Etude des voies de signalisation in vivo. Marie-Laure Parmentier, IGF, Montpellier

Transcription

1 Etude des voies de signalisation in vivo Marie-Laure Parmentier, IGF, Montpellier

2 Qu est-ce qu une voie de signalisation? + Mécanismes d arrivée du signal signal + Mécanismes de dégradation du signal Changement d état physiologique de la cellule

3 Qu est-ce qu une voie de signalisation? Organismes modèles ont permis la découverte des différents intervenants des voies de signalisation (génétique) Exemple de signaux? signal Où sont-ils produits, comment diffusentils?

4 Qu est-ce qu une voie de signalisation? Concepts : - Mouvement du signal dans un tissu/ stabilité du signal - Différentes réponses en fonction de la quantité de signal - Différentes réponses selon l endroit où arrive le signal dans la cellule (la cellule n est pas homogène). Techniques : - génétique, clones mutants, système Gal4, clones de surexpression

5 Un signal particulier : le morphogène Le morphogène Ses effets temps Exemples :?????

6 Un signal particulier : le morphogène Le morphogène Ses effets temps Exemples : Wingless (Wnt), Dpp, Hh

7 Effet morphogène Organisateur de Spemann: Expériences de transplantation au stade gastrula, conduisant à une duplication complète avec une image en miroir (Spemann et Mangold, 1924) Propriétés d un morphogène: Molécule diffusible qui va induire des réponses dose-dépendantes et va agir directement sur les cellules.

8 (W. Sullivan, 1997)

9 Diffusion d un morphogène Pendant le développement précoce de la Drosophile, on a Bicoid: Protéine à Homéodomaine, Facteur de transcription (Ashe et Briscoe, 2006)

10 Diffusion d un morphogène Plus tard dans organisme cellularisé Le gradient de morphogènes va instruire des cellules pour adopter un devenir différent en fonction de leur distance par rapport à la source Protéine signal Récepteur transmembranaire P FT FT P Gènes cibles

11 Questions posées concernant les morphogènes Outre leur identification i) Comment les morphogènes bougent au travers d un tissu ii) Comment est maintenu le gradient iii) Comment les morphogènes coordonnent la croissance et la différenciation («patterning»)

12 I. L aile de la mouche et le morphogène Hedgehog (Hh) 1) Notion de compartiment 2) Techniques génétiques utilisées 3) Le voie de signalisation Hh 4) Est-ce que Hh est un morphogène? 5) Comment est contrôlée la diffusion d Hh? 6) Conservation de cette voie de signalisation chez les vertébrés

13 L importance des compartiments et de leurs frontières - Les compartiments sont des unités fonctionnelles, qui permettent à des lots de cellules d avoir un devenir commun. - Les frontières entre les compartiments ont deux fonctions au cours du développement:. maintenir la position des «organisateurs» (sources de morphogènes) dans des tissus en croissance indépendamment des systèmes de signalisation autour.. permettre la communication entre des groupes de cellules (des compartiments) pour synchroniser la prolifération et la différenciation, au moment de la formation des structures adultes. - Différents groupes de cellules auront donc la possibilité de communiquer, via les morphogènes.

14 Formation des compartiments et de leurs frontières Engrailed Protéine à homédodomaine, Facteur de transcription Engrailed (Chanas et al., 2004) A- Rhombomères B- Thalamus C- Télencéphale

15 Engrailed (Tabata et Takei, 2004) Disque imaginal d aile de Drosophile D V EN1 Bourgeon d aile chez le poulet

16 Développement de l aile Nécessite la mise en place des morphogènes impliqués dans le développement («patterning») des structures adultes et dans la prolifération des cellules. D/V Wg Dpp Dpp Compartiment postérieur Engrailed: Facteur de transcription Gène sélecteur Hedgehog: Protéine signal, diffusible Decapentaplegic (Dpp) selon A/P

17 Système d activation UAS/Gal4 Promoteur spécifique Gal4 X UAS Séquence codante Engrailed LacZ Gal4

18 Capacités de morphogène de Hedgehog Compartiment postérieur Engrailed: Facteur de transcription Hedgehog: Protéine signal, diffusible Antérieur Hh Postérieur ectopic Hh (Tabata et Takei, 2004)

19 Acteurs de la voie de signalisation de Hh A P Hh A? Hh P Ci complex Ci activateur Zn Engrailed ptc, dpp, en Cellule A recevant Hh Cellule P produisant Hh En= Engrailed= facteur de transcription sélecteur, spécifique des compartiments postérieurs (P) (protéine à homéodomaine). Hh= Hedgehog= effecteur= protéine diffusible, sécrérée vers l antérieur (A) Ptc= Patched= récepteur de Hh, capable de reconnaître le signal Hh. Smo= Smoothened= récepteur associé à Ptc. Conformation change en présence de Hh, conduisant au maintien de Ci activateur Ci= Cubitus-interruptus= facteur de transcription spécifique de A (protéine à doigt de Zinc) Dpp= Decapentaplegic= facteur de croissance, protéine diffusible qui va agir sur prolifération des cellules et le «patterning»

20 Transduction du signal Hh Cellules A ne recevant pas Hh Cellules A recevant Hh hh, dpp ptc, dpp, en (Ingham, 1998)

21 Smoothened nécessaire pour transduire Hh ptc, dpp, en (Chen et Struhl, 1996)

22 Les gènes cibles de la voie Hh Ptc-LacZ Dpp-LacZ Dpp PTC EN

23 Mise en place d un gradient du facteur de croissance Dpp I A/P A P A/P Dpp A P Hh En Dpp: Decapentaplegic, facteur de croissance type TGF-ß, protéine diffusible, qui va agir sur prolifération des cellules et le «patterning»

24 Clones de surexpression FRT FRT tub Gal4 UAS-GFP hs-flp CD2, y+ > > UAS-EN ou X + HS tub > X > Gal4 UAS-GFP UAS-EN ou X GFP Anti-EN

25 Hh est-il un morphogène? Expressions de En et Dpp dépendent de la diffusion de Hh Hh/ En Hhm/ En En/ Dpp Hhm/ Dpp Expression ectopique de Hh Agit sur En et Dpp sur plusieurs rangées de cellules Expression ectopique de Hh membranaire Agit sur En et Dpp et est donc direct (Strigini et Cohen, 1997)

26 Qu y a-t-il en aval de smoothened : les protéines G? ptc, dpp, en (Ayers et Leopold 2010)

27 Qu y a-t-il en aval de smoothened : les protéines G? Hh ptc luciferase (Ogden et al. 2010)

28 Gi Hh Ptc promoteur

29 Est-ce que Galphai module l expression des cibles de Hh in vivo? Surexpression forme CA de Galphai (visualisation expression Dpp avec Dpp-LacZ) (Ogden et al. 2010)

30 Gi Dpp promoteur

31 Induction de clones mutants dans les disques imaginaux FRT > > mut + GFP + HS hs-flp FLPase > > X > > GFP GFP Clone jumeau Clone mutant

32 Est-ce que Galphai module l expression des cibles de Hh in vivo? Clones mutants pour Galphai Dpp (visualisation expression Dpp avec Dpp-LacZ) (Ogden et al. 2010)

33 Gi Dpp promoteur endogenously

34 Est-ce que Galphai joue un rôle en aval de Smo in vivo? Expression d un DN Smo (Ogden et al. 2010)

35 Gi Smo endogenously

36 Est-ce que la quantité d AMPc influe sur la voie Hh? Expression d un DN Smo en contexte dnc (phosphodiesterase) (Ogden et al. 2010)

37 AMPc Smo endogenously

38 Comment est contrôlée la diffusion de Hh? Patched nécessaire pour séquestrer Hh Dpp Clones ptc - (en contexte faible expression de ptc) Dpp (Chen et Struhl, 1996)

39 SS: Séquence signal Hh-N: N-ter Hh-C: C-ter Hh-Np: N-ter modifiée La protéine Hh est active après protéolyse et modification

40 Rôle du cholestérol dans la diffusion de HH En-Gal4; UAS-Hh-N Ptc et Dpp augmentent dans A, quand Hh ne contient pas de cholesterol 1- Modification de Hh par le cholestérol est nécessaire - pour diffusion de Hh à partir des cellules P - pour la séquestration de Hh par Ptc (Burke et Basler, 1999) 2- HH a la capacité d activer des cibles différentes en fonction de sa concentration, mais la présence du cholestérol est reconnue par Ptc, ce qui l empêche de diffuser

41 Conclusions sur la voie de signalisation En/Hh -Le compartiment P va déclencher la voie grâce à l expression du facteur de transcription Engrailed (gène sélecteur). -Hedgehog possède toutes les propriétés attendues des morphogènes: i) Molécule diffusible, capable d induire une duplication de structures adultes. ii) Capable d agir directement sur les cellules et sur l expression des gènes, de façon différentielle, en fonction de sa concentration. - Les études sur la Drosophile ont permis d identifier les acteurs de la voie: i) Le système de réception du signal par Ptc ii) Le système de transduction du signal par Smo iii) L activation du facteur de transcription Ci iv) Les cibles activées par Ci - Les mécanismes mis en jeu pour former et contenir le gradient: i) La diffusion de Hh est en partie ralentie par Ptc qui va séquestrer Hh ii) Sa modification par le cholestérol contrôle sa diffusion

42 Expression ectopique de Sonic Hedgehog (Riddle et al., 1993)

43 Signalisation de Sonic hedgehog (Shh) et le développement du tube neural Différenciation du tube neural de poulet (Griti-Linde et al., 2001)

44 Réutilisation de la voie canonique de Shh dans différents processus développementaux A- Sonic hedgehog spécifie la devenir neuronal B- Sonic hedgehog agit avec Netrin-1 pour guider les axones commissuraux C- Sonic hedgehog guide les axones antérieurement (Charron et Tessier-Lavigne, 2005)

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48 Comment est donc régulé le gradient d un morphogène? Pour un morphogène donné, l étendue de son action dépend du tissu étudié : pour Wg, la protéine diffuse et agit symétriquement à partir de sa source sur un rayon de 25 cellules environ alors que chez l embryon, le rayon d action de ce signal est de cinq cellules au maximum. L étendue d un signal est modulée par - le taux de sécretion de ce signal - la composition de la matrice extracellulaire (Héparan Sulfate protéoglycans, qui peuvent séquestrer Wg et affecter sa diffusion) - la quantité de récepteur (le récepteur patched séquestre son ligand Hh, alors que le récepteur Frizzled 2 stabilise son ligand Wg et étend le gradient Wg) - le taux d internalisation du signal - le temps alloué pour la diffusion de ce signal

49 Quels facteurs sont responsables de l asymétrie du gradient Wg chez l embryon? La quantité de récepteur frizzled ou frizzled En En Wg S Wg S fz fz2 Très peu de récepteurs dans les cellules en prot Wg En ARNs Lecourtois et al., Dev Biol 01

50 Quels facteurs sont responsables de l asymétrie du gradient Wg chez l embryon? La dégradation de Wg par les lysosomes Exp : surexpression d une protéine de fusion HRP-Wg avec en-gal4 Wg HRP Dubois et al, Cell 01 MVB Lysosome 0,5 µm

51 Quantification : Nombre de lysosomes marqués HRP Dubois et al, Cell 01

52 Qu est-ce qu une voie de signalisation? Concepts : - Mouvement du signal dans un tissu/ stabilité du signal - Différentes réponses en fonction de la quantité de signal - Différentes réponses selon l endroit où arrive le signal dans la cellule (la cellule n est pas homogène). Techniques : - génétique, clones mutants, système Gal4, clones de surexpression