Stress Oxydant et Vieillissement. Modifications oxydatives des protéines au cours du vieillissement GERONTOLOGIE FONDAMENTALE

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1 Stress Oxydant et Vieillissement Modifications oxydatives des protéines au cours du vieillissement GERONTOLOGIE FONDAMENTALE Isabelle Petropoulos Laboratoire de Biologie Cellulaire du Vieillissement UMR 7079

2 Plan du cours Implication du stress oxydant dans les processus de vieillissement (rôle des espèces réactives de l oxygène ou ERO) Modifications par voie oxydative des protéines au cours du vieillissement Implication du protéasome et plus généralement des systèmes de maintenance (élimination et réparation des protéines oxydées)

3 Qu est ce que le vieillissement? Le vieillissement se caractérise par une diminution de la capacité d un organisme à faire face à son environnement Usure de l organisme suite à l accumulation d altérations subies au cours du temps Théorie des radicaux libres Les changements associés au vieillissement sont dus à l accumulation des dommages produits pas les ERO. Production des ERO Défenses antioxydantes Systèmes de maintenance qui aident la cellule à répondre au stress oxydant

4 Relation entre la longévité et résistance au stress oxydant Igf-1 receptor Tyrosine-kinase receptor 26 % increase in KO mouse Enhanced (paraquat, H ) (Nature, 2003, Y. Le Bouc)

5 Origine et réponses cellulaires aux ROS Sources endogènes Mitochondries Péroxysomes Lipoxygénases NADPH oxydase Cytochrome P450 Défenses antioxydantes Systèmes enzymatiques : CAT, SOD, GPx Systèmes non-enzymatiques : Glutathion et vitamines (A, C et E) Sources exogènes UV Radiations ionisantes Toxines inflammation (cytokines) ONOO - ROO. NO 2 Taux basal H 2 O 2 RO. ROS O 2.- NO. OH. Taux élevé Homéostasie Croissance normale métabolisme normal Altération des fonctions physiologiques vieillissement maladie mort cellulaire

6 Les principales cibles des Espèces Réactives de l Oxygène dans la cellule Oxydation de l ADN mutations : la guanine peut réagir avec 1 radical hydroxyl : 8 hydroxyguanine Coupures simple brin et double brin Délétions (ADN mitochondrial) Oxydation des lipides Oxydation des protéines Oxydation des phospholipides des membranes Formation de peroxydes lipidiques - 4-hydroxynonenal (4-HNE) - malonaldéhyde (MDA) Modifications oxydatives multiples (carbonyles)

7 Qu est-ce que l oxydation des protéines? Modification covalente des protéines provoquées par des espèces réactives de l oxygène ou par des dérivés induits par le stress oxydant Oxydation Protéine active Protéine oxydée non fonctionnelle

8 Modification des protéines par voie oxydative Oxydation Tous les acides aminés Hydroxyls R-OH Carbonyls R-C-H, R-C-R, O O Disulfide cys-s-s-cys Methionine sulfoxide MeSO Protéine native Histidine Cystéine Lysine Glycation Produits d Amadori Lysine Arginine Conjugaison avec des produits de péroxydation lipidique (e.g. HNE, MDA) Glycoxydation N AGEs N R N H N H R R NH CH2 COO - Carboxymethylysine Pentosidine

9 Acides aminés les plus susceptibles à l oxydation et leurs principaux produits de réaction Acide aminé Cysteine Methionine Tyrosine Tryptophane Phenylalanine Valine, Leucine Histidine Glutamyl Proline Threonine Arginine Lysine Produits d oxydation Disulfides, mixed disulfides (e.g., glutathiolation), acides cystéiques Methionine sulfoxide, methionine sulfone Dityrosine, nitrotyrosine, chlorotyrosines, DOPA Hydroxy- and nitro-tryptophans, kynurenines Hydroxyphenylalanines Hydroperoxides 2-Oxohistidine, asparagine, aspartate acide oxalique, acide pyruvique Hydroxyproline, pyrrolidone, glutamic semialdehyde Acide 2-Amino-3-cetobutyrique semialdehyde glutamique, chloramines semialdehyde, chloramines,

10 Maladies et situations dans lesquelles est impliquée l oxydation des protéines Athérosclérose (LDL) Arthrite rhumatoïde (IgG) Ischemie-reperfusion cardiaque et cérébrale Emphysème pulmonaire (inhibiteur de l α -1-proteinase, elastase) Maladies neurodegeneratives - Alzheimer Dystrophie musculaire Syndrome de détresse respiratoire Vieillissement Progeria/syndrome de Werner Alcoolisme Cataracte (α-crystallines) Cancer -Parkinson

11 Modification et devenir des protéines cellulaires endommagées OXYDATION GLYCATION/ GLYCOXIDATION CONJUGAISON AVEC DES PRODUITS DE PEROXIDATION LIPIDIQUES Aggregats PROTEINE NATIVE PROTEINE ENDOMMAGEE DEGRADATION BIOSYNTHESE REPARATION Peptide methionine sulfoxide reductase system Proteasome Acides Aminés PEPTIDES

12 Immunodétection des groupements carbonyles sur les protéines O proteine oxydée DNPH protéine DNP DNP anticorps Anti-DNP DNP protéine DNP * * * ** * Western blot, ELISA, immunohistochimie En western blot : Détection des protéines oxydées dans un mélange de protéines (susceptibilité différentielle des protéines à l oxydation) Sensibilité 1 pmol de groupement carbonyle

13 Levine and Stadtman, 2001, Exp. Gerontol., 36: (fibroblastes humains, cristallin human, cerveau humain, foie de rat, mouche)

14 Modification et devenir des protéines cellulaires endommagées OXYDATION GLYCATION/ GLYCOXIDATION CONJUGAISON AVEC DES PRODUITS DE PEROXIDATION LIPIDIQUES Aggregats BIOSYNTHESE PROTEINE NATIVE REPARATION Peptide methionine sulfoxide reductase system PROTEINE ENDOMMAGEE DEGRADATION Proteasome Acides Aminés PEPTIDES

15 ELIMINATION DES PROTEINES OXYDEES LE PROTEASOME Rôles dans le vieillissement et les maladies liées à l âge

16 Le protéasome : machinerie d élimination des protéines endommagées Complexe 19S α ββ α ATP Chymotrypsine-similaire Hydrolase post-glutamique Trypsine-similaire Protéasome 20S Protéasome 26S

17 Régulateur 19 S + ATP Protéasome 20 S Protéasome 26 S Dégradation des protéines modifiées par oxydation Dégradation des protéines marquées par les chaînes de polyubiquitines Rôles physiologiques importants dans: Le cycle cellulaire (dégradation des cyclines) La présentation de l antigène L inflammation (activation de NFkB) L apoptose (p53) La réparation de l ADN (PARP)

18 Micrographies de particules protéasomales

19 Dégradation des protéines ubiquitinées par le protéasome 26 S

20 Dégradation des protéines oxydées par le protéasome 20 S

21 Protéasome et vieillissement de la peau Vieillissement intrinsèque chronologique et génétique Vieillissement extrinsèque Stress oxydant, photo-vieillissement Diminution du renouvellement cellulaire, sénescence Dégradation de la matrice extra-cellulaire Endommagement des macromolécules cellulaires Oxydation des protéines au cours du vieillissement de l épiderme Rôle du protéasome dans les processus de vieillissement

22 Modifications des protéines cytosoliques durant le vieillissement de l épiderme A Oxyblot C MWM kda Western blot anti-age MWM kda B Western blot anti-hne D ng eq glycated-bsa/μg of proteins ELISA anti-age age of donor (years)

23 Activités protéolytiques du protéasome Activité Hydrolase post - glutamique Activité Chymotrypsine-similaire LLE-NA LLVY-AMC (Coupure après acide aminé aromatique) (Coupure après acide aminé acide) LSTR-AMC (Coupure après acide aminé basique) Activité Trypsine -similaire 20S Excitation 350 nm Emission 440 nm -βna -AMC Excitation 333 nm Emission 410 nm -AMC

24 Effet de l âge sur les activités du protéasome dans les cellules épidermiques A MWM kda Chymotrypsin-like pmol AMC/min. per mg Peptidylglutamyl-peptide hydrolase pmol NA/min. per mg B age du donneur (années)

25 GEL BIDIMENSIONNEL DE PROTEASOME PURIFIE A PARTIR DE L EPIDERME DE DONNEUR DE 17 ANS ph=3 ph= kda 21kDa b SDS-PAGE Comparaison avec des donneurs plus âgés : Diminution de 3 sous-unités α : α3, α4 et α5 Augmentation d 1 sous-unité β : β4

26 Expression des sous-unités du protéasome 20 S 100 β7 100 β2 100 β MRC C1 C2 C3 C6 α3 0 E) MRC C1 C2 C3 C6 α6 0 MRC C1 C2 C3 C MRC C1 C2 C3 C6 0 MRC C1 C2 C3 C Nombre de passages

27 Effet de l âge sur les activités peptidasiques du protéasome espèce tissu âge effet sur l activité Humain Lymphocytes T ans vs ans Chymotrypsine Cristallin clair vs cataracte Chymotrypsine Rat Foie Coeur Poumon Cerveau 3-8 mois vs mois 3 mois vs 28 mois Chymotrypsine Trypsine PGPH Chymotrypsine muscle 4 mois vs 34 mois Chymotrypsine Trypsine PGPH

28 Effet de l âge sur l expression du protéasome Analyse de transcriptome espèce tissu âge Effet sur l expression Effet de la restriction calorique Humain Fibroblastes 8 ans vs 92 ans α2, α7 (protéasome 20 S) sous-unités du 19S (protéasome 26S) souris Muscle squelettique 5 mois vs 30 mois β2, β7 (protéasome 20 S) sous-unités du 19S (protéasome 26S)

29 PROTEASOME ET VIEILLISSEMENT CONCLUSIONS Le contenu en groupements carbonyles des protéines augmentent avec l âge dans les kératinocytes et les fibroblastes. Ces groupements peuvent être générés : - soit par oxydation directe d acides aminés - soit par conjugaison avec des produits de péroxydation lipidique - soit par glycation Deux des activités (chymotrypsine et peptidyl-glutamylpeptide hydrolase) du protéasome diminuent avec l âge, ce qui peut s expliquer, au moins en partie, par une diminution de la quantité de protéasome cellulaire. Une diminution de l activité, de la quantité du protéasome est également observée au cours de la sénescence réplicative (kératinocytes et fibroblastes en culture). Une diminution de l expression de certains gènes codant des sous-unités catalytiques et régulatrices a été observée dans les fibroblastes âgés. Les centenaires semblent avoir la capacité de «préserver» leur protéasome

30 Rôle de l oxydation des LDL dans l athérogenèse Les LDL oxydées représentent un facteur de risque majeur dans l athérogenèse et sont impliquées dans les événements précoces de formation de la plaque : - Attraction dans la paroi des cellules mononuclées (macrophages et lymphocytes T) - Formation de cellules spumeuses - Migration et prolifération des cellules musculaires lisses - Dysfonction endothéliale (apoptose et nécrose) - Potentialisation des effets toxiques des LDL oxydées par inhibition du protéasome

31 Oxydation des HDL et transport reverse du cholestérol F C Bile CE HDL Mature A-I HDL Naissant A-I CE LCAT CL Macrophage FC CL Foie CETP HDL impliqués dans le transport réverse du cholestérol des macrophages spumeux vers le foie. Dysfonctionnement des HDL mis en cause dans les maladies cardiovasculaires Ce dysfonctionnement serait en partie du aux attaques oxydatives (myélopéroxydase élevée dans les macrophages des tissus athérosclérotiques). Rôle de l oxydation de l Apo A1 sur l activité de la LCAT (lecithine:cholestérol acyltranférase)

32 Oxydation de l Apo A1 et activité LCAT

33 Exemple de l α1-antitrypsine Synthétisée dans les hépatocytes. Présente dans le parenchyme pulmonaire. Protection de la matrice alvéolaire contre l activité de l élastase (sérine protéase). Contient 9 résidus méthionines dont 2 (Met 351 et Met 358) seulement sont oxydables en présence d oxydant. Une déficience de l activité de cette enzyme est mise en cause dans l emphysème pulmonaire du fumeur (maladie pulmonaire caractérisée par une destruction des bronchioles)

34 Inactivation de l α1-antitrypsine par oxydation des résidus méthionines Cigarette (H 2 0 2, phénol) cigarette Régulation de l activité élastase

35 Inhibition du protéasome dans les cerveaux de patients atteints de la maladie d Alzheimer Accumulation de protéines oxydées Dégénérescence et mort neuronale