Analyse d article. Benjamin Richard & Nadine Ajzenberg. Pubmed. M1 UE8b 21/3/

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1 Analyse d article Benjamin Richard & Nadine Ajzenberg M1 UE8b 21/3/2013 Pubmed

2 Structure d un article original Titre Résumé structuré : Contexte scientifique, objectifs, résultats, conclusion Mots clefs Introduction Matériel et méthodes Résultats Discussion Remerciements Références bibliograhiques Tableaux Légendes des figures figures

3 (fig 1BC)

4 (fig 2A) (fig 3)

5 (fig6d) Fig6E

6 (fig 7) Interprétation des résultats

7 1 2 Western blot (fig 1BC) - Electrophorèse sur gel de polyacrylamide Transfert sur membrane + 3 Immunoréaction et révélation substrat Traceur = HRP (Horseradish Peroxidase) signal anticorps secondaire anticorps primaire Film photographique Caractérisation de la PN1 plaquettaire (fig 1BC) 1B: Après activation par la thrombine, PAR-1 collagène ou convulxine: PN-1 détectée uniquement dans la fraction secrétée 1C: Si inhibition de l activation plaquettaire par PGE1 avant stimulation par la thrombine: PN-1 détectée dans les extraits plaquettaires PN-1 plaquettaire secrétée par un mécanisme dépendant de l activation plaquettaire

8 QuickTime and a Fig 2A La PN-1 est stockée dans les granules α plaquettaires Plaquettes lavées de donneurs sains versus GPS ± activées par PAR1-AP PN-1 non détectée dans les lysats de plaquettes dépourvues de granules-α decompressor are needed to see this picture. Protéine de ménage membranaire Protéine de ménage cytosolique PN-1 non détectée dans les surnageants de plaquettes activées dépourvues de granules-α Activité catalytique de la thrombine (fig 3) Plaquettes (hum/souris activées par PAR1-AP 50 µm ou PAR4-AP 250 µm) Plaquettes PN1-/- ou WT 30 min 37 C Contrôles : plaquettes +tampon centrifugation Surnageant incubé Avec IIa0.25 nm ±anti-pn1 Ou ± anti-pai1 S2238 Activité thrombine résiduelle Mesurée à405nm

9 (fig 3) Effet de la PN1 secrétée sur l inhibition de l activité catalytique de la thrombine Plaquettes normales hum Sd des plaquettes grises plaquettes souris PN1/-/- et WT Surnageant plaq activées+polybrene en présence de surnageant des plaqau repos pas d inhibition de la IIa En présence de surnageant de plaqactivées inhibition de la IIa: plaqsecrètent un inhibiteur Anti-PN1 bloque cette inhibition. PN-1 principal inhibiteur de la II libérée par les plaqactivées (3B) et liée aux GAG (3D) AGREGATION PLAQUETTAIRE MESUREE PAR TURBIDIMETRIE (fig6d) Principe de mesure : enregistrement graphique de la transmission d un faisceau lumineux àtravers une suspension de plaquettes lavées agitées à37 C. Les plaquettes en suspension empêchent la transmission du signal lumineux. Après ajout d un inducteur, les plaquettes s agrègent, le milieu s éclaircit et la quantitéde lumière transmise est proportionnelle àcet éclaircissement. On obtient une courbe d agrégation. Plaquettes lavées PN1-/- ou WT 3x10 8 /ml + thrombine Agrégation augmentée chez les souris PN1- /-en présence de faibles concde IIa

10 1-CoatingCollagène Collagen-induced thrombus formation under flow conditions 1000 sec-1 (fig 6E) 2-Incubation en chambre humide à4 C O/V 3-Saturation de la plaque en BSA 10µg/ml 4-Lavage de la plaque en tampon de flux Sang total de sourisincubéavec rhodamine6g Acquisition sur microscope Enregistrement d un film sur 2min Shear1000s -1 Quantification de la surface couverte par les plaquettes Images pour quantification sur Collagène 30sec 1min 2min

11 Quantification de l adhésion plaquettaire sur collagène Fig 6E Après 2 min de perfusion sur collagène, thrombiformés en présence de FT, plus gros chez les souris PN1-/-que chez les WT En présence de PPACK (inhibiteur de IIa), pas de différence d adhésion plaquettaire Effet de PN-1 dépendant de la thrombine Thrombose in vivo chez la souris. Anesthésie des souris. Marquages des cellules sanguines à la rhodamine 6G, 3.3mg/kg..Lésions au FeCl 3 500mM des artères/veines mésentériques.microscopie intravitaleen temps réel (artérioles/veinules mésentériques)

12 Formation de thrombus in vivo (fig 7) Après 20 min, occlusion complète des des veines du mésentères des souris PN1-/- 2xplus rapide que chez WT Résultats comparables dans les artérioles Rôle anti-thrombotique de PN-1 plaquettaire dans les veines et les artérioles Discussion-conclusion Lieu de stockage et sécrétion de la PN-1: PN-1 stockée dans les granules alpha des plaquettes PN-1 relarguéeaprès activation plaquettaire par thrombine (non fixée sur les plaquettes P-selectine) Activités de la PN-1: Inhibe directement la thrombine Inhibe l activation et l agrégation plaquettaire dépendante de la thrombine Inhibe la formation d un thrombus in vitro et in vivo PN-1 nouvelle cible anti-thrombotique

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