Alexandre Florimond, Philippe Chouteau, Nicole Defer, Aurore Gaudin, Jacqueline Polyte, Hervé Lerat et Jean-Michel Pawlotsky

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1 Dérégulation du cycle cellulaire et activation de la réponse aux dommages de l'adn par les protéines du VHC, déclencheurs potentiels de l'hépatocarcinogenèse Alexandre Florimond, Philippe Chouteau, Nicole Defer, Aurore Gaudin, Jacqueline Polyte, Hervé Lerat et Jean-Michel Pawlotsky Les auteurs déclarent n avoir aucun conflit d intérêt

2 Histoire naturelle de l infection chronique par le VHC VHC Réponse immunitaire Protéines virales Inflammation chronique Cirrhose Carcinome hépatocellulaire (CHC)

3 Histoire naturelle de l infection chronique par le VHC VHC Réponse immunitaire Protéines virales Inflammation chronique? Cirrhose Carcinome hépatocellulaire (CHC)

4 Infection par le VHC Expression des protéines virales Dommages de l ADN Perturbations du cycle cellulaire Higgs et al. Cancer Research, 2010 Higgs et al. Oncogene, 2013

5 Infection par le VHC Expression des protéines virales? Dommages de l ADN? Perturbations du cycle cellulaire in vivo Higgs et al. Cancer Research, 2010 Higgs et al. Oncogene, 2013

6 Infection par le VHC Expression des protéines virales Objectifs : Dommages de l ADN - Analyser les perturbations du cycle cellulaire hépatocytaire associées à l expression des protéines du VHC in vivo - Caractériser le rôle des dommages de l ADN dans ces perturbations du cycle cellulaire et les mécanismes impliqués Perturbations du cycle cellulaire in vivo? Higgs et al. Cancer Research, 2010 Higgs et al. Oncogene, 2013

7 Souris transgénique VHC : VHC de génotype 1b, isolat N2 C E1 E2 p7 NS2 NS3 4A NS4B NS5A NS5B Promoteur Albumine SV40 polya Expression exclusivement hépatique des protéines virales Expression des protéines virales à un niveau physiologique Absence d inflammation locale Adapté de Lerat et al. Gastroenterology, 2002

8 1- Etude des perturbations du cycle cellulaire associées à l expression in vivo des protéines du VHC Modèle de régénération hépatique (Injection d une dose unique de CCl 4 ) Injection de CCl 4 en I.P. (795mg/kg) 0h 24h 40h 48h 60h 72h 120h Foie quiescent / Lésions / Prolifération hépatocytaire / Réparation hépatique

9 1- Etude des perturbations du cycle cellulaire associées à l expression in vivo des protéines du VHC 60 24h post injection CCl 4 Surface de nécrose 24h post injection CCl 4 (%)

10 1- Etude des perturbations du cycle cellulaire associées à l expression in vivo des protéines du VHC 60 24h post injection CCl 4 Surface de nécrose 24h post injection CCl 4 (%) ASAT ALAT UI/L FL-N35 UI/L FL-N h 6h 24h 40h 48h 60h 0 0h 6h 24h 40h 48h 60h

11 1- Etude des perturbations du cycle cellulaire associées à l expression in vivo des protéines du VHC 0h 24h 40h 48h 60h

12 1- Etude des perturbations du cycle cellulaire associées à l expression in vivo des protéines du VHC 0h 24h 40h 48h 60h Hépatocytes BrdU + / µm p<0,0001 p<0,0001 0h 24h 40h 48h 60h FL-N35 n= 4/4 4/4 8/8 4/4 4/4 - CCl 4 + CCl 4

13 Résumé L expression in vivo des protéines du VHC est associée à une altération de la progression du cycle cellulaire hépatocytaire.

14 2- Etude des dommages de l ADN associés à l expression des protéines du VHC Les hépatocytes des souris en culture primaire présentent des dommages de l ADN plus importants que les hépatocytes des souris. WT 60 p=0,001 % Oxidative damage Apex1 Higgs M. et al., Oncogene, 2013

15 2- Etude des dommages de l ADN associés à l expression des protéines du VHC Détection par PCR des délétions de l ADN mitochondrial associées aux dommages oxydatifs de l ADN (Tanhauser S.M. et Laipis P.J., 1995) Amplicon de 4671 pb 3821 pb Amplicon de 851 pb

16 2- Etude des dommages de l ADN associés à l expression des protéines du VHC +/- D-Bait (Quanz et al Quanz et al. 2010) - - PCR sur ADN mitochondrial Amplification d un fragment de 851 pb? OUI NON Dommages de l ADN Dommages de l ADN

17 2- Etude des dommages de l ADN associés à l expression des protéines du VHC D-Bait bp

18 Résumé L expression in vivo des protéines du VHC est associée à une altération de la progression du cycle cellulaire hépatocytaire. L expression in vivo des protéines du VHC est associée à des dommages de l ADN.

19 3 - Les dommages de l ADN et les perturbations du cycle cellulaire hépatocytaire sont-ils liés chez les souris? Dommages de l ADN ATM ATR p53 Chk 2 PTh68 P Ser345 Chk 2 Chk 1 Chk 1 Dégradation p53 P Ser15 p21 cdc25a cdc25a Rb E2F Cyclin E Cdk2 Rb E2F P Ser807/811 Gènes en phase S (Cyclin A) Adapté de Harper et al. Molecular cell, 2007 Retardé

20 3 - Les dommages de l ADN et les perturbations du cycle cellulaire hépatocytaire sont-ils liés chez les souris? Dommages de l ADN ATM ATR p53 Chk 2 PTh68 P Ser345 Chk 2 Chk 1 Chk 1 Dégradation p53 P Ser15 p21 cdc25a cdc25a Rb E2F Cyclin E Cdk2 Rb E2F P Ser807/811 Gènes en phase S (Cyclin A) Retardé

21 3 - Les dommages de l ADN et les perturbations du cycle cellulaire hépatocytaire sont-ils liés chez les souris? Dommages de l ADN ATM ATR p53 Chk 2 PTh68 P Ser345 Chk 2 Chk 1 Chk 1 Dégradation p53 P Ser15 p21 cdc25a cdc25a Rb E2F Cyclin E Cdk2 Rb E2F P Ser807/811 Gènes en phase S (Cyclin A) Retardé

22 3 - Les dommages de l ADN et les perturbations du cycle cellulaire hépatocytaire sont-ils liés chez les souris? P-Rb (Ser 807/811) γ Tubulin 40h post injection CCl 4 Ratio (P-Rb / γ tubulin) p < 0,05 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 n= h post CCl 4 injection

23 3 - Les dommages de l ADN et les perturbations du cycle cellulaire hépatocytaire sont-ils liés chez les souris? Cyclin A γ Tubulin Relative quantities Cyclin A mrna expression 500 p=0, h 24h 40h 48h n= 4/4 4/4 8/8 4/4 - CCl 4 + CCl 4 Ratio (Cyclin A / γ tubulin) 0h 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 24h 40h 48h Cyclin A protein expression p<0,05 0 6h 24h 40h 48h n= 4/4 4/4 8/8 4/4 - CCl 4 + CCl 4

24 Résumé L expression in vivo des protéines du VHC est associée à une altération de la progression du cycle cellulaire hépatocytaire. L expression in vivo des protéines du VHC est associée à des dommages de l ADN. L expression in vivo des protéines du VHC est associée à une altération du checkpoint G1/S du cycle cellulaire hépatocytaire.

25 3 - Les dommages de l ADN et les perturbations du cycle cellulaire hépatocytaire sont-ils liés chez les souris? Dommages de l ADN ATM ATR p53 Chk 2 P Th68 Chk 2 P Ser345 Chk 1 Chk 1 Dégradation p53 P Ser15 p21 cdc25a cdc25a Rb E2F Cyclin E Cdk2 Rb E2F P Ser807/811 Gènes en phase S (Cyclin A) Retardé

26 3 - Les dommages de l ADN et les perturbations du cycle cellulaire hépatocytaire sont-ils liés chez les souris? Dommages de l ADN ATM ATR p53 Chk 2 P Th68 Chk 2 P Ser345 Chk 1 Chk 1 Dégradation p53 P Ser15 p21 cdc25a cdc25a Rb E2F Cyclin E Cdk2 Rb E2F P Ser807/811 Gènes en phase S (Cyclin A) Retardé

27 3 - Les dommages de l ADN et les perturbations du cycle cellulaire hépatocytaire sont-ils liés chez les souris? Dommages de l ADN ATM ATR p53 Chk 2 P Th68 Chk 2 P Ser345 Chk 1 Chk 1 Dégradation p53 P Ser15 p21 cdc25a cdc25a Rb E2F Cyclin E Cdk2 Rb E2F P Ser807/811 Gènes en phase S (Cyclin A) Retardé

28 3 - Les dommages de l ADN et les perturbations du cycle cellulaire hépatocytaire sont-ils liés chez les souris? 0,84 NS P-Chk1 (Ser 345) Chk1 cdc25a γ Tubulin 40h post CCl 4 injection La réponse ATR n est pas activée en réponse aux dommages de l ADN Ratio (P-Chk1 / γ tubulin) Ratio (cdc25a / γ tubulin) 0,8 0,76 0,72 0,68 0,64 0,6 n = h post CCl 4 injection 0,25 NS 0,2 0,15 0,1 0,05 0 n = h post CCl 4 injection

29 3 - Les dommages de l ADN et les perturbations du cycle cellulaire hépatocytaire sont-ils liés chez les souris? Dommages de l ADN ATM ATR p53 Chk 2 P Th68 Chk 2 P Ser345 Chk 1 Chk 1 Dégradation p53 P Ser15 p21 cdc25a cdc25a Rb E2F Cyclin E Cdk2 Rb E2F P Ser807/811 Gènes en phase S (Cyclin A) Retardé

30 3 - Les dommages de l ADN et les perturbations du cycle cellulaire hépatocytaire sont-ils liés chez les souris? Dommages de l ADN ATM ATR p53 Chk 2 P Th68 Chk 2 P Ser345 Chk 1 Chk 1 Dégradation p53 P Ser15 p21 cdc25a cdc25a Rb E2F Cyclin E Cdk2 Rb E2F P Ser807/811 Gènes en phase S (Cyclin A) Retardé

31 3 - Les dommages de l ADN et les perturbations du cycle cellulaire hépatocytaire sont-ils associés chez les souris? P-Chk2 (Thr 68) Chk2 P-p53 (Ser 15) Lamine A/C p21 Lamine A/C γ Tubulin 40h post injection CCl 4 40h post injection CCl 4 40h post injection CCl 4 Ratio (P-Chk2 / γ tubulin) 0,35 0,3 0,25 0,2 0,15 0,1 0,05 0 p = 0,027 Ratio (P-p53 / Lamine A/C) 0,8 0,7 0,6 0,5 0,4 0,3 0,2 0,1 0 p<0,05 Ratio (p21 / lamine A/C) p<0,05 n= 8 8 n= 8 8 n= h post injection CCl 4 40h post injection CCl 4 40h post injection CCl 4 La réponse ATM est activée en réponse aux dommages de l ADN

32 Résumé L expression in vivo des protéines du VHC est associée à une altération de la progression du cycle cellulaire hépatocytaire L expression in vivo des protéines du VHC est associée à des dommages de l ADN. L expression in vivo des protéines du VHC est associée à une altération du checkpoint G1/S du cycle cellulaire hépatocytaire. Les dommages de l ADN présents chez les souris sont associés à une activation de la voie ATM.

33 Conclusion L expression in vivo des protéines du VHC est associée à des perturbations du checkpoint G1/S du cycle cellulaire hépatocytaire en lien avec l activation de la voie ATM des réponses aux dommages de l ADN

34 Remerciements Equipe 18, INSERM U955 CNR des hépatites virales B, C et delta Hôpital Henri Mondor, Créteil Pr Jean-Michel PAWLOTSKY Philippe CHOUTEAU Nicole DEFER Aurore GAUDIN Jacqueline POLYTE Hervé LERAT Collaboration: INSERM U2012, CNRS UMR3347 Institut Curie, Orsay Dr Marie DUTREIX Nirmitha HERATH Flavien DEVUN

35

36 Infection par le VHC Expression des protéines virales NS5A Protéines Non structurales? Dommages de l ADN Bid +core Dysfonctions mitochondriales Oxidative Stress Pi3K/P-AKT Syndrome métabolique (IR,stéatose) Promoter c-myc β-catenin β-catenin c-myc c-myc c-myc c-myc Promoter GADD45b CH3 CH3 Dommages de l ADN Defective DNA repair Gadd45β? Perturbations du cycle cellulaire Apoptose diminuée Instabilité génomique Événements pro-carcinogènes Checkpoints anormaux du cycle cellulaire Gastro 2002, 2004, 2006, 2008 JBC 2003 JBC 2009 Hepato 2009 Cancer Res 2010 J Hepatol 2012 Oncogene 2012

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