TD Révision BIO57. Connaissance et Technique du gène

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1 TD Révision BIO57 Connaissance et Technique du gène Novembre 2007 Cécile BAUDOT INSERM 910 «Génétique Médicale et Génomique Fonctionnelle» Maladies Neuromusculaires

2 Le syndrome Progéria d Hutchinson-Gilford Maladie du vieillissement prématuré Décrite en 1886 par Jonathan Hutchinson et en 1904 par Hasting Gilford Maladie rare ( 100 cas dans le monde)

3 Le syndrome Progéria d Hutchinson-Gilford En 2003, recherche de mutation dans le gène LMNA Pourquoi rechercher des mutations? Renseigner le patient Mieux comprendre la physiopathologie de la maladie Approches thérapeutiques Pourquoi ce gène? Similitude de phénotype avec d autres pathologies du vieillissement prématuré. caractérisation d une mutation dans le gène LMNA

4 Un Gène Structure d un gène

5 Pré-ARNm 5 ATG +1 ATG STOP 3 STOP Exon Intron Pré-ARNm 5 ATG STOP AAAAA ARNm mature Protéine

6 Pré-ARNm 5 ATG +1 ATG STOP 3 STOP Pré-ARNm 5 ATG STOP5 AAAAA ARNm mature ARNm mature Protéine A Protéine B

7 Le syndrome Progéria d Hutchinson-Gilford: LMNA ADN génomique: 24 kb 12 exons Code pour 2 protéines

8 Un gène: LMNA Deux protéines: Lamine A et Lamine C Gène LMNA LAMINE C [572 acide aminé] Gène LMNA LAMINE A [646 acide aminé]

9 Rôles des Lamines A et C LMNA code pour 2 protéines: LAMINE A et LAMINE C Les lamines interviennent dans -la structure du noyau -la réplication de l ADN -La régulation de la transcription - Membrane Nucléaire Représentation schématique de l interface noyau/cytoplasme

10 LA RECHERCHE DE MUTATION: Comment? Matériel Biologique? ADN génomique (=chromosomique) des patients et de témoins (issu de fibroblastes ou de lymphoblastes) Q : L ADN génomique est il différent selon son origine cellulaire? Q : A quel niveau l information génétique est-elle différente entre différents types cellulaire? Q Quelle méthode existe-t-il pour amplifier de l ADN génomique? Q : Quelle méthode permet de connaitre (nucléotide par nucléotide) la séquence nucléotidique du fragment amplifié?

11 Le syndrome Progéria d Hutchinson-Gilford Mutation dans le gène LMNA Contrôle Patient Q : Quelle différence entre ces 2 chromatogrammes?

12 Le syndrome Progéria d Hutchinson-Gilford Mutation dans le gène LMNA: c.1824c>t sous forme hétérozygote Contrôle Patient GTG GGC GGA GTG GGT GGA

13 Le syndrome Progéria d Hutchinson-Gilford Extraction de l ARN fibroblastique du patient portant la mutation Q : Que peut on faire à partir de l ARN du patient? Q : Pourquoi une RT-PCR? Migration (gel agarose 1% ) d un fragment de cdna de LMNA (amplifié par PCR) du patient et d un contrôle Q : Que remarquez vous? Q : Comment peut on l expliquer?

14 LMNA sauvage Le syndrome Progéria d Hutchinson-Gilford 11 GU AG 12 3 UTR Epissage: LMNA muté GU AG 12 3 UTR La mutation active un site donneur d épissage dans l exon 11 (site jamais utilisé chez des personnes «saines») Ce site «anormal» (cryptique) d épissage va être utilisé à la place du site «normal» en fin de l exon 11 et va se raccorder normalement au site accepteur de l exon 12

15 Le syndrome Progéria d Hutchinson-Gilford 11 GU AG 12 3 UTR Epissage: L utilisation de ce site «cryptique» (anormal) d épissage, entraine la délétion de la fin de l exon 11 dans l ARNm mature (l exon 12 est normalement épissé et ajouté à l ARNm mature!!!) Codon STOP précoce Utilisé chez le patient porteur de la mutation d épissage Traduction en acides aminés: Codon STOP sauvage La délétion de la fin de l exon 11 va décaler le cadre de lecture lors de la traduction, ce qui entraine l apparition d un codon STOP précoce à la fin de l exon 11

16 Le syndrome Progéria d Hutchinson-Gilford Migration des cdna d un fragment de LMNA du patient et d un contrôle (obtenus par RT-PCR sur l ARNm) sur gel agarose 1% Q : Pourquoi a-t-on quand même la bande «sauvage» chez le patient?

17 Le syndrome Progéria d Hutchinson-Gilford Gène LMNA LAMINE A Gène LMNA muté LAMINE A tronquée Partie délétée La protéine traduite par l ARMm porteur de la mutation d épissage est tronquée: elle n est pas entière La cellule détruit la protéine non fonctionnelle

18 Le syndrome Progéria d Hutchinson-Gilford Q : Comment peut on vérifier l absence d une protéine? Q : Quelles méthodes de détection des ADN, ARN et Protéine avez-vous vu en cours et en TD?) Q : Que va-t-on utiliser pour vérifier notre hypothèse d une dégradation protéique?

19 Le Western Blot 1-Dépot des échantillons protéique sur gel de polyacrylamide (maillage) 2-Migration par électrophorèse (comme pour un gel d agarose) 3-Transfert des protéines sur une membrane de nitrocellulose 4-Hybridation des membranes (donc des protéines) avec un anticorps spécifique de la protéine d intérêt Permet: -de visualiser la présence d une protéine d intérêt -de comparer la quantité de protéine chez un patient par rapport a un contrôle

20 Le syndrome Progéria d Hutchinson-Gilford Coloration au rouge Ponceau de la membrane de nitrocellulose (membrane sur laquelle la totalité des protéines a été transféré): CONTROLE Ce contrôle permet de vérifier que les 2 échantillons (témoin et patient) ont la même quantité de protéine Q :Pourquoi faut il faire ce contrôle?

21 Le syndrome Progéria d Hutchinson-Gilford Hybridation de la membrane avec des anticorps spécifiques de la Lamine C et de la Lamine A (ainsi que un anticorps spécifique de l Emerine: protéine de contrôle) Q : Qu observez vous? Q : Pourquoi n y a-t-il pas absence total de Lamine A chez le patient Q : Pourquoi la Lamine C est en quantité égale chez le patient et chez le témoin? (Rappel: la lamine C est aussi codée par LMNA)

22 Le syndrome Progéria d Hutchinson-Gilford Immunomarquage: utilisation d un anticorps Lamine A sur des cellules de patients et des cellules contrôles Lamine C Lamine A DAPI (noyau) (Contrôle) Témoin Patient

23 Cheminement dans la tête d un chercheur 1- Recherche d un gène d intérêt Par similarité des phénotypes des patients 2- Amplification du gène d intérêt Par PCR (ADN génomique, Polymérase, Amorce, dntp) 3- Séquençage automatique (basée sur la méthode de Sanger) Même principe que la PCR, mais avec de ddntp (fluorescence) 4- Analyse du chromatogramme la mutation est une substitution hétérozygote: c.1824c>t La mutation n entraine pas de défaut dans la séquence d acide aminé de la protéine

24 Cheminement dans la tête d un chercheur 5- Reverse Transcriptase PCR Obtention du cdna du patient 6- Electrophorèse du cdna du patient et du contrôle Deux bandes obtenues chez le patient au lieu d une seule observée chez le témoin 7- Mutation d épissage la mutation va favoriser l utilisation d un site anormal d épissage au milieu de l exon 11. Le mécanisme d épissage va utiliser de manière préférentielle ce site anormal au lieu du site sauvage à la fin de l exon L utilisation du site anormal d épissage au milieu de l exon 11 va entrainer un décalage du cadre de lecture lors de la traduction en acide aminé, et l apparition d un codon STOP précoce

25 Cheminement dans la tête d un chercheur 9- La traduction de l ARNm portant la mutation va donc codé pour une protéine tronquée, c est-à-dire une protéine ne comprenant pas les acides aminés codés par les codons de la fin de l exon 11 et de la totalité de l exon La protéine ainsi produite va être détruite par la cellule Vu par Western Blot et Immunomarquage 11- La pathophysiologie de la maladie commence a être mieux comprise, et des essais thérapeutiques sur des animaux modèles (souris progéria) sont en cours!!!!!!!!!!!!

26 LA RECHERCHE DE MUTATION: Comment? Matériel Biologique? ADN génomique (=chromosomique) des patients et de témoins (issu de fibroblastes ou de lymphoblastes) Q : L ADN est il différent selon son origine cellulaire?

27 LA RECHERCHE DE MUTATION: Comment? Amplification de chaque exon par PCR (Polymerase Chain Reaction) grâce à des amorces «encadrant» chaque exon Q : Que faut il pour réaliser une PCR? - ADN polymérase Taq Polymerase - Amorces = oligonucléotides séquence complémentaire de la séquence à amplifier, et qui encadre la zone d interet Amorce Sens 5 Intron Intron 3 Exon 3 5 Amorce Anti-Sens - 4 désoxyribonucléotides 4 dntp A T G C

28 LA RECHERCHE DE MUTATION: Comment? Polymerase Chain Reaction 1- Dénaturation de l ADN d intéret // // 95 C // But: Séparer les deux brins d ADN (joue le rôle de l hélicase dans la transcripton ouverture de la boucle de transcription) //

29 LA RECHERCHE DE MUTATION: Comment? 1- Hybridation: 55 C Polymerase Chain Reaction // // But: Hybrider par complémentarité de base, les amorces sur les séquences cibles Fixer la Taq sur l extrémité 3 des amorces

30 LA RECHERCHE DE MUTATION: Comment? 3- Elongation: 72 C Polymerase Chain Reaction // A C A T A C G G T T C T A C T A C G G T T C T //

31 L epissage Site de branchement Site donneur d epissage Site accepteurd epissage

32 Notion d Homozygotie/Hétérozygotie 1. HOMOZYGOTE ADN génomique Chrs 1Chrs 2 Localisation du gène d intérêt Amorces Chrs 1Chrs 2 Amplification par PCR

33 1. HOMOZYGOTE Produits PCR Notion d Homozygotie/Hétérozygotie Séquençage (fluorophore) Chrs 1 : AGGTGGGCGG Chrs 2: AGGTGGGCGG Lecture des différentes fragments obtenus Séquence lue sur le chromatogramme: AGGTGGGCGG séquence HOMOZYGOTE

34 Notion d Homozygotie/Hétérozygotie 2. HETEROZYGOTE Chrs 1Chrs 2 Localisation du gène d intérêt «sauvage» Gène d intérêt «muté» Amorces Chrs 1Chrs 2

35 2. HETEROZYGOTE Produits PCR Notion d Homozygotie/Hétérozygotie Séquençage (fluorophore) Lecture des différentes fragments obtenus Chrs 1 : AGGTGGGCGG Chrs 2: AGGTGGGTGG Séquences lues sur le chromatograme: AGGTGGGCGG (Chrs 1) AGGTGGGTGG (Chrs 2 portant la mutation) Séquence HETEROZYGOTE (non identique entre les 2 chromosomes)

36 Les mutations Dominantes Un seul chromosome porte la mutation Le patient est atteint Récessives Deux chromosomes portent la mutation Le patient est atteint (donc si une personne porte la mutation sous forme hétérozygote, il ne sera pas atteint) Liées à l X Le ratio Homme/Femme n est pas égale à 1 caractère dominant/récessif de la maladie: peut toucher uniquement les femmes ou les hommes

37 Les mutations A D N Variations dans la séquence nucléotidique Substitutions: changement ponctuel dans la séquence nucléotidique Transition (Purine>Purine, Pyrimidique>Pyrimidique) Transversion (Purine>Pyrimidique, Pyrimidique>Purine) Conséquences A c i d e A m i n é s «Mutation Silencieuse» Le codon muté code toujours pour le même acide aminé (CGU Arginine / CGA Arginine) «Mutation non-sens» Le codon muté est un codon STOP. La synthèse de la chaine d acide aminé s arrête. Une protéine tronquée est très souvent pathogène (UAC Tyrosine / UAA STOP) «Mutation faux-sens» Le codon muté code pour un acide aminé différents du «sauvage». Ce changement dans la séquence protéique peut avoir ou non un effet sur l activité de la protéine (et donc être pathogène) (GUU Valine / GGU Glycine)

38 Les mutations A D N Variations dans la séquence nucléotidique Délétion ou Insertion Addition ou délétion d un nombre variable de paire de base dans la séquence nucléotidique Insertion/Délétion d un multiple de 3 Insertion/Délétion d un non multiple de 3 A c i d e A m i n é s Conserve le cadre de lecture Ajoute ou supprime un/des acides aminés Conséquences variables sur l activité de la protéine Conséquences Perturbe le cadre de lecture Créer souvent un codon stop arrêt de la synthèse plus tôt que prévue Change radicalement la séquence protéique la protéine de pourra plus assurer sa fonction