Diplôme d Études Approfondies en Biochimie/Biologie Moléculaire. Spécialité : Biologie Moléculaire

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1 UNIVERSITE DE OUAGADOUGOU Unité de Formation et de Recherche en Sciences de la Vie et de la Terre (UFR/SVT) BURKINA FASO UNITE - PROGRES - JUSTICE 3678 THESETH Département de Biochimie-Microbiologie Mémoire Présentée pour l obtention du CERBA/LABIOGENE UFR/SVT ******************** Diplôme d Études Approfondies en Biochimie/Biologie Moléculaire et Bioinformatique (BAEBIB) Spécialité : Biologie Moléculaire Par : GHOMA LINGUISSI Laure Stella Maître ès Sciences. SUR LE THÈME : Diagnostic Moléculaire du VIH par PCR au Centre Médical Saint Camille de Ouagadougou et au CERBA/LABIOGENE Soutenu le 04 Janvier 2012 devant le jury : Président : Pr Odile Germaine NACOULMA, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou Membres : Pr Jacques SIMPORE, Professeur Titulaire, Université de Ouagadougou Dr Christelle WM NADEMBEGA, Maître Assistante, Université de Ouagadougou

2 Dédicace A la mémoire de ma sœur. Et Rose, elle a vécu ce que vivent les roses, l espace d un matin François de Malherbe. 2

3 Remerciements Ce travail a été réalisé au laboratoire de Biologie Moléculaire du Centre Médical Saint Camille et au Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro ANNIGONI (CERBA/LABIOGENE). Nous exprimons nos profondes gratitudes. Au Professeur Odile Germaine NACOULMA, responsable de l école doctorale (Département de Biochimie/Microbiologie) pour avoir accepté de présider notre jury. Je tiens tout d abord à adresser mes plus vifs remerciements au Prof. Jacques Simporé, Professeur titulaire de Biologie Moléculaire et de Génétique moléculaire à l Université de Ouagadougou, Directeur du Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni, Saint Camille CERBA/LABIOGENE et Recteur de l Université saint Thomas d Aquin (USTA). Il a encadré avec bienveillance ce mémoire de DEA, financé entièrement sa réalisation et donné les moyens nécessaires pour mener à bien cette étude, dans son centre de recherche. En plus, il m a aidé dans le choix de ce thème. Je lui suis très reconnaissante de m avoir fait profiter de la richesse et de la pertinence de ses connaissances scientifiques. Je suis également sensible à la confiance qu il m a témoignée. Mes sincères remerciements vont au Professeur Francine Ntoumi, Présidente de la Fondation Congolaise pour la Recherche Médicale (FCRM) et Coordonatrice du projet CANTAM pour m avoir octroyé la bourse qui m a permis de poursuivre mes études. Merci également pour avoir accepté d évaluer notre travail et d avoir accepté d être membre du jury. Au Dr. W.M. Christelle NADEMBEGA, Maître Assistante en Biochimie Microbiologie, Université de Ouagadougou, pour avoir accepté d évaluer notre travail et d avoir accepté d être membre du jury. Au Professeur Jean-Baptiste NIKIEMA, Professeur Titulaire en Pharmacognosie, Université de Ouagadougou, DGPML et président du conseil d administration du centre Muraz pour son appui scientifique et technique. 3

4 Au Docteur Charlemagne GNOULA, Maître Assistant en chimie thérapeutique et au Docteur Djeneba OUERMI, Assistante à l Université de Ouagadougou pour leurs conseils et pour l aide qu iles ont apporté dans la réalisation de ce travail. A tous les enseignants-chercheurs du département de Biochimie/Biologie Moléculaire Appliquée/ Substances Naturelles/ Plantes médicinales et Phytothérapie pour la qualité de la formation reçue. Je remercie la Conférence Episcopale Italienne (CEI), pour son soutien financier dans la réalisation de nos travaux de mémoire de DEA. Je remercie également le projet CANTAM et particulièrement Dr Odile OUWE MISSI OUKEM pour le précieux appui financier, pour l inscription à l AEA, qui m a permis de continuer ma formation en DEA. Je remercie Docteur Cyrille BISSEYE pour l aide précieuse au laboratoire et notamment pour l initiation à la RT-Real-time PCR. Un immense Merci à l équipe de Saint Camille CERBA/LABOGIENE avec qui j ai partagé mon quotidien dans la recherche : aux messieurs Bolni Marius Nagalo et Désiré Ilboudo ; aux dames Florencia Djigma, Tani Sagna, Thérèse Kagoné et Zoenabo Douamba. Soyez rassurez de ma profonde gratitude. J aimerais remercier chaleureusement et ensuite exprimer ma profonde gratitude à la famille Simporé (Monsieur François Simporé, sa femme et leurs enfants) pour m avoir accueillie comme membre de leur famille. Je suis particulièrement sensible à la marque d hospitalité qu ils ont tous fait montre à mon égard. Enfin, je voudrais remercier mes parents, mes frères et sœurs qui m apportent un grand soutien depuis plusieurs années. En espérant que le fruit de ce travail traduise en partie la récompense de tous leurs efforts et leur dévouement. 4

5 TABLES DE MATIERES Tables de matieres... 5 Liste des acronymes... 7 listes des Figures... 8 Introduction Enoncé du problème Justification de l étude Objectifs de la recherche Objectif principal Objectifs spécifiques Chapitre I. Généralités I.1 Diversité génétique du VIH I.1.1 Origine du VIH et de sa diversité génétique I.1.2 Distribution géographique et prévalence des sous-types VIH I.2 Structure du VIH I.2.1 Particule virale I.2.2 Génome du VIH I.3 Cellules cibles du VIH et Réservoirs cellulaires I.3.1 Cellules dendritiques I.3.2 Cellules de la lignée monocytaire I.3.3 Lymphocytes T I.3.4 Organes lymphoïdes : cibles précoces du VIH I.4 Mécanisme d infection par le VIH I.4.1 Différents stades de l infection I Cycle de réplication virale I.5 Réponse immunitaire de l hôte face à l infection à VIH I.5.1 Réponse à médiation cellulaire I.5.2 Réponse à médiation humorale I.6 Mécanisme de transmission du VIH I.6.1 Transmission Sexuelle I.6.2 Transmission Sanguine I.6.3 Mécanismes de la transmission mère-enfant du VIH I.6.4 Moment de la transmission Evolution des différentes populations cellulaires lors des phases de la maladie I.8 Traitements I.8.1 Principes et définition I.8.2 Moyens de traitement I.9 Prise en charge de la grossesse chez la femme enceinte séropositive II Techniques de diagnostic des infections à VIH II.1 Diagnostic Indirect II.1.1- Tests ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) II.1.2 Tests de dépistage dits : «tests rapides» II.1.3 Méthode de Western blot II.2 Diagnostic direct II.2.1 Antigène p II.2.2 Techniques de biologie moléculaire III Mesure des marqueurs viro-immunologiques Chapitre II. Méthodologies II.1 Cadre de l étude II.1.1 Centre Médical Saint Camille

6 II.1.2 Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA/LABIOGENE) II.2 Protocole PTME au Centre Médical Saint Camille II.3 Déroulement de l'étude II.3.1 Période et type d étude II.3.2 Collecte des données et des échantillons de sang II.3.3 Mode de recrutement II.4 Considération éthique II.5 Matériel II.5.1 Appareils de diagnostic utilisés II.5.2 ARV utilisés pour le PTME II.6 Méthodes pour les techniques utilisées II.6.1 ELISA indirect II.6.2 Extraction II.6.3 PCR qualitative II.6.4 Statistiques Chapitre III Résultats et discussion III.1 Résultats III.1.1 Caractéristiques sociodémographiques des mères, selon l âge et la profession III.1.2 Analyse des tests PCR III.1.3 Analyse des tests pour le Real time-pcr des personnes à sérologie douteuse III.1.4 Analyse des tests PCR par l ADN proviral en utilisant les DBS III.2 Discussion Conclusion et perspectives

7 LISTE DES ACRONYMES 3TC : Lamivudine AA : Allaitement artificiel ADN: Acide Désoxyribonucléique AM : Allaitement Maternel ARN: Acide Ribonucléique ARV : Antirétroviraux AZT : Zidovudine BET : Bromure d'éthidium CERBA : Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro ANNIGONI CMSC : Centre Médical Saint Camille CPA : Cellules présentatrices d antigène CREN : Centre de Récupération et d Education Nutritionnelle CRF: Circulating Recombinant Form DBS: Dried Blood Spot DO: Densité optique ELISA: Enzyme Linked Immunosorbent Assay HAART: Highly Active Antiretroviral Treatment IF : Inhibiteurs de Fusion INNTI : Inhibiteurs non Nucléosidiques de la Transcriptase Inverse INTI : Inhibiteurs Nucléosidiques de la Transcriptase Inverse IP : Inhibiteurs de Protéase LABIOGENE : Laboratoire de Biologie Moléculaire et de Génétique Moléculaire LTR : Long terminal repeat NSI : Non Sycintium Inducing NVP : Névirapine ONUSIDA : Organisation des Nations Unies pour la lutte contre le SIDA PCR: Polymerase Chain Reaction PTME : Prévention de la Transmission Mère-enfant SI : Syncitium Inducing. SMI : Santé Maternel et Infantile TDR : Test de Diagnostic Rapide TME: Transmission mère-enfant URF: Unique Recombinant Form VIH : Virus de l'immunodéficience Humaine 7

8 LISTES DES FIGURES Figure 1 : Structure du virion VIH Figure 2 : Représentation schématique du génome du VIH Figure 3 : Stade de l infection par le VIH Figure 4 : Représentation schématique du cycle de réplication du VIH Figure 5 : Schéma des étapes de fixation et de fusion du virus et de la cellule hôte Figure 6 : Mécanismes de transmission du VIH in utero Figure 7. Origine du VIH dans le lait maternel Figure 8 : Evolution des marqueurs de la contamination par le VIH Figure 9 : PCR en temps réel Figure 10: Photos de tests rapides VIH Figure 11: Thermocycleur Figure 12 : système d électrophorèse Figure 13 : Appareil 7500 real time PCR Figure 14 : Système photo doc Figure 15 : Centrifugeuse réfrigérée Figure 16 : Représentation des résultats du Génie II HIV-1/HIV-2 SDBioline Figure 17 : Electrophorèse sur gel d agarose à 2%

9 LISTE DES TABLEAUX Tableau I : Protocoles ARV de prévention de la transmission mère-enfant du VIH Tableau II : Mélange Réactionnel de la PCR Tableau III : Programme d amplification de la PCR Tableau IV : Mélange réactionnel de la DTT Tableau V : Mélange réactionnel de la RT Tableau VI : Programme d amplification de la RT-PCR en temps réel qualitative Tableau VII : Répartition du statut sérologique en fonction des groupes d âge Tableau VIII : Répartition du VIH en fonction des professions des mères Tableau IX : Prévalence des tests PCR positifs en fonction des professions des mères Tableau X : Résultats des tests PCR des enfants en fonction du mode de traitement de leur mère Tableau XI : Résultats des tests PCR des enfants en fonction de leur mode d allaitement Tableau XII : Répartition de l allaitement selon les tests PCR Tableau XIII : Résultats de la PCR des personnes au statut sérologique douteux à l ELISA

10 Résumé Introduction Cette étude fait le bilan de la prise en charge dans la prévention de la transmission mèreenfant du VIH/SIDA (PTME) au Centre Médical Saint Camille de Ouagadougou et au CERBA/LABIOGENE, deux centres de référence en PTME. L objectif de cette étude est d effectuer le diagnostic moléculaire du VIH par PCR chez les enfants nés de mères VIH séropositives et chez les femmes enceintes ayant un statut sérologique douteux. Patients et Méthode Une étude longitudinale était conduite sur 1300 femmes venant pour une consultation prénatale entre septembre 2010 et juillet La sérologie VIH de ces femmes a été déterminée par ELISA et les résultats douteux ont été confirmés par PCR en temps réel. Le Diagnostic moléculaire du VIH par PCR a été effectué sur 378 enfants nés de mère séropositives, en utilisant du sang séché sur papier Buvard (Dried Blood Spot : DBS). Résultats L incidence globale de la transmission mère-enfant du VIH était de 4,76% (18/378) : 0,00% (0/114) pour les mères sous HAART et 6,82% (18/264) pour celles sous NPP (AZT + 3TC + NVP). Les mères étaient essentiellement des ménagères (69,69%), leur moyenne d âge était de 28,3± 0,2 ans et 41,5% des mères étaient du groupe d âge ans. La différence n était pas significative (p= 0,529) en comparant la PCR positive des enfants allaités avec le lait maternel avec allaités avec le lait artificiel (6,5% versus 4,2%).Le taux de décès chez les enfants durant le suivi médical était de 1,3%. Par ailleurs, parmi les 16 échantillons identifiés indéterminés au test VIH par ELISA, chez les femmes enceintes, la PCR en temps réel a confirmé 2 échantillons (12,5%) VIH positifs. Conclusion L efficacité de la stratégie nationale de la PTME repose sur le bon suivi de son protocole. La thérapie antirétrovirale (HAART) des enfants pourraient réduire d une manière très significative la transmission verticale du VIH. En plus, l utilisation d une technique de diagnostic précoce du VIH chez les enfants nés de mères séropositives par PCR est nécessaire et recommandable dans le cadre de la PTME au Burkina Faso. Chez les femmes enceintes, la PCR est également essentielle pour confirmer leurs tests VIH douteux effectués par ELISA. Mots clés : VIH Nouveau né ARN DBS - ADN PCR PCR en temps réel PTME Femmes enceintes 10

11 Abstract Aim of the study The objective of this study was to evaluate the HIV Mother to child transmission and to confirm by Real-Time PCR HIV infection in pregnant women with dubious serological status. Patients and Methods A longitudinal study was conducted among 1300 women attending the antenatal service at Saint Camille Medical Centre from September 2010 to July HIV status of mothers was determined by rapid tests and ELISA. Discordant results were confirmed by real-time PCR. PCR was used to determine HIV status of children born from HIV-positive mothers. Results From 1300 pregnant women tested for HIV, 378 were seropositive. Mothers were predominantly housewives (69.7%), and mean age was 28.3 ± 0.15 years. The overall prevalence of HIV transmission from mother to child was 4.8% (18/378). This prevalence differed significantly from 0.0% (0/114) to 6.8% (18/264) in children born from mothers under HAART and those with mothers under NPP (AZT + 3TC + NVP), respectively (p = 0.009). Children s mortality rate during the medical follow up was 1.3% (5 /378). Among 16 women with HIV dubious status by ELISA, the Real Time PCR confirmed 2/16 (12.5%) as HIV positive. Conclusion The protocol of prevention of mother to child HIV transmission (PMTCT) is effective. The rate of HIV vertical transmission is significantly reduced. Early diagnosis determined by PCR of children born from HIV- positive mother is necessary and recommended in the context of PMTCT in Burkina Faso. We also found that PCR is a performant tool to confirm HIV status in pregnant women. Keywords: Pregnant women; child; HIV; PMTCT; Real Time PCR; DNA; DBS. 11

12 INTRODUCTION En 2010, selon ONUSIDA, le nombre de personnes nouvellement infectées par le VIH dans le monde était estimé à 2,6 millions. Près de 33,3 millions de personnes vivent avec le VIH, avec 15,9 millions de femmes et 2,5 millions d enfants de moins de 15 ans (ONUSIDA, 2010). En effet, dans les pays en développement, le taux élevé de mortalité induit par le VIH a un impact significatif sur la mortalité infantile globale. En 2009, trois cent soixante dix mille ( ) enfants ont été infectés par le VIH à travers la transmission mère enfant (ONUSIDA, 2010). Un quart des femmes enceintes infectées découvrent leur séropositivité, dans le cadre de la prévention de la transmission mère enfant du VIH (PTME). Le taux de transmission de la mère à l'enfant est d'environ 15-20% en l'absence de prévention par traitement antirétroviral (ARV) (GAY et al., 2010). En Afrique subsaharienne, ce taux peut être réduit de 10,4% à 1,4% lorsque des mesures préventives sont combinées (SIMPORE et al., 2006; SIMPORE et al., 2007). Malheureusement, en 2009, dans les pays en voie de développement, seul 53 % des femmes enceintes vivant avec le VIH ont reçu un traitement antirétroviral pour prévenir la transmission mère enfant (ONUSIDA, 2010). Au Burkina Faso, la lutte contre le VIH/SIDA et les IST a commencé depuis une vingtaine d années. Sur la base de la séro-surveillance sentinelle, la prévalence globale du VIH chez les 15 à 49 ans était à 2,0% en 2008 (UNAIDS, 2010). Les stratégies nationales élaborées depuis 2000 incluent un programme PTME et la mise en place des protocoles antirétroviraux (ARV) plus efficaces (Rapport Direction de la Santé et de la Famille Burkina Faso, 2006). Des progrès considérables ont été réalisés au niveau des programmes nationaux de PTME/ VIH mis en place, mais, il existe un risque résiduel de transmission chez les enfants nés de mères séropositives. Entre 14 et 16 mois, les enfants nés des mères VIH séropositives, portent les anticorps de leur mère et sont toujours positifs au test ELISA bien qu ils peuvent ne pas être infectés par le virus. Seuls les dosages de l antigène p24 et le diagnostic moléculaire par PCR peuvent déterminer la séropositivité de l enfant dès la naissance. Ainsi donc, le diagnostic moléculaire précoce demeure l outil incontournable pour mesurer les risques d infections durant la vie intra-utérine, pendant l accouchement et durant l allaitement. 12

13 L étude qui a été menée au Centre Médical Saint Camille de Ouagadougou (CMSC) en 2009 a confirmé la baisse de l incidence de la TME chez les enfants nés de mères séropositives qui ont suivi le protocole de la PTME jusqu à leur accouchement. Il a été décelé un taux de transmission verticale de 9,09 % (12/132) chez les mères sous Névirapine ; 4,55 % (4/88) chez celles sous triprophylaxie (AZT+3TC+NVP) et 0,00 % (0/61) chez celles sous HAART (SAGNA T. et al., 2008). La PCR de l ADN viral intégré (ADN proviral) est la plus utilisée pour détecter précocement le VIH chez le nouveau-né. Dans les pays en développement l utilisation de ce test a été facilitée par la technique de «Dried Blood Spot» (DBS). Le défi médical est d'identifier les enfants infectés par la transmission verticale du VIH pour leur prise en charge thérapeutique par les ARV. Dans les pays à ressources limitées, il y a beaucoup d avantages à utiliser les échantillons de DBS que le sang total pour la réalisation d une PCR pour détecter l ADN (CASTRO et al., 2008). En effet, dans les centres médicaux ruraux qui n ont ni électricité ni congélateur, il est impossible de conserver des échantillons de sang total ou de sérum. Le diagnostic précoce et l initiation des antirétroviraux chez les enfants infectés par le VIH sont cruciaux pour diminuer la morbidité et la mortalité chez les enfants nés de mères séropositives (IVERS et al., 2008). L utilisation de la PCR est donc bien indiquée pour le diagnostic précoce chez les enfants nés des mères séropositives et pour la confirmation des tests ELISA indéterminés effectués chez les adultes (NAGALO et al., 2011). 13

14 Énoncé du problème A cause de la présence des anticorps maternels chez l enfant jusqu à l âge de mois, les tests sérologiques semblent donc inefficaces dans le diagnostic précoce du VIH. En plus, il existe des cas de tests ELISA indéterminés qui posent le problème de la positivité de l individu. Dans ces situations, l usage de la PCR s avère être nécessaire. Justification de l étude Le diagnostic précoce du VIH chez les enfants nés de mères séropositives est nécessaire pour leur prise en charge médicale adéquate, il est aussi important chez les sujets adultes en séroconversion qui n ont pas encore des taux d anticorps suffisants pour être détectés par ELISA. Chez ces derniers, le diagnostic moléculaire par PCR du VIH pourrait s effectuer afin de confirmer ou clarifier leur statut sérologique. OBJECTIFS DE LA RECHERCHE Objectif principal L objectif de cette étude est d évaluer la transmission de la mère à l enfant du VIH et de diagnostiquer l infection à VIH chez les femmes enceintes ayant un statut sérologique indéterminé. Objectifs spécifiques Les objectifs spécifiques de cette recherche sont : - Dépister par PCR au 4 ème mois de naissance les enfants nés de mères VIH séropositives ; - Estimer l incidence de la TME chez les enfants sous allaitement maternel et ceux sous allaitement artificiel. - Déterminer la mortalité parmi les enfants allaités au sein et ceux allaités au lait artificiel. - Confirmer par PCR le statut sérologique des femmes enceintes ayant à l inclusion dans la PTME un test VIH indéterminé par ELISA. 14

15 CHAPITRE I : GENERALITES I.1 Diversité génétique du VIH I.1.1 Origine du VIH et de sa diversité génétique Le VIH présente une très grande diversité génétique. On distingue deux types de VIH : Le VIH1 et le VIH2. Le VIH-2 est moins pathogène que le VIH-1 et il est confiné en l Afrique de l Ouest (FANALES-BELASIO et al., 2010). Les études phylogénétiques du VIH-1 chez l homme et du SIV CPZ chez les primates suggèrent qu au moins trois événements indépendants de transmission se sont produits entre les années 1910 et 1950 à partir de chimpanzés (KEELE et al., 2006). Ces événements ont conduit à l apparition de trois groupes M (major), O (outlier) et N (non-major et non-outlier). Plus de 90% des infections sont dues au VIH-1 du groupe M. En 2009, une nouvelle souche relativement proche du virus de l immunodéficience simienne de gorilles a été découverte chez une femme camerounaise. Il a été désigné par VIH-1 du groupe P (PLANTIER et al., 2009). En 2008, une étude a démontré que le VIH était déjà présent chez l homme en 1881 (WOROBEY et al., 2008). Le groupe M est sous-divisé en 9 sous-types soit : A, B, C, D, F, G, H, J et K. La variation génétique à l intérieur d un même sous-type se situe entre 15% et 20% alors qu elle atteint 25 à 35% entre les sous-types. De plus, certains sous types sont également sous divisés en sous sous-types. C est le cas pour le sous-type A qui est divisé en quatre sous-sous types, A1, A2, A3 et A4 ainsi que pour le sous-type F séparé en deux sous-sous types soit F1 et F2 (BUONAGURO et al., 2007). D abord, la variabilité génétique découle des taux élevés de mutations (approximativement 1 par 10 4 nucléotides) (ELENA et SANJUAN, 2005) et de recombinaison génétique (3 par cycle de réplication) (ZHUANG et al., 2002) engendrées par la transcriptase inverse dans le contexte d une réplication virale intense, estimée à virions produits par jour chez un individu infecté non-traité (PERELSON et al., 1996). Une telle variabilité rend difficile l'élaboration d'un vaccin. Ainsi, lorsque le système immunitaire est encore efficace, on observe un grand nombre de variants dû aux mutations : le virus déborde ainsi le système immunitaire, qui est alors détruit. La variabilité se réduit alors, le variant le plus efficace prenant le dessus. 15

16 Ensuite, l évolution se produit en réponse à la pression sélective exercée par le système immunitaire, plus précisément les anticorps neutralisants, les lymphocytes T CD4+ auxiliaires et les lymphocytes T CD8+ cytotoxiques (JONES et al., 2009) et par les agents antirétroviraux en cas de traitement (CASAZZA et al., 2005). Ces facteurs génèrent une population virale hautement hétérogène dont la diversité s intensifie au fur et à mesure de l évolution de l infection (SIMON et HO, 2003). La recombinaison génétique est un autre processus contribuant à l apparition de la diversité virale. Ce phénomène se produit lorsqu une personne est infectée par deux sous-types différents et que ces deux virus se multiplient dans une même cellule, résultant en un virus hybride représentant une mosaïque des deux virus présents. Lorsque cette forme recombinante est retrouvée chez au moins trois autres personnes non épidémiologiquement liées, on la décrit alors comme étant un CRF (Circulating Recombinant Form), alors que si elle n est retrouvée que chez un seul individu on parle alors de URF (Unique Recombinant Form). Récemment, l accès au séquençage complet des génomes viraux à partir d une seule copie de virus (single genome sequencing) a permis de documenter une panoplie de nouveaux CRF et URF ainsi que leur distribution géographique, illustrant bien la complexité et la diversité de l épidémiologie du VIH à travers le monde (TAYLOR et al., 2008). À ce jour, plus de 43 CRF ont été décrits (Rapport du groupe d'experts, 2010). I.1.2 Distribution géographique et prévalence des sous-types VIH-1 Le sous-type A est présent en Afrique de l Est et Centrale ainsi qu en Asie de l Est et en Europe occidentale et il est responsable d environ 12% des infections par le VIH dans le monde. Bien que le sous-type B soit le plus répandu géographiquement, il est surtout retrouvé en Amérique, en Europe ainsi qu en Australie et ne représente qu environ 10% des cas dans le monde. Au contraire, le sous-type C à lui seul, est responsable de la moitié des infections (TAYLOR et al., 2008) et il se retrouve dans les régions du monde les plus touchées par l épidémie, c est-à-dire, l Afrique de l Est, l Afrique du Sud et l Inde. Le sous-type D se trouve principalement en Afrique de l Est et serait l ancêtre africain du sous-type B, les deux clades étant génétiquement similaires. Le sous-type D est associé à une progression rapide de la maladie et ce virus utiliserait le corécepteur CXCR4 très tôt au cours de l infection (HUANG et al., 2007). 16

17 Heureusement, la prévalence de ce sous-type serait à la baisse (RAINWATER et al., 2005). Le sous-type E retrouvé surtout au sud-est de l Asie, a été reclassé comme étant plutôt une forme recombinante AE et non un sous-type pur E après le séquençage complet de son génome. Ce sous-type est maintenant identifié comme CRF01_AE (GAO et al., 1996). Cette forme recombinante est relativement répandue et représente 5% des infections VIH dans le monde. On retrouve le sous-type G en Afrique de l Ouest et il représente environ 6% des infections. La forme recombinante CRF02_AG est également fréquente dans cette région (environ 5% des cas). Finalement, les sous-types F-H-J-K sont peu répandus et représentent moins de 1% des cas, alors que les autres formes recombinantes représentent moins de 0,1% des cas chacune. I.2 Structure du VIH I.2.1 Particule virale Le VIH-1 est doté d un génome ARN simple brin en double copie de polarité positive de 9817 paires de bases protégé par une nucléocapside icosaédrique. C est un virus possédant une enveloppe formée de trimères protéiques. Le VIH se présente sous forme de particules sphériques d un diamètre de 90 à 120 nm. Il comporte une enveloppe virale constituée d'une bicouche lipidique et de deux glycoprotéines : gp120 et gp41. La molécule gp41 traverse la bicouche lipidique tandis que la molécule gp120 occupe une position plus périphérique. La gp120 joue le rôle de récepteur viral de la molécule membranaire CD4 des cellules hôte. La gp41 est responsable de la fusion de l enveloppe avec la membrane cellulaire. Ces deux glycoprotéines sont liées entre elles par des liaisons non covalentes (PANCERA et al., 2010). L'enveloppe virale dérive de la cellule hôte, elle contient donc quelques protéines membranaires de cette dernière, y compris des molécules du Complexe Majeur d Histocompatibilité (CMH) (ALCAMI et KOSZINOWSKI, 2000). A l intérieur, le core viral ou nucléocapside inclut une couche de protéines de matrice p17 et une couche plus profonde de protéines de capside p24. La protéine p17 est une protéine renfermant la protéase virale. La polymérisation de p24 conduit à la formation d un cône tronqué renfermant le génome viral (BARRE-SINOUSSI, 1996). Ce génome est constitué de deux copies d'arn simple brin associées à deux molécules de 17

18 transcriptase inverse (p64) et à d'autres protéines enzymatiques (protéase p10 et intégrase p32) (Figure 1). Figure 1 : Structure du virion VIH-1 (BRIGGS et al., 2003) I.2.2 Génome du VIH-1 Le génome viral est transformé dans le cytoplasme de la cellule infectée en une seule copie d ADN double brin grâce à la transcriptase inverse. Cette rétro transcription suit un mécanisme très complexe qui aboutit à la création des LTR (Long terminal repeat) aux extrémités de l ADN complémentaire (ADNc). Après circularisation ce dernier migre dans le noyau et intègre le génome cellulaire. Les LTR constitués des régions U3, R, U5 permettent l insertion du virus dans l ADN génomique de la cellule infectée. Les LTR contiennent aussi des séquences nécessaires à la transcription du provirus. Bien que ces séquences soient identiques, elles jouent différents rôles selon l extrémité où elles se retrouvent (5 ou 3 ). - Au niveau de l extrémité 5, le LTR joue le rôle de promoteur fort de la transcription. On y retrouve, le site d initiation de la transcription (CAAT box) et un «catalyseur» (TATA box). - Au niveau de l extrémité 3 le LTR est un promoteur non spécifique capable d activer tout gène endogène ou non situé à sa proximité. 18

19 Figure 2 : Représentation schématique du génome du VIH-1 (PETERLIN et TRONO, 2003). Le génome du VIH est constitué uniquement de deux molécules d ARN monocaténaires de 9,2 kb et de polarité positive, disposant à chaque extrémité d une région R identique, indispensable à la transcription inverse. Les ARN génomiques viraux ont une structure d ARNm (ils possèdent une coiffe en 5 et sont polyadénylés en 3 ). Le VIH possède 3 gènes rétroviraux: codant pour différentes protéines virales : o Le gène gag (groupe antigène) code pour des protéines internes ("core") : p50 et p40 qui se cliveront en p13, p18 et p24. Le gène gag est responsable de la synthèse des protéines qui composeront la structure virale, comme la capside (p24), la nucléocapside (p6, p7) ainsi que la matrice (p17). o Le gène pol (polymérase) code pour des enzymes nécessaires à sa réplication : notamment p68 (transcriptase inverse) et p34 (intégrase). Le gène pol code pour les enzymes virales : la transcriptase inverse, l intégrase, la protéase ainsi que la ribonucléase. o Le gène env, (enveloppe) code pour des glycoprotéines (gp120 et gp 41 issues de gp 160), qui entrent dans la composition de l enveloppe virale (gp160) contenant les déterminants interagissant avec le récepteur et le corécepteur, essentiels à l entrée dans la cellule hôte. La gp41 est formée de trois domaines majeurs : l ectodomaine responsable de la fusion, la région d ancrage transmembranaire et la queue cytoplasmique. 19

20 A la différence des autres rétrovirus, le VIH-1 a une organisation beaucoup plus complexe. En plus des trois gènes communs aux rétrovirus (gag, pol, env), son ARN code pour 6 autres gènes permettant la synthèse de seize protéines dont 3 enzymes (transcriptase inverse, intégrase, protéase) 7 protéines dites protéines structurales (gp41, gp120, matrice, nucléocapside, capside, p7, p6) et 6 protéines accessoires soit : Rev, Nef, Vpu, Vpr, Tat, Vif (tat qui favorise l'augmentation du niveau de la synthèse des protéines virales, rev qui favorise l'augmentation des ARN messagers correspondant aux protéines de gag, pol et env ; ainsi que d'autres gènes tels que vif qui permet d'augmenter l'infectiosité, nef, vpu ou vpr (vpx pour le VIH-2) (WANG et al., 2011). Les gènes tat, rev, vpu, vif, nef et vpr sont dits gènes régulateurs. Ces gènes sont en charge de régulariser divers aspects de l infection virale. La protéine Tat est un activateur de la transcription virale via le LTR alors que Rev joue un rôle de transport de l ARN viral du noyau vers le cytoplasme. Vpu, Vpr, Nef et Vif sont des protéines dites accessoires et sont, par conséquent, non essentielles à la réplication virale. Par contre l effet de ces protéines sur la dynamique virale et sur l échappement au système immunitaire n est pas négligeable. Notons également que le VIH-2 ne possède pas de protéine Vif. A coté de ces trois gènes, nous avons un certain nombre d autres gènes codant pour les protéines dites «accessoires». Le gène Tat code pour la protéine Tat (Transactivator of Transcription). Cette protéine par sa fixation sur la séquence Tar va permettre l amplification de la transcription des ARNm. La protéine Rev issue du gène Rev (Regulatory of Virion Expression) permet la régulation de l exportation du noyau des ARN viraux. La protéine Nef (Negative regulatory Factor) codée par le gène du même nom a plusieurs rôles : o Elle induit une régulation négative de l expression des CD4 et du complexe majeur d histocompatibilité de classe 1 (CMH-1) de la cellule infectée (CAI et al,. 2011). Cette régulation contribue en partie à l augmentation de l infectivité virale (CAI et al., 2011). Le gène Vif (Viral Infectivity Factor) codant pour la protéine Vif a été identifié par FISHER et al.(1987). Vif sera intégré dans le virion et associée à la nucléocapside. A ce stade elle va inhiber l intégration de la protéine APOBEC3G dans le virus (LAVENS et 20

21 al., 2010). Puis Vif envoie la protéine APOBEC3G dans la voie d ubiquitination. Ceci aura pour effet la dégradation d APOBEC3G par les protéasomes. APOBEC3G par son activité antivirale constitue une défense naturelle très efficace contre les rétrovirus HIV- 1, HIV-2 et SIV. Vif est indispensable à l infectivité du virus. Le gène Vpu (Viral Protein U) code pour la protéine Vpu. Cette protéine permet de diminuer l expression des récepteurs CD4 à la surface des cellules infectées. Ce sont essentiellement les CD4 néosynthétisés dans le réticulum endoplasmique, complexés avec le gp160 qui sont la cible de Vpu (WILDUM et al., 2006). L interaction de Vpu se fait directement avec la partie C-terminal du domaine cytoplasmique de CD4 (PTAK et al., 2010). La protéine Vpr (Viral Protein R) codée par le gène Vpr est indispensable à l infection de cellules qui ne se divisent pas tels que les macrophages (KOGAN et RAPPAPORT, 2011). Dans ce cas, Vpr est étroitement reliée au PIC (viral Pré-Integration Complexe). En effet, elle présente une affinité forte pour les pores nucléaires ce qui permettra au PIC de passer le pore. I.3 Cellules cibles du VIH et Réservoirs cellulaires Les cellules cibles du VIH sont caractérisées par la présence, à leur surface du récepteur CD4, sur lequel viendra se fixer le virus. Deux groupes de cellules ont été répertoriés ; les lymphocytes T CD4+ et les cellules présentatrices d antigène (CPA). La disparition progressive des lymphocytes T CD4+ est la marque du syndrome de l immunodéficience acquise (SIDA). La grande majorité de la réplication virale (99%) se passe dans ces cellules activées dans les organes lymphoïdes et les autres tissus libérant dans le plasma des virions dont la demi-vie est estimée à quelques heures. Les CPA sont les monocytes sanguins, les macrophages tissulaires et les cellules dendritiques. Ces dernières sont présentes dans le thymus, la peau (cellules de Langherans), les muqueuses, les organes lymphoïdes, le système nerveux central et le sang périphérique. La fixation du gp120 sur le récepteur CD4 entraîne un changement conformationnel qui permet l accessibilité à des corécepteurs, appartenant à la famille des récepteurs chémochiniques. Ces derniers coopèrent avec le CD4 pour permettre l entrée du virus dans la cellule. 21

22 On distingue le CCR5 sur le macrophage, le CXCR4 sur les lymphocytes T. D autres corécepteurs jouant un rôle mineur ont été mis en évidence, ce sont le CCR3, le CCR2 et le CXCR1. Selon leur tropisme pour ces cellules et selon la nature et le type de chémokines, les isolats viraux peuvent être classés en trois souches : - les souches M-tropiques, dont le tropisme est restreint aux monocytes macrophages. Ils étaient auparavant décrits comme des virus NSI : non sycintium inducing, du fait de la faible production de syncitia in vitro ; - les souches T-tropiques ou X4, autrefois appelées SI : syncitium inducing, qui reconnaissent la lignée cellulaire T ; - les souches M-T-tropiques ou R5X4 ont un double tropisme. I.3.1 Cellules dendritiques Des populations cellulaires sont présentes dans les muqueuses et sont susceptibles à l infection. C est le cas des cellules de Langerhans, qui sont des cellules dendritiques cutanées. Ces cellules sont très nombreuses dans les muqueuses cervicales et vaginales et expriment un fort niveau de récepteurs CD4 et de CCR5 (HLADIK et McELRATH, 2008). Les cellules dendritiques, quant à elles, sont des cellules présentatrices d antigènes et le VIH peut s y attacher via le récepteur cellulaire DC-SIGN (IZQUIERDO-USEROS et al., 2007). Les cellules dendritiques sont de grandes voyageuses de par leurs fonctions de présentation d antigène et, vont malencontreusement propager l infection vers d autres organes lymphatiques comme les ganglions lymphatiques, le thymus et la rate. Suite à cette dissémination virale, la virémie devient alors très importante au niveau sanguin et le sujet infecté est fortement contagieux. Ce sont des cellules présentatrices d antigènes, présentes dans le thymus, la peau (cellules de Langerhans), les muqueuses ainsi que dans tous les organes lymphoïdes secondaires. Elles ont un rôle majeur dans la reconnaissance de l antigène au cours de la réponse immune primaire (VAN KOOYK, 2008). Ainsi, les cellules dendritiques des muqueuses génitales transportent le virus aux organes lymphoïdes voisins où il serait transmis aux cellules CD4 dans lesquelles il se réplique (PERESSIN et al., 2011). 22

23 Les cellules dendritiques expriment la molécule CD4 et il a été montré qu elles sont fréquemment infectées par le VIH in vivo (DUVALL et al., 2007) ; et de plus il semble que la réplication du VIH dans ces cellules soit particulièrement efficace (PERESSIN et al., 2011). I.3.2 Cellules de la lignée monocytaire Chez l homme, les cellules de la lignée monocytaire expriment la molécule CD4, et sont présentes dans le sang circulant sous la forme de monocytes, et dans tous les tissus sous forme de macrophages (REDEL et al., 2010). Elles sont chargées de la capture et de la dégradation de l antigène, puis de sa présentation aux lymphocytes T (REUTER et al., 2010). Dans le cerveau, les cellules microgliales d origine monocytaire représentent la principale population cellulaire infectée par le VIH (POLUEKTOVA et al., 2004). I.3.3 Lymphocytes T Parmi les lymphocytes T du sang périphérique, il existe deux populations : l une exprimant la molécule CD4 et l autre la molécule CD8 (MORIS et al., 2006). La plupart des cellules CD8+ sont des lymphocytes cytotoxiques, tandis que la plupart des lymphocytes CD4+ sécrètent des lymphokines. La réplication virale implique majoritairement les CD4+ (JOSEFSSON et al., 2011). I.3.4 Organes lymphoïdes : cibles précoces du VIH Dès les stades précoces de l infection, les ganglions apparaissent contenir 5 à 10 fois plus de virus associés aux cellules ganglionnaires que les cellules mononuclées circulantes. Les ganglions ne sont pas les seuls organes lymphoïdes atteints par le VIH ; d autres tissus tels que, la rate et le thymus sont également touchés (ZHANG et al., 2011). I.4 Mécanisme d infection par le VIH I.4.1 Différents stades de l infection Un contact infectieux avec le VIH se produit généralement au niveau des muqueuses gastro-intestinales ou génitales. Quoique les corécepteurs CXCR4 et CCR5 soient utilisés par le VIH pour infecter une cellule, les virus utilisent presque exclusivement le récepteur CCR5 lors 23

24 de l infection primaire (LEONARD et ROY, 2006). Au fil de la progression de la maladie, l évolution d espèces virales utilisant le récepteur CXCR4 s observe chez environ la moitié des individus (WILKIN et al., 2007). Or, la muqueuse gastro-intestinale est le plus grand organe lymphoïde du corps humain et environ 70% de la population de lymphocytes s y trouve (VOSSENKAMPER et al., 2011). Ces cellules expriment fortement les récepteurs CD4 et CCR5 ainsi que les marqueurs d activation HLA-DR et CD69 et sont donc très susceptibles à l infection par le VIH (BIANCOTTO et al., 2008; DAI et al., 2009). Ce sont les cellules de la muqueuse gastro-intestinale qui sont généralement les toutes premières cellules qui vont rencontrer les virus transmis. Il va s ensuivre une infection massive et une réplication virale importante et, plus de 50% des cellules exprimant CD4 et CCR5 seront infectées et détruites dans les deux à trois premières semaines suivant l infection. D autres populations cellulaires sont présentes dans les muqueuses et sont susceptibles à l infection. C est le cas des cellules de Langerhans, qui sont des cellules dendritiques cutanées. Ces cellules sont très nombreuses dans les muqueuses cervicales et vaginales et expriment un fort niveau de récepteurs CD4 et CCR5 (HLADIK et McELRATH, 2008). Toutefois, l infection primaire passe souvent inaperçue. Les symptômes sont souvent discrets tels que : fièvre, adénopathies, maux de gorge, éruptions cutanées, douleurs musculaires, diarrhée et maux de tête et se résorbent généralement en quelques semaines. Souvent ces symptômes vont être associés à tort à une mononucléose ou à une grippe. Selon la classification de Fiebig, la primo-infection peut-être divisée en six stades (FANALES-BELASIO et al., 2010): D abord le stade I se caractérise par l apparition d une charge virale supérieure à 100 copies d ARN par ml de plasma et se produit généralement dans les 10 à 17 jours suivant la transmission. Durant cette période, le virus va se répliquer massivement et le sujet est alors fortement infectieux. En quelques jours, la détection de l antigène p24 va également être positive (stade II) et la charge virale est nettement supérieure (parfois jusqu à 5-6 log d ARN viral). Puis les premières réponses immunitaires de type IgM vont se produire et pourront être détectées à l aide des tests de nouvelle génération dont la sensibilité est accrue : on parle alors de séroconversion (stade III). 24

25 Environ 30 jours après l infection, le test western blot, qui met en évidence les protéines virales, est indéterminé (stade IV). La charge virale est relativement stable durant les stades II à IV, puis, approximativement 3 mois après l infection, on observe une diminution de la charge virale ainsi qu un résultat du test western blot positif (stade V). Le dernier stade peut être subdivisé en infection récente puis, ultérieurement, en infection chronique (figure 3). Figure 3 : Stade de l infection par le VIH (KEELE et al., 2008). Cette figure représente les différents stades de Fiebig (FIEBIG et al., 2003) en corrélation avec les résultats de tests de laboratoire lors du suivi de l infection par le VIH. I Cycle de réplication virale Tout comme les autres virus, le VIH ne peut se répliquer qu en pénétrant dans une cellule et en utilisant sa machinerie cellulaire. Le cycle de réplication du VIH se divise en deux phases : une précoce et une tardive (DIDIERLAURENT et al., 2008). 25

26 Figure 4 : Représentation schématique du cycle de réplication du VIH(HAN et al., 2007). Le cycle de vie complexe du VIH-1 offre de multiples moyens d'intervention des ARV. La thérapie actuelle dirigée contre la transcription inverse et l'assemblage viral induirait à la fois une tendance à la résistance et une insuffisante de l'éradication du virus. Un troisième axe d attaque à l entrée de ce dernier est nécessaire et pourrait provenir des agents ciblant l enveloppe virale- CD4 ou l interaction des corécepteurs (CCR5 et CXCR4), R5 et X4 du VIH-1, en utilisant CCR5 et CXCR4 du VIH-1, respectivement (MICHAEL et MOORE, 1999). I Phase précoce Figure 5 : Schéma des étapes de fixation et de fusion du virus et de la cellule hôte (CLAPHAM et WEISS, 1997). 26

27 Lors de la phase précoce, le virus se fixe sur la cellule cible par reconnaissance entre la protéine virale gp120 et la protéine CD4 du lymphocyte T ou d autres cellules phagocytaires mononuclées, ainsi qu un corécepteur. Le récepteur CD4 est une glycoprotéine monomérique de 58 kda. Le corécepteur est un membre de la famille des chimiokines à 7 passages transmembranaires couplés aux protéines G (VENZKE et al., 2006). L interaction du cofacteur au complexe gp120/cd4 induit un changement conformationnel qui permet le démasquage de gp41 et la fusion des membranes (FENOUILLET et al., 2007). Après fusion de l'enveloppe virale avec la membrane plasmique de la cellule cible, la nucléocapside (contenant le génome viral et les enzymes) peut pénétrer dans la cellule cible. Il y a alors élimination des protéines de la nucléocapside, ce qui libère le génome viral et les enzymes. La transcriptase inverse virale catalyse la transcription inverse de l'arn, formant des hybrides ADN-ARN. La matrice d'arn étant ensuite dégradée par une activité RNase de la transcriptase inverse, il y a synthèse d'un second brin d'adn. Cette étape est fortement régulée, et est sous le contrôle des protéines Vif et NC (nucléocapside). Vif a pour rôle de contrôler l accrochage de l amorce spécifique, un t-rnalys, qui permettra par la suite de reconnaître le progénome viral et de l adresser au noyau de la cellule. L ADN nouvellement synthétisé (ou pro-génome) migre vers le noyau, grâce à sa liaison au complexe supramoléculaire protéique : le PIC ou complexe de pré-intégration qui contient l intégrase, la protéine de matrice, la transcriptase inverse et le Vpr qui joue un rôle majeur dans l import nucléaire (FRANCIS et al., 2011). Le pro-génome viral est ensuite intégré dans le génome de la cellule hôte, grâce à l intégrase. I Phase tardive Cette phase correspond aux étapes permettant d obtenir des virions complets, qui seront capables de bourgeonner et d arriver à maturation après leur libération dans le milieu extracellulaire. Ce sont les enzymes cellulaires qui réalisent la transcription de l ADN proviral, sous l influence de facteurs d activation environnementaux (cytokines, antigènes) et viraux propres au VIH. 27

28 Les fonctions cellulaires sont détournées au profit du virus. Des ARNs courts et épissés, codant pour les protéines Tat, Rev et Nef (dites précoces), sont produits. - Nef est une protéine accessoire. - Tat est un activateur transcriptionnel qui se fixe sur l ARN en cours de synthèse au niveau de la région TAR (Trans-Activating Response Element), et permet ainsi de recruter différentes protéines cellulaires favorisant l élongation de la transcription. - Rev permet l export des ARNm non épissés via sa fixation sur le RRE (Rev Responsive Element) des transcrits primaires, et permet le recrutement de l exportine-1 (HOFMANN et al., 2001) et du facteur Ran-GTP (ASKJAER et al., 1998). Des ARNs non épissés ou simplement épissés, correspondant aux gènes gag, gag-pol (protéines de structure), env (enveloppe), vif et vpr, sont ensuite produits pour donner des protéines dites tardives. Une fois traduits, les différents composants viraux sont adressés à la membrane cellulaire, s assemblent pour former un virion qui bourgeonne et finissent leur maturation dans le milieu extracellulaire grâce à la protéase (DOOLITTLE et GOMEZ, 2011). Dans les cellules quiescentes, l ADN proviral n est pas intégré dans le génome de la cellule hôte (REDEL et al., 2010). I Particularités sur l évolution de l infection vers le SIDA Il n y a pas de progression vers le SIDA pour une certaine catégorie de personnes infectées par le VIH-1. Ce sont des non progresseurs sur le long terme (Long Term Non- Progressors), leur taux de LT CD4+ reste stable pendant de nombreuses années et leur charge virale cellulaire et plasmatique demeure faible. Ces patients présentent une faible hyperplasie lymphocytaire et ont de hauts niveaux de LT CD8+ cytotoxiques mémoires anti-vih-1. Enfin, l apoptose spontanée des LT est réduite chez ces patients. Par ailleurs, un autre groupe est particulièrement étudié : les exposés non infectés. Il s agit de personnes séronégatives qui sont hautement exposées au VIH-1 et qui demeurent indemnes de l infection. Certaines de ces personnes ont des LT cytotoxiques (LTC) spécifiques du VIH-1, confirmant que ces personnes ont bien été exposées au virus, et la présence de ces LTC pourrait expliquer leur statut séronégatif. Elles possèdent également de nombreuses IgA anti-vih-1 (SHACKLETT, 2006). 28

29 Ces données confortent le rôle protecteur important des LTC. Parmi ces personnes exposées et non infectées, certaines portent une mutation défective (délétion de 32 paires de bases) du gène codant pour le corécepteur CCR5. Cette mutation à l état homozygote confère une résistance à l infection, au moins par voie sexuelle. I.5 Réponse immunitaire de l hôte face à l infection à VIH Le système immunitaire détecte l infection par le VIH et réagir de plusieurs façons soit : - par le système immunitaire inné constitué des phagocytes et des «natural killers (NK)», - par le système immunitaire adaptatif composé des lymphocytes T auxiliaires et des lymphocytes T cytotoxiques. L infection par le VIH-1 génère une réponse immunitaire qui contient le virus mais qui ne l élimine jamais. Deux types de réponses sont mis en place pour le contrôle de l infection : la réponse à médiation cellulaire et la réponse à médiation humorale. I.5.1 Réponse à médiation cellulaire Réponse CD8 Les lymphocytes T cytotoxique (LTC) sont des effecteurs essentiels de la réponse immunitaire antivirale. Des LTC spécifiques du VIH-1 ont été trouvés en grand nombre et dans une multitude de compartiments anatomiques (sang, rate, ganglions lymphatiques, muqueuse vaginale et gastro-intestinale, peau, espaces broncho-alvéolaires) chez des patients infectés par le VIH-1. Ces LTC sont dirigés contre des épitopes de différentes protéines du VIH (Gag, Pol, Tat, Nef, Vif ou Env). Après l infection par le VIH-1 des populations oligo-clonales de LT CD8+ apparaissent rapidement dans le sang périphérique des individus infectés et lysent les cellules infectées par le VIH-1 (SIRCAR et al., 2010) avec comme corollaire le déclin de la charge virale en ARN plasmatique durant la période de primo-infection. Les LT CD8+ sont également importants lors de la phase asymptomatique (JIAO et al., 2011). Ainsi, bien que la charge virale soit faible, les réponses LTC se maintiennent in vivo durant cette phase. Lors d un rebond de la virémie ou lors d une interruption de la trithérapie chez des patients infectés, de nouvelles cellules ou des cellules préexistantes T CD8+ spécifiques du VIH-1 peuvent être activées et s épandre. Toutefois, il apparaît que cette réponse n est pas 29

30 efficace tant sur le plan quantitatif que qualitatif, car elle ne permet pas l éradication du virus et n empêche pas l évolution vers le stade SIDA. Réponse CD4 Les LT CD4+ spécifiques du virus ont aussi un rôle important dans le contrôle de la réplication du VIH-1 (ZHENG et al., 2009). En effet, l amplitude de la réponse lymphocytaire T CD4+ et le contrôle de la virémie sont en corrélation chez des individus infectés et non progresseurs. Toutefois, l infection par le VIH-1 conduit à une déplétion sélective de la population lymphocytaire T CD4+. Or, les LT CD4+ sont un élément essentiel du système immunitaire car ils permettent le développement et le maintien de la réponse LTC et humoral. Leur déplétion influe par conséquent sur la capacité d élimination du virus. I.5.2 Réponse à médiation humorale La mise en place d une réponse à médiation cellulaire est suivie par une forte réponse humorale (VAN MONTFORT et al., 2011). La séroconversion apparaît 3 à 6 semaines après l infection, mais certaines séroconversions sont plus tardives (au-delà de six mois). Elle suit le contrôle de la virémie plasmatique. Les anticorps neutralisants sont principalement dirigés contre l enveloppe du VIH-1 et agissent soit en bloquant l infection avant l attachement du virion à la cellule, soit en inhibant la fusion membranaire, voire l internalisation du virion. Il existe également des anticorps dits facilitant les virions recouverts de ces anticorps pénètrent dans les cellules par le biais des récepteurs aux immunoglobulines exprimés à la surface de ces cellules. Ainsi, bien que la réponse humorale ait un rôle central dans l élimination de nombreuses infections virales, son rôle dans l infection par le VIH-1 est plus controversé. I.6 Mécanisme de transmission du VIH Depuis le début de cette pandémie, trois principaux modes de transmission ont été observés : la voie sexuelle, la voie sanguine et la transmission verticale. 30

31 I.6.1 Transmission Sexuelle La majorité de la transmission par le VIH soit 75 à 85% s effectue par les rapports sexuels non protégés (BUNNELL et al., 2006). C est le mode de contamination le plus fréquent en Afrique. Les facteurs augmentant le risque de transmission sexuelle sont les stades de primo-infection et SIDA qui sont les stades où la virémie est élevée. Les autres facteurs de risque : un taux de CD4 <200/mm3, une antigénemie p24 positive, charge virale élevée non contrôlée ou multi résistance aux anti-rétroviraux. Le risque est aussi augmenté en cas d'infections génitales, de rapports sexuels pendant les règles, de violences sexuelles. I.6.2 Transmission Sanguine Elle est observée chez les usagers de drogues par voie intraveineuse, lors de transfusion sanguine, de transfusion d'extrait de sang à risque. Les contaminations professionnelles se produisent au cours de piqûres ou de blessures accidentelles avec du matériel contaminé ou projection de sang sur les muqueuses. Le risque est diminué par le dépistage systématique chez les donneurs. I.6.3 Mécanismes de la transmission mère-enfant du VIH-1 I Durant la grossesse I Rôle du trophoblaste Le trophoblaste correspond à la couche cellulaire continue formée de fibroblastes qui limite l'œuf, devenu blastocyste au 6 e jour après la fécondation. Tout au long de la grossesse, des microlésions entaillent la barrière placentaire, qui est plus mince et vulnérable en fin de grossesse. Il est donc possible que des cellules infectées, provenant de la circulation maternelle ou de la décidue, ou bien les particules virales libres, puissent directement passer à travers les brèches pour atteindre la circulation sanguine fœtale (VIDRICAIRE et TREMBLAY, 2004). L entrée du virus dans la cellule cible représente une étape cruciale du cycle de vie viral. L expression de CD4 a été détectée dans les trophoblastes ce qui accrédite l idée que l entrée du VIH dans les trophoblastes pourrait se faire via l interaction CD4/gp120, une glycoprotéine de membrane. L expression du CD4 et des corécepteurs CCR5 et CXCR4 dans les trophoblastes 31

32 demeurent une controverse. En fait il a été montré récemment que le VIH entrait massivement dans ces cellules, non par fusion avec la membrane, comme c est le cas pour les lymphocytes T, mais par endocytose (VIDRICAIRE et TREMBLAY, 2004; CAVARELLI et SCARLATTI, 2011) (Figure 6). I Rôle de l environnement placentaire Il semblerait aussi que les cytokines ou les facteurs de croissance, présents dans l environnement placentaire et dont l expression est modulée dans le temps, pourraient favoriser une infection productive par le VIH ou, au contraire, conférer une certaine protection contre l infection. Dans cette optique, il est intéressant de noter que les cytokines IL-1 et TNF-alpha, activatrices de l expression virale, sont exprimées par le placenta en début de grossesse puis au moment de l accouchement, deux stades correspondant précisément aux périodes où les risques de transmission mère-enfant sont les plus élevés (VIDRICAIRE et TREMBLAY, 2004). Figure 6 : Mécanisme de transmission du VIH in utero (VIDRICAIRE et TREMBLAY, 2004). A et B : des virions libres ou des cellules lymphocytaires infectées (voire des macrophages), présents dans la circulation maternelle, viennent au contact des cellules trophoblastiques. C : le VIH entre alors dans les cellules trophoblastiques, par le biais de mécanismes encore hypothétiques : fusion des virions avec la membrane ou internalisation par endocytose. D : il s ensuit alors une réplication virale à l intérieur des cellules trophoblastiques et un bourgeonnement de nouveaux virions au niveau du pôle basolatéral (circulation fœtale). E : le VIH pourrait également pénétrer dans les trophoblastes par endocytose, et être directement transporté du pole apical vers le pole basolatéral sans qu il y ait infection des cellules trophoblastiques : c est le processus de transcytose. F : dans les deux cas (infection des cellules trophoblastiques ou transcytose), le VIH atteint les cellules sous-jacentes, notamment les lymphocytes et les macrophages fœtaux pour les infecter (VIDRICAIRE et TREMBLAY, 2004). 32

33 I Durant l accouchement Au moment du passage dans le canal utérin, le nouveau-né serait exposé aux secrétions vaginales et au sang maternel contaminé par le VIH : on observe ainsi une différence d infection verticale entre le premier (taux de transmission plus élevé) et le second des jumeaux nés par voie vaginale (ROUZIOUX et al., 2002). Le virus est présent dans les secrétions génitales maternelles sous forme de lymphocytes CD4 infectés et sous forme de particules virales libres. Le fœtus est donc exposé par voie transplacentaire (échanges sanguins Foteo-maternels) ou digestive (du fait de contacts au moment du passage de l enfant dans la filière génitale). Le virus peut être détecté dans les aspirations gastriques des nouveau-nés, qu il s agisse d une exposition par voie ascendante ou lors de l accouchement par voie basse. Les principaux facteurs obstétricaux de risque de transmission virale sont les infections génitales, l accouchement prématuré et surtout la rupture prématurée des membranes de plus de 4 heures. Ces facteurs sont liés à la problématique de la chorioamniotite et des infections bactériennes latentes. Elles doivent faire l objet d un effort de prévention (VIDRICAIRE et TREMBLAY, 2004). Par ailleurs la probabilité de transmission est réduite de moitié, si l accouchement est réalisé par une césarienne programmée pratiquée avant le début du travail. (VIDRICAIRE et TREMBLAY, 2004). I Pendant l allaitement Le risque de transmission est clairement lié à la durée de l allaitement, à la charge virale dans le lait, et à l existence d une inflammation du tissu mammaire (mastite) ou de crevasse des mamelons (ROUZIOUX et al., 2002). Bien que le VIH ait été détecté dans la phase liquide à la fois du lait maternel et dans les cellules du lait maternel (WILLUMSEN et al., 2003), l'origine du virus dans le lait maternel reste controversée. Pendant l'allaitement, les nourrissons sont quotidiennement exposés à des quantités élevées de cellules infectées et aux virus du VIH-1 libre via leur muqueuse buccale et 33

34 gastro-intestinal. Cette exposition est estimée à plus de particules virales par jour (LEWIS et al., 1998). Le virus libre dérive, au moins en partie, à partir du sang (soit à partir de plasma ou de lymphocytes infectés / monocytes) et est ensuite libéré dans le lait maternel. Alternativement, les virus peuvent être produits par une réplication locale dans les macrophages et dans les cellules épithéliales mammaires (TONIOLO et al., 1995). Figure 7. Origine du VIH dans le lait maternel. (VAN, 2007) I.6.4 Moment de la transmission Il est proposé une définition distinguant les contaminations in utero où la PCR est positive dès les 2 premiers jours de vie, des contaminations intrapartum où la PCR ne se positive que secondairement, à partir de 7 jours de vie (VIDRICAIRE et TREMBLAY, 2004). La contamination in utero survient le plus souvent dans les dernières semaines précédant l accouchement dans environ un tiers des cas d enfants infectés. Elle a lieu le jour de l accouchement dans deux tiers des cas. Toutefois, elle peut intervenir durant les premières semaines de grossesse. Elle est maximale (70%) à l accouchement (ROUZIOUX et al., 2002; VIDRICAIRE et TREMBLAY, 2004). 34

35 1.7 Evolution des différentes populations cellulaires lors des phases de la maladie Il y a une relation entre évolution de la maladie, populations cellulaires et charge virale. Pendant la primo infection, les symptômes se limitent le plus souvent à ceux d une maladie virale bénigne. A la phase asymptomatique (deux semaines à quelques mois après la contamination), la présence dans le sang de différents anticorps anti-vih est décelée, le sujet est dit alors séropositif pour le VIH. Apparaissent en même temps dans le sang du sujet contaminé des lymphocytes T cytotoxiques spécifiques dirigés contre les cellules infectées par le VIH. Pendant cette période asymptomatique de plusieurs années, les défenses immunitaires restent actives mais les virus continuent à se multiplier et le nombre de lymphocytes T4 à diminuer. Enfin la phase SIDA ou phase symptomatique, où en absence de traitement, le nombre des LT4 baisse. Le sida se caractérise alors par diverses maladies opportunistes. I.8 Traitements I.8.1 Principes et définition Actuellement, l initiation aux antirétroviraux est fondée sur l évaluation du risque de progression de la maladie (niveau et évolution de la charge virale), l intensité du déficit immunitaire (taux et évolution du nombre de lymphocytes T CD4+) et l engagement du patient à suivre son traitement. En l absence de vaccin, la thérapie antirétrovirale constitue aujourd hui l unique moyen de lutter contre le VIH. Si elle ne permet pas l éradication complète du virus présent dans l organisme, elle diminue néanmoins la mortalité et la morbidité grâce à une prévention et/ou une restauration du déficit immunitaire. Ainsi, le commencement d un traitement est recommandé chez tous les patients symptomatiques ou au stade SIDA, et/ou ayant un nombre de CD4+ inférieur à 200/mm 3. Chez les patients asymptomatiques, le traitement est généralement débuté lorsque le taux de CD4+ est en dessous de 350/mm 3. La première molécule qui fut introduite sur le marché en 1987 fut l AZT (POMMIER et al., 2005). Toutefois, avec son usage en monothérapie, une résistance a rapidement été observée 35

36 (VAN MARLE et al., 2010). Depuis la monothérapie a été abandonnée et la thérapie consiste maintenant en des associations de plusieurs molécules ce qui, a permis de diminuer drastiquement la morbidité et la mortalité liées au VIH. Toutefois, des mutations se produisant dans les gènes codant pour les protéines ciblées par les médicaments, que ce soit la transcriptase inverse, la protéase, l intégrase ou l enveloppe et sont responsables d échecs thérapeutiques (FLEXNER, 2007). Des profils de résistance ont été décrits pour chacune de ces molécules et sont régulièrement mis à jour (JOHNSON et al., 2008). Le traitement antiviral est maintenant disponible dans presque toutes les parties du monde où prédomine l infection avec des sous-types non-b. Des mutations associées à de la résistance ont été observées dans toutes ces régions mais les voies de résistance chez les sous-types non-b sont moins connues. Le traitement vise donc, d une part à abaisser la charge virale globale, et d autre part à stabiliser le nombre de lymphocytes T CD4+, favorisant ainsi un équilibre immuno-virologique. La stratégie des traitements antirétroviraux est d inhiber de façon ciblée les différentes étapes du cycle de réplication du VIH afin de prévenir l infection de nouvelles cellules et la production de virions. Des traitements complémentaires, dits adjuvants, peuvent s ajouter aux premiers, incluant en particulier l immunothérapie. I.8.2 Moyens de traitement Il existe actuellement 7 familles d antirétroviraux: - Les inhibiteurs de la transcriptase inverse : - Les inhibiteurs nucléosidiques (INTI) et nucléotidiques ; - Les inhibiteurs non nucléosidiques (INNTI) de la transcriptase inverse ; - Les inhibiteurs de protéase ; - Les inhibiteurs de fusion ; - Les inhibiteurs du corécepteur CCR5 ; - Les inhibiteurs d entrée ; - Les inhibiteurs de maturation; - Les inhibiteurs d intégrase. 36

37 Ces antirétroviraux inhibent la réplication virale à différentes étapes du cycle du VIH. Ils sont virostatiques et ne permettent donc pas l éradication du virus (VIGET et YAZDANPANAH, 2006). Ces molécules doivent être utilisées en association pour obtenir un niveau suffisant d efficacité et réduire le risque d émergence de mutants résistants (VIGET et YAZDANPANAH, 2006). Cette efficacité est cependant obtenue au prix d effets secondaires et de contraintes de prise de médicaments rendant l observance du traitement difficile. I.9 Prise en charge de la grossesse chez la femme enceinte séropositive La prise en charge est multidisciplinaire, elle nécessite les interventions de virologues, d obstétriciens et de pédiatres. Les antirétroviraux utilisables doivent répondre à plusieurs critères : absence de fœtotoxicité, de teratogénicité et de mutagénicité et avoir une bonne tolérance à court et à long terme chez l enfant (VIGET et YAZDANPANAH, 2006). Ceci impose une surveillance particulière de la grossesse chez la femme enceinte séropositive. Ainsi, deux antirétroviraux (l efavirenz et la zalcitabine) sont interdits pendant la grossesse pour leurs effets tératogènes. L association stavudine-didanosine est contre-indiquée à cause du risque d acidose lactique chez la mère et doit être remplacée par une combinaison d autres inhibiteurs nucléosidiques de la transcriptase inverse. I.10 Cinétique des anticorps anti-vih Le virus est décelable après la contamination, sous la forme d'acide ribonucléique (ARN) à partir du ème jour et sous la forme d'antigène p24 représentant juste une fraction du virus, vers le ème jour. Puis apparaissent les anticorps dirigés contre les différentes protéines structurales et non structurales du VIH. Les premiers anticorps sont détectables en moyenne vers le 21 ème jour mais le délai d apparition des anticorps après le contact infectant peut varier de 3 semaines à 3 mois. Cette cinétique peut varier en fonction de chaque patient et aussi de la souche infectante. L'apparition des anticorps, encore appelée séroconversion, conditionne donc la positivité des tests de dépistage. 37

38 L'utilisation de ces tests de dépistage raccourcit donc la période de «silence» sérologique ou «fenêtre» immunologique (période pendant laquelle aucun marqueur sérologique n est détectable) lors de la primo-infection. Une fois produits par la réponse immune, les anticorps anti-vih persisteront toute la vie du patient mais sans avoir de rôle immunisant contre la maladie (PLANTIER et SIMON, 2002). Figure 8 : Evolution des marqueurs de la contamination par le VIH (RESEAU VIH, 2005) II Techniques de diagnostic des infections à VIH Ces tests sont utilisés de façon automatisée en routine dans les laboratoires d analyses médicales. 38

39 II.1 Diagnostic Indirect II.1.1- Tests ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) Les antigènes viraux, constitués par des protéines virales purifiées du VIH sont fixés au fond des puits d une plaque en matière plastique. Les sérums à tester, les contrôles positifs et négatifs, sont déposés dans les puits. Les anticorps anti-vih éventuellement présents se fixent sur les antigènes viraux. Après plusieurs lavages des puits pour éliminer tout ce qui n est pas fixé, est rajouté un anticorps anti-immunoglobuline ou immunoconjugué. Celui-ci, reconnait et se fixe sur l anticorps anti-vih, préalablement marqué par une enzyme. Les complexes antigènes/anticorps formés seront alors détectés par addition du substrat de l enzyme (ou chromogène), qui donnera naissance à une réaction colorée. La coloration est traduite en densité optique (DO) par lecture avec un spectrophotomètre. II.1.2 Tests de dépistage dits : «tests rapides» De nombreux tests rapides de type qualitatif ont été mis en place pour la recherche d anticorps anti-vih-1 et 2. L Organisation Mondiale de la Santé recommande particulièrement leur utilisation dans les pays en voie de développement. Un test révélant un diagnostic positif pour le VIH devra systématiquement être vérifié par l utilisation d un test différent du premier. Ces tests permettent la détection d anticorps anti-vih en moins de 30 min. Ils font appel à une agglutination ou à une absorption du complexe anticorps-antigène sur une membrane puis à une coloration visible à l œil nu. La sérologie VIH par la méthode ELISA a une très bonne sensibilité ; en revanche elle présente un défaut de spécificité de l ordre de 0.5% et donc tout résultat positif obtenu par ELISA doit être contrôlé par une autre méthode. II.1.3 Méthode de Western blot C est une technique de transfert par capillarité des protéines. L immuno-empreinte qui sert donc à confirmer les tests positifs en ELISA, utilise des antigènes du VIH purifiés et séparés par électrophorèse. Elle permet ainsi de déterminer si les anticorps détectés par ELISA sont spécifiques des antigènes du VIH ou s il s agit d une réaction croisée avec 39

40 d'autres composants, non viraux, du système ELISA. Les antigènes utilisés sont des protéines ou des glycoprotéines du VIH de poids moléculaire variable. Pour l interprétation, on considère le test (VIH-1) positif uniquement s il y a présence d anticorps dirigés contre les protéines d enveloppe (gp160, gp120 et gp41), associés à au moins un anticorps dirigé contre une protéine du virus : gag ou pol. Pour le test VIH-2 on utilise comme antigènes les protéines et glycoprotéines de VIH-2. II.2 Diagnostic direct II.2.1 Antigène p24 Le principe de ce test est la recherche de l'antigène de la capside du virus. On utilise un anticorps primaire qui le reconnaît, puis on utilise un anticorps secondaire, qui reconnaît l'anticorps primaire. L'anticorps secondaire étant couplé à une enzyme qui va réagir avec son substrat, cela produit une coloration mesurée par la densité optique. Comme plusieurs anticorps secondaires se fixent en même temps sur l'anticorps primaire on a une amplification du signal. II.2.2 Techniques de biologie moléculaire Elles permettent la mise en évidence du génome viral. La virologie moléculaire a pris une place de choix dans l arsenal des méthodes de diagnostic direct de l infection à VIH. II Amplification par PCR (Polymerase Chain Reaction) ou par RT-PCR La réaction de polymérisation en chaine dite «PCR» est une méthode d amplification génique in vitro particulièrement sensible, qui permet de mettre en évidence de très faibles quantités d ADN proviral dans un prélèvement biologique. Les régions ciblées sont localisées préférentiellement dans les gènes les plus stables à savoir gag, pol, env, voire dans les LTRs. La séquence cible peut être soit une région intégrée (ADN proviral) soit de l ARN viral après rétro transcription. La technique de PCR-ADN spécifique du VIH est la technique de référence. Elle permet la détection de l ADN pro-viral intégré au génome cellulaire, après amplification enzymatique à partir de cellules sanguines. 40

41 Il peut s avérer pertinent d extraire les ARNm pour générer ensuite des copies d ADNc. C est la technique de RT-PCR (reverse transcriptase) classique de l ARN du VIH. Cette réaction est catalysée par la transcriptase inverse des rétrovirus (reverse transcriptase) qui synthétise une chaîne d ADN à partir d une matrice d ARN. À l issue de la transcription inverse, les ARNm sont hydrolysés (traitement alcalin, RNase ou température). Les étapes suivantes sont réalisées dans l enceinte du thermocycleur. Les ADNc monocaténaires sont alors répliqués par l ADN polymérase au cours d un premier cycle de température. D autres cycles sont réitérés afin d amplifier les ADNc bicaténaires en grande quantité. II Diagnostic par PCR en temps réel : la méthode Taqman La technique de charge virale par PCR-ARN quantitative permet la détection de l ARN VIH plasmatique. La charge virale permet d'évaluer le nombre de copies d ARN viraux par millitre de sérum, mais surtout d'avoir une véritable vue cinétique de la production des virus et, par là même, d'en déduire la vitesse de destruction des lymphocytes T CD4. Figure 9 : PCR en temps réel

42 En ce qui concerne la méthode Taqman, les sondes sont marquées à leur extrémité 5 par un fluorochrome émetteur (reporter), par exemple FAM, et à leur extrémité 3 par un fluorochrome suppresseur (quencher) fluorescent ou non, par exemple TAMRA, qui inhibe l émission du reporter lorsqu ils sont à proximité. Au cours de la PCR, si la sonde est hybridée sur sa cible, elle est hydrolysée par l ADN polymérase. Le reporter ainsi séparé du quencher émet un signal proportionnel au nombre de sondes hydrolysées, mesurable au moment de l élongation. La spécificité de la réaction est liée à la fois à celle des amorces et à celle de la sonde réduisant significativement l émission de fluorescence non spécifique due à des mésappariements ou des dimères d amorce. III Mesure des marqueurs viro-immunologiques Pour ce qui est des marqueurs immunologique, on distingue donc les lymphocytes porteur de marqueurs CD3 et CD4 (LT4) et les lymphocytes porteurs de marqueurs CD3 et CD8 (LT8). L'expansion des lymphocytes CD8+ constitue une des caractéristiques majeures, avec la déplétion en lymphocytes CD4, des anomalies immunologiques observées au cours de l'infection à VIH. Le nombre de lymphocytes T CD4 est le marqueur indirect le plus souvent utilisé en clinique pour suivre d'une manière quantitative l'évolution de la maladie et le rétablissement de l'immunité chez les patients vivant avec le VIH/SIDA. Les CD4+ sont utilisés pour mesurer la capacité de l organisme à se défendre contre «l envahisseur» qui est le VIH. La numération des sous-populations de lymphocytes T CD4, CD8 et CD3 permettent de suivre le rétablissement de l'immunité et l'efficacité thérapeutique, comme la thérapie antirétrovirale hautement active (HAART). Lorsque le ratio CD4/CD8 tend vers zéro, l infection du VIH évolue vers le stade SIDA, alors que lorsque le ratio CD4/CD8 tend vers un, l infection reste latente. On utilise la technique de cytofluorimétrie (Facs Count, Facs Caliburs, Apogée 40 ), pour leur mesure. La quantification de la charge virale peut porter sur le virus libre plasmatique (antigénémie, virémie plasmatique par culture, quantification moléculaire de l'arn viral) ou sur le virus intégré dans les cellules sanguines mononuclées (virémie cellulaire par culture, mesure de l'adn proviral). Elle est mesurée par une PCR quantitative. 42

43 CHAPITRE II : MÉTHODOLOGIES II.1 Cadre de l étude II.1.1 Centre Médical Saint Camille Le Centre Médical Saint Camille est un centre situé à Ouagadougou dans la commune de Bogodogo au secteur 14, sur l avenue Babangida. Ce centre a été crée en 1974 par l ordre des religieux camilliens. C est un centre privé qui comporte : une maternité où 7300 naissances en moyenne ont lieu chaque année ; un centre de pathologie néonatale qui accueille environ 450 enfants par an ; un dispensaire comportant une section adulte et une section pédiatrie qui reçoit environ 300 malades par jour ; un dispensaire mobile qui sillonne deux villages (Boulbi et Kossiam) ; un centre de Santé Maternel et Infantile (SMI) qui reçoit plus de 4000 femmes enceintes, administre plus de 3000 doses de vaccins et effectue des milliers de pesées pendant l année ; un centre de suivi des personnes vivant avec le VIH (PvVIH) ; un Centre de Récupération et d Education Nutritionnelle (CREN) qui fait partie intégrante de la SMI ; un laboratoire d analyse qui comporte des services de bactériologie, de parasitologie, de biochimie, d hématologie, d immunologie et de biologie moléculaire et qui reçoit près de 150 à 200 prélèvements par jour ; une serre pour la culture de la Spiruline. Le CREN est un centre qui ne comporte pas de structure hospitalière mais se référant au service de pédiatrie pour l hébergement des mères et enfants admis au CREN s ils habitent loin du centre. Le CREN est une partie du service de soins maternels et infantiles (SMI). Les activités du CREN sont : la pesée quotidienne des enfants malnutris ; l inscription de nouveaux cas avec prise de la taille, du poids, du tour brachial et crânien; le remplissage des fiches du CREN et du registre ; la pose de la sonde naso-gastrique pour les enfants gravement malnutris qui sont incapables de s alimenter ; une éducation nutritionnelle des mères sur la malnutrition et l hygiène ; une démonstration culinaire des différents types de bouillies. 43

44 Le CREN se réfère au service de pédiatrie du centre situé à quelque dizaine de mètres pour la consultation et les soins des enfants malnutris. Il accueille en moyenne 700 enfants par an et obtient un taux de guérison de 36% contre 57% d abandon et 6% de décès. II.1.2 Centre de Recherche Biomoléculaire Pietro Annigoni (CERBA/LABIOGENE) Le CERBA est un centre de recherche comprenant: o un laboratoire de biologie et de génétique moléculaires (LABIOGENE) chargé de l extraction de matériel nucléaire, de la PCR simple, de la PCR en temps réel, du séquençage et du génotypage ; o un laboratoire de biologie cellulaire chargé des cultures cellulaires et des bio-essais y afférant notamment les tests de cytotoxicité, les tests anti-protozoaires et les tests d immunomodulation; o un laboratoire de microbiologie chargé des tests antimicrobiens; o un laboratoire d enzymologie chargé de l extraction et de la purification des enzymes et d activité enzymatique; o un laboratoire de phytochimie chargé de l extraction et de la purification des principes actifs des plantes; o un laboratoire de biochimie clinique pour les analyses de routine; o un laboratoire d hématologie pour les examens de routine; o un laboratoire de parasitologie et de bactériologie; o un laboratoire d immunologie et d endocrinologie. Les principaux axes de recherche du CERBA se situent au niveau de la recherche fondamentale et les sciences du génome, de la mise en valeur de la médecine traditionnelle et l identification des composants actifs des produits naturels et au niveau de la recherche clinique, notamment dans les essais pharmaco-cliniques. Les PCR et la lecture des résultats ont été réalisées dans le laboratoire de biologie moléculaire. Cette étude s inscrit dans un cadre global de recherche sur le VIH/SIDA dont les grands axes sont la diversité génétique du virus, les interactions virus cellules cibles de l hôte, la génétique de la réponse immunitaire, la génétique de résistance aux ARV et la recherche vaccinale. Le diagnostic moléculaire est l étape initiale d un ensemble d études qui à terme 44

45 permettront l exploration de l ARN ou de l ADN impliqués significativement dans l infection à VIH/SIDA. II.2 Protocole PTME au Centre Médical Saint Camille Comme dans tous les autres pays africains, le Burkina Faso avait mis en place une stratégie de lutte contre le VIH/SIDA et les IST de 2001 à Cette stratégie incluait un programme national de Prévention de la Transmission Mère-Enfant du VIH (PTME) par chimioprophylaxie à la Névirapine et allaitement artificiel ou limité aux trois (03) premiers mois (OMS, 2004). A la période allant de un autre protocole avait vu le jour, visant d une part à combler les insuffisances constatées lors de la mise en œuvre du premier programme et d autre part à introduire des protocoles ARV plus efficaces. L option prise dans ce protocole était une triprophylaxie à partir de la 28 ème semaine de grossesse pour les femmes non éligibles au traitement ARV et la trithérapie pour celles qui sont éligible (OMS, 2006). Toutes les gestantes reçues en consultation prénatale bénéficient du Conseil Dépistage Volontaire ; celles qui choisissent de se faire dépister sont reçues individuellement par la sagefemme pour le conseil pré-test. Le dépistage est alors effectué, la sage-femme annonce le résultat au bout d une vingtaine de minutes, au cours d un conseil post test. Les gestantes dépistées négatives sont invitées à reprendre le test trois mois plus tard ; si le résultat est indéterminé, on fait appel à une méthode spécifique. Quant aux gestantes dépistées positives, elles bénéficient du bilan biologique standard et un dossier est ouvert à la «file active» pour le suivi médical. En fonction du terme de la grossesse, de l état clinique et biologique, les gestantes infectées reçoivent le traitement adéquat pouvant être : la prévention des infections opportunistes par le cotrimoxazole (800/160 mg en prise unique par jour) à partir du deuxième trimestre de grossesse ; un rendez-vous à partir de vingt huit semaines d aménorrhée pour la remise des ARV selon le protocole PTME (OMS, 2006); la mise sous trithérapie. Ces patientes poursuivent les consultations prénatales normalement ; elles sont revues aux dates fixées ou en cas de besoin ; après un choix éclairé du mode d allaitement, elles peuvent accoucher dans le centre de leur choix bien qu il soit souhaitable que l accouchement se déroule 45

46 au Centre Médical Saint Camille ou au moins dans un centre qui dispose de NVP et d AZT pour nouveau-né. Lors du dernier rendez-vous avant l accouchement, la future mère reçoit les ARV nécessaires pour la PTME du VIH: une quantité suffisante d AZT comprimés 300 mg, 2x jour à partir de la 28 ème semaine jusqu à l accouchement ; une dose unique de 200 mg de NVP comprimés, 2x jour ; les comprimés d AZT/3TC 300 mg/150 mg (DUOVIR) en quantité suffisante : la première prise est faite au moment du travail d accouchement et pendant 7 jours post partum. Après l accouchement, le nouveau-né est conduit au service de néonatologie du CMSC (si l accouchement a lieu à la maternité du Centre Médical Saint Camille ou dans un centre ne disposant pas de NVP et d AZT) où il reçoit la dose de NVP (2mg/Kg PU) et le sirop d AZT (4mg/jour x2). Il est gardé pendant trois jours dans l unité de néonatologie (si l accouchement a eu lieu au CMSC) puis il est revu deux fois le premier mois et une fois par mois jusqu au douzième mois de vie. Au cours du suivi, une PCR est réalisée entre quatre et six mois et la sérologie au douzième mois. En cas d échec de la PTME (PCR ou sérologie positive), l enfant est suivi par la section pédiatrique de la prise en charge des PvVIH au CMSC. II.3 Déroulement de l'étude II.3.1 Période et type d étude L étude qui s est déroulée sur une période de 11 mois, allant du 1er septembre 2010 au 29 juillet 2011 portait sur le suivi des grossesses et la prise en charge des enfants nés de mères séropositives au VIH. Il s agit d une étude prospective à visée descriptive. II.3.2 Collecte des données et des échantillons de sang Les échantillons de sang total de 1300 femmes enceintes de moins de 28 semaines d aménorrhée ont été récoltés dans cette étude pour le dépistage du VIH. Les échantillons de sang séché sur papier buvard de 378 enfants nés de mères séropositives ont été retenus pour le test de diagnostic PCR. 46

47 Deux étapes de collectes ont été importantes : 1. La sérologie VIH des mères a été effectuée par des tests rapides (Determine et SDBioline). Le sang a été prélevé sur des tubes imprégnés d EDTA. Après détermination du statut sérologique, le sang est ensuite centrifugé à 4000g pendant 5 mn le plasma a été collecté dans des cryotubes de 1,5 ml et conservés à -20 C. Les échantillons ayant donnés un résultat indéterminé (douteux) aux tests rapides (Determine et SDBioline) ont été conservés pour une confirmation par PCR. 2. À partir de micro-prélèvements de sang veineux (piqûre au bout du doigt ou au talon des nouveaux nés), des gouttes de sang ont été déposées sur du papier puis séchées. Ces prélèvements se sont effectués du 1er septembre 2010 au 29 juillet 2011 dans le laboratoire du Centre Médical Saint Camille. Après séchage, ces papiers imprégnés de sang ont été conservés à température ambiante. II.3.3 Mode de recrutement II Critères d inclusion o Femmes enceintes, séropositives au VIH-1, dépistées à l issue du Conseil de Dépistage Volontaire Anonyme (CDVA) ou antérieurement suivies au CMSC; o Femmes enceintes ayant un résultat VIH indéterminé par ELISA. II Critères de non inclusion o Femmes séropositives VIH-2 ou co-infectées VIH-1 et VIH2. o Mères refusant que l on fasse le test à leur enfant. o Femmes enceintes non consentantes. II Recueil des données Les informations ont été recueillies à l aide de fiches standardisées. La source d information a été constituée à partir : o des dossiers obstétricaux des mères ; o des registres d accouchement du centre ; o des registres d hospitalisation des services de pédiatrie; 47

48 o des registres de consultations externes de pédiatrie des enfants séropositifs. II.4 Considération éthique La réalisation de cette étude a été soumise au comité d éthique du Centre Médical Saint Camille et du CERBA. La confidentialité était primordiale et de rigueur. Le sang des patients était prélevé avec leur consentement éclairé, pour les adultes et le consentement des parents pour les bébés. La participation à l étude était volontaire et individuelle. Les parents ont été informés, dès la naissance de l enfant, de la consultation possible du dossier de l enfant et de la mère pour réaliser des études à but scientifique. Les enfants nés de mères séropositives sont suivis au Centre Médical Saint Camille pour une consultation spécialisée jusqu à l âge de 18 mois (âge au-delà duquel seuls ceux dont la contamination est confirmée sont spécifiquement surveillés). Les données recueillies étaient sous le couvert de l anonymat. II.5 Matériel II.5.1 Appareils de diagnostic utilisés Figure 10: Photos de tests rapides VIH (à gauche Determine TM VIH-1/2 Inverness et à droite SD Bioline) 48

49 Figure 11: Thermocycleur 9700 (Applied Biosystems) (Appareil- laboratoire CERBA) Figure 12 : système d électrophorèse (Appareil- laboratoire CERBA) Figure 13 : Appareil 7500 Fast Real Time PCR (Appareil- laboratoire CERBA) 49

50 Figure 14 : Système photo gel doc. (Appareil- laboratoire CERBA) Figure 15 : Centrifugeuse réfrigérée (Appareil- laboratoire CERBA) 50

51 II.5.2 ARV utilisés pour le PTME BURKINA FASO - PROTOCOLES ARV DE PREVENTION DE LA TRANSMISSION MERE ENFANT DU VIH Tableau I : Protocoles ARV de prévention de la transmission mère-enfant du VIH Femme sans indications pour traitement ARV Protocole en vigueur (inspiré aux recommandations OMS, 2006) Nouveau protocole A (à partir de janvier 2012 et inspiré aux recommandations OMS, 2010) Nouveau protocole B (toujours inspiré aux recommandations OMS 2010, remplacera A à partir de janvier 2014) Temps d administration Pendant la grossesse Pendant le travail En post-partum Pendant l allaitement AZT 300 mg x 2/jour à partir de la 28 ème semaine de grossesse AZT 300 mg x 2/j à partir de la 14 ème semaine de grossesse Triprophylaxie à partir de la 14 e semaine de grossesse avec, en 1 e intention : AZT/3TC 300/150mg x 2/jour + EFV (600 mg pu/j) *** NVP 200 mg pu* +AZT/3TC 300mg/150mg pu NVP 200 mg pu* +AZT/3TC 300 mg/ 150 mg pu Poursuivre triprophylaxie Mère : AZT/3TC 300/150mg x 2/jour pendant 7 jours* Enfant : NVP (2mg/kg pu à la naissance)* + AZT 4mg/kg X 2 /jour pendant 7jours Mère: AZT/3TC 300/150mg x 2/jour pendant 7 jours* Enfant: commence NVP (4mg/kg pu/jour) * ou en 2 e intension AZT (4mg/KgX2 jour) Mère : poursuivre tripropylaxie Enfant: Pendant 6 semaines NVP (4mg/kg pu/jour) * ou en 2 e intension AZT (4mg/KgX2 jour) La mère choisie entre allaitement par SLM et allaitement maternel exclusif avec sevrage précoce entre 4 e et 6 e mois. Après le post-partum, aucune administration d ARV n est prévue, ni pour la mère ni pour l enfant. Allaitement maternel exclusif jusqu au 6 e mois, suivi d allaitement maternel + introduction de compléments alimentaires, avec sevrage à 12 mois** Enfant: poursuit NVP * ou AZT jusqu à 1 semaine après sevrage Allaitement maternel exclusif jusqu au 6 e mois, suivi d allaitement maternel + introduction de compléments alimentaires, avec sevrage au 12 e mois** Mère : poursuivre triprophylaxie, jusqu à 1 semaine après le sevrage * à ne pas administrer si VIH2 en mono-infection ** si la mère peut financer l achat de SLM pendant au moins 12 mois, et si elle vit dans un contexte où les SLM sont acceptables, disponibles et surs, elle pourra choisir l allaitement par SLM. Dans ce cas, administrer à l enfant NVP (4mg/kg pu/jour) pendant 6 semaines après naissance, sauf si VIH2 en monoinfection ***2 e intention : AZT+3TC+LPV/r ou AZT+3TC+ABC (notamment si VIH2 en mono-infection ou en infection mixte) ou TDF+3TC(ou FTC)+EFV 51

52 Femme avec indications pour traitement ARV Protocole en vigueur (inspiré aux recommandations OMS, 2006) Nouveau protocole (à partir de janvier 2012 et inspiré aux recommandations OMS, 2010) Temps d administration Pendant la grossesse Pendant le travail En post-partum Trithérapie à partir de la 14 ème semaine de grossesse : avec, en 1 e intention : AZT (300 mg x 2/j) + 3TC (150 mg x 2/j) + NVP (200 mg x 2/j) ** Trithérapie à partir de la 14 ème semaine de grossesse avec, en 1 e intention : AZT (300 mg x 2/j) + 3TC (150 mg x 2/j) + NVP (200 mg x 2/j) *** Poursuivre trithérapie Poursuivre trithérapie Mère : Poursuivre trithérapie Enfant : NVP (2mg/kg pu à la naissance)* + AZT 4mg/kg X 2 /jour pendant 7jours Mère : Poursuivre trithérapie Enfant : Pendant 6 semaines NVP (4mg/kg pu/jour) * ou en 2 e intension AZT (4mg/KgX2 jour) Pendant l allaitement La mère choisie entre allaitement par SLM et allaitement maternel exclusif avec sevrage précoce entre 4 et 6 mois. Mère : poursuivre trithérapie. Allaitement maternel exclusif jusqu au 6 e mois, suivi d allaitement au maternel + introduction de compléments alimentaires, avec sevrage au 12 e mois**** Mère : poursuivre trithérapie. * à ne pas administrer si VIH2 en mono-infection ** 2 e intention : d4t+3tc+nvp (ou EFV) ou AZT+3TC+EFV ou TDF+3TC(ou FTC)+NVP ou TDF+3TC(ou FTC)+EFV ; si VIH2, AZT (ou D4T)+3TC+LPV/r ou AZT (ou D4T)+3TC+ABC *** 2 e intention : AZT+3TC+EFV ou TDF+3TC(ou FTC)+NVP ou TDF+3TC(ou FTC)+EFV ; si VIH2, AZT+3TC+LPV/r ou AZT+3TC+ABC. Sur indications de l OMS, le D4T n est plus utilisé ni en prophylaxie ni en traitement à cause des ses effets secondaires (neuropathies) **** si la mère peut financer l achat de SLM pendant au moins 12 mois, et si elle vit dans un contexte où les SLM sont acceptables, disponibles et surs, elle pourra choisir l allaitement par SLM. Dans ce cas, administrer à l enfant NVP (4mg/kg pu/jour) pendant 6 semaines après naissance, sauf si VIH2 en monoinfection NB : si femme déjà sous trithérapie avant grossesse, poursuivre trithérapie. En cas de protocole incluant EFV, remplacer cette molécule embriotoxique au cours du 1 er trimestre, par NVP ou LPV/r ou ABC 52

53 II.6 Méthodes pour les techniques utilisées II.6.1 ELISA indirect II Procédure du test rapide Determine HIV 1&2 La technique consistait à : 1. Déposer la bandelette sur une surface plate et horizontale après avoir enlevé sa protection plastique ; 2. Pipeter 60µl de sang à l aide d une micro pipette ; 3. Déposer dans la bandelette sur la zone de dépôt du plasma symbolisée par une flèche ; 4. Attendre 20 minutes ; 5. Lire le résultat ; 6. Interprétation et validation des résultats. Le résultat du test est validé et interprété de la manière suivante : a- résultat positif Apparition de bandes rouges dans la fenêtre-contrôle et dans la fenêtre-patient (une bande par fenêtre). b- Résultat négatif Apparition d une bande rouge dans la fenêtre-contrôle. c- Résultat non valide ou indéterminé - Absence des bandes rouges dans la fenêtre-contrôle et dans la fenêtre-patient ; - Absence de bande rouge dans la fenêtre-contrôle et présence de bande rouge dans la fenêtre-patient. - Enregistrement des résultats. Les résultats ont ensuite été enregistrés dans le registre PTME. II Procédure du test rapide SDBioline HIV 1&2 Ce deuxième test ne concerne que les échantillons jugés positifs et indéterminés au premier test rapide. C est un test de discrimination qui permet de déterminer le type de VIH du patient. Il a l avantage d être rapide et de spécifier les types de VIH. Il existe rarement de faux positifs. Le test ELISA Genie II HIV-1/HIV-2 Bioline est un test immunoenzymatique de double reconnaissance car basée sur la détection spécifique des anticorps anti-vih-1 et anti-vih-2. Le support de réaction est constitué de deux puits: le premier puits «A» de forme circulaire est 53

54 destiné au dépôt de l échantillon. Le deuxième puits «B» de forme rectangulaire elliptique est le puits de réaction, pour le dépôt des réactifs. Ce dernier puits est sensibilisé en deux spots de réaction séparés par les antigènes dérivés du VIH-1 et VIH-2. Il y a un troisième spot de contrôle «contrôle interne» qui permet de valider ou non le test. Le test est résumé en cinq étapes, la première se déroule seulement dans le puits «A» et les quatre dernières dans le second puits. Le mélange de trois gouttes (150 microlitres) du diluant échantillon et de 20 microlitres d échantillon de sang a été transféré dans le puits A du support de réaction. On a attendu l absorption complète de la solution du puits A du support de réaction avant de passer à la lecture visuelle. La figure montre des exemples de cas de résultat positif et négatif. B B Contrôle interne VIH-2 VIH-1 Contrôle interne A A Patient positif VIH-1 et VIH-2 Patient négatif Figure 16 : Représentation des résultats du Génie II HIV-1/HIV-2 SDBioline II.6.2 Extraction L ARN a été isolé du plasma selon le protocole décrit dans le kit d extraction d ARN, kit Qiagen (Qiagen Hilden, Allemagne). L ADN a été isolé à partir du sang total sur papier séché selon le protocole décrit dans le kit d extraction d ADN, kit Qiagen (Qiagen Hilden, Allemagne). 54

55 II Protocole d extraction de l ADN proviral en utilisant le DBS Préchauffer les deux plaques chauffantes : l une à 85 C et l autre à 56 C. 1. Sortir les différents réactifs ; 2. Préparer les tampons AW1 et AW2 en suivant les instructions du fabricant ; 3. Couper des pastilles de 3 mm de diamètre à partir d une goutte de sang séché, à l aide de ciseaux ; 4. Transférer les bouts de pastilles provenant du papier buvard contenant le sang séché dans un tube de 1,5 ml et y ajouter 180 µl de tampon ATL ; 5. Incuber 10 min à 85 C. Centrifuger brièvement, afin de récupérer les gouttelettes accumulées dans le capuchon ; 6. Ajouter 20 µl de solution de Protéinase K, mélanger en vortexant puis incuber 1h à 56 C. Centrifuger brièvement afin de récupérer les gouttelettes accumulées dans le capuchon ; 7. Ajouter 200 µl de tampon AL à l échantillon, mélanger vigoureusement en vortexant puis incuber 10 min à 70 C. Centrifuger brièvement; 8. Ajouter 200 µl d éthanol absolu à l échantillon et mélanger vigoureusement en vortexant. Centrifuger brièvement; 9. Déposer avec précaution le mélange obtenu à l étape 6 dans la colonne QIAmp sans en mouiller le bord. Fermer le capuchon et centrifuger 1 min à 8000 rpm. 10. Transférer la colonne QIAmp dans un tube collecteur de 2 ml et jeter le tube contenant l effluent; 11. Ajouter 500 µl de tampon AW1. Centrifuger 1 min à 8000 rpm. 12. Transférer la colonne QIAmp dans un collecteur de 2 ml et jeter le tube contenant l effluent. 13. Ajouter 500 µl de tampon AW2. Fermer le capuchon et centrifuger 3 min à rpm. 14. Mettre l colonne QIAMP dans un nouveau tube collecteur de 2 ml et jeter l ancien tube collecteur contenant l effluent. Centrifuger 1 min à rpm ; 15. Transférer la colonne QIAmp dans un tube propre de 1,5 ml. Jeter l ancien tube collecteur contenant l effluent; 16. Ajouter 70µl de tampon d élution. Incuber 1 min à température ambiante puis centrifuger pendant 1 min à 8000 rpm. 55

56 II Protocole d extraction de l ARN viral dans le plasma Pour augmenter la sensibilité de la PCR en temps réel, 300 µl de plasma recueilli pour chaque échantillon ont été centrifugés à g à 4 C pendant une heure. Nous avons prélevé 200 µl de surnageant et récupéré 100 µl de culot plasmatique pour faire l extraction de l ARN. 1. Préparer le tampon ATL en suivant les instructions du fabricant ; 2. Préparer les tampons AW1 et AW2 en suivant les instructions du fabricant ; 3. Pipeter 560 µl de tampon ATL dans les tubes contenant les 100 µl de culot d ARN plasmatique; 4. Incuber 10 min à température ambiante. Centrifuger brièvement; 5. Ajouter 630 µl d éthanol absolu à l échantillon et mélanger vigoureusement en vortexant. Centrifuger brièvement; 6. Déposer avec précaution le mélange obtenu dans la colonne QIAmp. Fermer le capuchon et centrifuger 1 min à 8000 rpm ; 7. Transférer la colonne QIAmp dans un tube collecteur de 2 ml et jeter le tube contenant l effluent; 8. Ajouter 500 µl de tampon AW1. Centrifuger 1 min à 8000 rpm ; 9. Transférer la colonne QIAmp dans un collecteur de 2 ml et jeter le tube contenant l effluent ; 10. Ajouter 500 µl de tampon AW2. Fermer le capuchon et centrifuger 3 min à rpm. 11. Mettre l colonne QIAMP dans un nouveau tube collecteur de 2 ml et jeter l ancien tube collecteur contenant l effluent. Centrifuger 1 min à rpm ; 12. Transférer la colonne QIAmp dans un tube propre de 1,5 ml. Jeter l ancien tube collecteur contenant l effluent; 13. Ajouter 70µl de tampon d élution. Incuber 1 min à température ambiante puis centrifuger pendant 1 min à 8000 rpm. II.6.3 PCR (Polymerase Chain Reaction) Après avoir effectué les deux types d extraction : extraction d ADN par sang séché sur papier et l extraction d ARN sur du plasma. 56

57 a. PCR qualitative Nous avons premièrement fait une PCR, en utilisant les échantillons d ADN. Nous avons utilisé le kit Generic DNA cell (Biocentric, Bandol, France), tel que utilisé dans l étude mené par AVETTAND-FENOEL et al. (AVETTAND-FENOEL et al., 2009). Une deuxième PCR de l ADN sur spot DBS a été effectué pour confirmer les résultats de la PCR en temps réel, pour les échantillons au statut sérologique indéterminé (douteux), qui se sont révélés négatifs à la PCR en temps réel qualitative. Le mélange réactionnel de l amplification est décrit dans le tableau II ci-dessous : Tableau II : Mélange Réactionnel de la PCR Constituants du MIX Volume μl Mix qpcr avec platinum Taq 60U/ml + Rox 25 Amorce A 1 Amorce B 1 Sonde C 1 Eau stérile 2 Total 30 μl La PCR a été faite dans un thermocycleur 9700 (Applied Biosystems, USA) dans un volume réactionnel de 50 µl comprenant 30 µl de mixe et 20 µl d ADN selon le programme d amplification décrit dans le tableau III. Tableau III : Programme d amplification de la PCR Etapes Temps Température Dénaturation initiale 2 min 50 C Activation de l enzyme 10 min 95 c Dénaturation 50 cycles 15 s 95 C Hybridation 1 min 60 C 57

58 b. Détection du VIH-1 par PCR en temps réel qualitative Le VIH-1 a été détecté dans les échantillons de plasmas en utilisant le kit HIV Real-TM Qual (Sacace Biotechnologies, Como, Italie) qui combine Rétrotranscription et PCR en une seule étape (RT-PCR one step). La RT-Real Time PCR a été faite dans un appareil 7500 Fast Real time PCR (Applied Biosystems, USA). Pour un volume de 25 réactions, nous avons mélangé, dans un tube DTT fourni dans le kit, les mixes 1 et 2 (Tableau IV). Tableau IV : Mélange réactionnel de la DTT Tube Réactifs Volume DTT RT-PCR-mix-1 RT-PCR-mix μl 200 μl Le mélange réactionnel de chaque RT-PCR est résumé dans le tableau V ci-dessous : Tableau V : Mélange réactionnel de la RT Réactifs Volume Mix DTT 8 μl TaqF polymerase 0,5μl M-MLV 0,25μl La réaction est faite dans un volume final de 18 µl comprenant 8 µl de mélange réactionnel et 10 µl d extrait d ARN et de contrôles positifs et négatifs fourni avec le kit HIV Real-TM Qual. Le programme d amplification de la RT-Real Time PCR est résumé dans le tableau VI cidessous : 58

59 Tableau VI : Programme d amplification de la RT-PCR en temps réel qualitative. Etape Température Temps Répétition (cycles) RT (reverse transcriptase) Synthèse de l ADNc 50 C 30 min 1 Real time PCR Synthèse de l ADN Activation de la Hot Start Taq F polymerase 95 C 15 min 1 Dénaturation Hybridation Elongation 95 C 55 C 72 C 20 sec 40 sec 30 sec 45 II.6.4 Statistiques Nous avons utilisé le logiciel Microsoft Word version 2000 pour le traitement de texte, des tableaux et des graphiques. La saisie des données a été faite sur le logiciel SPSS version 17.0, certaines analyses statistiques ont été faites en utilisant Epi info 6.4. Les statistiques usuelles (moyenne, écart-type, proportion) ont été utilisées pour la synthèse de nos données, selon le caractère quantitatif ou qualitatif. Les tests statistiques ont été utilisés en vue de comparer les variables catégorielles (test chi2 de Pearson et le test exact de Fisher) avec un seuil de signification 5%. Les variantes étudiées dans le modèle étaient celles liées au paramètre d intérêt (PCR positif). Les résultats ont été présentés sous forme de tableaux. 59

60 CHAPITRE III : RESULTATS ET DISCUSSION III.1 Résultats Du premier septembre 2010 au 29 juillet 2011, 1300 femmes âgées de 18 à 49 ans enceintes ont accepté librement de suivre le programme de prévention de la transmission mèreenfant du VIH (PTME) au Centre Saint Camille de Ouagadougou et au CERBA/LABIOGENE qui prévoit : un counselling pré-test du VIH, un test VIH par ELISA, un counselling post-test, une prise en charge thérapeutique pour les mères et leurs enfants par les antirétroviraux (ARV) et enfin, au quatrième mois de la naissance de leurs enfants, un test PCR. III.1.1 Caractéristiques sociodémographiques des mères, selon l âge et la profession La moyenne d âge des femmes enceintes qui ont suivi le programme PTME étaient de 28,32 ± 0,15 ans. Le tableau VII décrit la prévalence du VIH suivant les tranches d âge que nous avons établit. Nous remarquons qu il y a une progression de la prévalence selon les classes d âge. Le groupe d âge le plus représenté était celui des ans composé de 115 femmes soit 43,7%. Nous notons qu au niveau des classes d âge 1 à 3, nous avons une progression de la prévalence : 16% (classe 1) ; 21,8% (classe 2) et 29% (classe 3). A partir de la classe 4, nous avons une régression : 43,7% (classe 4) puis 34,1% (classe 5), tableau VII. Tableau VII : Répartition du statut sérologique en fonction des groupes d âge Classe Groupe Total d âge (ans) Test VIH Types de VIH VIH- VIH+ VIH-1 VIH-2 VIH-1&2 1 < /87 (16%) /320 (21,8%) /551 (29%) /263 (43,7%) > /79 (34,1%) Total /1300 (29,69%) p (1) (2) < 0,001 ; p (1) (3) < 0,001 ; p (1) (4) < 0,001 ; p (1) (5) = 0,004 ; p (2) (3) < 0,001 ; p (2) (4) < 0,001 ; p (2) (5) <0,001 ; p (3) (4) < 0,001 ; p (3) (5) < 0,001 ; p (4) (5) < 0,

61 Tableau VIII : Répartition du VIH en fonction des professions des mères Classe Profession Total VIH- VIH+ VIH-1 VIH-2 VIH-1&2 1 Ménagères /767 (35,1%) 264/378 4/7 1 69,84% 57,14% 2 Secteur /312 (26,9%) 82/378 2/7 0 informel 21,69% 28,57% 3 Elèves /119 (7,5%) 9/378 0/7 0 étudiantes 2,38% 0,00% 4 Fonctionnaires /102 (23,5%) 23/378 1/7 0 6,08% 14,29% Total p (1) (2) < 0,001 ; p (1) (3) <0,001 ; p (1) (4) <0,001; p (2) (3) < 0,001; p (2) (4) <0,001; p (3) (4) = 0,008. Le tableau VIII montre la répartition du VIH au sein des groupes cibles comme : ménagères, élèves, commerçantes, artisanes (secteur informel), fonctionnaires de l état. Le groupe ayant la prévalence la plus élevée du VIH est celui des ménagères (35,1%), viennent ensuite le groupe du secteur informel (26,9%) puis les fonctionnaires (23,5%). Parmi ces 1300 femmes enceintes, 378 femmes ont été dépisté VIH-1 séropositives, soit une prévalence de 29,1% (378/1300). Cette prévalence ne reflète aucunement la prévalence du VIH sur le plan national. En effet, les CMSC et le CERBA qui sont des centres de références du VIH, reçoivent des femmes qui cachent leur séropositivité à leur dépend afin de pouvoir bénéficier de la prise en charge gratuite dans ces deux structures sanitaires. Ces femmes ont eu un suivi médical du temps de leur dépistage jusqu à leur accouchement et un diagnostic précoce du VIH, par PCR, a été effectué sur leurs enfants. III.1.2 Analyse des tests PCR La PCR terminée, les amplicons étaient séparés par électrophorèse sur gel d'agarose 2,0% et leur révélation était faite sous ultra violet (UV). La figure 17 montre le profil électrophorétique des amplicons. 61

62 PM PM pb 2000 pb 200 pb 200 pb 200 pb 200 pb 124 pb 100 pb Figure 17 : Electrophorèse sur gel d agarose à 2%. Légende : PM = Marqueur de poids moléculaire (Fermentas: GeneRuler DNA Ladders «GeneRuler DNA Ladder Mix», ready-to-use, SM 0333; ,000 bp). Puits 24 = contrôle positif ; Puits 25 = contrôle négatif Au niveau des puits 1, 2, 4, 5, 7, 8, 9, 10, 11, 13, 14, 15,16, 17, 18, 19, 20, nous avons des bandes visibles: ces échantillons sont positifs à la PCR. Les puits 3, 6, 12, 21, 22, 23, correspondent à des échantillons négatifs à la PCR. Les bandes d ADN attendues se sont formées entre 100 et 200 paires de bases (pb) ; ce qui correspond à la taille du fragment attendu d environ 110 à 120pb. C est la région 5 LTR du génome du VIH-1 qui a été amplifiée, en se basant sur l étude d AVETTAND-FENOEL et al. (2009). Tous les échantillons qui ont montré des bandes visibles sur le gel étaient donc infectés par le VIH-1 et les enfants correspondants ont été déclarés VIH-1 positifs. Tableau IX : Prévalence des tests PCR positifs en fonction des professions des mères PCR Total Total Négative Positive Ménagère /264 (5,7%) 264 Profession Secteur informel /82 (3,6%) 82 Fonctionnaire /23 (0,0%) 23 Élèves-étudiantes 9 9 0/9 (0,0%) 9 Total (100,0%)