L'ASSIMILATION DU NITRATE PAR LES PLANTES

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1 Université de Neuchâtel Laboratoire de Physiologie végétale Travaux pratiques de Physiologie végétale L'ASSIMILATION DU NITRATE PAR LES PLANTES En général, les plantes couvrent leur besoin en azote par le prélèvement de nitrate à partir du sol. Celuici est réduit en deux phases pour donner de l'ammoniaque : 1 2 NO 3 NO 2 NH La nitrate réductase; enzyme cytosolique; contient un cofacteur avec du Mo 2+ ; l'agent réducteur est le NADH + H +. nitrate nitrite 2 La nitrite réductase; enzyme plastidiale; l'agent réducteur est la ferrédoxine réduite. Finalement, par l'intermédiaire des réactions suivantes, l'ammonium est incorporé dans les molécules organiques : Glutamate Glutamine H 3 N + C H Glutamine synthétase H 3 N + C H CH 2 + NH ATP CH 2 + ADP + Pi CH 2 CH 2 CONH 2 Glutamine αcétoglutarate 2x Glutamate Glutamate synthétase ("GOGAT") H 3 N + C H O=C H 3 N + C H + CH 2 CH 2 2x CH 2 ferrédoxine réduite CH 2 CH 2 CH 2 C O NH 2

2 2 Bilan des deux réactions : Fd. Réd. αcétoglutarate + NH ATP > Glutamate + ADP + Pi La quantité de nitrate réductase dans les plantes dépend de la présence d'azote disponible. Le NO 3 induit la production d'enzyme par néosynthèse (induction par le substrat). Ainsi, la nitrate réductase n'est produite que lorsqu'elle est vraiment nécessaire. Dans l'expérience suivante, nous allons déterminer l'activité de la nitrate réductase dans du matériel végétal qui a été cultivé ou non en présence de NO 3. Le dosage de l'activité se fait par une détermination colorimétrique quantitative de la quantité de NO 2 formé selon le schéma suivant : Sulfanilamide Sel de diazonium N[Naphthyl(1)]éthylènediammoniumdichloride Colorant azo (rouge) Matériel : Matériel végétal: Des graines d'orge (Hordeum vulgare, "Estana") sont imbibées durant la nuit dans de l eau aérée et finalement semées dans quatre bacs de Vermiculite / Perlite. Deux bacs sont arrosés avec de l eau, les autres bacs sont arrosés avec une solution contenant 5 mm KNO 3. Les bacs sont ensuite déposés dans une chambre climatisée (20 C, 16h jour, 8h nuit) pendant 10 jours. Les cultures sont arrosées régulièrement avec les solutions correspondantes. Deux jours avant le déroulement du TP deux bacs (+/ KNO 3 ) sont déposes à l obscurité.

3 3 Solutions nécessaires pour le TP: Tampon de broyage: 0.1 M TrisHCl, ph 8.0, 1 mm EDTANa 4. Les étudiants doivent ajouter dans le tampon fourni au moment du TP, de la Cystéine : concentration finale10 mm, soit 1.2 g/l. KNO M 0.1 M tampon phosphate de potassium ph 7,5 NaNO mm (à préparer fraîchement) Acétate de zinc 1M NADH 1 mm (à préparer fraîchement) Réactif de sulfanilamide: Dissoudre 1 g de sulfanilamide dans 75 ml H 2 O et 25 ml HCl concentré. Réactif de naphthyl: 0.02 % Solution aqueuse de N(1naphthyl) éthylènediammonium dichloride (conserver au frais dans une bouteille brune). Matériel de laboratoire: Pipettes 50, 200 et 1000 Tubes eppendorfs Mortier et pilon Sable de Fontaineblau Bac de glace Centrifugeuse pour eppendorf Spectrophotomètre Cuvettes en plastique Spatule et papier à peser Déroulement de l'expérience: Courbe de calibration du nitrite: Dans des cuvettes en plastique : Préparer: ,1 mm NO 2 (µl) H 2 O (µl) Réactif de 1 ml sulfanilamide Réactif de Naphtyl 1 ml Mélanger Mesurer l absorbance à 540 nm après 10 min, faire le blanc sur le premier tube. nmol NO 2 [à calculer!] Absorbance (540 nm) zéro

4 4 Préparation de l extrait enzymatique brut: Pour chaque traitement: Prélever quelques feuilles d'orge (1ère et 2ème feuilles) pour avoir environ 1g. Rincer à l eau distillée, absorber les gouttes sur un papier ménage sans laisser sécher les tissus. Peser et noter le poids exact. Ajouter au tampon de broyage de la cystéine! Broyer le matériel dans un mortier refroidi (glace) en présence d une spatule de sable et de 4 ml de tampon de broyage froid. Il faut faire attention qu il n y ait pas de morceaux de glace qui arrivent dans le mortier. Transférer le broyat (avec une pipette en plastique) directement du mortier dans des tubes eppendorfs en mettant tout le liquide mais en évitant de mettre le sable (2 tubes de 2 ml). Centrifuger pendant 2 min à vitesse maximale à l aide d une centrifugeuse. Après la centrifugation, récupérer tout de suite les surnageants dans des tubes à essai de 10 ml à l'aide d'une pipette et conserver dans la glace (réunir les surnageants de chaque traitement!). Ceci constitue l extrait enzymatique. Test enzymatique: Une fois recueillis tous les extraits enzymatiques, pour chacun des traitements: Pipetter dans 12 tubes eppendorfs placés à température ambiante, les solutions suivantes: 0.4 ml Tampon KH 2 PO M, ph 7,5 (à mettre en premier) 0.1 ml KNO M 0.1 ml NADH 1 mm Démarrer la réaction avec l'ajout de l'extrait enzymatique: 0.4 ml extrait enzymatique (tube 13 : extrait «lumière H 2 0» ; tube 46 : extrait «lumière N0 3» ; tube 79 : extrait «obscurité H 2 0» ; tube 1012 : extrait «obscurité N0 3») Ajouter immédiatement dans 1 tube par traitement (no. 1, 4, 7, 10) 0.2 ml d acétate de zinc 1 M Placer ce tube dans la glace en attendant la fin de la réaction (Témoin). Laisser incuber les 8 autres tubes à température ambiante pendant 1 h. Après 1h stopper la réaction en ajoutant 0.2 ml d acétate de zinc 1 M. Centrifuger tous les tubes pendant 5 min. pour éliminer les éléments turbides (protéines dénaturées). Transférer 1 ml de chaque surnageant dans une cuvette spectro (numéroté!).

5 5 Puis ajouter: 1 ml de réactif de naphtyl 1 ml de réactif de sulfanylamide Mélanger puis attendre pendant 10 min Mesurer l absorbance à 540 nm Résultats: Courbe d'étalonnage Faire un graphe avec en abscisse la quantité de nitrite (en nmol) dans chaque tube et en ordonnée l'absorbance. Test enzymatique Déduire de la courbe d'étalonnage la quantité de nitrite formée dans chaque tube. Calculer l'activité de la nitrate réductase en mol x h 1 x g 1 pour chaque traitement. Comparer l activité de la nitrate réductase des extraits enzymatiques (traitements) différents. Bon travail!