, la détection devrait être menée au moyen d une analyse génétique par PCR multiplex portant sur des cellules trophectodermiques. L arrivée de nouvelles technologies de CCS (comme l acgh, l identification de SNP en microréseau et la qpcr) s avère très prometteuse : elle pourrait permettre aux techniques cytogénétiques de conférer l avantage clinique que les méthodes fondées sur la FISH n ont pu atteindre. Ces méthodologies permettent, dans le cadre du diagnostic génétique préimplantatoire, l identification et le rejet simultanés des embryons qui présentent une aneuploïdie et une anomalie chromosomique particulière (translocations déséquilibrées) et, dans le cadre du dépistage génétique préimplantatoire, la sélection de l embryon le plus compétent (euploïde) aux fins du transfert. Des données probantes plus robustes s avèrent toujours requises (des ECR en cours devraient y parvenir) avant que leur utilisation clinique dans le contexte du diagnostic génétique préimplantatoire-dépistage génétique préimplantatoire ne soit mise en œuvre de façon régulière. RÉFÉRENCES 1. Handyside AH. Preimplantation genetic diagnosis after 20 years. Reprod Biomed Online 2010;21: Audibert F; comité sur la génétique de la Société des obstétriciens et gynécologues du Canada. Dépistage génétique préimplantatoire. Mise à jour technique de la SOGC, n 232, août J Obstet Gynaecol Can 2009;31: MAY JOGC MAI 2015 S13

14 MISE à JOUR TECHNIQUE DE LA SOGC 3. Handyside AH, Kontogianni EH, Hardy K, Winston RM. Pregnancies from biopsied human preimplantation embryos sexed by Y-specific DNA amplification. Nature 1990;344: Harper JC, Sengupta SB. Preimplantation genetic diagnosis: state of the art Hum Genet 2012;131: Dickens BM. Preimplantation genetic diagnosis and savior siblings Int J Gynaecol Obstet 2005;88: Derks-Smeets IA, Gietel-Habets JJ, Tibben A, Tjan-Heijnen VC, Meijer-Hoogeveen M, Geraedts JP, et al. Decision-making on preimplantation genetic diagnosis and prenatal diagnosis: a challenge for couples with hereditary breast and ovarian cancer. Hum Reprod 2014:29: Whittaker AM. Reproduction opportunists in the new global sex trade: PGD and non-medical sex selection. Reprod Biomed Online 2011;23: Handyside AH, Ogilvie CM. Screening oocytes and preimplantation embryos for aneuploidy. Curr Opin Obstet Gynecol 1999;11: Paulson RJ, Sauer MV, Lobo RA. 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15 Mise à jour technique : Diagnostic et dépistage génétiques préimplantatoires 37. Treff NR, Scott RT Jr. Four-hour quantitative real-time polymerase chain reaction-based comprehensive chromosome screening and accumulating evidence of accuracy, safety, predictive value, and clinical efficacy. Fertil Steril 2013;99: Harton GL, Magli MC, Lundin K, Montag M, Lemmen J, Harper JC; European Society for Human Reproduction and Embryology (ESHRE) PGD Consortium/Embryology Special Interest Group. ESHRE PGD Consortium/Embryology Special Interest Group best practice guidelines for polar body and embryo biopsy for preimplantation genetic diagnosis/screening (PGD/PGS). Hum Reprod 2011;26: Montag M, Köster M, Strowitzki T, Toth B. Polar body biopsy. Fertil Steril 2013;100: Montag M, van der Ven K, Delacrétaz G, Rink K, van der Ven H. Laser-assisted microdissection of the zona pellucida facilitates polar body biopsy. 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