A l interface entre la Biologie Moléculaire, la Biochimie, l Imagerie et la Médecine

Transcription

1 A l interface entre la Biologie Moléculaire, la Biochimie, l Imagerie et la Médecine

2 L Imagerie Petit Animal : Visualisation de marqueurs in vivo Fluorescence ou Bioluminescence Bruno Combettes HAMAMATSU

3 1. Introduction 2. Principes : fluorescence bioluminescence 3. Biologie Moléculaire 4. Détection du signal caméra sensible comptage de photons 5. Applications 6. Conclusions

4 1. Introduction 2. Principes : fluorescence bioluminescence 3. Biologie Moléculaire 4. Détection du signal caméra sensible comptage de photons 5. Applications 6. Conclusions

5 Modèle : Représentation simplifiée d un processus ou d un système qui ne peut être étudié pour des raisons éthiques ou techniques. Modèle animal : animal qui va permettre d étudier dans des conditions de laboratoires contrôlées, les causes, les processus et les traitements éventuels d une pathologie. L analogie d un modèle animal avec la pathologie humaine correspondante doit satisfaire aux critères suivants : Causes, Symptômes, Mécanismes et Traitements.

6 - Faible dimensions des organes ou structures : Haute résolution spatiale - Faible concentration des molécules à détecter : Haute sensibilité - Anesthésie - Suivi des paramètres physiologiques Ces contraintes imposent le développement d appareils dédiés à l imagerie des petits animaux

7 HAMAMATSU

8

9 1. Introduction 2. Principes : fluorescence bioluminescence 3. Biologie Moléculaire 4. Détection du signal caméra sensible comptage de photons 5. Applications 6. Conclusions

10 La Fluorescence Diagramme simple de Jablonski (1935) 3 : Relaxation radiative : émission de fluorescence

11 Excitation 2. Durée de vie de l excitation (~10-9 sec) 3. Émission de fluorescence Hν em fluorescence 0

12 iagramme e Jablonski 1935)

13 1. Eemission < Eexcitation E = hν = hc/λ λ emission > λ excitation. Loi de Kasha : pectre d émission = miroir du spectre d excitation 3. Intensité de fluorescence: I f = 2.3. φ f. I0. ε. C. l φ f = rendement quantique du fluorochrome ε = coefficient d extinction I0 = intensité d excitation

14 La Green Fluorescent Protein (GFP( GFP) Aequorea victoria Renilla reniformis

15 La GFP, Structure 11 feuillets β disposés en parallèle, formant une cage Å 1 hélice α contenant le chromophore

16 Le fluorophore de la GFP

17 La GFP Protéine de 238 acides aminés, 27 Kda Stable jusqu à 65 C C pour des ph allant de 5.5 à 12 Les acides aminés s 2 à 229 sont impliqués s dans la réaction r de fluorescence Le chromophore est constitué de 3 acides aminés Ser65-Tyr66 Tyr66-Gly67 La fluorescence ne nécessite n ni substrat ni co-facteur Dans le chromophore le remplacement de Ser 65 par Thr65 conduit au mutant GFP65T excitable à 490 nm et 6 fois plus fluorescent.

18 La GFP Clonage du gène de la GFP Prasher DC, Eckenrode VK, Ward WW, Prendergast FG, Cormier MJ. (1992) Primary structure of the Aequorea victoria green-fluorescent protein. Gene 111,, La GFP, gène rapporteur Chalfie M, Tu Y, Euskirchen G, Ward WW, Prasher DC. (1994) Green fluorescent protein as a marker for gene expression, Science

19

20

21

22 La Bioluminescence : phénomène naturel qui consiste en l excitation chimique d un fluorophore qui emet de la lumière en se relaxant. intérêt : pas d excitation lumineuse externe qui pourrait ammener des artéfacts inconvéniant : doit apporter le substrat (injection)

23 3 Ca 2+ O O 469 nm coelentérazine Aequorine Coelentéramide + CO 2

24 Le BRET Bioluminescence Resonance Energy Transfer

25 iagramme e Jablonski 1935)

26 3 Ca 2+ O O 469 nm coelentérazine Coelentéramide + CO 2

27 GFP O O 3 Ca 2+ coelentérazine 508 nm Coelentéramide + CO 2 intérêt : pas d excitation lumineuse externe qui pourrait ammener des artéfacts intérêt : ne doit pas apporter le substrat (pas d injection)

28 PCMV GFP aequorine PG i A (TCC GGC GGG AGC GGA TCC GGC GGC CAG) x 1-51 TCC GGA CTC AGA TCT

29 1. Introduction 2. Principes : fluorescence bioluminescence 3. Biologie Moléculaire 4. Détection du signal caméra sensible comptage de photons 5. Applications 6. Conclusions

30

31

32

33 1. Introduction 2. Principes : fluorescence bioluminescence 3. Biologie Moléculaire 4. Détection du signal caméra sensible comptage de photons 5. Applications 6. Conclusions

34 ER-150 Hamamatsu

35 La résolution spatiale du capteur de la caméra joue un rôle clé dans l acquisition. Caméra analogique : ~ pixels Caméra numérique : 1,3 Millions pixels La résolution colorimétrique de la caméra joue un rôle clé dans l analyse, c est la dynamique. (capacité à séparer 2 niveaux de gris proches) n bits 2n couleurs * Caméra monochrome 8 bits soit 256 niveaux * Caméra monochrome 12 bits soit 4096 niveaux

36 1500 pixels

37 pixels

38 pixels

39 pixels

40 6 couleurs

41 18 couleurs

42 4096 couleurs

43 16 M couleurs

44

45

46

47 1/30 Sec. 1 Sec. 10 Sec. 100 Sec Sec.

48

49 1. Introduction 2. Principes : fluorescence bioluminescence 3. Biologie Moléculaire 4. Détection du signal caméra sensible comptage de photons 5. Applications 6. Conclusions

50 Luminescence Imagerie métabolique Activité de l ATP dans les tumeurs malignes

51 Imagerie fonctionnelle Expression d un gène tissu-spécifique sous contrôle de la Tétracycline

52 Régulation des gènes in vivo Arabidopsis + luciférase

53

54 Fluorescence Imagerie cellule-spécifique Expression de l EGFP dans différentes cellules tumorales

55 Imagerie des tumeurs (nouveau modèle) Modèle tumoral par xénogreffe : inoculation de cellules tumorales in vivo

56 Co-localisation de marqueurs Coenorabditis elegans

57 Expression de lectine chez arabidopsis thaliana

58 1. Introduction 2. Principes : fluorescence bioluminescence 3. Biologie Moléculaire 4. Détection du signal caméra sensible comptage de photons 5. Applications 6. Conclusions

59 Les progrès récents en biologie moléculaire et leurs applications en médecine (cancérogenèse, études métaboliques...) nécessitent de nouveaux outils, en particulier pour l'analyse micro et macroscopique des données images. Dans ce but, la solution d'imagerie par un système de boîte noire 'petit animal répond à ces applications. Combinant les approches luminescence ou fluorescence, ce système permet de visualiser, suivre dans le temps, quantifier des signaux provenant d'un marqueur et émis in situ dans l'animal vivant anesthésié. Ce système trouve son utilisation dans de nombreuses thématiques de recherche telles que l'imagerie fonctionnelle, métabolique, la régulation de gènes in vivo, l'imagerie des tumeurs...

60 L imagerie peut être étendue à d autres petits animaux Plus d informations : bcombettes@hamamatsu.fr