MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit

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1 GUIDE DE L UTILISATEUR MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Catalog Numbers , (with PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit), (with PrepSEQ Rapid Spin Sample Prep Kit) Publication Number Revision A Réf. attestation ABI 29/03 03/11 [Fin de validité : voir le certificat à l adresse METHODES ALTERNATIVES D ANALYSE POUR L AGROALIMENTAIRE Certifié par AFNOR Certification Réservé aux tests d échantillons alimentaires et environnementaux.

2 Information in this document is subject to change without notice. LIFE TECHNOLOGIES CORPORATION AND/OR ITS AFFILIATE(S) DISCLAIM ALL WARRANTIES WITH RESPECT TO THIS DOCUMENT, EXPRESSED OR IMPLIED, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THOSE OF MERCHANTABILITY, FITNESS FOR A PARTICULAR PURPOSE, OR NON-INFRINGEMENT. TO THE EXTENT ALLOWED BY LAW, IN NO EVENT SHALL LIFE TECHNOLOGIES AND/OR ITS AFFILIATE(S) BE LIABLE, WHETHER IN CONTRACT, TORT, WARRANTY, OR UNDER ANY STATUTE OR ON ANY OTHER BASIS FOR SPECIAL, INCIDENTAL, INDIRECT, PUNITIVE, MULTIPLE OR CONSEQUENTIAL DAMAGES IN CONNECTION WITH OR ARISING FROM THIS DOCUMENT, INCLUDING BUT NOT LIMITED TO THE USE THEREOF. Limited Use Label License: environmental testing, quality control/quality assurance testing, food and agricultural testing The purchase of this product conveys to the purchaser the limited, non-transferable right to use the purchased amount of the product (a) to perform internal research for the sole benefit of the purchaser; and (b) for environmental testing, quality control/quality assurance testing, food and agricultural testing, including reporting results of purchaser s activities in environmental testing, quality control/quality assurance testing, food and agricultural testing for a fee or other commercial consideration. No other right is hereby granted expressly, by implication, or by estoppel. This product is for environmental testing, quality control/quality assurance testing, food and agricultural testing and research purposes only. The purchase of this product does not grant the purchaser any additional rights, including (without limitation) the right to transfer or resell the product in any form or the right to use the product as a therapeutic agent or diagnostics test component. For information on obtaining additional rights, please contact outlicensing@lifetech.com. Human diagnostic uses require a separate license from Roche Molecular Systems, Inc. TRADEMARKS The trademarks mentioned herein are the property of Life Technologies Corporation or their respective owners. AOAC is a trademark and Performance Tested Methods is a service mark of AOAC International. TaqMan is a registered trademark of Roche Molecular Systems, Inc. Translated from English Publication Number Revision C Life Technologies Corporation. All rights reserved.

3 Sommaire Informations sur le produit Description du produit Matériel et équipement Chapitre 1 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Utilisation du RapidFinder Express Software Workflow du kit Extraction de l ADN Préparation de la PCR Démarrage de l instrument Affichage des résultats Ressources d affichage des résultats Chapitre 2 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Utilisation de SDS Software Workflow du kit Extraction de l ADN Préparation de la PCR Démarrage de l instrument Affichage des résultats Chapitre 3 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Utilisation du StepOne Software Workflow du kit Extraction de l ADN Préparation de la PCR Démarrage de l instrument Affichage des résultats Chapitre 4 Résolution des problèmes Annexe A Informations générales Présentation du produit Annexe B Bonnes pratiques en matière de PCR Prévention des contaminations et des amplifications non spécifiques

4 Annexe C Sécurité Sécurité chimique Manipulation spécifique des produits chimiques Sécurité en matière de dangers biologiques Documentation et support Obtention d une FDS Obtention de certificats d analyse Obtention d une assistance Support relatif à la sécurité alimentaire Garantie limitée Références

5 Informations sur le produit Informations sur le produit IMPORTANT! Avant d utiliser ce produit, lire les informations décrites dans Annexe C, «Sécurité» page 47 et s assurer de les avoir bien comprises. AVERTISSEMENT! E. coli O157:H7 est un organisme relevant du niveau de biosécurité 2 (BSL-2). Il convient d être vigilant lors de la manipulation d échantillons susceptibles de contenir E. coli O157:H7. Le personnel du laboratoire doit être correctement formé à la manipulation d agents pathogènes avant d être autorisé à dépister E. coli O157:H7 dans des échantillons. Le personnel du laboratoire doit porter les équipements de protection appropriés, notamment des lunettes de protection, un masque facial, des vêtements/blouses de laboratoire et des gants. Des précautions extrêmes doivent être prises lors de la manipulation d objets tranchants. L accès au laboratoire doit être restreint pendant les travaux. Les déchets doivent être éliminés conformément à la législation locale et nationale en vigueur. S assurer que l instrument est correctement installé et étalonné. Pour plus d informations sur l étalonnage, consulter la documentation qui accompagne l instrument. Description du produit Le MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit détecte E. coli O157:H7 de manière simple, fiable et rapide dans des échantillons alimentaires, à l aide d un format de réactif lyophilisé. Le dosage utilise la réaction de polymérisation en chaîne (PCR) pour amplifier les séquences cibles d ADN spécifiques à un micro-organisme unique et les sondes TaqMan pour détecter les séquences amplifiées. Le logiciel RapidFinder Express Software, Sequence Detection System (SDS) Software et StepOne Software peuvent être utilisés avec ce kit de détection pour préparer et gérer le processus de détection. Ce protocole fournit les instructions à suivre pour : l automatisation de la détection à l aide du RapidFinder Express Software (Chapitre 1) ; l exécution de la détection à l aide du SDS Software (Chapitre 2) ; l exécution de la détection à l aide du StepOne Software (Chapitre 3). Pour plus d informations générales, se reporter à Annexe A, page 41. 5

6 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Matériel et équipement Matériel et équipement Contenu du kit MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit contient des réactifs suffisants pour 96 réactions. Les composants du kit et leurs conditions de conservation sont décrits dans les tableaux suivants. Cat. no. Élément Contenu Couleur du bouchon Description Conservation MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit (Partie 1 sur 2) Orange (portoir) E. coli O157:H7 Assay Beads, douze barettes de 8 tubes (96 réactions/kit) 5 ± 3 C ; garder à l abri de la lumière, fermer la poche hermétiquement Pathogen Detection Negative Control (Partie 2 sur 2) S/O Rouge MicroAmp Optical 8-Cap Strips, 1 sachet, douze barettes de 8 capuchons Pathogen Detection Negative Control, 1 tube, 1,5 ml de contrôle (Cat. no ) MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Starter Kit with PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit Contenu du cat. no (voir ci-dessus) PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit (Magnetic Particles, Lysis Buffer, Wash Buffer Concentrate, Elution Buffer, Proteinase K Buffer, Proteinase K) MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Starter Kit with PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K Contenu du cat. no (voir ci-dessus) PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K (Lysis Buffer, 100 Spin Columns, 200 tubes de prélèvement, Proteinase K) Température ambiante (23±5 C) 5 ± 3 C Pour plus d informations sur les conditions de conservation des composants MicroSEQ, voir ci-dessus. Composants PrepSEQ : Magnetic Particles : 5±3 C Tampons : 23 ± 5 C Proteinase K : En-dessous de -18 C Pour plus d informations sur les conditions de conservation des composants MicroSEQ, voir ci-dessus. PrepSEQ Kit : Lysis Buffer : 5 ± 3 C Colonnes et tubes : 23 ± 5 C Proteinase K : En-dessous de -18 C Toute exposition excessive à la lumière peut affecter le fonctionnement des sondes fluorescentes. Pour protéger les billes du dosage contre l humidité, fermer la poche hermétiquement à chaque retrait d une barette de 8 tubes. Remarque : Des composants peuvent être expédiés séparément, selon la configuration et les conditions de conservation. 6

7 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Matériel et équipement Matériel non inclus dans le kit Le tableau suivant indique le matériel requis pour l utilisation du MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit (Cat. no ) mais non fourni. Sauf indication contraire, bon nombre des composants indiqués sont disponibles auprès des principaux fournisseurs de matériel de laboratoire (MLS, Major Laboratory Supplier). Instruments, équipement, consommables et réactifs Élément Source Applied Biosystems 7500 Fast Real-Time PCR System StepOnePlus Real-Time PCR System Microcentrifugeuse de laboratoire Centrifugeuse de plaque Vortex MicroAmp 96-Well Base (facultatif) Instruments Équipement Contacter le représentant commercial local de Life Technologies. MLS MLS MLS Life Technologies Cat. no. N MicroAmp Cap Installing Tool Life Technologies Cat. no Fast Precision Plate Holder for MicroAmp Tube Strips (à utiliser avec le 7500 Fast Real-Time PCR System) MicroAmp 96-Well Tray for Veriflex Blocks (à utiliser avec le StepOnePlus Real-Time PCR System) Consommables PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit Food and Environmental Testing # (inclut la Proteinase K en option) Life Technologies Cat. no Life Technologies Cat. no Life Technologies Cat. no PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Life Technologies Cat. no PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit with Proteinase K PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean Life Technologies Cat. no Life Technologies Cat. no PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Life Technologies Cat. no Kit Extra Clean with Proteinase K Guide de l utilisateur de MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit 7

8 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Matériel et équipement Instruments, équipement, consommables et réactifs (suite) Élément Source Embouts de pipette résistant aux aérosols Gants jetables Micropipettes : À piston À air comprimé Multicanal MLS MLS MLS MicroAmp Fast 8-Tube Strip, 0,1 ml Life Technologies Cat. no MicroAmp Optical 8-Cap Strip, 300 barettes Life Technologies Cat. no Nuclease-free Water Réactifs Life Technologies Cat. no. AM9938 L utilisation du matériel indiqué ici avec ce kit a été validée. Les résultats peuvent varier en cas d utilisation de produits de substitution d autres fournisseurs. Inclus dans le kit de démarrage. # Inclus avec le cat. no Inclus avec le cat. no

9 Chapitre 1 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Utilisation du RapidFinder Express Software Workflow du kit Ce chapitre présente un protocole utilisant le logiciel RapidFinder Express Software sur le 7500 Fast Instrument pour automatiser les processus de MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit. Dosage de détection des agents PrepSEQ Sample pathogènes MicroSEQ RapidFinder Preparation Kits Extraction de l ADN (page 10) Pré-enrichissement Préparation des échantillons Préparation de la PCR (page 10) Création ou modification d un fichier de série à l aide du RapidFinder Express Software Saisie des informations du fichier de la série Sélection des cibles Définition des échantillons et des contrôles Saisie des noms des échantillons Examen et confirmation de la disposition de la série Pipetage des échantillons Sélection d un fichier de série Sélection d une option de procédure de pipetage Configuration des tubes d échantillon et de contrôle Pipetage des inconnues, des contrôles négatifs et des contrôles positifs Chargement de l instrument Démarrage de l instrument (page 15) Sélection du fichier à exécuter Exécution de la série Déchargement de l instrument Guide Guide de de l utilisateur de MicroSEQ E. E. coli O157:H7 Detection Detection Kit Kit Utilisation Utilisation de de RapidFinder RapidFinder Express Express Software Software Affichage des résultats (page 15) Affichage des résultats par emplacement et par échantillon Impression de rapports Exportation des résultats 9

10 Chapitre 1 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Extraction de l ADN Extraction de l ADN L utilisation de l une des méthodes d extraction de l ADN suivantes est recommandée avec ce kit de détection. Les deux documents suivants décrivant ces méthodes contiennent des informations sur le pré-enrichissement et la préparation des échantillons à l aide de kits PrepSEQ : PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit User Guide: E. coli O157:H7 (protocole basé sur des billes magnétiques automatisé : Pub. no ) Kit PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit Food and Environmental Testing (inclut la Proteinase K en option) Cat. no PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kits User Guide: E. coli O157:H7 (protocole basé sur des colonnes de centrifugation : Pub. no ) Kit Cat. no. PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit with Proteinase K PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K Nous recommandons le protocole Extra Clean pour les matrices à forte teneur en graisse. La plupart des échantillons alimentaires d origine animale présentent une meilleure récupération de l ADN de l E. coli après digestion de Proteinase K, mais aucune amélioration n a été observée sur les produits d origine non animale. Préparation de la PCR Pour préparer la PCR, commencer par ouvrir le RapidFinder Express Software à partir du 7500 Fast Instrument et créer un fichier de série, puis préparer les billes lyophilisées et les échantillons. Il est recommandé d utiliser le RapidFinder Express Software pour suivre les instructions pas à pas en ligne de configuration des dosages, suivie de l analyse automatique des données. Pour plus d informations, se reporter à RapidFinder Express Software Online Help (Pub. no ). 10

11 Chapitre 1 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Préparation de la PCR Démarrer RapidFinder Express Software 1. Cliquer sur l icône RapidFinder Express pour accéder à la page principale : Guide de l utilisateur de MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Utilisation de RapidFinder Express Software IMPORTANT! Vérifier que la version de RapidFinder Express Software utilisée inclut l agent pathogène cible de l E. coli O157:H7. Créer ou modifier un fichier de série à l aide du RapidFinder Express Software 1. Dans la page principale de RapidFinder Express Software, cliquer sur Create/Edit a Run File. 2. Sélectionner Create New Run File, Edit Existing Run File ou Use Run File Template. Cliquer sur Next pour continuer. 3. Saisir ou modifier les informations du fichier de la série. Cliquer sur Next pour continuer. Remarque : Un nom de fichier de série est requis pour continuer. 4. Sélectionner l agent pathogène cible à tester, par exemple E. coli O157:H7, puis saisir le nombre d échantillons, de réplicats et de contrôles positifs et négatifs pour chaque cible. Un contrôle négatif au moins est requis pour chaque agent pathogène cible. Cliquer sur Next pour continuer. Remarque : Différentes détections d agents pathogènes cibles peuvent être exécutées simultanément. 11

12 Chapitre 1 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Préparation de la PCR 5. Saisir ou importer les informations et les noms d échantillons pour chaque cible. Cliquer sur Next pour continuer. Remarque : Il est possible d importer les noms des échantillons si un fichier d importation a été créé. 6. Examiner et confirmer le Run Layout. Cliquer sur Print Run Layout si la page doit être imprimée. Si le fichier de la série est correctement configuré, cliquer sur Next pour continuer. 7. Sélectionner Pipette Samples pour passer directement à l affichage des instructions de pipetage, puis cliquer sur Next pour continuer. Ou cliquer sur Close pour retourner à la page principale. Pipetage des échantillons 1. Dans la page principale de RapidFinder Express Software, cliquer sur Pipette Samples. Sélectionner un fichier de série pour le pipetage, puis cliquer sur Next. (Si l option Pipette Samples a été sélectionnée dans la dernière page Create a Run File, le fichier de la série tout juste créé est sélectionné par défaut.) 2. Sélectionner Print all pipetting procedures, Print only the run layout, Display the run layout ou Use online step-by-step pipetting procedures. Poursuivre avec la sélection de la procédure de pipetage, comme indiqué par le logiciel. 3. Ouvrir la poche de stockage contenant les tubes avec billes lyophilisées (découper au niveau de l entaille dans l angle supérieur de la poche de stockage, au-dessus de la bande de fermeture à glissière). IMPORTANT! Ne pas retirer le déshydratant de la poche de stockage. 4. Retirer le nombre approprié de tubes individuels ou de barettes de 8 tubes, et les placer dans une base de 96 puits, comme l indique le logiciel dans les instructions Run Layout ou Pipette Samples. Retirer les bouchons de couleur et les éliminer. Éviter de perturber les billes au fond des tubes. Remarque : Les billes lyophilisées contiennent tous les composants nécessaires pour chaque réaction. IMPORTANT! Ne pas utiliser les tubes ou les bouchons de couleur pour la réaction du kit. Les tubes ou les bouchons de couleur peuvent affecter les mesures des signaux des fluorochromes pendant la PCR en temps réel. 12

13 Chapitre 1 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Préparation de la PCR Remarque : La configuration du RapidFinder Express Software est affichée à l aide des abréviations L. mono pour Listeria monocytogenes, Sal spp. pour les souches de Salmonella, O157:H7 pour Escherichia coli O157:H7 et souches L. pour les souches de Listeria. Le Run Layout utilise des icônes pour indiquer les échantillons inconnus, les contrôles négatifs, les contrôles positifs et les tubes vides dans chaque position. 5. Refermer la poche de stockage à l aide de la bande de fermeture à glissière, puis la conserver à 5 ± 3 C. 6. Suivre les instructions des procédures de pipetage détaillées en ligne (ou les imprimer) pour pipeter les échantillons inconnus, les contrôles négatifs et les contrôles positifs. Ajouter 30 µl d échantillon à chaque bille lyophilisée en utilisant la même disposition que celle déterminée par le RapidFinder Express Software. Les billes se dissolvent en 1 à 5 secondes. Mélanger en aspirant et en distribuant délicatement plusieurs fois. (Il est également possible d agiter les tubes de dosage au vortex après les avoir bouchés à la fin de la dernière étape.) Guide de l utilisateur de MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Utilisation de RapidFinder Express Software IMPORTANT! De la condensation peut apparaître pendant le stockage. L éliminer après la décongélation des échantillons et avant leur ouverture afin d éviter toute contamination croisée. Pour les échantillons préparés à l aide du PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit, centrifuger la x g 1 minute environ. Pour les échantillons préparés à l aide du PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit, microcentrifuger les x g pendant 1 minute approximativement afin de réduire toutes les matières particulaires dérivées de la colonne de centrifugation, qui peuvent interférer avec l amplification. L ADN microbien est en phase aqueuse. Pour le Pathogen Detection Negative Control et les contrôles positifs contenus dans les tubes de microcentrifugation, agiter les tubes au vortex, puis faire une centrifugation rapide (un spin down ). IMPORTANT! Il convient de suivre la configuration déterminée par le RapidFinder Express Software. 13

14 Chapitre 1 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Préparation de la PCR Remarque : Ajouter 30 µl de l échantillon PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit ou 30 µl de l échantillon PrepSEQ Rapid Spin Kit à chaque bille lyophilisée. Le PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit fournit environ 100 µl d échantillon, tandis que le PrepSEQ Rapid Spin Kit en fournit 300 µl. Utiliser 30 µl du Pathogen Detection Negative Control par réaction de contrôle négatif. Si d autres méthodes de préparation d échantillons sont utilisées et moins de 30 µl d échantillon sont disponibles, ajouter de l eau au volume de l échantillon jusqu à parvenir à 30 µl pour chaque type de réaction. Remarque : Les échantillons inconnus et les échantillons de contrôle positif sont fournis par le chercheur. Le kit inclut un contrôle négatif (Pathogen Detection Negative Control). 7. Organiser les tubes vides dans la base de 96 puits comme indiqué dans la page du Run Lay-out de manière à équilibrer le plateau quand les tubes de dosage seront placés dans l instrument ultérieurement. 8. Boucher les tubes, en fermant chacun d'eux avec les bouchons en barette optiques transparents utilisant une MicroAmp 96-Well Base (Cat. no. N ) et le MicroAmp Cap Installing Tool (Cat. no ) afin d éviter tout écrasement, flexion ou erreur d alignement des tubes. Vérifier que les barettes sont bien droites et que chaque tube est aligné sur le tube adjacent. 9. Marquer ou étiqueter une extrémité du capuchon en barette (mais pas directement sur les capuchons) de manière à ne pas oublier l orientation des tubes lors de leur transfert sur le plateau de l instrument. 10. S assurer que les réactifs sont bien mélangées ; si des réactifs n ont pas été mélangées au préalable pendant l étape de pipetage, placer les tubes de dosage dans une base de 96 puits et les mélanger au vortex. 11. S assurer que les réactifs se trouvent au fond des tubes ; le cas échéant, faire une centrifugation rapide (spin down) du contenu à x g pendant 30 secondes environ avec une centrifugeuse équipée d'un rotor à barettes. 12. Pour charger l instrument, transférer les tubes vers le 7500 Fast Instrument en respectant la même disposition que celle de la page du run layout. Utiliser le 7500 Fast Precision Plate Holder pour MicroAmp Tube Strips (Cat. no ; voir la figure ci-dessous). 13. Fermer le plateau de l instrument (voir la figure ci-dessous). 14

15 Chapitre 1 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Démarrage de l instrument 14. À la fin de la procédure de pipetage, le logiciel invite l utilisateur à passer à l étape suivante (par exemple, Start Instrument Run) ou à cliquer sur Close pour retourner à la page principale. Appuyer sur la porte du plateau pour l ouvrir. Démarrage de l instrument Transférer les tubes vers le support de plaques de précision (SPP) dans le plateau. Fermer la porte du plateau. 1. Dans la page principale, cliquer sur Start Instrument Run. Sélectionner le fichier de la série à utiliser, puis cliquer sur Next. (Si l option Start Instrument Run a été sélectionnée dans la dernière page Pipette Samples, le fichier de la série tout juste utilisé est sélectionné par défaut.) Guide de l utilisateur de MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Utilisation de RapidFinder Express Software 2. Cliquer sur dans la page Start Instrument Run pour exécuter la série. 3. Une fois la PCR terminée, retirer les tubes de l instrument. Affichage des résultats 1. Dans la page principale, cliquer sur View Results. Sélectionner le fichier de la série à afficher. 2. Cliquer sur l onglet Results by Location pour passer en revue les résultats de tous les tubes. La vue Layout View par défaut affiche les résultats sous forme d icônes. Cliquer sur le bouton d option Table View pour afficher les résultats et l évaluation au format texte. Cliquer sur Help pour afficher la description du texte d évaluation et les actions suggérées en réponse aux avertissements. Un résultat est indiqué pour chaque échantillon inconnu ou chaque contrôle. Dans la vue Layout View par emplacement, les résultats sont affichés sous forme d icônes. 3. Cliquer sur l onglet Results by Sample pour passer en revue les résultats de tous les réplicats d une combinaison d échantillon/cible donnée. Cliquer sur Help pour afficher la description du texte d évaluation et les actions suggérées en réponse aux avertissements. 15

16 Chapitre 1 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Affichage des résultats Ressources d affichage des résultats Analyse des résultats dans SDS Software Pour plus d informations sur l analyse des données, consulter : le guide de l utilisateur de l instrument approprié ; RapidFinder Express Software Online Help (Part no ). Il est recommandé d utiliser des méthodes différentes pour analyser les échantillons et confirmer les résultats. En cas d utilisation de MicroSEQ Pathogen Detection System pour analyser les échantillons, il est recommandé d avoir recours aux méthodes de culture et biochimiques pour confirmer les résultats. FSIS (USDA) MLG 5.04 et ISO 16654:2001, (voir «Références», page 53) sont les protocoles approuvés pour confirmer la présence de E. coli O157:H7. Dans le cadre de la NF Validation, les résultats positifs doivent être confirmés comme décrit à l Annexe A, «Validation ISO 16140» page 42. Le cas échéant, pour obtenir davantage d informations sur les avertissements, analyser les résultats dans SDS Software. 1. Dans la page principale de RapidFinder Express Software, sélectionner View Results. 2. Sélectionner le fichier de série à afficher. 3. Cliquer sur View in SDS dans RapidFinder Express Software (voir la figure intitulée «Bouton «View in SDS»») pour ouvrir SDS Software (voir la figure intitulée «SDS Software»). Cliquer sur l onglet Results. Pour plus d informations, voir «Analyse des avertissements ou des échecs dans le SDS Software» dans RapidFinder Express Software Online Help (Part no ). Bouton «View in SDS» SDS Software IMPORTANT! Si un fichier de série RapidFinder Express Software est modifié dans SDS Software, il ne sera plus possible de l ouvrir dans le RapidFinder Express Software. Pour empêcher la modification d un fichier de série RapidFinder Express Software, l enregistrer sous un nouveau nom dans SDS Software avant d effectuer la moindre action. 16

17 Chapitre 1 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Ressources d affichage des résultats Impression et exportation des résultats Pour imprimer un rapport dans RapidFinder Express Software : 1. Dans la page View Results, cliquer sur l onglet Report. 2. Sélectionner les options à inclure dans le rapport. Cliquer sur Print. Pour exporter les résultats : 3. Dans la page View Results, cliquer sur l onglet Report. 4. Sélectionner les options à inclure dans les résultats exportés. Cliquer sur Export Results. Ressources d affichage des résultats Pour plus d informations sur l analyse des données, consulter le guide de l utilisateur de l instrument approprié. Il est recommandé d utiliser des méthodes de principe différentes pour analyser les échantillons et confirmer les résultats. En cas d utilisation de MicroSEQ Pathogen Detection System pour analyser les échantillons, il est recommandé d avoir recours aux méthodes de culture et biochimiques pour confirmer les résultats. Les protocoles de confirmation comprennent FSIS (USDA) MLG 5.04 et ISO 16654:2001, décrits à la section «Références», page 53. Dans le cadre de la NF Validation, les résultats positifs doivent être confirmés comme décrit à l Annexe A, «Validation ISO 16140» page 42. Guide de l utilisateur de MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Utilisation de RapidFinder Express Software 17

18 Chapitre 1 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Ressources d affichage des résultats 18

19 Workflow du kit Chapitre 2 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Utilisation de SDS Software Ce chapitre présente un protocole pour l utilisation de MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit avec le Sequence Detection System (SDS) Software sur le 7500 Fast Instrument. PrepSEQ Sample Preparation Kits Extraction de l ADN (page 20) Pré-enrichissement Préparation des échantillons Guide de l utilisateur de MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Utilisation Utilisation de RapidFinder de SDS Express Software Software Dosage de détection des agents pathogènes MicroSEQ SDS Software Préparation de la PCR (page 20) Création d un fichier de série à l aide du SDS Software Préparation des billes lyophilisées Préparation des échantillons et des contrôles Combinaison d échantillons et de contrôles avec les billes lyophilisées Préparation des tubes pour le 7500 Fast System Démarrage de l instrument (page 26) Exécution des réactions de 8 tubes sur le 7500 Fast System Affichage des résultats sur le 7500 Fast System (page 27) Remarque : le SDS Software n a pas été inclus dans les études de validation AOAC ou AFNOR. 19

20 Chapitre 2 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Extraction de l ADN Extraction de l ADN L utilisation de l une des méthodes d extraction de l ADN suivantes est recommandée avec ce kit de détection. Les deux documents suivants décrivant ces méthodes contiennent des informations sur le pré-enrichissement et la préparation des échantillons à l aide de kits PrepSEQ : PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit User Guide: E. coli O157:H7 (protocole basé sur des billes magnétiques automatisé : Pub. no ) Kit PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit Food and Environmental Testing (inclut la Proteinase K en option) Cat. no PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kits User Guide: E. coli O157:H7 (protocole basé sur des colonnes de centrifugation : Pub. no ) Kit Cat. no. PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit with Proteinase K PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K Nous recommandons Extra Clean pour les matrices à forte teneur en graisse. La plupart des échantillons alimentaires d origine animale présentent une meilleure récupération de l ADN de l E. coli après digestion de Proteinase K, mais aucune amélioration n a été observée sur les produits d origine non animale. Préparation de la PCR Pour préparer la PCR, commencer par ouvrir le SDS Software à partir du 7500 Fast Instrument et créer un fichier de série, puis préparer les billes lyophilisées et les échantillons. Ce chapitre décrit la procédure de base utilisant le SDS Software pour le 7500 Fast Real-Time PCR System. 20

21 Chapitre 2 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Préparation de la PCR Démarrage de SDS Software Cliquer sur l icône SDS pour ouvrir le SDS Software pour le 7500 Fast System : Guide de l utilisateur de MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Utilisation de SDS Software Création d un fichier de série à l aide du SDS Software 1. Dans le SDS Software, créer un fichier de série. Accéder à File New pour ouvrir l assistant New Document Wizard. 2. Dans la section Define Document du New Document Wizard, sélectionner les options suivantes : a. Assay : Absolute Quantification (Standard Curve). b. Container : 96-Well Clear. c. Template : Blank Document. d. Run Mode : Fast e. Dans tous les autres champs, saisir les informations requises. f. Cliquer sur Next pour continuer. Remarque : Pour plus d informations sur la création d un fichier de série, consulter la documentation qui accompagne l instrument. 3. Dans la section Select Detectors du New Document Wizard, rechercher les détecteurs dans lesquels les Reporters sont renseignés par FAM, VIC et NED, et les Quenchers sont réglés sur none. Sélectionner chaque détecteur, puis cliquer sur Add pour entrer le détecteur en question dans le champ Detectors in Document. Cliquer sur Next pour continuer. Remarque : Si un détecteur ne figure pas dans la liste, cliquer alors sur New Detector et créer un nouveau détecteur pour chaque fluorochrome. Lors de la création de nouveaux détecteurs, il est recommandé de sélectionner une couleur différente pour chaque fluorochrome. 21

22 Chapitre 2 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Préparation de la PCR 4. Dans la section Set Up Sample Plate du New Document Wizard, affecter les fluorochromes appropriés à chaque puits contenant un échantillon, puis cocher la case Use en regard de chaque détecteur. Cliquer sur Finish pour continuer. IMPORTANT! Passer en revue «Démarrage de l instrument», page 26 pour déterminer la configuration optimale permettant de minimiser les risques de flexion ou d erreur d alignement des barettes de tubes. Remarque : Si les détecteurs FAM, VIC et NED ne figurent pas dans la liste des détecteurs, utiliser l onglet Back pour ajouter les détecteurs manquants dans le document. Chaque puits contenant un échantillon doit comporter trois symboles «U» correspondant aux trois fluorochromes, à savoir FAM, VIC et NED. 5. Dans l onglet Setup, entrer le nom de chaque échantillon en double-cliquant sur le puits d échantillon. Remarque : Chaque puits contenant un échantillon doit comporter trois symboles «U» correspondant aux trois fluorochromes (FAM, VIC ou NED ). Le fluorochrome NED permet de détecter le contrôle positif interne (IPC) ; les fluorochromes FAM et VIC permettent de détecter les cibles. 6. Dans l onglet Instrument, définir les conditions de cyclage thermique comme indiqué dans le tableau suivant. Pour plus d informations, se reporter au 7300/7500/7500 Fast Real-Time PCR System Absolute Quantitation Using Standard Curve Getting Started Guide (Pub. no ). Étape Activation de l enzyme PCR MAINTENIR Cycle (40 cycles) Dénaturation Hybridation/ extension Temp. 95 C 95 C 60 C Durée 2 min 3 s 30 s 22

23 Chapitre 2 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Préparation de la PCR 7. Régler le volume des échantillons sur 30 µl. L image suivante indique les conditions de cyclage thermique pour le 7500 Fast System utilisant le SDS Software avec le mode d exécution réglé sur Fast 7500 : Guide de l utilisateur de MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Utilisation de SDS Software 8. Sous File, enregistrer le fichier de série au format.sds dans le dossier approprié. Préparation des billes lyophilisées 1. Ouvrir la poche de stockage contenant les tubes avec les billes lyophilisées (découper au niveau de l entaille dans l angle supérieur de la poche de stockage, au-dessus de la bande de fermeture à glissière). IMPORTANT! Ne pas retirer le déshydratant de la poche de stockage. 2. Retirer le nombre approprié de tubes individuels ou de barettes de 8 tubes, selon le nombre d échantillons et de contrôles qui doivent être traités, et les placer dans une base de 96 puits. Un contrôle négatif au moins est recommandé pour l agent pathogène cible. Retirer les bouchons de couleur et les éliminer. Éviter de perturber les billes au fond des tubes. Remarque : Les billes lyophilisées contiennent tous les composants nécessaires pour chaque réaction. 23

24 Chapitre 2 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Préparation de la PCR IMPORTANT! Ne pas utiliser les tubes ou les bouchons de couleur pour les réactions du kit. Les tubes ou les bouchons de couleur peuvent affecter les mesures des signaux des fluorochromes pendant la PCR en temps réel. 3. Refermer la poche de stockage à l aide de la bande de fermeture à glissière, puis la conserver à 5 ± 3 C. Préparation des échantillons et des contrôles 1. Décongeler complètement tous les réactifs (échantillons et contrôles). 2. Eliminer les gouttes de condensation après la décongélation des échantillons et avant leur ouverture afin d éviter toute contamination croisée. Pour les échantillons PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit, centrifuger la plaque pendant 1 minute environ. Pour les échantillons PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit, microcentrifuger les pendant 1 minute approximativement afin de réduire toutes les matières particulaires dérivées de la colonne de centrifugation, qui peuvent interférer avec l amplification. L ADN microbien est en phase aqueuse. Pour le Pathogen Detection Negative Control et les contrôles positifs contenus dans les tubes de microcentrifugation, agiter les tubes au vortex, puis faire une centrifugation rapide (un spin down ). Remarque : Les échantillons inconnus et les échantillons de contrôle positif sont fournis par le chercheur. Le kit inclut un contrôle négatif (Pathogen Detection Negative Control). 3. Ajouter 30 µl de l échantillon préparé ci-dessus à chaque bille lyophilisée. Commencer par distribuer tous les échantillons inconnus et poursuivre avec les contrôles négatifs, puis les contrôles positifs. Les billes se dissolvent en 1 à 5 secondes. Mélanger en aspirant et en distribuant délicatement plusieurs fois. (Il est également possible d agiter les tubes de dosage au vortex après les avoir bouchés à la fin de la dernière étape.) IMPORTANT! Utiliser un nouvel embout de pipette pour chaque échantillon. Remettre en suspension le contenu en le pipetant et le rejetant délicatement plusieurs fois, en maintenant l embout de la pipette au fond du tube afin de réduire la formation d aérosol et le risque de contaminations croisées. Si un vortex est disponible, mélanger les tubes bouchés au vortex jusqu à la dissolution du culot. Pour plus d informations, voir Annexe B, «Bonnes pratiques en matière de PCR» page

25 Chapitre 2 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Préparation de la PCR Préparation des tubes pour le 7500 Fast System Remarque : Ajouter 30 µl de l échantillon PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit ou 30 µl de l échantillon PrepSEQ Rapid Spin Kit à chaque bille de dosage. Le PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit fournit environ 100 µl d échantillon, tandis que le PrepSEQ Rapid Spin Kit en fournit 300 µl. Utiliser 30 µl du Pathogen Detection Negative Control par réaction de contrôle négatif. Si d autres méthodes de préparation d échantillons sont utilisées et moins de 30 µl d échantillon sont disponibles, ajouter de l eau au volume de l échantillon jusqu à parvenir à 30 µl pour chaque type de réaction. Les barettes de 8 tubes contenant les billes lyophilisées sont compatibles avec le 7500 Fast System. 1. En cas d utilisation de barettes de 8 tubes avec un maximum de sept réactions, ajouter des tubes vides supplémentaires, comme requis, de sorte que chaque barette contienne un ensemble complet de 8 tubes. Guide de l utilisateur de MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Utilisation de SDS Software Remarque : Les barettes de 8 tubes bouchées vides distribuent de manière uniforme la pression appliquée aux barettes de tubes d échantillon pendant le traitement, réduisant ainsi le risque d écrasement des tubes. Ajouter les tubes vides nécessaires pour créer une barette de 8 tubes complète et la boucher avec une barette de 8 capuchons intacte. 2. Boucher les tubes, en fermant chacun d eux avec les capuchons en barette optiques transparents fournis dans le kit. Boucher les tubes avec les capuchons en barette utilisant la MicroAmp 96-Well Base (Cat. no. N ) et le MicroAmp Cap Installing Tool (Cat. no ) pour éviter tout écrasement, toute flexion ou toute erreur d alignement des tubes. Vérifier que les barettes sont bien droites et que chaque tube est aligné sur le tube adjacent. 3. Marquer ou étiqueter une extrémité du capuchon en barette (mais pas directement sur un capuchon) de manière à ne pas oublier l orientation des tubes lors de leur transfert sur le plateau de l instrument. 4. S assurer que les réactions sont bien mélangées. Si des réactions n ont pas été mélangées au préalable pendant l étape de pipetage, placer les tubes de dosage dans une base de 96 puits et les mélanger au vortex. 5. S assurer que les réactifs se trouvent au fond des tubes. Le cas échéant, faire une centrifugation rapide (spin down) du contenu à x g pendant 30 secondes environ avec une centrifugeuse équipée d'un rotor à barettes. 25

26 Chapitre 2 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Démarrage de l instrument Démarrage de l instrument Cette section décrit la procédure d exécution des réactions de 8 tubes sur le 7500 Fast System d Applied Biosystems à l aide du SDS Software. Exécution des réactions de 8 tubes Il est recommandé d utiliser le 7500 Fast Precision Plate Holder for MicroAmp Tube Strips (Cat. no ). En cas d utilisation des barettes de 8 tubes MicroAmp, si la colonne 1 (extrémité gauche) et la colonne 12 (extrémité droite) ne sont pas utilisées, insérer dans ces colonnes deux barettes de 8 tubes vides complètement bouchées. Remarque : Les barettes de 8 tubes bouchées vides distribuent de manière uniforme la pression du bloc appliquée aux barettes de tubes d échantillon pendant le traitement, réduisant ainsi le risque d écrasement des tubes. 1. Insérer délicatement deux barettes de 8 tubes contenant des échantillons ou plus, en allant du centre de support de plaques vers la périphérie. Cette configuration réduit les risques de flexion ou d erreur d alignement des barettes de tubes. Remarque : Deux à douze barettes de 8 tubes au maximum peuvent être traitées simultanément. IMPORTANT! Toujours utiliser un total de 8 tubes par colonne. Il peut s avérer nécessaire d ajouter de nouveaux tubes vides dans une colonne. 26

27 Chapitre 2 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Affichage des résultats Affichage des résultats 2. Ouvrir le fichier de série correspondant à la plaque de réaction créée à la section «Création d un fichier de série à l aide du SDS Software», page Dans l onglet Instrument, sélectionner Start pour lancer l exécution. Remarque : Le fichier de série doit être enregistré au préalable. Si le fichier de série n a pas été enregistré avant la sélection du bouton Start, un message indiquera que ce fichier doit d abord être sauvegardé. IMPORTANT! Pour éviter les faux positifs en raison de l amplification de matières dans votre zone de travail, ne pas ouvrir les tubes après l amplification. Guide de l utilisateur de MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Utilisation de SDS Software Procédure d utilisation générale de SDS Software La procédure générale d affichage des résultats à partir de MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit implique : l affichage des tracés d amplification de toutes les réactions ; la définition des valeurs de base et de seuil ; la vérification du signal des fluorochromes FAM et VIC (spécifiques à la cible) et du signal du fluorochrome NED (IPC) de chaque échantillon. Le tableau suivant sert de référence de base pour l interprétation des résultats : Signal du fluorochrome FAM (cible 1) Signal du fluorochrome VIC (cible 2) Signal du fluorochrome NED (IPC) Résultat + + +, Positif + + Négatif + + Négatif + Négatif + Non concluant ; aucun IPC détecté + Non concluant ; aucun IPC détecté Non concluant ; aucun IPC détecté et aucun signal spécifique à la cible détecté 27

28 Chapitre 2 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Affichage des résultats Ressources d affichage des résultats Pour plus d informations sur l analyse des données, consulter le guide de l utilisateur de l instrument approprié. Il est recommandé d utiliser des méthodes de principe différentes pour analyser les échantillons et confirmer les résultats. En cas d utilisation de MicroSEQ Pathogen Detection System pour analyser les échantillons, il est recommandé d avoir recours aux méthodes de culture et biochimiques pour confirmer les résultats. Les protocoles de confirmation comprennent FSIS (USDA) MLG 5.04 et ISO 16654:2001, décrits à la section «Références», page 53. Dans le cadre de la NF Validation, les résultats positifs doivent être confirmés comme décrit à l Annexe A, «Validation ISO 16140»page

29 Workflow du kit Chapitre 3 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Utilisation du StepOne Software Ce chapitre présente un protocole pour l utilisation de MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit avec le logiciel StepOne Software sur le StepOnePlus l instrument Step One plus. PrepSEQ Sample Preparation Kits Extraction de l ADN page 30 Pré-enrichissement Préparation des échantillons Guide de l utilisateur de MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Utilisation de StepOne Software Dosage de détection des agents pathogènes MicroSEQ StepOne Software Préparation de la PCR page 31 Création d un fichier de série à l aide de StepOne Software Préparation des billes lyophilisées Préparation des échantillons et des contrôles Combinaison d échantillons et de contrôles avec les billes lyophilisées Préparation des tubes pour le StepOnePlus System Démarrage de l instrument page 37 Exécution des réactions de 8 tubes sur le StepOnePlus System Affichage des résultats sur le StepOnePlus System page 38 IMPORTANT! Le MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit peut être utilisé avec le StepOnePlus Instrument, mais pas le StepOne Instrument, car le StepOne Instrument n est pas capable de détecter les trois fluorochromes dans le dosage de l E. coli O157:H7. Remarque : Le StepOnePlus Instrument n a pas été inclus dans les études de validation AOAC ou AFNOR. 29

30 Chapitre 3 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Extraction de l ADN Extraction de l ADN L utilisation de l une des méthodes d extraction de l ADN suivantes est recommandée avec ce kit de détection. Les deux documents suivants décrivant ces méthodes contiennent des informations sur le pré-enrichissement et la préparation des échantillons à l aide de kits PrepSEQ : PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit User Guide: E. coli O157:H7 (protocole basé sur des billes magnétiques automatisé : Pub. no ) Kit PrepSEQ Nucleic Acid Extraction Kit Food and Environmental Testing (inclut la Proteinase K en option) Cat. no PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kits User Guide: E. coli O157:H7 (protocole basé sur des colonnes de centrifugation : Pub. no ) Kit Cat. no. PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit with Proteinase K PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean PrepSEQ Rapid Spin Sample Preparation Kit Extra Clean with Proteinase K Nous recommandons l utilisation du protocole Extra Clean pour les matrices à forte teneur en graisse. La plupart des échantillons alimentaires d origine animale présentent une meilleure récupération de l ADN de l E. coli après digestion de Proteinase K, mais aucune amélioration n a été observée sur les produits d origine non animale. 30

31 Chapitre 3 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Préparation de la PCR Préparation de la PCR Démarrage de StepOne Software Pour préparer la PCR, commencer par ouvrir StepOne Software et créer un fichier de série, puis préparer les billes lyophilisées et les échantillons. Ce chapitre décrit la procédure de base utilisant StepOne Software pour le StepOnePlus Real-Time PCR System. Cliquer sur l icône StepOne pour ouvrir le logiciel pour le StepOnePlus System : Guide de l utilisateur de MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Utilisation de StepOne Software Création d un fichier de série à l aide de StepOne Software 1. Dans StepOne Software, créer un fichier de série. Accéder à File New Experiment et sélectionner Advanced Setup. Remarque : Pour plus d informations sur la création d un fichier de série, consulter la documentation qui accompagne l instrument. 2. Dans la page Experiment Properties, sélectionner les options suivantes : a. Instrument : StepOnePlus Instrument (96 Wells) b. Type of experiment : Quantitation Standard Curve c. Type of reagents : TaqMan Reagents d. Ramp speed : Fast 3. Dans la page Plate Setup, dans l onglet Define Targets and Samples, créer trois cibles avec les quenchers NFQ-MGB. Sélectionner FAM, VIC et NED comme fluorochrome. 31

32 Chapitre 3 MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit Préparation de la PCR 4. Dans l onglet Assign Targets and Samples, associer les fluorochromes FAM, VIC et NED à chaque réaction. IMPORTANT! Passer en revue «Démarrage de l instrument», page 37 ou «Exécution des réactions de 8 tubes sur le StepOnePlus System», page 37, comme approprié, pour déterminer la configuration optimale permettant de minimiser les risques de flexion ou d erreur d alignement des barettes de tubes. Le kit MicroSEQ E. coli O157:H7 Detection Kit peut être utilisé avec l instrument StepOnePlus (mais pas StepOne ). Remarque : Les fluorochromes FAM et VIC sont utilisés pour détecter les cibles ; le fluorochrome NED sert à détecter le contrôle positif interne (IPC). Le dosage de l E. coli O157:H7 est compatible avec le StepOnePlus Instrument, mais pas avec le StepOne Instrument, car le StepOne Instrument n est pas capable de détecter les trois colorants dans le dosage de l E. coli O157:H7. 5. Dans la page Run Method, définir les conditions de cyclage thermique comme indiqué dans le tableau suivant. Pour plus d informations, se reporter au «Chapitre 5 Présence/absence d expériences» du StepOne and StepOnePlus Real-Time PCR Systems User Guide (Pub. no ). Étape Activation des enzymes PCR MAINTENIR Cycle (40 cycles) Dénaturation Hybridation/extension Temp. 95 C 95 C 60 C Durée 2 min 1 s 20 s 32

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