Appli Ozyme Western Blot Protocole Complet

Transcription

1 Appli Ozyme Western Blot Protocole Complet SOMMAIRE Matériel et réactifs nécessaires... P.2 Déroulement de l expérience... P.3 Préparation, électrophorèse et protocole de transfert... P.3 Protocole de révélation du blot P.8 Appendice P.10 Merci de vous référer au protocole complet ci-dessous et non au protocole individuel de chaque produit cité. P. 1

2 Matériel et réactifs nécessaires Gels Tris-Glycine SDS précoulés : gels PAGEr EX (dimensions et concentrations variables selon références; à déterminer selon la taille des protéines et le type de cuve utilisée : se reporter à l appendice pour les références à commander Tampon de migration : ProSieve EX Running Buffer (Réfs. : LON ou LON L ou 4 L) Tampon de transfert (10X) : ProSieve EX Western Blot Transfer Buffer (Réf. : LON L) Marqueur de protéines précolorées en 4 couleurs : ProSieve QuadColor Protein Marker Réf. LON x 250 µl soit environ 70 mini-blots à 7µl par dépôt (suivi du marqueur durant la migration et le transfert) Marqueur de protéines non coloré biotinylé : Biotinylated Protein Ladder Detection Pack Réf. : 7727S ou L soit 65 ou 325 mini-blots à10 µl par dépôt : incluant le marqueur de protéines biotinylées en format prêt à l emploi et un anticorps anti-biotine couplé HRP (Réf. : 7075) (optimisé pour la détection des Western blots en chimioluminescence) ECL RevelBlOt Plus Réf. : OZYB (500 ml soit environ 50 mini-blots (10 x 10 cm) ; solution A : 250 ml et solution B : 250 ml) ou ECL RevelBlOt Intense Réf. : OZYB (100 ml soit environ 10 mini-blots (10 x 10 cm) ; solution A : 50 ml et solution B : 50 ml) Anticorps primaire Cell Signaling Technology (CST) de votre choix Anticorps secondaires CST : anticorps anti-igg de lapin conjugué HRP (Réf. : 7074S) ou anticorps anti IgG de souris conjugué HRP (Réf. : 7076S) (selon la source de l anticorps primaire) Cuve d électrophorèse minigel (PAGEr Gel Chamber & Blot Module Réf. : LON59907 ; voir appendice) et cassettes de transfert compatibles ou système de transfert liquide ou semi-sec indépendant Générateur (Tension nécessaire de 270V minimum) Autres réactifs Tampon de charge au choix : ProSieve ProTrack Dual Color Loading Buffer Réf. : LON , Blue Loading Buffer Pack Réf. : 7722S ou Red Loading Buffer Pack Réf. : 7723S. Lait écrémé en poudre (Réf. : 9999). Sérum-albumine bovine (BSA) (Réf. : 9998) : selon l anticorps primaire utilisé (voir fiche produit), on utilisera de la BSA ou du lait dans le tampon de dilution de l anticorps primaire. Tampon Tris-Tween 20 10X (TBST-10X) (Réf. : 9997). Sandwiches nitrocellulose Réf.: 12369S (membranes de nitrocellulose 7 x 8,5 cm, diamètre des pores : 0,2 μm ; capacité de liaison : 90 μg/cm 2 / et papier buvard) ou membrane équivalente (PVDF ou nitrocellulose) et papier buvard (de préférence très épais). Eau distillée pour dilution des tampons. P. 2

3 Déroulement de l expérience Préparation du gel, du tampon et des échantillons Electrophorèse Transfert Incubation des anticorps Détection ECL Prise de vue et analyse Préparation, électrophorèse & protocole de transfert Préparation du tampon de migration 1. Ajouter 933 ml d eau déionisée à 67 ml de tampon ProSieve EX Running Buffer (10 X) pour obtenir une solution finale à 0,67 X. 2. Bien mélanger. Préparation du marqueur précoloré ProSieve QuadColor Protein Marker 1. Décongeler. 2. Mélanger doucement. Préparation des échantillons et du marqueur biotinylé A. Pour des extraits de protéines déjà prêts, utilisation du tampon de charge bicolore ProSieve ProTrack Dual Color (Réf. : LON ) - Pratique : contient deux colorants de repérage : le bleu, pour suivre la progression de l électrophorèse ; le rose pour suivre le transfert des protéines sur la membrane. 1. Décongeler l agent réducteur et dissoudre (le cas échéant) les solides précipités dans le tampon de charge à 37 C. 2. Vortexer le tampon de charge et l agent réducteur. 3. Ajouter les quantités adéquates d agent réducteur, de tampon de charge et d échantillon de protéines (additionnés d eau) dans chaque tube selon le tableau ci-dessous. Volume du dépôt Agent réducteur 20 X (2 M DTT) Tampon de charge 4X Echantillon* Quantité 14 μl 0,7 μl 3,5 μl 9,8 μl 4. Porter les échantillons et le marqueur biotinylé à ébullition (100 C) pendant 3 à 5 minutes. 5. Centrifuger, puis placer sur la glace. P. 3

4 B. Pour des extraits protéiques déjà prêts, utilisation du tampon de charge SDS PAGE 2X (Blue Loading Buffer Pack Réf. : 7722S ou Red Loading Buffer Pack Réf. : 7723S) - Colorant unique pour suivre la progression de l électrophorèse. 1. Préparer du tampon de charge frais 3X en ajoutant 1/10 de volume de DTT 30 X (agent réducteur) à 1 volume de tampon de charge SDS 3X. 2. Diluer le tampon de charge SDS 3X en une solution 2X avec ddh2o. Cette préparation fournit suffisamment de matériel 3X pour obtenir 12 ml de solution 2X (soit 8 ml de tampon 3X + 4 ml ddh 2O). 3. Sur de la glace, ajouter 1 volume de tampon de charge 2X (7 µl) à 1 volume d échantillon (7 µl) et bien mélanger. 4. Porter les échantillons et le marqueur biotinylé à ébullition (100 C) pendant 3 à 5 minutes 5. Centrifuger, puis placer la préparation sur glace. C. Pour la préparation d extraits de culture cellulaire, utilisation du tampon de charge SDS PAGE 1X (Blue Loading Buffer Pack Réf. : 7722S ou Red Loading Buffer Pack Réf. : 7723S): 1. Préparer du tampon de charge frais 3X en ajoutant 1/10 de volume de DTT 30X (agent réducteur) à 1 volume de tampon de charge SDS 3X 2. Diluer le tampon de charge SDS 3X en une solution 1X avec ddh2o. Cette préparation fournit suffisamment de matériel 3X pour obtenir 24 ml de solution 1X (soit 8 ml de tampon 3X + 16 ml ddh 2O). 3. Aspirer le milieu de culture. Laver les cellules au PBS 1X. Aspirer de nouveau. 4. Procéder à la lyse cellulaire en ajoutant du tampon de charge SDS 1X (100 µl par puits en plaque 6 puits ou 500 µl en boite de 10 cm 2 ). Gratter immédiatement les cellules et transférer dans un tube de centrifugation. Conserver sur la glace. 5. Soniquer de 10 à 15 secondes pour fragmenter l ADN et réduire la viscosité de l échantillon. 6. Porter les échantillons de 14 µl et le marqueur biotinylé à ébullition (100 C) pendant 3 à 5 minutes. Laisser refroidir sur de la glace. 7. Centrifuger rapidement et placer sur glace. Préparation du gel 1. Rincer la cassette de gel à l eau distillée ou déionisée. 2. Retirer l adhésif et le peigne. 3. Charger le gel dans la cuve (face imprimée vers l extérieur : voir schéma page suivante). 4. Remplir la cuve de tampon de migration ProSieve EX 0,67X. 5. Rincer une ou deux fois les puits à la pipette. P. 4

5 Si vous n utilisez qu un gel, glissez la plaque vierge du côté sans gel.. Si vous utilisez une cassette 9 cm x 10 cm, insérez l adaptateur de gel 9 cm comme indiqué figure 4. Chargement et migration du gel (utiliser le marquage des puits comme guide pour déposer) 1. Compléter le volume de chaque échantillon jusqu à 14 µl avec de l eau distillée. D un côté du gel, charger 7 μl de marqueur ProSieve QuadColor dans un puits, et de l autre côté 10 µl de marqueur biotinylé Réf. : 7727 dans un puits. Note : 7 µl de marqueur ProSieve QuadColor (déjà porté à ébullition) suffisent pour suivre la migration et le transfert. 2. Charger 14 μl des échantillons préparés sur le gel. Astuce technique : charger le même volume d échantillon dans chaque puits. Charger tout les puits y compris ceux non utilisé de tampon d échantillon 1X. Si un puits est laissé vide les puits adjacents pourraient déborder dedans. 3. Faire migrer à voltage constant, soit 250V pour le(s) gel(s) de 9 x 10 cm et 270V pour le(s) gel(s) de 10 x 10 cm. 4. Lorsque le colorant atteint la partie inférieure du (des) gel(s), couper l alimentation et récupérer le(s) gel(s) (au bout de 20 à 25 min). P. 5

6 Ouverture de la cassette et démoulage du gel 1. Positionner le bout du peigne dans les encoches du tour de la cassette et tourner pour écarter les plaques. 2. Placer le peigne à 45 entre les plaques à chaque angle inférieur de la cassette et tourner. 3. Séparer les deux plaques. 4. A l aide du peigne ou d une spatule, libérer l un des coins inférieurs du gel et le récupérer dans un bac. Figure 5 Transfert de gels avec le tampon de transfert ProSieve EX Western Blot Transfer Buffer 1. Ajouter 900 ml d eau déionisée à 100 ml de tampon de transfert 10X, pour obtenir 1L de solution. Bien mélanger. 2. Faire tremper le gel 5 minutes dans l eau distillée, puis 5 minutes dans le tampon de transfert Western blot ProSieve EX transfer buffer 1X. NOTE : chauffer l eau et le tampon de transfert 25 secondes au micro ondes jusqu à 70 C, voire jusqu à ébullition, pour réduire le temps d incubation à 2 minutes. NOTE : pour des protéines plus grandes ou plus difficiles à transférer, il est conseillé d augmenter le temps d incubation. 3. Tremper la membrane et les papiers au moins 5 minutes dans le tampon de transfert Western Blot ProSieve EX transfer buffer 1X. NOTE : Si nécessaire, pré-tremper la membrane avant d équilibrer dans le tampon de transfert (en méthanol dans le cas du PVDF). 4. Préparer le dispositif de transfert selon les indications du fabricant et remplacer le tampon de la cuve par du tampon de transfert Western blot ProSieve EX Transfer Buffer 1X (voir le schéma d assemblage du «sandwich» pour transfert liquide ou semi-sec -figures 6 & 7). 5. Transférer le blot en liquide, en cuve à 300V de 10 à 15 minutes, ou en semi-sec à 375 ma, de 10 à 15 minutes également.(le transfert liquide a été validé pour la détection des phospho-protéines avec les anticorps CST.) P. 6

7 Assemblage du «Sandwich» pour le transfert liquide Assemblage du «Sandwich» pour le transfert semi-sec Figure 6 Figure 7 Astuce technique : pour préparer le gel pour le blot : couper les puits et le bas du gel en excès, et inverser de 180 de façon à ce que les protéines de haut poids moléculaire se retrouvent au fond de la cassette. Cela permet de mettre les protéines de haut poids moléculaire au contact du champ électrique le plus élevé, permettant un transfert plus efficace. P. 7

8 Protocole de révélation du blot Préparation des solutions et réactifs Note : préparer les solutions à l eau distillée. 1. Solution saline tamponnée 10X au Tween 20 (TBST-10X) : (Réf. : 9997S) pour obtenir 1 L de TBST 1X, mélanger 100 ml de TBST 10X à 900 ml de dh2o. 2. Tampon de blocage : TBST 1X avec 5% de lait écrémé en poudre (Réf. : 9999S) : pour 150 ml, ajouter 7,5 g de lait écrémé en poudre à 150 ml de TBST 1X et bien mélanger. 3. Tampon de lavage : TBST 1X. 4. Anticorps anti-biotine conjugué HRP (Réf. : 7075) inclus dans le Marqueur protéique biotinylé (Réf. : 7727SAMPLE). 5. Tampon de dilution pour anticorps primaire : TBST 1X à 5% de BSA (Réf. : 9998S) ou 5% de lait écrémé en poudre, (Réf. : 9999) selon les indications de la fiche technique de l anticorps primaire. Pour 20 ml, ajouter 1 g de BSA ou de lait écrémé en poudre à 20 ml de TBST 1X et bien mélanger. 6. Tampon de dilution pour anticorps secondaire : TBST 1X à 5% de lait écrémé en poudre (Réf. : 9999). Pour 20 ml, ajouter 1g de lait écrémé en poudre à 20 ml de TBST 1X et bien mélanger. Utiliser 10 ml par blot. Rappel: la dilution de l anticorps secondaire est de 1:2 000 ou 1: selon l ECL RevelBlOt utilisé. Dilution 1:2 000 pour l ECL RevelBlOt Plus Dilution 1: pour l ECL RevelBlOt Intense 7. ECL RevelBlOt Plus ou ECL RevelBlOt Intense : mélanger 5 ml de solution A à 5 ml de solution B. Blocage de la membrane et incubation des anticorps Note : les volumes sont indiqués pour une membrane de 10X10 cm (100 cm 2 ). Pour des membranes de dimensions différentes, ajuster les volumes. P. 8

9 A. Blocage de la membrane 1. (Facultatif) Après le transfert, laver la membrane de nitrocellulose 5 minutes dans 25 ml de TBS, à température ambiante. 2. Incuber la membrane 1 heure dans un tampon de blocage à température ambiante. 3. Laver une fois pendant 5 minutes avec 15 ml de TBST. B. Incubation des anticorps (pour anticorps primaires non conjugués) 1. Incuber la membrane avec l anticorps primaire (respecter la dilution et le type de tampon conseillés dans la fiche technique) toute la nuit à 4 C dans 10 ml de tampon de dilution pour anticorps primaire, sous agitation douce. 2. Laver 3 fois pendant 5 minutes avec 15 ml de TBST. 3. Incuber la membrane avec l anticorps secondaire conjugué HRP (Réf.: 7074S ou 7076S) dilué à 1:2 000 ou 1:10 000, et l anti-biotine conjugué HRP (Réf.: 7075S) pour la détection du marqueur protéique biotinylé à 1:2 000 or 1: suivant le RevelBlOt ECL utilisé, dans 10 ml de tampon de blocage, sous agitation douce, pendant 1 heure à température ambiante. 4. Laver 3 fois pendant 5 minutes avec 15 ml de TBST. 5. Procéder à la détection (étape suivante). Détection ECL et prise de vue 1. Incuber la membrane dans 10 ml de RevelBlOt Plus ou Intense (5 ml de Solution A + 5 ml de Solution B) pendant 5 minutes à température ambiante. 2. Retirer l excès de réactif (la membrane ne doit jamais sécher). Envelopper la membrane dans du film plastique. 3. Utiliser un imageur Syngene configuré pour le Western blot en chimiluminescence pour la prise de vue et l analyse d image. P. 9

10 Appendice Cuves les plus couramment utilisées : Pour d autres modèles, contactez le service technique d Ozyme tech@ozyme.fr ou le Cuve : marque et modèle Dimensions de cassette à commander Notes concernant la cuve Lonza PAGEr Minigel Chamber 10 x 10 cm Les gels peuvent être insérés sans retirer le support de la cuve. Avec les gels 9 x 10 cm utiliser les spacers fournis. XCell SureLock Chamber 10 x 10 cm Placer le spacer (Cat No. LON59900) entre le gel et le support de gel. Mini-PROTEAN Tetra Cell Mini-PROTEAN II Mini-PROTEAN Ready Gel Cell Systems 9 x 10 cm Retirer le joint en caoutchouc du support de gel. Le replacer dans l autre sens côté plat vers l extérieur. Références de cuve Minigel LONZA PAGEr : LON59905 LON59906 LON59907 PAGEr Gel Chamber PAGEr Blot Module (à utiliser avec PAGEr Gel Chamber) PAGEr Gel Chamber & Blot Module P. 10

11 Comment choisir votre gel PAGEr EX? Dimensions et concentrations variables selon références ; à déterminer selon la taille des protéines et type de cuve utilisés (voir tableau ci-dessous) : Référence à commander Désignation Conditionnement Concentrations équivalentes Format de cuve d'électrophorèse/ compatibilité (autres cuves) LON58722 PAGEr EX Gels (Mid/High range kda, 9x10 cm, 12 well) 9x10 cm compatible avec BioRad Mini PROTEAN I, II & III & BioRad Ready Gel Cell LON58724 LON59722 PAGEr EX Gels (Mid/High range kda, 9x10 cm, 16 well) PAGEr EX Gels (Mid/High range kda, 10x10 cm, 12 well) 4-12% 9x10 cm compatible avec BioRad Mini PROTEAN I, II & III & BioRad Ready Gel Cell 10x10 cm compatible avec Novex Xcell SureLock MiniCell avec Spacer Réf. : LON59900 LON59724 PAGEr EX Gels (Mid/High range kda, 10x10 cm, 16 well) 10x10 cm compatible avec Novex Xcell SureLock MiniCell avec Spacer Réf. : LON59900 LON58702 PAGEr EX Gels (Low/Mid range kda, 9x10 cm, 12 well) 9x10 cm compatible avec BioRad Mini PROTEAN I, II & III & BioRad Ready Gel Cell LON58714 PAGEr EX Gels (Low/Mid range kda, 9x10 cm, 16 well) 10% 9x10 cm compatible avec BioRad Mini PROTEAN I, II & III & BioRad Ready Gel Cell LON59502 PAGEr EX Gels (Low/Mid range kda, 10x10 cm, 12 well) 10x10 cm compatible avec Novex Xcell SureLock MiniCell avec Spacer Réf. : LON59900 LON59714 PAGEr EX Gels (Low/Mid range kda, 10x10 cm, 16well) 10x10 cm compatible avec Novex Xcell SureLock MiniCell avec Spacer Réf. : LON59900 P. 11